DE2417291A1 - Verfahren zur herstellung von alphagalactosidase - Google Patents
Verfahren zur herstellung von alphagalactosidaseInfo
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Description
Socie*te* des Produits Nestle* S.A.
Vevey / Schweiz
"Verfahren zur Herstellung von ot-Galaetosidase"
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von o^-Galactosidase durch Kultivierung eines Mikroorganismus
in einem Milieu, welches mindestens einen Zucker enthält, der mindestens eine ocD-Galactopyranosylbindung aufweist.
Es ist allgemein bekannt, daß oc-Galactosidase, ein Enzym,
welches Oligosaccharide zu hydrolisieren vermag, welche Galactose enthalten, d.h. Zucker, die mindestens eine a£D-Galactopyranosy!bindung
enthalten, das sind also blähende
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Zucker, wie z.B. Stachyose oder Raffinose, eine wichtige industrielle Rolle auf dem Gebiet der Herstellung von Nahrungsmittel auf der Basis von Hülsenfrüchten und bei der
Herstellung von Rübenzucker spielen kann.
Von den Hülsenfrüchten wird insbesondere Soja in großen Mengen zur Ernährung von Vieh verwendet. Außerdem ersetzt
es mehr und mehr vollständig oder einen Teil der Nahrungsmittel auf Fleischbasis und Milchprodukte, die für den
Menschen bestimmt sind. Die Assimilationsschwierigkeiten, die auf die Anwesenheit von nicht-resorbierbaren Oligosacchariden
zurückgehen und die Blähungserscheinungen können
weitgehend durch eine Behandlung des Ausgangsmaterials,
wie z.B. entfettetes Sojamehl, mit Hilfe von enzymatischen Präparaten mikrobiellen Ursprungs beseitigt werden. Um dem
Mangel an οί,-Galactosidase bei Mensch und Tier abzuhelfen,
kann man sich der Mikroorganismen bedienen, die dieses spezielle Enzym synthetisieren können.
Die Erzeugung von Sucrose bzw. Saccharose aus Zuckerrüben ist durch die Anwesenheit von Raffinose beschränkt, welche die
normale Kristallisation von Saccharose inhibiert. Ein bekanntes Verfahren zur Erhöhung der Ausbeute an Saccharose bei Verwendung
von Zuckerrüben als Ausgangsmaterial besteht darin, den Melassen oder behandelten Rüben ©(-Galactosidase zuzusetzen,
welche die Raffinose in Saccharose und Galactose zersetzt. Die Ausbeute wird durch die Beseitigung der Inhibierungswirkung
der Raffinose und durch das Zersetzungsprodukt der letzteren erhöhte
Es ist außerdem bekannt, daß die Mikroorganismen, von denen bis jetzt bekannt ist, daß sie gute Erzeuger von oc-Galactosidase
sind, wie z.B. Mortierella vinacea von der Art raffinoseutilizer,
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bei Anwesenheit eines Gälacto-Oligosaccharids, wie z.B.
Raffinose oder Lactose im Fermentationssubstrat Aktivität zeigen,
.So sind verschiedene Kulturmedien bekannt geworden, die auf einer Zusammensetzung aus Sojapulver, Reiskleie und Wasser
basieren und die an Raffinose angereichert sind.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Abwässer
auszunutzen, die reich an Nährstoffen sind, welche für die Entwicklung von Mikroorganismen günstig sind, und die außerdem
hinsichtlich der Umweltverschmutzung keinen vernachlässigbaren
Faktor darstellen. Ein solches Abwasser ist ein Wasser, das beim Bleichen von Gemüse, insbesondere weißen Bohnen, vor
deren Verarbeitung in Konserven gedient hat. So hat es sich gezeigt, daß die Stachyose und die Raffinose, die in einem
solchen Bleichwasser vorhanden sind, zur Synthese einer 04-Galactosidase führen, wenn ein thermophiler Pilz in diesem
Wasser gezüchtet wird. Es hat sich außerdem gezeigt, daß diese oC-Galactosidase nicht von Invertase begleitet ist, die
unglücklicherweise Saccharose von Zuckerrüben abbaut. Außerdem ist auch keine Lipase enthalten, welche den Geschmack
und den Geruch von Produkten aus Sojabasis in ungünstiger Weise beeinträchtigen.
Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von oC-Galactosidase durch Kultivierung eines Mikroorganismus
in einem Medium, welches mindestens einen Zucker enthält, der mindestens eine OLD-Galactopyranosylbindung aufweist, welches
dadurch ausgeführt wird, daß man dert Pilz Penicillium duponti in wäßriger Suspension kultiviert und das so erhaltene Myeel
gewinnt.
Vorzugsweise ist das Kulturmedium ein Bleichwasser von weißen
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Bohnen, das gegebenenfalls konzentriert ist. Es kann je Liter
Wasser 6 bis 20 g Trockenfeststoffe enthalten, die zu 30 40 Gew.-ί aus Zuckern, 2 - 5 Gew.-% gesamtem Stickstoff, 12 20
Gew.-? Lipiden und 13 - 18 Gew.-5& Asche besteht.
Die Zucker können zu 30 - H0% aus Stachyose, 40 - 50% Saccharose, 7 - 9% Raffinose und 1,5 - 3,5ί reduzierenden Zuckern bestehen.
Der pH des Mediums kann auf einen Wert zwischen 6 und 7 eingestellt
werden. Die Fermentation kann unter Rühren während 24 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 40 bis 50°C ausgeführt
werden.
Das Enzym wird in den Zellen des Mikroorganismus synthetisiert. Wenn das Mycel, beispielsweise durch Filtration, vom Kulturmedium
abgetrennt wird, dann findet man keine extracellulare oc-Galactosidase im Filtrat. Als enzymatisches Präparat kann
man das Mycel selbst oder einen Mycelextrakt gewinnen. Im ersten Fall wird vorteilhafterweise das vom Medium abgetrennte
und gewaschene Mycel zerrieben. Im zweiten Fall kann man das Mycel in einen Puffer bei einem pH zwischen 5,5 und 7,5 homogenisieren
und zentrifugieren, worauf man den überstand abtrennt. Die oC-Galactosidaseaktivität des letzteren ist genausogut
wie diejenige des My'cels selbst. Ein kleiner Unterschied kann sich aufgrund gewisser Verluste während der Homogen!sation
ergeben. Das Mycel wie das Enzym können in einer lyophilisierten Form konserviert werden, wobei ihre Eigenschaften nur gering
verschlechtert werden.
Das Verfahren gestattet die Herstellung einer Biomasse deren
Trockengewicht je Liter Kulturbouillon in der Größenordnung
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ORIGINAL INSPECTED
von 2 bis 3 g liegt. Wenn man eine ct-Galactosidaseaktivitätseinheit
(U) als diejenige Menge Enzym definiert, die 1/Ug
reduzierende Gruppen von einer 0,05 ί-igen Stachyoselösung in 30 Minuten in Freiheit setzt, dann ergibt sich, daß die
Aktivität des nicht-homogenisierten Mycels, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, 45 000 U/g trockenes
Mycel erreichen kann und daß die Aktivität des Mycels nach der Homogenisierung 42 000 U/g trockenes Mycel erreichen kann«
Diese Aktivität eröffnet vorzügliche industrielle Perspektiven. Anwendungsversuche, nämlich die Verwendung des lyophilisierten
Enzyms für die Behandlung einer Sojamilch und die Verwendung des lyophilisierten Mycels zum Abbau von Raffinose in einem
Zuckerrübensaft haben durchaus vorzügliche Resultate ergeben.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen (Phaseolus vulgaris) zeigt
die folgende Zusammensetzung:
Stachyose 1,0 g/l
Raffinose 0,2 g/l
andere Zucker 1,6 g/l
Gesamtstickstoff 0,4 g/l
Lipide 1,7 g/l
Asche 1,1 g/l
Der pH dieses Wassers wird auf 6,5 eingestellt und in 2 Liter-Flaschen
in einer Menge von 500 ml je Flasche abgefüllt. In die Flaschen wird ein Inoculum des Pilzes Penicillium duponti
(Talaromyces thermophilus) (ATCC 10518, CBS 23658) eingebracht. Die inoculierten Flaschen werden in einem Schüttler mit 120
Drehbewegungen/min 24 Stunden lang bei 45°C bewegt. Die Kultur-
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bouillon wird durch Absaugen auf einer gewöhnlichen Glasfritte
abfiltriert. Das Mycel wird in einer Menge von 2,7 g Trockenfeststoffe/l
Bouillon erhalten. Ein Versuch an Stachyose ergibt, daß die oC-Galactosidaseaktivität des so erhaltenen Mycels
45 000 ü/g trockenes Mycel beträgt, wobei eine Aktivitätseinheit
(U) definiert ist als die Enzymmenge, die in 30 Minuten aus einer 0,05 ϊ-igen Stachyoselösung 1 ,ug reduzierende Gruppen
in Freiheit setzt.
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen besitzt die folgende Zusammensetzung:
Stachyose 1,2 g/l
Raffinose 0,3 g/l
andere Zucker 2,1 g/l
Gesamtstickstoff 0,4 g/l
Lipide 1,3 g/l
Asche 1,8 g/l
In diesem Wasser wird der Pilz Penicillium duponti (ATCC 10518)
unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert. Das während einer 48-stündigen Kultivierung erhaltene Mycel
macht 2,9 g Trockenfeststuffe je Liter Kultur aus. Nach Lyophilisierung
des Mycels zeigt dieses eine an Stachyose getestete Aktivität von 39 000 U/g Trockenfeststoffe.
Ein Bleichwasser von weißen Bohnen, welches die gleiche Ausgangszusammensetzung
wie in Beispiel 2 aufweist, wird einer Konzen-
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trierung unterworfen, während der das Volumen auf die Hälfte
verringert wird. Der Pilz Penicillium duponti (ATCC IO518)
wird in diesem Medium kultiviert, welches die doppelte Konzentration an Nährelementen enthält, wie das in Beispiel 2
genannte Medium. Die Fermentationsbedingungen sind die gleichen wie in Beispiel 1. Das nach 48 Stunden Kultivierung erhaltene
Mycel enthält.5,5 g Trockenfeststoffe je Liter Kulturmedium.
Nach Lyophilisierung besitzt das an Stachyose getestete
Mycel eine Aktivität von 34 000 U/g Trockenfeststoffe.
Ein Mycel von Penicillium duponti (ATCC IO5I8) wird gemäß
Beispiel 1 hergestellt. Dieses Mycel wird in einem 0,05 m Acetatpuffer mit pH 6 homogenisiert. Hierauf wird mit
23 000 U/min 60 Minuten lang zentrifugiert. Der überstand
wird gewonnen. Die Aktivität des überstands gegenüber den
folgenden Substraten wird getestet.
1. Saccharose
2. Raffinose
3. Stachyose
4. 4-Nitropheny1-ß-D-glucopyranosid
5. 2-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid
6. 2-Nitrophenyl-oc-D-galactopyranosid
7. Azocoll
8. Olivenöl
Bei den Substraten 1, 5, 7 und 8 wird keinerlei Aktivität festgestellt. Der überstand enthält keine Invertase, keine
ß-Galactosidase, keine Protease und keine Lipase.Er enthält eine oc-Galactosidase und eine ß-Glucosidase. Die c*-Galactoseaktivität
des Überstands bei Stachyose ist 42 000 U gemäß obiger Definition.
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Es wird ein Mycel von Penicillium duponti (ATCC IO518) hergestellt,
wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Dieses Mycel wird in einem 0,05 m Acetatpuffer mit pH 6 homogenisiert.
Hierauf wird 30 Minuten lang mit 23 000 ü/min zentrifugiert.
Die oC-Galactosidaseaktivität des Überstands beträgt, an
Stachyose getestet, 40 000 U.
Zu 500 ml Sojamilch, die 3,7 % Stachyose enthält, werden
100 mg des Enzyms oder Überstands zugegeben, das bzw. der gemäß Beispiel 4 hergestellt und dann lyophilisiert worden
ist. Die enzymatische Behandlung wird während 30 Minuten
bei 55°C durchgeführt. Nach der Behandlung ist der Gehalt an Stachyose in der Sojamilch auf kO% reduziert, jedoch ist
der Geschmack der Milch praktisch nicht verändert.
Zu 200 ml eines Zuckerrübensafts, der 22£ Saccharose und
2% Raffinose enthält, werden 1 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten
Mycels zugegeben. Die enzymatische Behandlung wird während 24 Stunden fortgesetzt, wobei fortlaufend der
Abbau der Raffinose beobachtet wird. Nach ungefähr 1 Stunde sind 40?, nach ungefähr 2 1/2 Stunden 60% und nach ungefähr
4 Stunden 80? abgebaut. Nach 8 Stunden ergibt sich eine Stabilisierung
bei etwa 85?.
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Claims (1)
- PATENTANSPRÜCHEVerfahren zur Herstellung vono^-Galactosidase durch Kultivierung eines Mikroorganismus in einem Medium, welches mindestens einen Zucker enthält, der mindestens eine otD-Galactopyranosylbindung aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man den Pilz Penicillium duponti in wäßriger Suspension kultiviert und das so erhaltene Mycel gewinnt.2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium ein Bleichwasser von weißen Bohnen verwendet wird.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium 6 bis 20 g Trockenfeststoffe/l Wasser enthält und daß die Trockenfeststoffe 30 bis 40 Gew.-% Zucker und 2 bis 5 Gew.-% Stickstoff enthalten.4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zucker zu 30 bis 4θ£ Stachyose, 40 bis 50? Saccharose, 7 bis 9% Raffinose und 1,5 bis 3,5ί reduzierenden Zuckern bestehen.5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der pH des Mediums auf einen Wert zwischen 6 und 7 eingestellt wird.6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß während der'Fermentierung das Medium auf eine Temperatur von 40 bis 500C gehalten wird.5 0 9 8 3 3/0826ORIGINAL INSPECTED-ΙΟΙ. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation 24 bis 48 Stunden durchgeführt wird.8. Verfahren nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene Myeel gewaschen und zerrieben wird.9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene Mycel in einem Puffer bei einem pH zwischen 5,5 und 7»5 homogenisiert und zentrifugiert wird und der überstand gewonnen wird.509833/082$
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