DE2402452C2 - Durchführung von Enzymreaktionen - Google Patents
Durchführung von EnzymreaktionenInfo
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Description
15
Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Der Patentanspruch 2 nennt
eine Ausgestaltung der Erfindung.
Bekanntlich finden Enzymreaktionen im Wasser statt, da letzteres das bestmögliche Lösungsmittel für Enzyme
ist und deren Aufbaubeständigkeit sicherstellt, von der die katalytische Wirksamkeit abhängt
Das setzt bei all denjenigen Reaktionen gewisse Grenzen fest, bei denen Ausgangsstoffe (Substrate des
Enzyms) verwendet werden müssen, die wasserunlöslich sind und daher den Einsatz organischer Lösungsmittel
benötigen. Bekanntlich Oben letztere in den meisten Fällen eine die Enzyme denaturierende Wirkung aus,
zumal wenn sie wasservermischbar sind.
Andererseits taugen wasserunmischbare Lösungsmittel als Enzymlösungsmittel fast nie, so daß Enzymreaktionen
in homogener organischer Phase meist undurchführbar sind.
Das bringt eine wesentliche Einschränkung des Zustandekommens von Enzymumwandlungen aller
schlecht wasserlöslicher Substrate mit sich, wovon einige (Steroide, Terpene, Lipidderivate, Liophilerzeugnisse
mit pharmakologischer Wirkung u.a.m.) gebrauchsmäßig
und wirtschaftlich von großem Interesse sind. Man könnte daher an die Möglichkeit denken, eine
bessere Dispersion der Substrate durch Emulgieren derselben in der wäßrigen Phase des Enzyms zu
erzielen; diesem Verfahren sind jedoch engere Grenzen gesetzt, sei es, weil viele der gangbarsten Dispergiermittel
eine Desaktivierung des Enzyms verursachen, sei es, auch weil diese Technik bei Substraten mit höherem
Schmelzpunkt als die Raumtemperatur nicht anwendbar ist.
Wir haben nun festgestellt, daß es möglich ist,
Enzymumwandlungen wasserunlöslicher Substrate bei guter Ausbeute gemäß der Erfindung vorzunehmen; das
dabei eingesetzte organische, wasserunmischbare Lösungsmittel wirkt als gutes Lösungsmittel für das
Substrat, so daß das Enzym in seinem natürlichen Wasserelement arbeitet und eine direkte denaturierende
Wirkung des Lösungsmittels vermieden wird.
Die Aufgabe des organischen Lösungsmittels besteht nicht allein in der Lösbarmachung des Substrats,
sondern auch in der Sicherstellung einer gleichbleibenden Konzentration (die bei schlecht wasserlöslichen
Stoffen praktisch der Sättigung gleicht) in der wäßrigen Phase, in welcher sich die Enzymumwandlung vollzieht
Zu dieser Aufgabe als »Speicher« kommt noch eine weitere, hinsichtlich der Reaktionsgeschwindigkeit
äußerst wichtige Aufgabe hinzu, die in der fortgesetzten Extraktion der Reaktionsprodukte aus der wäßrigen
Phase seitens des wasserunmischbaren Lösungsmittels besteht Das gilt in den Fällen (die ">ei weitem
überwiegen), wo die Enzymumwandlungserzeugnisse unlöslicher Substrate einen gegenüber der organischen
Phase noch günstigen Verteilungskoeffizienten besitzen. Diese Extraktionswirkung der Reaktionsprodukte
läßt sich z. B. durch Emulgieren der Substrate nicht erzielen, und sie stellt eine vorteilhafte Eigenschaft der
hier beschriebenen Technik dar.
Die Bedeutung dieser Entziehung der Produkte ist in bestimmten Fällen besonders bemerkenswert und sie
beschränkt sich nicht auf eine Verlagerung des Reaktionsgleichgewichts durch Massenwirkung, sondern
sie ist besonders in den zahlreichen Fällen wertvoll, wo eine Zunahme des Konzentrationsgrades der
Reaktionsprodukte im wäßrigen Element eine die katalytische Wirkung des Enzyms hemmende Aktion
ausübt
Die Erfindung kann bei Enzymreaktionen angewandt werden, bei welchen das Enzymsubstrat im Wasser
unlöslich bzw. schwer löslich ist Ein besonderes Anwendungsgebiet der Erfindung bilden Enzymumwandlungen
der Steroide, wie z. B. Oxydationen, Hydroxylierungen, Dehydrierungen. Weitere Enzymreaktionen
wie z. B. Umwandlung des Salicylate in Pyrocatechin, Oxydation der Dihydroxyphenole, Oxydation
aromatischer Kohlenwasserstoffe, lassen sich durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
vorteilhaft durchführen.
Als brauchbare organische Lösungsmittel können folgende angeführt werden: Ester von Carbonsäuren
mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen, Alkyläther von Alkoholen mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, aliphatische,
aromatische oder cycloaliphatische kohlenwasserstoffe, Halogenide.
LAKKASE Enzymquelle:
gereinigtes Enzym aus Kulturflüssigkeit des Pilzes Poliponis versicolor.
Reaktion:
Substrat + O2
Gemisch wird bei 25° C unter Rührung mit reinem Sauerstoff oder mit in der gasförmigen Phase
Bei einem typischen Verfahren werden 5 ml Äthylace- 63 vorhandener Luft bebrütet. Zu verschiedenen Zeitpunktat,
die 10 mg östradiol (3,6 χ 10"2 M)/ml enthalten, mit ten werden je 5 ml der organischen Phase entnommen
gleichem Volumen Pufieracetat 0.1 M, pH 5.4 emulgiert, und für die Analyse des östradiol und etwaiger
welche Lakkase 0,060 mg/ml (10"6M) enthalten. Das Oxydationsprodukte benutzt.
Nach vierstündigem Verbleiben unter den beschriebenen Versuchsbedingungen ist die Hälfte des östradiols
in (zumindest 5) chromatographisch erkennbare s Produkte umgewandelt Bei ähnlichen Versuchen, die in
Abwesenheit des organischen Lösungsmittels durch Sättigung des die Lakkase enthaltenden Pufferacetats
mit östradiol ausgeführt wurden, war es anhand der üblichen Analysenverfahren nicht möglich, die Reaktion
nachzuweisen. Das ist wahrscheinlich auf die in der ^ wäßrigen Phase erzielbare, unausreichende Konzentration
des Steroids zurückzuführen.
Unter den erwähnten Versuchsbedingungen erfolgt die Umwandlung nachstehend aufgeführter Substrate
mit annähernd gleicher Geschwindigkeit (t\n=4 Stunden) wie beim östradiol: Östradiol, östron, östriol,
Äquilin, Äquilenin, Diäthylstilböstrol.
Durch viele weitere wasserunmischbare, organische Lösungsmittel wurde das Äthylacetat bei gleichen
Ergebnissen ersetzt, z. B.: Trichloräthylen, Diäthyläther,
Äthylendichlorid.
Betspiel 2
HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE (HBDH) Enzymquelle:
aus Zellen des Pseudomonas Testosteron (Sigma H 9004).
Reaktion:
+ HASDH
Testosteron + NAD £ 7 4-androsicrön, 3,17-dion + NADH τ H+;
Testosteron + NAD £ 7 4-androsicrön, 3,17-dion + NADH τ H+;
HSDH = Hydroxysteroid - Dehydrogenase,
NAD = Nicotinamid - Adenin - Dinukleotid.
NAD = Nicotinamid - Adenin - Dinukleotid.
3,2 ml Pufferphosphat, μ OA pH 7,6, die 2,5 mg NAD+ Stöße je Minute) und die optische Dichte der wäßrigen
und 0.05 Einheiten HSDH enthalten, wurden mit 3,2 ml jo Phase bei 340 nm wird zu verschiedenen Zeitpunkten
eines 13 mg Testosteron (1,4 χ 10-2M) enthaltenden gemessen.
Versuchsdaten | O. D. 340 nm | O. D. 340 nm |
Organische·· | nach | nach |
Lösungsmittel | 2 Stunden | 22 Stunden |
1.4 | 3.4 | |
Äthylacetat | 1.3 | 3.2 |
Butylacetat | 1.2 | 2.5 |
Äthyläther | 0.55 | 1.9 |
Butanol | ||
O. D. = optische Dichte. | ||
In Abwesenheit des organischen Lösungsmittels ist die Gesamtzunahme der optischen Dichte bei 340 nm
durch die Wasserlöslichkeit des Testosterons eingeschränkt (die gesättigte Lösung enthält 25-30μg
Testosteron/ml). Ohne organisches Lösungsmittel übersteigt sie daher nie einen Wert von etwa 0,3.
HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE + LACTI - DEHYDROGENASE Enzymquellen:
HYDROXYSTEROID - DEHYDROGENASE (HSDH) aus Zellen von Pseudomonas Testosteron;
Lacti - Dehydrogenase (LDH) (Boehringer).
1. Testosteron + NAD <■ 7 Androsteron 3,17-dion + NADH + H+.
2. Pyruvat + NADH + H
Lactat + NAD
*' (TeSt)(NAD) 26X1°
(LaCt)(NAD-)
2 (PyD(NADH)(H+) °'4 10 '
2 (PyD(NADH)(H+) °'4 10 '
5 6
Dem Gleichgewicht nach erscheint die Reaktion von der Konzentration von (H+) und NAD1* oder NADH
unbeeinflußt
Verfahren
10
Bei einem Musterversuch werden die beiden Enzyme LDH und HSDH 3 mi einer den oxydierten Kofaktor
und das Na-Pyruvat enthaltenden Pufferlösung zugesetzt Der wäßrigen Lösung wird ein gleich großes
Volumen an organischer, das Steroid enthaltende Phase beigemischt und die Reaktion beginnt beim Emulgieren
der beiden Phasen. Die Reaktion wird unter Rührung des Behälters in einer Schwingvorrichtung bei 90
Schwingungen in der Minute fortgesetzt
Der Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde durch Bestimmung der in der organischen Phase vorkommenden
Mengen an umgewandeltem bzw. nicht umgewandeltem Steroid verfolgt
Zu bestimmten Zeitpunkten werden die Phasen verrührt, ein genau gemessenes Volumen der organisehen
Phase wird entnommen sowie Testosteron und Androstendion per TCL durch Elution mit dem
Äthylacetat-Benzol-n-Hexan-System (100:80:60) getrennt
Die Steroide werden vom Träger mit CHCI3 extrahiert (24 h bei Raumtemperatur) und nach
Verdunsten des CHCl3 bei 240 nm in ETOH spektrophotometrisch
analysiert
Umwandlungsversuche sind vorgenommen worden, bei welchen die Konzentrationsverhältnisse nahe der
Hemmgrenze des LDH (0,2 molar Pyruvat) lagen.
Der Zweck war, zu erweisen, daß es möglich ist, aus
kleinen Volumen und niedrigen Mengen HAD hohe Mengen umgewandelten Disteroids zu gewinnen, eine
restlose Umsetzung und daher einen hohen Reinheitsgrad des Produktes zu erzielen.
Nachdem rohes HSDH verwendet wurde, das die Isomerase Δ*-Δ5 enthält, sind diese Versuche bei
verschiedenen pH-Werten vorgenommen worden.
1,5 ml F1Ufferphosphat 0,4 mol
15 Na-PyruvatflmlHzO)
1500 γ NAD (0,5 ml H2O) 1,5 mg
LDH = 1,6 Einheiten HSDH = 0,16 Einheiten Organische Phase:
3 ml Butylacetat
30 mg Testosteron
3 ml Butylacetat
30 mg Testosteron
pH | Umsetzungs-% | nach | 46h | 72 h | Spuren von |
3 h 45' | 22 h | 84 | 93 | Steroktisomer | |
6.8 | 14 | 50 | 90 | 95 | vorhanden |
7.3 | 18 | 58 | 92 | 100 | vorhanden |
7.5 | 20 | 62 | 96 | 100 | vorhanden |
8.8 | 30 | 70 | nicht vorhanden | ||
Es wird angenommen, daß es sich bei den Spuren des Steroids, das in den TLC and Rf-Platten größer als Δ*
Androstendion erscheint um Δ5 Androstendion handelt
Aus den Tabellenangaben gefct hervor, daß man nach
72 Stunden Reaktion mit pH zwischen 7,5 und 8,8 die volle Umsetzung erzielt, daß aber das Reaktionsprodukt
erst bei pH 8,8 chromatographisch rein ist so
Beispiel 4 LIPASE
Veränderliche Mengen Lipase (Koch-Light cat ·λ
1503 L) wurden in 5 ml Na-Malat-Puffer 0,1 M, pH 6,5 aufgelöst
Im ersten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen, in 2,5 ml Dichloräthan gelöst und
eine Stunde lang bei 37°C unter Ruht ung bebrütet to
Im zweiten Fall wurden 5 ml Enzymlösung mit 2,5 ml Olivenöl geschlagen und eine Stunde lang bei 370C
unter Rührung bebrütet
Daraufhin wurden 30 ml eines Gemisches gleicher Anteile von Aceton und Äthanol zugesetzt um die bs
Emulsion zu brechen, und die durch Enzymkatalyse freigewordenen Fettsäuren mit Natron 0,05 M titriert
Lipase
Versuch
mit Lösung*- ohne Emulsion
mittel ohne Lösungsmittel
μ Mol freigewordeiK FetUiure in 1 h
bei 37-C
97
206
310
439
206
310
439
280 400
Beispiel 5 ALKOHOL-DEHYDROGENASE
Hefe(Borhringer 154 18 EAAD) Reaktion:
I.Versuch
mit Butanol ohne Lösungsmittel
mit Butanol ohne Lösungsmittel
Das Reaktion>gemisch besteht aus 10 ml Puffer-Pyrophosphat
0,1 M, pH 9, in denen folgende Stoffe gelöst sind:
7 8
Semi-carbazid HCI 12,5 mg 2. Versuch
5!yci". , . 16,7 mg Butanol mit zugesetztem Benzol
Glutathion, reduziert 3 mg
Glutathion, reduziert 3 mg
NAD 30 mg Das Gemisch des ersten Versuches wird mit einem
5 Gemisch aus 5 ml Butanol und 5 ml Benzol unter Rühren
Das Gemisch wird mit 5 ml Butanol unter Rühren bei bei 20° C bebrütet
2O0C bebrütet
2O0C bebrütet
1. Verweh 2. Venu· h
0 | 0,190 | 0,190 |
5 | 3,85 | 3,80 |
10 | 4,95 | 5^0 |
30 | 7,65 | 9,60 |
60 | Qi | η.*- |
145 | 103 | 15,0 |
180 | 11,4 | 163 |
300 | 11,7 | 17,5 |
1320 | 12,2 | 20,4 |
Bei Anwesenheit des Butanols allein wurde eine 25 j stellt, daß die Konzentration des n-ButanoIs in der
Entaktivierung des Enzyms festgestellt, die die Tatsache wäßrigen Phase - wegen des weniger günstigen
erklärt, daß die Reaktion beim ersten Versuch nach fünf Verteilungskoeffizienten — um 3%, also bedeutend
Stunden nur mäßig vor sich geht niedriger var als beim Versuch ohne aromatisches
Bei den Arbeitsbedingungen des zweiten Versuchs Lösungsmittel,
wurde durch gaschromatographische Analyse festge- 30
Claims (2)
- Patentansprüche;1, Verfahren zur Durchführung von Enzymreaktionen, be! welchen das Substrat in der das Enzym enthaltenden Flüssigkeit schlecht löslich ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Anwesenheit eines wasserunmischbaren, mit dem Substrat jedoch mischbaren organischen Lösungsmittel erfolgt
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat dem organischen Lösungsmittel als Lösung zugesetzt wird.10
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