DE2364999A1

DE2364999A1 - Verfahren zur dehydroxylierung von aminoglykosid-antibiotika

Info

Publication number: DE2364999A1
Application number: DE2364999A
Authority: DE
Inventors: Tsunehiko Asako; Kentaro Hiraga; Tetsuya Okutani; Kouichi Yoshioka
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-12-29
Filing date: 1973-12-28
Publication date: 1974-07-11
Also published as: AU6403773A; CA1021327A; FR2223357B1; GB1460039A; AT332544B; NL7317827A; SU873888A3; ATA1072973A; NO139522C; SE402777C; CH608022A5; FR2223357A1; NO139522B; US4029883A; SE402777B

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHONWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING

5 KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 27. Dezember 1973 Kl/En

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27» Doshomachi 2-chome., Higashi-ku, Osaka (Japan)

Antibiotika

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Dehydroxylierung von Aminoglykosid-Antibiotika.

Bisher.wurden Aminoglykosid-Antibiotika häufig zur Behandlung von durch Mikroorganismen verursachten Infektionen verwendet. Im Verlauf der Verabreichung traten je-

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doch verschiedene, gegen die Antibiotika resistente Mikroorganismen auf.

Vor kurzem wurden mehrere Arbeiten veröffentlicht, aus welchen hervorgeht, daß Deoxyaminoglykosid-Antibiotika gegen diese, gegenüber Aminoglykosid-Antibiotika resistenten Mikro-Organismen wirksam sind.

In einer im Journal-of Antibiotics 2±_t 613-616 (1972) veröffentlichten Arbeit wird bezüglich der Dehydroxylierung von Aminoglykosid-Antibiotika berichtet, daß 3* ·^'-Dideoxyribostamycin aus Ribostamycin in neun Schritten mit einer Gesamtausbeute von höchstens I5 ^CJ> hergestellt wurde;

Journal of Antibiotics 24_, 274-275 (1971) berichtet, daß 3'-I^>e^oxy^Jcaimmycin durch Umsetzen von 6-Azido -2,4-di-0-benzyl~3,6-dideoxy-a-D-glucopyranosyl-chlorid mit 6-0-(2-0-Benzyl-3~d.©oxy-3-⁼^thoxycarbonylamido-4, 6-0-isopropylidena-D-glucopyranosyl)-N₉N^l-diäthoxycarbonyl-2-deoxystreptamin mit einer Ausbeute -von. etwa 25 $ erhalten wird.

-Aus der DT-OS 2 t35 I9I geht hervor, daß 3¹ _th'Dideoxykanamycin B hergestellt wirdj auch gemäß diesem Verfahren wird jedoch die gewünschte Verbindung nur mit einer Ausbeute von 20 $> .erhalten.

Gemäß der Offenbarung in den angeführten Literaturstellen sind daher die Gesamtausbeuten an den nach den dort beschriebenen Verfahren hergestellten Produkten weit niedriger als 25 #.

Es wurden umfangreiche Arbeiten unternommen, um ein wirksames Verfahren- zur Dehydroxylierung von Aminoglykosid-Antibiotika zu entwickeln, diese Arbeiten führten zur Entwicklung neuer Verfahren auf diesem Gebiet.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Dehydroxylierung von Aminoglykosid-Antibiotika.

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Ein veiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von dehydroxylierten Aminoglykosid-Antibiotika mit hoher Ausbeute.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen Verbindung, nämlich eines Halogen-dehydroxylierten Aminoglykosid-Antibiotikums, velches gegen Aminoglykosid-Antibiotika-resistente Mikroorganismen wirksam ist.

Zu den Arainoglykosid'-Antibiotika gehören solche vom Neomycin-Typ, welche in den Stellungen h und/oder 5 des 2-Deoxystreptamins Zucker aufweisen, wie z.B. Neomycine (z.B. Neomycin A, Neomycin B, Neomycin C, Neomycin LPb, Neomycin LPc), Paromomycine (z.B. Paromomycin I, Paromomycin II), Butirosine (z.B. Butirosin A, Butirosin B), Ribostamycin, Xylostasin, Lividomycine (z.B. Lividomycin A, Lividomycin B) oder Streptamine wie z.B. Hybrimycine (z.B. Hybrimycin A-, Hybrimycin A₂, Hybrimycin A„, Hybrimycin B-, Hybrimycin B₂, Hybrimycin B^), Aminoglykosid-Antibiotika vom Kanamycin-Typ, welche Zucker in den Stellungen h und 6 aufweisen, wie z.B. 2-Deoxystreptamin wie Kanamycine (z.B. Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C)₁ 3¹,^'-Dideoxykanamycin B, Gentamycine (z.B. Gentamycin G₁ , Gentamycin C₁, Gentamycin C₂, Gentamycin A, Gentamycin B, Gentamycin B₁, Gentamycin D), Tobramycin, Sisomycin, weiters Streptomycine wie Streptomycin, Streptomycin B, Dihydrostreptomycin), Hydroxystreptomycin, Bluensomycin und andere Arten wie z.B. Destomycine, z.B. Destomycin A, Destomycin B und Hygromycin B.

Unter dem Ausdruck "Deoxyaminoglykosid-Antibiotikum" ist eine Verbindung zu verstehen, welche durch Dehydroxylierung des als Ausgangsstoff eingesetzten Aminoglykosid-Antibiotikums hergestellt wird. Beispiele für die als Ausgangsstoffe verwendeten Aminoglykosid—Antibiotika sind Deoxyaminoglykosid-Antibiotika wie z.B. Montodeoxyaminoglykosid-und Dideoxyaminoglykosid-Antibiotika.

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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden" als Ausgangsstoffe durch Phosphorylierung hergestellte, phosphorylierte Aminoglykosid-Antibiotika eingesetzt.

Die Phosphorylierung der Aminoglykosid—Antibiotika wird z.B. durchgeführt, indem das Antibiotikum mit einer Kulturbrühe oder aus dieser hergestelltem und aufgearbeitetem Material, welches Phosphotransferase eines Mikroorganismus wie z.B. Pseudomonas aeruginosa oder Escherichia coli enthält, in Gegenwart eines Phosphat-donors in Berührung gebracht wird. .

Typische Beispiele für die Mikroorganismen sind Escherichia coli R11 (FERM-P 2123, ATCC-21990), Escherichia coli KI2 ML 1629 (Journal of Antibiotics ,2_f_, Nr. 1, 22-29 (1968)), Escherichia coli ML1401Rii1q (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, £, Nr. 3, 1*12-146 (1972)), Escherichia coli JR66/ ¥677 (FEBS LETTERS V±, Nr.5,293 (1971)) und Pseudomonas aeruginosa R3^R (fERM-P Nr-. 21 2**).

Der Mikroorganismus wird in einem Kulturmedium gezüchtet, welches Kohlenstoffquellen wie z.B. Glukose, Saccharose ,(Sucrose)und lösliche Stärke, Stickstoffquellen wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Aminosäuren, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumchlorid und anorganische Verbindungen wie Magnesiumchlorid und Natriumchlorid enthält. Die Kultivierung kann statisch oder unter aeroben Bedingungen und unter Rühren durchgeführt werden. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von 20 bis 40°C, vorzugsweise von 28 bis 37 C. Der pH-Wert des Mediums beträgt 6-9, vorzugsweise 6,8 - 7j8. Die Dauer der Kultur beträgt 2 _»- 72 Stunden, vorzugsweise 6-24 Stunden.

Die so erhaltene Kulturbrühe oder das daraus gewonnene Material, welches Phosphotransferase enthält, wird bei der Phosphorylierung der Aminoglykosid-Antibiotika eingesetzt. Unter dem gewonnenen Material.sind alle Materialien zu ver-

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stehen, welche nach Behandlung· der Kulturbrühe, z.B. nach - Filtrieren, Zentrifugieren, Schallbehandlung oder Desintegrierung in der FRENCH-Presse oder nach Enzymbehandlung durch Lyse der Kulturbrühe eine phosphorylierende Wirkung auf Aminoglykosid-Antibiotika aufweisen.

Die Phosphorylierung wird bei 15 - 80 C, vorzugsweise bei 30 - ^O C und bei einem pH-Wert von h - 11, vorzugsweise von 6 bis 10, und im allgemeinen innerhalb eines Zeitraumes von 10 min bis 48 Stunden, vorzugsweise 1-48 Stunden, durchgeführt. Die Konzentration des als Ausgangsmaterial eingesetzten Aminoglykosid-Antibiotikums im Reaktionssystem beträgt vorzugsweise 0,01 bis 100 mg/ml und die Kulturbrühe oder das aus ihr aufgearbeitete Material kann in Mengen, welche 1-50 Teile nasses Mycel pro 1000 Vol.-Teile Reaktionssystem enthalten, eingesetzt werden.

Dem Reaktionssystem können Phosphatspender, Reaktionsbeschleuniger und Enzymstabilisatoren zugegeben werden. Aber in manchen Fällen erfordert die Umsetzung nicht die Zugabe von Pbösphatdonoren, nämlich dann wenn die eingesetzten Zellen oder Mycelien selbst als Phosphatdonoren wirken.

Beispiele für Phosphatdonoren sind Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat, Deoxyadenosintriphosphat, Deoxyadenosindiphosphat, Cytidintriphosphat, Guanosintriphosphat und Uridintriphosphat. Beispiele für Reaktionsbeschleuniger sind Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Ammoniumchlorid, Lithiurachlorid, 2-Mercaptoäthanol, Dithiothreitol (Dithioerithrol) und Cystein.. Beispiele für Enzymstabilisatoren sind Mannitol, Sorbitol, Glycerol, Ammoniumsulfat, Sucrose.

Nach Bedarf können dem Reaktionssystem auch weitere Metallsalze wie z.B» Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Magnesiuniacetat, Manganchlorid, Cobaltchlorid und Zinkchlorid, Eisen(ll)Chlorid (FeCl ), Nickelchlorid (NiCl ) zugegeben werden.

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Durch, die Phosphorylierung werden eine oder mehrere Hydroxylgruppen der Aminoglykosid-Antibiotika phosphoryliert.

In der Folge wird die phosphorylierte Hydroxylgruppe manchmal als "Phosphonoxygruppe" "bezeichnet.

Die Stellungen der Phosphonoxygruppen variieren je nach der A_rt der Aminoglykosid-Antibiotika und den Phasphorylierungsbedingungen, vor allem Je nach der eingesetzten Phosphotransferase. Beispiele für Phosphonoxygruppen sind unsubstituierte Gruppen wie (-OP0_H_), und substituierte wie Nucleotidylphosphonoxygruppen {z.B. Adenosylphosphonoxy, Uridylphosphonoxy, 5^!-Inosinylphosphonoxy, 5'-Guanosylphosphonoxy), Alkylphosplionoxygruppen (z.B. Dimethylphosphonoxy, Diäthylphosphonoxy, Methylphosphonoxy, Äthylphosphonoxy).

Die Trennung der so erhaltenen phosphorylierten Amxnoglykosid-Antibiotika aus dem Reaktionsgemisch wird nach an sich bekannten Verfahren wie Extraktion, Ausfällen, Lyophilisieiroig und Sätilenchromatographie an einem lonenaustauscherharz, lonenaustauscherzellulose oder Aktivkohle vorgenommen.

-Das so phosphorylierte Aminoglykosid wird als Ausgangsstoff für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt und halogeniert. Bevor die Verbindung der Halogenierung unterworfen wird, empfiehlt es sich, alle ihre funktioneilen Gruppen wie Hydroxyl— oder Aminogruppen durch eine geeignete Schutzgruppe wie z.B. durch Silyl oder Acyl zu schützen, indem man das phosphorylierte Aminoglykosidantibiotikum mit z.B. einem Silylierungs- oder Acylierungsmittel umsetzt.·

Beispiele für das oben angeführten Silylierungsinittel sind Hexamethyldisilazan, Triraethylchlorosilan, Bis-(trimethylsilyl)-acetamid, Bis-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamid, Trimethylsilylacetaraidj. N-Methyl-N-trimethylsilylace'tainid, N-Triiaethylsilyliniidazol, N- (trimethylsilyl)diäthylamin oder Halogensilan (z .B.Diniethyldiclilörsilan) .

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Bei Verwendung eines Silylierungsrnittels muß die Reaktion nicht unbedingt in einem Lösungsmittel durchgeführt werden,es kann,jedoch ein aprotisches Lösungsmittel vie Benzol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril oder Hexamethylphosphoramid eingesetzt verden. Nach Bedarf kann die Reaktion auch durch Einsatz eines tertiären Amins, wie z.B. Triethylamin, Pyridin, Diisoprop3^rlmethylamin, Triäthylendiamin als Katalysator beschleunigt und verbessert werden.Die Silylierungsreaktion vird bei Temperaturen von -50 bis 200 C, vorzugsweise von 80 - I50 C, durchgeführt, sie kann jedoch auch bei Raumtemperatur erfolgen.

Die Menge des eingesetzten Silylierungsmittels soll zum Schutz der funkt ioneil en Gruppen wie z.B. von Hydroxyl, Amino- und Guanidinogruppen der Ausgangsverbindung ausreichen, es kann jedoch auch ein Überschuß an Silylierungsmittel eingesetzt verden.

Um alle funktioneilen Gruppen mit Acylgruppen zu schützen, wird die Ausgangsverbindung z.B. mit einem Säureanhydrid, Acetylchlorid, Benzoylchlorid, Benzyloxycarbonylchlorid od. dgl. umgesetzt.

Die Reaktion kann gegebenenfalls in Gegenwart einesLösungsmittels wie Pyridin, Collidin, Dimethylformamid, Acetonitril, Hexamethylphosphoramid durchgeführt werden. Nach Bedarf kann der Reaktionsverlauf durch Einsetzen einer Base als Katalysator beschleunigt verden. Beispiele für derartige Basen sind Triethylamin, Triethylendiamin oder Pyridin.Die Reaktion vird bei -50 bis 200 C, vorzugsweise bei 80 bis 15 0 ° C, durchge führt·.

Die Menge des eingesetzten Acylierungsmittels soll zum Schutz aller funktionellen Gruppen der Ausgangsverbindung ausreichen, es kann jedoch auch ein Überschuß an Acylierungsmittel vervendet werden.

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• Die oben angerührten Si Iy lie rungs- und Acylierimgsniittel können auch miteinander kombiniert oder eines nach dem anderen eingesetzt werden, um sie an die funktionellen Gruppen der Ausgangsverbindung zu bringen.

Die Halogenierungsreaktion wird durch Umsetzen des phosphorylierten und geschützten Aminoglykosids mit einem Halogenierungsmittel durchgeführt. Beispiele für Halogenierungsmittel sind Halogensilane, wie z.B. Trialkylsilylhalid (z.B. Trimethylsilylchlorid, Dimethyl-t-butylsilylchlorid, Trimethylsilylbromid, Dimethyldichlorsilan),Trimethylsilyljodid und Triarylsilylhalid (z.B. Triphenylsilylchlorid), Arylalkylsilylhalid (z.B. Phenyldimethylsilylchlorid, Methyldiphenylsilylchlorid), Trialkoxysilylchlorid (z.B.Trimethoxysilylchlorid, Triäthoxysilylchlorid), Thionylchlorid, Trimethoxymethylphosphoniumjodid, Phosphoroxychlorid, Phosphor— thiooxychlorid, Phosphorpentachlorid, Oxalylchlorid, Phosphorpentabromid u.dgl.

Das Halogenierungsmittel kann in äquimolaren Mengen zu der in der oben beschriebenen Reaktion erhaltenen Verbindung eingesetzt werden, es ist jedoch üblich, einen Überschuß davon zu verwenden. Es kann aber auch eine Mischung von Halogenierungsmittein. verwendet werden. Die Reaktion wird bei Temperaturen von -50 bis 200 C, insbesondere bei 80 bis 150 C durchgeführt, sie kann gegebenenfalls in Gegenwart eines aprotischen Lösungsmittels erfolgen. Beispiele für das aprotische Lösungsmittel sind Pyridin, Benzol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Hexamethylphosphoramid oder Acetonitril. Nach Bedarf kann der Verlauf der Reaktion durch Zugabe eines.Phosphine wie z.B.Triary!phosphin ( z.B. Triphenylphosphin), Trialkylphosphin (z.B. Tri-n-butylphosphin) oder eines Metallhalogenide wie z.B. Zinkchlorid, Lithiunichlorid, Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Titanchlorid, beschleunigt werden.

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Bei Einsatz der Halogensilane als Halogenierungsinittel ' -gehen der Schutz und die Halogenierung gleichzeitig vor sich.

Die Halogenierung geht besonders glatt vor sich, wenn das phosphorylierte Aminoglykosid- die folgende Strukturkonfiguration auf\ireist:

(i) die Phosphonoxygruppe ist an ein sekundäres Kohlenstoffatom gebunden^

(ii) die Kohlenstoffgruppe ist an ein Kohlenstoffatom mit einer primären oder sekundären Aminogruppe gebunden und

(iii) die Aminogruppe und die Phosphonoxygruppe stehen in Transkonfiguration zueinander,

oder wenn das phosphorylierte Aminoglykosid eine an ein primäres Kohlenstoffatom gebundene Phosphonoxygruppe aufweist. Beispiele für phosphorylierte Aminoglykoside sind Antibiotika vom Typ Neomycin mit Phosphonoxygruppen in den Stellungen 3' und/oder 5"? Antibiotika vom Kanamycin-Typ mit Phosphonoxygruppen in den Stellungen 3' und/oder 2^U~ und Antibiotika vom Streptomycin-Typ rait Phosphonoxygruppen in Stellung 3".

Die oben angeführten Erkenntnisse bezüglich der Halogenierung sind auf alle Aminozuckerverbisidungen anwendbar.

Das so erhaltene Halogendeoxyaminoglykosid ist eine neue Verbindung, welche sowohl als Zwischenprodukt zum Deoxyaminoglykosid als auch als wirksames Antibiotikum nicht nur gegen gewöhnliche Mikroorganismen sondern auch gegen Aminoglykosid-Antibiotika-resistente Mikroorganismen verwendet werden kann.

Das Halogendeoxyaminoglykosid wird, dann der Reduktion unterworfen, diese kann nach einem an sich bekannten Verfahren wie katalytisch^ Reduktion, elektrolytisch^ Reduktion, Reduktion unter Einsatz eines Reduktionsmittels oder Reduktion unter Verwendung einer Grignard-Verbindung vorgenommen werden.

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Wird eine katalytisch^ Hydrierung vorgenommen, so geht wan wie folgt vor; Das Halogendeoxyaminoglyko'sid wird in einem üblichen Lösungsmittel wie Wasser, Alkohol, Methanol, Äthanol, Isopropanol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid oder in einem Gemisch aus diesen Lösungsmitteln gelöst, dann wird in die Lösung Wasserstoffgas in Gegenwart eines Katalysators wie Raney-Nickel, Palladium auf Kohle, Palladiumbariumcarbonat, Platinoxid, Rhodiumkomplex, Raney-Kobalt, Raney-Eisen oder Raney-Kupfer eingeleitet. Diese Reaktion wird bei Temperaturen von -30 tiis I50 C, vorzugsweise von Raumtemperatur bis 100 C, durchgeführt. Die Reaktion kann bei Atmosphärendruck oder bei erhöhtem Druck von 5 bis 100 kg/cm vorgenommen werden. Die Reaktion kann beschleunigt und je nach der Art des eingesetzten AusgangSHiaterials durch. Zugabe einer geeigneten Base wie Triethylamin, Diäthylamim und Alkalimetallhydroxid kann die Ausbeute an dem gewünschten Produkt erhöht werden. Bei elektrolyt!sslxeir Reduktion wird das Ausgangsmaterial in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst xsjid. dann nach einem üblichen Verfahren vorgegangen. So z_eB. kann das Halogenoxyaminoglykosid in einem Lösungsmittel wie Wasser, Alkohol. (Methanol, Äthanol od.dgl.), Ammoniak, Dimethylformamid od. dgl. gelöst und die Reduktion unter Einsatz einer Elektrode mit niedriger Überspannung (2s.B. Platin, Wolfram od.dgl.) oder einer Elektrode mit hoher Überspannung (z.B. Blei,Zink, Quecksilber od.dgl.) durchgeführt werden. Manchmal werden bessere Ergebnisse erzielt, wenn der pH-Wert der Lösung im sauren Bereich eingestellt wird, z.B. auf Ferte von 2 bi s 3·

Wird die Reduktion mit einem Reduktionsmittel vorgenommen, so behandelt man das Halogendeoxyaminoglykosid mit einem Reduktionsmittel wie z.B. einem Metallhydrid (Lithiumalumiraiumhydrid, Natriumborhydrid, Tributylzinnhydrid od. dgl. ) _s einem Alkalimetall (Lithium,, Natrium od.dgl. ), einem

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Metallsalz (z.B. zweiwertigen Chromsalzen wie Chromchlorid, Chroraacetat od.dgl.),Zink oder Zinkamalgara in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol, t-Butanol_t Amylalkohol, Dimethylformamid, Dioxan, Tetrahj'drofuran, Dimethylsulfoxid, Äthylenglycol, Äthylendiamin, Diäthylentriamin usw. Das Verfahren wird bei Temperaturen von -30 bis I50 C, insbesondere bei solchen von Raumtemperatur bis SO C, durchgeführt.

Bei Einsatz einer Grignard-Verbindung geht man wie folgt vor: Das halogenierte Antibiotikum wird entweder wie es ist oder nach erfolgtem Schutz der■fraktionellen Gruppen mit metallischem Magnesium in einem bei Verwendung von Grignardverbindungen herkömmlichen Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Äther oder Dioxan gelöst, die entstandene Grignard-Verbindung wird mit Wasser, Methanol, Äthanol, n-Butanol od. dgl, bei Raumtemperatur oderi wenn nötig, unter Erhitzen zersetzt, wobei das Halogen durch Tiasserstoff ersetzt wird. Die Schutzgruppen können vor, während oder nach der Reduktion entfernt werden.

Die Entfernung der Silylgruppen kann leicht durch Inberührungbringen des Produktes mit einem Protonendonor wie Wasser, Alkohol{Methanol, Äthanol od.dgl.), Carbonsäure (Essig-, Propionsäure od.dgl.) oder Sulfonsäure (z.B. p-Toluolsulfonsäure) bewirkt werden. Die Acylgruppen. können auf einfache Weise durcli Hydrolysieren des Produktes mit einem Katalysator in Form einer Säure wie z.B. Salz-, Schwefelsäure od.dgl. oder einem Alkali wie Natriumhydroxid, Bariumhydroxid, Kaliumhydroxid od.dgl. entfernt werden.

In dem so hergestellten Deoxyaminoglykosid fällt die dehydroxylierte Stellung mit der Stellung der Phosphonoxygruppe der Ausgangsverbindung zusammen.

Einige der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Deoxyaminoglykosidantibiotika sind an sich bekannte Verbindungen, die nachstehend angeführten sind neue Verbindungen:

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3'-Deoxyneoinycin, z.B. 0~£_oc-2, 6-Diamino-2, 3» 6-trideoxy-D-glucopyranosyl 0 —* *0 ".Z 0-/Ö-£a-2, 6-Diamino-2, 6-dideoxy-L-idopyranosyl (1 —$- 3)} -B-D-ribofuranosyl (1—>5)_/ 2-deoxystreptfimin, 3'-Deoxyxylostasin, z.B. O-0-D-Xylofurnnosyl-(1 —> 5)-0-/. OC-2, 6~diamino-2, 3» 6-trideoxy-D-glticopyranosyl (1 —> 4)_y-2-deoxystreptamin, 3'-DeoxyJ'-i-bostaniycin, z.B. 0-ß-D-Ribofuranosyl (1 —^ 5)-0-/_ a-2 , 6-dianiino-2, 3, 6-trideoxy-D-glucopyranosyl (1 —^ 4) /-2-deoxystreptamin.

Abtrennung und Reinigung der gewünschten Deoxyaminoglykosidantibiotika können nach herkömmlichen Verfahren wie durch Extraktion, Ausfällen, Lyophilisieren oder Säulenchromatogra- " phie.an einem schwach sauren Ionenaustauscherharz vorgenommen werden. ·

Die Halogendeoxyaminoglykosidantibiotika und Deoxyarninoglykosidantibiotika besitzen beide im wesentlichen die gleiche antibakterielle Wix-ksamkeit wie die,entsprechenden Aminoglykosidantibiotika, sie sind ebenfalls wirksam gegen jene Bakterien, welche gegenüber den Aminoglykosidantibiotika resistent sind. Die so erhaltenen DeoxyaminoZuckerverbindungen sind daher, zur medikamentösen Behandlung von Tuberkulose, Dysenterie und Staphylokokken geeignet.

Die .Deoxyaminoglykosidantibiotika oder Halogendeoxyaminoglykosidantibiotika werden gewöhnlich in Form von Tabletten, Injektionen u.dgl. zusammen mit Hüllen in der täglichen Routinedosis von 1 bis 30 mg/kg (z.B. Menscli, Rindvieh, Schwein, · Ratten), verabreicht. Z.B. wird das 3' -Deoxyneomycin in Tablettenform in täglichen Routinedosen von etwa 4 mg/kg, 3¹-Deoxyxylostasin in Injektionsform in täglichen Routinedosen von etwa 20 mg/kg pro Säugetier und 3'-Deoxyribostamycin in Injetionsform in täglichen Routinedosen von etwa 20 mg/kg verabreicht.

In den nachstehenden Beispielen, welche zur näheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen, sind alle Teile

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Gewichtstoile, wenn nicht anders angeführt, und das Verhältnis zwischen "Teilen" und "Vol.-Teilen" entspricht jenem zwischen "Gramm" und "Milliliter». Die Ausdrücke M, N, °/o und UpM bedeuten Molkonzentration, Normalität .oder Äquivalenz-Konzentration, Prozent und Umdrehung pro Minute. Mit Amberlite bezeichnete Harze sind von Röhm und Haas Ltd., USA, vertriebene Handelsprodukte.

Bezugsbeispiel T:

In 250 Vol.-Teilen einer 0,5N wässerigen Bariumhydroxidlösung werden 5»Q Teile Butirosin A gelöst. Die Lösung wird 2 Stunden lang am Rückfluß gekocht, gekühlt und mit 1 N Schwefelsäure neutralisiert. Der entstandene Niederschlag von Bariumsulfat wird abzentrifugiert. Die überstehende Schicht wird über eine Säule mit 3OO Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50(nh.⁺-Form)(Röhm & Haas Co.)) geleitet, dann wird die Säule mit Wasser gewaschen und es wird mit 0,2N wässerigem Ammoniak eluiert. Die Xylostasin enthaltenden Fraktionen, welche auf dünnschichtchromatographischem Wege gesammelt werden, werden vereinigt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und lyophilisiert, man erhält 3»8 Teile Xylostasin in Form eines weißen Pulvers. Element aranaly se für C. „H-jH. O.

gefunden C 44,23 5»; H 7,53 fo', N 12,10 $

berechnet C 44,93 $>; H 7,j?4 <f₀; N 12,33 ^ .

Optische Rotation: /. «_/_ = + 34° (o = 1 in Kasser).

Die chemische Bezeichnung des Xylostasins ist O-ß-D-Xylofuranosyl-(1 —^ 5)-0~_/ (X-2, 6-diaraino-2, 6-dideoxy-D-glucopyranosyl(i —ν 4)_/-2-deoxystreptamin, es weist die folgende chemische Struktur auf:

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CH₂NH₂

BezufTsbeispiel 2: -

Ein flüssiges Medium (pH-Vert 7,2), welches 3 ^cjo PoIypepton (ein pankreatisches Caseindigest), welches von Daigo Nutritive Chemicals Ltd. vertrieben wird, 1 $ Fleischextrakt ₉ und 0,5 /o Natriumchlorid enthält, wird mit Bacillus sp.Y-399 beimpft, welcher unter der.Alezessionsnummer ATCC 21932 bei American Type Culture Collection in Maryland, USA, und beim FERM-P Kr,1^79 Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology in Chiba, Japan, deponiert wurde.

Die Kultivierung wird unter Schütteln bei 28°C 40 Stunden lang fortgesetzt. Mit dieser Saatkultur wird dann ein wässeriges Kulturmedium (30 000 Vol.-Teile, pH-Wert 7,5), welches 1 JO Glukose, 1 ^c/o Polypepton, 0,7 ^cß> Fleischextrakt und 0,5 /ö Magnesiumchlorid enthielt und in einen Tank eingebracht wird, beimpft, wobei der Tank einen Fassunffsraum von 50 Vol.-Teilen hat und die Impf masse 10 ^cJo beträgt. Die Kultivierung wird bei 28°C, 100 $ Belüftung und Rühren mit 200 UpM 66 Stunden lang fortgesetzt.

Der pH-Wert der entstandenen Fermentationsbrühe wird

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mit einer Gesättigten, wässerigen Oxalsäurelösung· auf 1 bis eingestellt, die Brühe wird mit einem Fi3terhilfsmittel (330 Teilen Hyflo-Super-Cel (Johns-Manville Products Co.)) filtriert. Der pH-Wert des Filtrats wird auf 7 eingestellt, das Filtrat wird über eine mit 2000 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 (NH. -Form)) gepackte Säule geleitet, dann wird der gegen Bacillus subtilis PCI 219 wirksame Wirkstoff an dem Ionenaustauscherharz adsorbiert. Das Harz wird erst mit Wasser gewaschen und dann mit 5 ^e/oxgem wässerigem Ammoniak eluiert. Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen (25OO Vol.-Teile) werden vereinigt und über eine mit Aktivkohle gefüllte Chromatographiesäule geleitet, um den Wirkstoff zu adsorbieren. Die Kohle-Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 0,3 N Salzsäure eluiert. Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, mit Anionenaustauscherharz (Amberlite IR 45 (Röhm & Haas Co., OH~-Form)) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Kon-zentrat wird lyophilisiert, man erhjilt 5,6 Teile eines rohen Pulvers, welches" etwa 3° ^cp Xylostasin enthält..

Das wie oben beschrieben erhaltene Rohprodukt (5, 6 Teile) wird in Wasser gelöst und an einer mit 100 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (Röhm & Haas Co., NH. -Form)) gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 0,2 N wässerigem Ammoniak eluiert. Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Drück eingeengt. Dann wurde dem Konzentrat das Zehnfache seines Volumens an Aceton zugegeben (Vol/ Vol) und der entstandene Niederschlag wird abfiltirert.-Man erhielt auf diese Weise 1,8 Teile eines blaßgelben Pulvers mit einem Xylostasingehalt von etwa 90 ^c/o. Dieses Pulver wird in Wasser gelöst und an einer mit 200 Vol.-Teilen Kationenaus-.tauscher (CM-Sephadex C-25 (NH^⁺-Form)) gefüllten Säule adsorbiert. Die Säule wird mit wässerigem Ammoniak nach dem Gra-Tiientelutionsverfahren (von 0 bis 1,7N) eluisiert, die den Wirk-

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stoff Xylostasin enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, man erhält 1,4i Teile Xylostasin in Form eines weißen Pulvers.

Beispiel 1:

Ein Gemisch aus 1,0 Teilen Xylostasin-3'-phosphatinonohydrat, dessen Herstellung in der Folge beschrieben wird, 0,7 TeilenTriphenylphosphin, 9 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 4 Vol.-Teilen Hexamethyldisiltfizan und 7,5 VoI»-Teilen Pyridin wird 43,5 Stunden lang auf 110°C erhitzt» Das Reaktionsgemisch wird unter Eiskühlung zu 200 VoI«-Teilen Methanol zugesetzt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dem Rückstand werden 200 Vol.-Teile destilliertes !fässer zugegeben. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert und in 100 Vol.-Teilen Äthylacetat gelöst, dann unter Schütteln in 100 Vol.-Teilen Wasser gewaschen. Die wässerige Schicht wird unter vermindertem Druck eingeengt und mit dem Filtrat versetzt. Das Gemisch wird dann über eine mit 185 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 (NH.⁺-Form)) gefüllte Säule geleitet. Die Säule wird mit I30 Vol.-Teilen Wasser gewaschen und mit 1000 Vol.-Teilen 1N Nil. OH eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 100 Vol.-Teile eingeengt und dann an einer mit 275'Vol.-Teilen Kationenaustaus&herharz -(-Amberlite CG-50 (NH. ⁺-Forn) ) gefüllten Säule adsorbiert.

Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann nach dem Linear-Gradientverfahren mit 1000 Vol.-Teilen destilliertem Wasser und 1000 Vol.-Teilen 0,3 N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Die 3'-Chlor-3^l-deoxyxylostasin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und lyophilisiert; man erhält 0,505 Teile 3^f-Chlor-3' -deoxyx3^rlostasin-Dihydrat.

Element ar analyse für C₁ _H_ooN,,0_oCl .2H_0

I 7 öj 4 6 2

berechnet C 40,T2; H 7,33; N 11,01; Cl 6,97 gefunden C 4O,O8; ₂H 7,29; N 10,73; Cl 6,55 Optische Rotation: /. α_/_D = +29,7° (c = 0_r6 in Wasser).

16 -

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Der durch Dünnschichtehronjatographie unter Einsatz einer Silikagelglasplatte (5721 Merck & Co,) ermittelte Rf-Tfert betrug O₁M, es wird ein Lösungsmittelsystem von "5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl :CH-OH:wässerigem Ammoniak: Wasser 4:3:2:1 und 3 Vol.-Teilen Methanol eingesetzt. Der Rf- ¥ert des als Kontrolle verwendeten freien Xylostasins beträgt 0,23.

Das Ausgangsmaterial Xylostasin-3'-phosphat wird durch Phosphorylieren mit einem Enzym aus Escherichia coli Nr.RII (FERM-P Nr.2123, ATCC-21990) erhalten.

200 Vol.-Teile eines wässerigen Saatkulturmediums mit einem pH-Wert von 7,2, welches 0,5 »/> Hefeextrakt, 0,5 # PoIypepton und 0,3 $ Fleischextrakt enthält, werden mit Escherichia coli R11 beimpft. Die Kultivierung wird unter Schütteln bei 37 C 16 Stunden lang fortgesetzt. Mit dieser Saatkultur wird ein Hauptkulturmedium (1800 Vol.-Teile, pH 7,2) mit der oben angeführten Zusammensetzung beimpft, die Kultivierung wird unter Schütteln bei 37 C 4 Stunden lang fortgesetzt. Die Kulturbrühe wird zentrifugiert, man erhält 4,4 Teile nasse Zellen. Die Zellen werden in 17,6 Vol.-Teilen 0,05>! Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert.

Die Suspension wird mit Überschall-Oszillatoren behandelt (KaiJo Denki Co.,Ltd. T-A-4201, 4230-Typ, 2A), um die Zellen zu desintegrieren, dann wird das unlösliche Material abzentrifugiert, man erhält 17 Vol.-Teile rohe Enzymlösung.

' 17 Vol.-Teilen der rohen Enzymlösung werden 5 Teile XyIostasin, 50 Vol.-Teile 0,5M Phosphatpuffer (pH 7,0), 100 VoI.-Teile 1M Adenosintriphosphatlösung, 50 Vol.-Teile 0,1M Magnesiuraäcetatlösung und 50 Vol.-Teile 0,IM 2-Mercaptoäthanol zugegeben, dieses Gemisch wird mit destilliertem Wasser auf 5OO Vol.-Teile aufgefüllt" und bei 37°C 2O Stunden lang der enzymatischen Umsetzung unterzogen.

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0 9 8 2 8/1118

Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang auf 80 C erhitzt, um die Reaktion zu beenden, dann wird zentrifugiert. Die überstehende Schicht wird über eine mit 900 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50(NHj,t-Forra) gefüllte Säule geleitet. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und es wird mit IN wässerigem Ammoniak eluiert, man erhält Fraktionen mit einem Gehalt an Xylqstasin-3'-phosphat. Die Fraktionen werden /gesammelt, eingeengt und über eine mit I50 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5O(NBY -Form) gefüllte Säule geleitet.

Die Säule wird mit Vassei/gevaschen und nach dem Linear-Gradient-Elu/'tions-Verfahren mit 1200 Vol.-Teilen destilliertem Wasser und 1200 Vol.-Teilen O,2N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Die XyIostasin-3*-phosphat enthaltenden Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, man erhält 4,4 Teile Xylostasin-3¹-phosphat-Monohydrat in Form eines weißen Pulvers. Elementaranalyse für C₁₇H₃ N^O₁₃P₄H₂O berechnet; G 36,96; H 6,75j N 10,14; P 5,61 gefunden; C 37,52; H 6₉73l N 9,, 78; P 5,41 Optische Rotation: /_ oc_/_D = + 40,0°(c = 0,6© in Wasser

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösung-smittelsystem von 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHC1.,:CH„OH: 28 °/o Ammoniak:H 0 (4:3:2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert betrug 0,55» der des zur Kontrolle eingesetzten, freien Xylostasins 0,23· ■

Das oben genannte Produkt wird zur genaueren Bestimmung der analytischen Werte acyliert, man erhält Tetra-N-acetylxylostasin-3'-phosphat-Dihydrat, welches einer Elementaranalyse unterworfen wird.
Elementaranalyse für C₃ H^ N^O₁ P.2H_£0

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	7,	70;	P	236.4999
N	7,		P	^;+,19
N		4,16

berechnet: C 4O,65; H 6,41;
gefunden: C 4o,95; H 6,52;

In 20 Vol.-Teilen Wasser werden 0,2 Teile 3'-Chlor-3'-deoxyxylostasin gelöst, dann werden 2,5 Teile Raneynickel und 0,3 Vol.-Teile Triethylamin zugegeben und das Gemisch wird im Vasserstoffstrom bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck geschüttelt. Nach 6 Stiinden wird der Katalysator abfiltriert, mit Wasser und I50 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak gut gewaschen, das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und auf etwa 20 Vol.-Teile eingeengt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat über eine mit 30 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH. -Form) gefüllte Säule geleitet. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 0 bis 0,5^ wässerigem Ammoniak nach dem Gradient-Elutions-Verfahren eluiert. Die 3^f-Deoxyxylo— stasin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt; man erhält 0,152 Teile 3¹—Deoxyxylostasin-Trihydrat.
•-El-ementaranalyse für C. _H_. N. 0_q.3H_?0 berechnet: C 41,54; H 8,18; -N 11,37 gefunden: C 41,23; H 7,95; N 11,08 Optische Drehung: /_ αJ- +28,0°(c = 0,61 in Wasser)

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Silikagelglasplatte (Merck 57^1) in einem Lösungsraittelsystem von 5 VoI-.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl_: CH OH: ■wässerigem Ammoniak:Wasser (4:3:2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert betrug 0,26, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Xylostasins 0,23.

'Beispiel 2:

. Ein Gemisch aus 0,3 Teilen Neomycin B-3'phosphat Pentahydrat, 2,7 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 1,2 Vol.-Teilen Hexamethyldisilazan, 2,25 Vol.-Teilen trockenem Pyridin und 0,21 Teilen Tripheny!phosphin wird auf einem Ölbad 44

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Stunden lang auf 115 C erhitzt. Nach beendeter Reaktion werden dem Reaktionsgeniisch unter Eiskühl-ang 30 Vol.-Teile Methanol zugegeben, dann wird es unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat werden 100 Vol.-Teile destilliertes Wasser zugegeben, die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert,dem Filtrat werden 100 Vol.-Teile Wasser und 100 Vol.-Teile Äthylacetat zugegeben, wonach es geschüttelt wird« Die -wässerige Schicht wird unter vermindertem Druck eingeengt, um das Äthylacetat zu entfernen. Die wässerige Schicht.wird über eine mit 90 VoIo-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 gefüllte Säule geleitet.

Die Säule wird rait 5OO VoI,-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 300 Vol.-Teilen 3N wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt, man' erhält 0,25 Teile Rohprodukt. Dieses wird in 50 VoI,-Teilen destilliertem Wasser gelöst und an 30 Vol.-Teilen eines Kationenaustauscherharzes (Amberlite CG-5OI (NHi- -Form) ) adsorbiert. Das Harz wird mit 100 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und nach dein Gradient-Elutions-Verfahren mit 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak fraktioniert« Das so erhaltene Rohprodukt wird nochmals an einem Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50(-NHK⁺-Form)) adsorbiert und das Harz mit 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Nach dem oben -beschriebenen Verfahren erhält man 0,195 Teile 3'-Chlor-3'-deoxyneomycin-B-Dihydrat.

Elementaranalyse für ^C ₂A A⁰I?⁰¹'²¹¹?⁰ berechnet: C 41,28; H 7,38; N 12,55; Cl .5,29 gefunden: C 41,03; H 7» 29; N 1.2,41 ; Cl 5,35

Der mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Merck 5721 Silikagelglasplatte in einem Lösungsmittel-System von CHC1„!Methanol:wässerigem Ammoniak:Wasser (1:4:2;1) ermittelte Rf-Wert betrug 0,47, der des zur Kontrolle eingesetzten, freien Neomycins B 0,29.

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Das Ausgangsmaterial Neomycin B-3'phosphat-Pentah^drat wurde wie in The Journal of Antibiotics,2J[,22 (I968) beschrieben, durch Einwirkung der rohen Enzymlösung von Escherichia coli K 12 ML I629 auf Neomycin.B hergestellt. Spezifische Drehung: /.α_/_^<'= +63,3°(c = 1,02 in HpO ) Elementaranalyse für Cp-Hi₇NrO₁^P.5HpO berechnet: C 35,20; H 7,32; N 10,70 gefunden: C 35,26; H 7,05; N 10,17 UV: keine spezifische Absorption

95S

Der durch DünnschichtChromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem von 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CKCl,,: CH^0H:wässerigem Ammoniak:Wasser (4t3:2:i) und 3 VoI„-Teilen Methanol ermittelte Rf«Wert betrug 0,35, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Neomycins B 0,11.

In 15 Vol.-Teilen Wasser wird 0,1 Teil 3'-ChIor-3'-deoxyneomycin B gelöst, durch Zugabe von 0,3 Vol.-Teilen Raney-Nickel und 0,5 VoI»-Teilen Triäthylamin wird ein Gemisch hergestellt und im Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur und Atmos phärendruck geschüttelt. Nach 4 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, gut mit 100 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak gewaschen, das Waschwasser mit dem Filtrat kombiniert und dann eingeengt. Nach diesem Verfahren erhält man 0,085 Teile Rohpulver. Das Rohprodukt wird in 20 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst und an einer mit 35 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5OI (NH. -Form)) gefüllten Säule adsorbiert, danach wird die Säule mit 0 bis Oj5N NH. OH nach dem Gradient-Elutions-Verfahren eluiert,das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiertj man erhält 0,00 Teile 3^!-Deoxyneomycin-B-Dihydrat. Elementaranalyse für C₀₀H. ^N--O₁ _ . 2H_0

23 ho ο 12 2

berechnet: C 43,52; H 7,94; N 13,24 gefunden: C 43,67; H 7,75; N 13,05

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0 9 8 2 8 / 1 1 1 8

Der durch DüxHischichtehromatographie vntor Verwendung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem aus einem Gemisch von CHCl., ^Methanol!wässerigem AmmoniaksVasser (Is4s2si) ermittelte Rf«Wert betrug 0.₉36, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Neomycins B 0,29·

Beispiel 3s

Ein Gemisch aus 0,1 Teilen Neomycin A-3'-phosphat-Trihydrat, 3 VoI «,-Teilen Trimethylsilylchlorid, 3 Vol.-Teilen Bis«= (trimethylsilyl)-acetamid und 3 Vol.-»Teilen trockenem Pyridin wird auf* einem Ölbad bei 130°C 15 Stunden lang erhitzt., Nach beendeter Realction wird dem Gemisch. Methanol unter Eiskühlung zug-egebexi itnd dann wird es unter vermindertem Druck eingeengt. Der" Rückstand wird in 50 VoI«,—Teilen destilliertem Wasser gelöst und die Lösung über eine m±t 50 VoI <,-Teilen KatioH.enat2St£iuscherharz (Amberlite IRC-=5Ö (NHj, -Form)) gefüllte Säule geleitet» Die Säule wird mit 100 VoI»-Teilen destilliertem ifesssr gewaschen und dann tait 200 VoI«-Teilen 0„5N wässerige!» Ammoniak elmiert, Das Elu&t wird unter vermindertem Druck auf 20 Vol₀°Teile konzentriert· Der pH-Wert des Konzentrates wird auf T₃ O eingestellt; dann wird es an einer mit 20 VoIo—Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH^ -Form)) gefüllten Säule adsorbiert.

Das Harz wird durch Elution mit O,O75N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Das so erhaltene Rohprodukt, wird wieder an einer mit 20 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH^⁺-Form)) gefüllten Säule adsorbiert und die Säule wird mit O,O75N wässerigem Ammoniak eluiert. Das gereinigte Produkt wird, lyophilisiert, man erhält O_sO35 Teile 3^!-Chlor-3' -deoxyneojiiycin-A.

Elementaranalyse für C_1?H_p„N. 0_C1₁

berechnet: G 42,29; H 7₈39? N I6_s44j Cl 1O_f4o gefunden? C 4i,9S; H 7,13; N 16,4O| Cl 10,12

NMR β ^2° s 5,47 (IH, d, J 1·,2·=3 Hz, C ^FP (

1«,2'=3 Hz, J 2·_β3'=1Τ Hz₉C 2'-H)

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Der mittels DünnschichtchrornatographiG unter Verwendung· einer Silikagelglasplatte (Chromagram 6o6O, Eastman Kodak) in einem Lösungsmittelsystem von 1 Vol.-Teil der überstehenden Schicht von CHCl^:Methanol:Wasser:wässerigem Ammoniak (2,0:1,5:0,5:1,0) und 1 Vol.-Teil Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,43t während jene des zur Kontrolle eingesetzten freien Neomycins A und des Neomycin-3'-phosphates 0,28 bzw. 0,21 betragen. ■

Um genauere analytische Werte des oben angeführten Produktes zu erhalten, wird es acyliert und silyliert, um Tetra-N-acetyl-tri-O-triinethylsxlyineomycxn A-3'-phosphat herzustellen, welches massenspektrometrisch untersucht wird. Charakteristische Peaks: 7II(M⁺-CH-)(Cl³⁷),

₃-^^_y, 491, 463,. ^5, ^19, 373, 355, 337, 299

Das Ausgangsmaterial A-3'-Phosphat-trihydrat wurde wde in The Journal of Antibiotics, 2±, Nr.1,22-29 (1968) beschrieben, durch Umsetzung der rohen Enzymlösung von Escherichia coli IC 12 MLI629 mif Neomycin A hergestellt. Elementaranalyse für C₁ _H_?(r0_oNrP. 3H„0 berechnet: C 31,65; H 7,0S; N 12,30; P 6,80 gefunden: C 31,78; H 7,22; N 12,09; P 6,81 Keine spezifische UV—Absorption

NMR(D O)Ss 3,1^(2'-H), 4O1(3'-H), 5, 78( 1H,d, J=4Hz, I-!!) IR^ Z^Z cm"¹: 965 £aJ/5⁷= +95,17 (c=1,01 in Wasser)

' In 10 Vol.-Teilen Wasser werden 0,15 Teile 3^!-Chlor-3'-deoxyneomycin-A gelöst, dann werden 1,8 Teile Raneynickel und 0,2 Teile Triäthylärain zugegeben und das Gemisch wird im Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck geschüttelt. Nach 5 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, gut mit 200 Vol.-Teilen 1N NH.OH gewaschen und das.Waschwasser mit dem Filtrat vereinigt und eingeengt. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert, das Filtrat an einer mit 30 ml

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Kationexmustauscherharz (Ainberlite CG-fjOX (^ -Form)) gefüllten Säule adsorbiert, mit Wasser gewaschen und mit 0,l bis 0,5N NHjOH nach dem Gradienten-Verfahren eluiert und gereinigt, man erhält 0,12 Teile 3'-Deoxyneomycin A-Monohydrat. Elementaranalyse für C₁₂II ^N,0„.H₃O
bereclmet: C hh₉h3; II 8,69ϊ Ν 17₃27 gefunden; C hh,12; H 8,53; N 16₉9S

Der mittels Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Chromagram 606, Eastman Kodak)- in einem Lösungsmittelsystem aus 5 VoI„-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl ;Methano1swässerigem Ammoniaks Wasser (4s3s2:i) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt O_s35„ jener des zur Kontrolle eingesetzten;, freien Neomycins A 0,3°·

Beispiel hi \

Ein Gemisch aus 0,15 Teilen Kanamycin-B-3'-phosphat-Trihydrat, 7,5 Vol.-Teilen Trimethylsilylchloridj 15,0 VoI „_: Teilen Hexamethyldisilazaix und 7»5 Völ.-Teilen trockenem Pyridin wird auf einem Ölbad IsL I30 C 62 Stunden lang erhitzt. "Nach beendeter Reaktion wird dem Reaktionsgemisch, unter Eiskühlung Methanol zugegeben, dann wird es unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Rückstand werden 1OO Vol.-Teile destilliertes !fässer zugegeben, dann wird das Gemisch über eine mit 200 VoI„-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 (NH. -Form)) gefüllte Säule geleitet. Die Säule wird mit 1000 Vol„~Teilen destilliertem Wasser.gewaschen und dann mit 1000 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak eluiert, Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, man. erhält 0,12 Teile RohprodLikt „ Dieses wird in 50 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst und an 3° Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (Uilf-Fonn)) adsorbiert. Das Harz wird mit 100 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und durch Elution nach dem Gradienten-Verfahren mit 0 bis 0,5 N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Das so erhaltene Rohprodukt wird weiter an Kationenaustauscherharz (Amberlite

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CG-50 (^I^ -Form)) adsorbiert; und das Harz wird wieder mit 0 - 0,5 N wässerigem Ammoniak eluiert. Das gereinigte Produkt wird lyopliilisiert. Nach dem oben angeführten Verfahren erhält man 0,0S2 Teile 3·-Chlor-3'-deoxykanamycin-B-Monohydrat.

Elementaranalyse für 0_1ΟΙΙ_ηΟΝ.,0_1Λ01.Η_ο0

ι -ο 3" 5 ι ο <£

berechnet: C 41,57; H 7,36; N 13,46; Cl 6,S1 gefunden: C 41,45; H 7,56;. N 12,88; Cl 6,64 Optische Drehung: JL Oi J^? +106,5° (c = 0,51 in Wasser)

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (5721 Merck) in einem Lösungsmittelsystem mit einem Gehalt von 1 Vol.-Teil der überstehenden Schicht von CHCl„iMethanol:Wasser!wässerigem Ammoniak (2,0: 1,5:0,5:1,0) und 1 Vol.-Teil Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,55» jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Kanamycins B und Kanamycin-B-3'-Phosphates 0,39 bzw. 0,25.

NMr£>°2°: 5,44 (iH,d,J_1S2,=3 Hz, C₁₁-H),

3,33 (ΐΗ,ς,^,'₂;=3Ηζ, J_2l)3r1OHz, ^Ο2'~^Η)

Um genauere analytische Daten zu erhalten, wird das oben angeführte Produkt acyliert und silyliert, um Penta-N-acetylpenta-O-trimethylsily!kanamycin B-3'-phosphat zu erhalten, welches dann inassenspelctrometrisch untersucht wird. Charakteristische Peaksϊ1O56(M-15), ΙΟ35 (Μ-3ό),1020 (M-51),

838, 810, 689, 6h5, 599, 420, 361,299

Das eingesetzte Ausgangsmaterial Kanamycin-B-3'-phosphat-Trihydrat wurde ähnlich wie in Applied Microbiology 16, Nr.9, 1276 (1968) beschrieben hergestellt, wobei man die rohe Enzymlösung von Pseudomonas aeruginosa R 3^R (FERM-P Nr.2124) auf Kanamycin B einwirken ließ.
Elementaranalyse für C^H _gN_0 P.3H 0 berechnet: C 35,00; H 7,13; N "11,34; P 5,01 gefunden: C 35,23; H 7,Ob; N 10,99; P 5,θ6 Optische Drehung: / <X_/~ 1^0 ^ / . _„ . ., \

^ö *- -'D = + 108,ό (c = O,53, an Wasser)

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NMR (£ in D_0): 4,36 (3'-H Quartett), 5,18 (1"-H, Doublett),

'5,78 (T-H, Doublett)

IRV^KBr cm"¹: 970 (Phosphat)
max

In einem Gemisch von 1 Vol.-Teil'Fässer und 1 Vol.-Teil Äthanol werden 0,03 Teile 3'-Chlor-3'-deoxykanaiaycin-B gelöst, dann werden 0,5 Vol.-Teile Raney-liickel zugegeben und das Gemisch wird im Ifasserstoff strom bei Raumtemperatur und AtmoSphärendruck geschüttelt. Nach 3 Stunden, wird der Katalysator abfiltriert, gut mit 50 Vol.-Teilen IN wässerigem Ammoniak gewaschen, das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und dann eingeengt. Dabei werden Q,O25 Teile eines Rohpulvers erhalten. Das Rohprodukt wird dann, an 5 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH. -Form)) adsorbiert und durch Elution nach dem Gradienten—Verfahren mit 0 bis 0,5N NHiOH gereinigt; man erhält 0,02 Teile 3^r-Deoxykanarayein B, dieses Produkt ist ident mit einer authentischen Probe *

Bei der Dünnschicht Chromatographie -srex-den z.B. die folgenden Rf-Werte ermittelt? . * 1.) E.Merck-Silikagelplatte (5721) (Glasträger) Lösungsmittel: die überstehende Schicht von' CHCl--Methanol-

17 fo ^

3·-Chlor-3'-deoxykanamycln B: 0,78
3'-Deoxykanamycin B: 0,7^

2.) Eastman Kodak Silicagelplatte (Chroraagram 6060) (Träger aus synthetischem Harz)
Lösungsmittel: die überstehende Schicht von CHC1„-Methanol-

konz.NH^OH-!fässer (2Οϊ53ϊ1Ο:5) 3^f-Chlor-3'-deoxykanamycin-Bs 0,64
3'-Deoxykanamycin-Bi 0,58
Optische Drehung; J_ OL-Z₁₃ = +123,2 (c = 1,085, in Wasser) Elementaranalyse für C₁ „H__N_0_o.2H„0

Io 37 jj 9 2

berechnet; C "42,93; H 8,20; K I3_S9O, gefunden: C 42,115 H 8,04; N 13„O5

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Die Retentionszeit für das entsprechende TrinethylsiIyI-derivat (Gaschromatographie) entspricht vollkommen jener einer authentischen Probe.

Beispiel 5?

Ein Gemisch aus 1,2 Teilen Kanamycin 33-3'-phosphat-Trihydrat, 0,8 Teilen Tripheny!phosphin, 10 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 4 Vol.-Teilen Hexamethyldisilazan und 4 Vol.-Teilen Pyridin wird 48 Stunden lang auf 130°C erhitzt. Das R_eaktionsgemisch wird unter Eiskühlung· in 200 Vol.-Teile Methanol eingebracht und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 3OO Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 120 VoI,-Teilen Methylendichlorid extrahiert. Die wässerigen Schichten verden gesammelt und das noch, verbliebene Methylendichlorid wird unter vermindertem Druck entfernt;. Die wässerige Schicht wird mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5OO Vol.-Teilen verdünnt, dann wird die Lösung über eine mit 400 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 (NH. Form)} gefüllte Säule geleitet. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und mit l400 Vol.-Teilen 11Ϊ wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf 3OO VoI.-Teile eingeengt und das Kosizeiatr^s ^iird über eine mit I60 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (KH. -Form)) gefüllte Kolonne geleitet.

Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und nach dem Gradienten-Verfahren mit 1200 Vol.-Teilen destilliertem Wasser und 1200 Vol.-Teilen 0,3N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, man erhält 0,755 Teile 3^f-Chlor-3^f-deoxykanamycin-B-Dihydrat.

^Siner Lösung von 0,053 Teilen 3'-Ghlor-3'-deoxykanamycin-B in 5 Vol.-Teilen Wasser werden 0,3 Vol.-Teile Raney-Nickel und 0,1 Vol.-Teil Triäthylamin zugegeben und die Mischung

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wird in strömendem Wasserstoff geschüttelt. Iiach M Stunden wix'd der Katalysator abfiltriert und mit 50 Vol.-Teilen 1N ':. -wässerigem Ammoniak gewaschen. Das Filtrat und das Wasehwasser werden miteinander vereinigt und konzentriert. Der Rückstand wird durch Chromatographie an einer Kationenaustauscherharzsäule (Amberlite CG-5OI (NH. ⁺-Form)) gereinigt, man erhält 0,033 Teile 3'-Deoxykanamyein-B,

Beispiel 6; * -

Ein Gemisch aus 0,63 Teilen Kanamycin B-3'-Phosphat-Trihydrat, 5 VoI,-Teilen Trimethylsilylchlorid, 2 Vol.-Teilen Hexamethyldisilazan, 2 Vol.-Teilen Pyridin, 0,4 Teilen Triphenylphosphin und 0, 1 Teil Zinkchlorid wird 48 Stunden lang auf 100 C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird auf ähnliche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben behandelt; man erhält 0,425 Teile 3'-Chlor-3'-deoxykanamycin-B

Einer Lösung von 0,1 Teil 3 ' -Chlor**· 3 ' -deoxykanamycin-B Vol.-

in 10/Teilen Wasser werden 0,3 Teile Palladium auf Kohle (i ^f/o) zugegeben. Das System wird im Wasserstoff strom gerührt. Nach 5 Stunden wird der Katalysator abfiltriert und mit 50 Vol.-Teilen 0,5N Salzsäure gewaschen. Das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und die vereinigte Lösung wird auf ein Drittel ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und dann mit IN wässerigem Ammoniak neutralisiert.

Die neutralisierte Lösung wird zuerst mit dem Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-.pO(NH.⁺-Forra) ) entsalzt und dann in einer Kolonne, die I5 Vol.-Teile Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5OI (NH^⁺-Form)) enthielt, gereinigt. Es werden 0,064 Teile 3'-Deoxykanamycin-B erhalten.

Beispiel 7: ■

Ein Gemisch aus 0,3 Teilen ParoraoPmyein Z-3¹-»phosphat-Tetrahydrat, 2,7 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 1,2 Vol.-. Teilen Hexamethyldisilazan, 2,25 Vol.-Teilen trockenem Pyridin

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8/1118

und 0,21 Teilen Triphenylphosphin wird U8 Stunden lang bei 110 C auf einem Ölbad erhitzt. Nach beendeter Reaktion wird das Reaktionsgemisch unter Eiskühlung in 3° Vol.-Teile Methanol gegossen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Rückstand werden 100 Vol.-Teile destilliertes Wasser zugegeben, der entstandene Niederschlag wird gesammelt und mit 100. Vol.-Teilen Äthylacetat extrahiert. Die wässerige Schicht wird unter vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte wässerige Schicht wird über eine mit 90 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50 (NH. -Form)) gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird mit 500 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 3°0 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak eluiert.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand in 50 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst und dann über eine mit 3Ö Vol.—Teilen Kationenaustauscherharz

(Amberlite CG-5OI (NH^⁺-Form)) gefüllte Kolonne geleitet.

Die Kolonne wird mit 100 Vol.-Teilen destilliertem !fässer gewaschen und durch Elution nach dem Gradienten-Verfahren mit 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak fraktioniert.

Das so erhaltene Rohprodukt wird an Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NHi -Form)) adsorbiert und das Harz mit 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak eluiert. Die 3'-Chlor-3^ldeoxyparomomycin I enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, das Konzentrat wird lyophilisiert, man erhält 0,202 Teile 3'-Chlor-3'deoxyparoraoraycin X Dihydrat.

Elementaranalyse für C H. .N 0 Cl.2HO berechnet: C 41,22; H 7,22; N 10,45; Cl 5,29 gefunden: C 40,97; H 7,09; N 10,73; Cl 5,03 TLC Rf-¥ert: 0,55 (PlattejArt 5721)
Paromomycin I: 0_fh^.

Als Entwickler wird eine Lösung aus CHCl :Methanoljwässe-

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rigem Ammoniak:!fässer im Verhältnis 1:/li2:1 eingesetzt.

Das als Ausgangsinaterial verwendete Paromomycin I 3'-phosphat-Tetrahydrat wurde auf ähnliche ¥eise wie in The Journal of Antibiotics, 21, 22 (196S) beschrieben eingesetzt, und zwar unter Einwirkung der rohen Enzymlösung von Escherichia coli K.12ML auf Paromomycin I.

Elenientaranalyse. für- C H_; /Ν,Ο^ΡΛΚ Ο berechnet: C 35,98; H 7,09; N 9,12 gefunden: C 35,S5; H 7,02; N 8,85 Optische Drehung J_ α_/_D = +59,3° (c = 1,01 in Wasser) Keine spezifische UV-Absorption

cm"¹: 96Ο
max

Der durch Dünnschichtchroniatographie unter Ven/endung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem aus 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl,,: Hethanol:wässerigera Ammoniak:Wasser (4:3:2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert betrug 0,46, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Paromomycins I 0,19·

In 20 Vol.-Teilen Wasser v/erden 0,1 Teile 3'-Chlor-3·- deoxyparomomycin-I gelöst, dann wird das System unter Zugabe von 0,3 Vol.-Teilen Raney-Nikcle und 0,5 Vol.-Teilen Triäthylamin in strömendem Wasserstoff bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck geschüttelt. Nach h Stunden wird der Katalysator abfiltriert, gut mit 100 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak gewaschen, das Waschwasser wird mit dem Filtrat vereinigt und zur Trockene eingeengt. Nach diesem Verfahren erhält man O,O91 Teile Rohpulver. Das Rohprodukt wird in 20 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst, die wässerige Lösung wird dann über eine mit 35 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5OI (NH.⁺-Form)) gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird mit 0 bis 0,5N wässerigem Ammonis.k nach dem Gradienten-Verfahren eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, man .erhält 0,07 Teile

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409828/1118

7364999

Si

3 · -Deoxypiiromomycin-I-Dihydrat.

Elementaranalyse für C„ IL „Ν,.0.' ,2H-O berechnet: C 43,^5; H 7,76; N 11,01 gefunden; C 43,29; H 7,65; N 10,91 DünnschichtChromatographie:

Rf-Vert: 0,47 (Platte 5721 Merck)

Kontrolle, Paroinomycin 1: 0,41 ·

Als Entwickler wird ein Gemisch aus CHCl :Methanol: wässerigem Ammoniak:Wasser = 1:4:2:1 eingesetzt.

Beispiel 8:

Ein Gemisch aus 0,6 Teilen Ribostamycin-5"-phosphat-Dihydrat, 0,6 Teilen Triphenylphosphin, 5 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 2 Vol.-Teilen Hexamethyldisilazan, 2 Vol.-Teilen trockenem Pyridin und 0,3 Teilen Zinkchlorid wird 413 Stunden lang auf 110 C erhitzt. Nach beendeter Reaktion werden dem Reaktionsgemisch unter Eiskühlung 15° Vol.-Teile Methanol zugegeben, dann wird es unter vermindertem Druck _t zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit I50 VoI.-Teilen destilliertem Wasser und I50 Vol.-Teilen Athylacetat geschüttelt. Die wässerige Schicht wird über eine mit Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite IRC-50(NH.⁺- Forra)) gefüllte Säule geleitet. Die Kolonne wird mit I5OO Vol.-Teilen destilliex'tem Wasser gewaschen und dann mit 1200 Vol.-Teilen IN wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 30° VoI,-Teile eingeengt und über eine mit 165 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH^⁺-Form)) gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird gewaschen und mit 1000 Vol.-Teilen destilliertem Wasser und 1000 VoI.-Teilen 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak nach dem Gradienten-Verfahren eluiert_c

Die erhaltenen Fraktionen werden gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt und lyophilisiert, man erhält 0,24γ Teile 5"-Chlor-5"-deoxyribostamyein-Monohydrat.

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Λ 0 9 8 2 8 / 1 1 1 S

7364999

Elenientaranalyse für C H NrO-ClJLO · . > ' berechnet: C 41,59; H 7,18; N 11,4i; Cl 7,22 gefunden: C 41,43; H 7,35; N 11,25; Cl 7,03

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in feinem Lösungsmittelsystem von 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl :Methanol:wasserigem Ammoniak:Wasser (4:3:2:i) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,31, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,24.

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Ribostämycin-5"-phosphat-Dihydrat wird auf ähnliche Weise wie in Applied Microbiology, 16, 1276 (1968) beschrieben hergestellt und zwar unter Einwirkung der rohen Enzymlösung von Pseudomonas laeruginosa R34R (fERM-P Nr.2124) auf Ribostamycin.

Elementaranalyse für C H „N.O. Ρ.2Η_0

berechnet:

C

35,

79;

H

6,

89;

N

9,

82;

P

5,

43

gefunden:

C

35,

79;

H

6,

87;

N

9,

82;

P

5,

10

Keine spezifische UV-Absorption. ₍

Optische Drehung: /_ 0i_/ = + 33,3° (c = Ο,6θΟ in Wasser) IR-O ^KBr cm"¹: 962.

^v max .

Der durch Dünnschicht Chromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem aus 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHC1_: Methanol:wässerigem Ammoniak:Wasser (4:3:2:1) und 3 VoI.-Teilen Methanol ermittelte Rf-¥ert betrug 0,25, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,24. '

Tetra-N-acetylribostamycin-5"-phosphat-Dihydrat Elementaranalyse für. C H N^O P.2HO

berechnet:	C	39,	6S;	H	6,	53;	N	7,	40;	P	4,09
gefunden:	C	39,	20;	H	6,	52;	N	7,	29;	P	4,07

In 15 Vol.-Teilen Wasser werden 0,1^ Teile 5"-Chlor-5"-

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deoxyribostamycin gelöst, dann wird das Syotöm leiter Zugabe von 2 VoI,-Teilen Baney-Nickel und 0,25 Vol.-Teilen Tri-Kthylamin im Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck geschüttelt. Nach 7 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, gut mit I50 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak gewaschen, das Waschwasser wird rait dem Filtrat vereinigt und auf etwa I5 Vol.-Teile eingeengt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird dann über eine mit 30 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH^⁺-Form)) gefüllte Kolonne geleitet, diese wird mit Fässer gewaschen und mit 0 bis O,3N" NH. OH nach dem Gradienten-Verfahren eluiert.

Die erhaltenen Fraktionen werden kombiniert und unter vermindertem Druck eingeengt, man erhält O,081 Teile 5"-Deoxj^ribostamycin-Dihydrat. ' .

Elementaranalyse für C₁₇H-.0 N. .2H 0 berechnet: C ^3,O3j H 8,07; N 11,81 gefunden: C ^3,07; H 7,89; N 11,51

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Einsatz einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem- aus 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl :Methanol:wässerigem Ammoniak:Wasser (4:3*2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,32, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,2**.
NMR(D₂O) Sppm: 1,49 (3H,d,J=5Hz, -CH).

Beispiel 9t

Ein Gemisch aus 0,5 Teilen Ribostamycin-3'-phosphat-Trihydrat, 2,7 Vol.-Teilen Trimethylsilylchlorid, 1,2 VoI.-Teilen Hexamethyldisilazan, 2,25 Vol.-Teilen trockenem Pyridin und 0,21 Teilen Triphenylphosphin wird auf einem Ölbad hk Stunden lang auf 100 bis 110°C erhitzt. Nach beendeter Reaktion werden dem R_eaktionsgeniisch unter Eiskühlung

- 33 409828/1118

. 236Λ999

30" Vol.-Teile Methanol zugegeben, dann wird es unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit 100 VoI,-Teilen destilliertem Wasser und 100 Vol.-Teilen Äthylacetat geschüttelt. Die wässerige Schicht wird eingeengt und über eine mit 90 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite ' IRC-50 (NHr⁺-FoCTn)) gefüllte Kolonne geleitet. Die Kolonne wird mit 500 VoI.-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und dann mit 3OO Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird unter, vermindertem Druck zur Trockene eingeengt, wobei, 0,239 Teile Rohprodukt erhalten werden. Dieses wird in 50 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst und über eine mit 30 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5OI (NH^-Form)) gefüllte Kolonne geleitet.

Die Kolonne wird mit 100 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gewaschen und durch Elution nach dem Gradienten-Verfahren mit 0 bis 0,3N wässerigem Ammoniak fraktioniert. Das so erhaltene Rohprodukt wird über eine mit 20 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-50 (NH. -Form)) ge- . füllte Kolonne geleitet. Die erhaltenen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert; man erhält 3'-Chlor-3'-deoxyribostamycin-Monohydrat. ElementaranaIyse für C.JL NrO_gCl.H 0 , berechnet: C 41,59; H 7,18; N 11,41; Cl 7,22 gefunden: C 4i,63; H 7,10; N 11,35; Ql 7,01 Optische Drehung / ^a-Jr\ ~ +36, S° (c = 0,38 in Wasser)

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsystem aus 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl- :Methanol:wässerigem Ammoniak:Wasser (4:3:2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,29, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,24.

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Ribostamycin—3'— phosphat-Trihydrat wurde ähnlich dem in The Journal of

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Antibiotics 2Ά_, 22 (1968) beschriebenen Verfahren, uud zwar durch Einwir-kung einer rohen Enzyinlosung von Escherichia coli JR66/17677 auf Ribostamycin, hergestellt.

Elementaranalyse für C H N₂O₁„P.3H_o0 berechnet: C 3^,69; H 7,02; N 9,52; P 5,26 gefunden: C 34,79; H 6,86; N 9,31; P 5,05 Keine spezifische UV-Absorption

Optische Drehtang: J_ OL_J~ = +46,8 (c=O,635 in !fässer) -™ >v 7KBr -1 _o „ „

IR V cm : 955

^K max - ^JJ

Der durch Dünnschichtchromatographie unter Einsatz einet*. Silikagelglasplatte (Merck 5721) in einem Lösungsmittelsytem von 5 VoI»-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl : Methanol:vässerigera Ammoniak:Wasser (4:3:2:1) und 3 Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,56, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,24. Tetra-N-acetylribostamycin-3'phosphat-Dihydrat

25^H43 4°i^r	C	2H₂O	65;	H	6,	41;	N	7,	59;	P.	4,19
berechnet:	C	40,	84; '	H	6,	46;	N	7,	79;	P	4,30
gefunden:	40,

In 15 Vol.-Teilen Wasser werden 0,1 Teile 3'-Deoxy-3'-chlorribostamycin gelöst, das System wird unter Durchströmen von Wasserstoff bei Raumtemperatur und Atmosphärendruclc geschüttelt. Nach 4 Stunden wird der Katalysator abfiltriert, gut mit 100 Vol.-Teilen 1N wässerigem Ammoniak gewaschen, das Waschvasser wird mit dem Filtrat vereinigt und eingeengt. Man erhält nach diesem Verfahren 0,09 Teile Rohpulver. Das Rohprodukt wird in 20 Vol.-Teilen destilliertem Wasser gelöst, an 35 Vol.-Teilen Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-5OI (NHiJ -Form)) adsorbiert und nach dem Gradienten-Verfahren mit Ο bis 0,5N NH₄OH eluiert.

Die entstandenen Fraktionen werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert, man erhält O,O68 Teile 3'-DeoJcyribostamycin-Monohydrat.

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Eletnentaranalyse fur C. „II ^ Nj O₀ .H O

berechnet: C ^,72; II 7,9²M N 12,27 gerunden: C 44,51;· II 8,08; N 12,19

Optische Drehung: / OL J~^V= + 30,2° (o = O,6O5 in !fässer)

Dei" durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer Silikagelglasplatte (Nerck 5721) in einem Lösungsmittelsystem aus 5 Vol.-Teilen der überstehenden Schicht von CHCl :Methanolrwässerigem Ammoniak:Fässer (4:3*2:1) und 3 Vol.-Teilen Methanol ermittelte Rf-Wert beträgt 0,29, jener des zur Kontrolle eingesetzten, freien Ribostamycins 0,24.

0 Figuren
20 Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche ;

1. Verfalxren zur Herstellung von Deoxyaminoglykosid-Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß die funktioneilen Gruppen eines phosphorylierten Aminoglykosid-Antibiotikums geschützt werden, daß die dabei erhaltene Verbindung halogeniert und diese Verbindung reduziert wird und die Schutzgruppen durch Inberührungbringen der halogenierten oder reduzierten Verbindung mit einem protonenliefernden Mittel entfernt werden. .

2. Verfahren nach Anspruch T₁ dadurch gekennzeichnet, daß ein phosphoryliertes Aminoglykosid-Antibiotikum mit folgender Strukturkonfiguration eingesetzt wird:

(i) die Phosphonoxygruppe ist an ein sekundäres Kohlenstoffatom gebunden,

(ii) dieses Kohlenstoffatom ist an ein Kohlenstoffatom, welches eine primäre oder sekundäre Aminogruppe trägt, gebunden und

(iii) die Aminogruppe und die Phosphonoxygruppe stehen in Transkonfiguration zueinaner, oder das Antibiotikum weist eine an ein primäres Kohlenstoffatom gebundene Phosphonoxygruppe auf.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schutz der funktionellen Gruppen und die Halogenierung durch Umsetzung des phosphorylierten Aminoglykosid-Antibiotikums mit einem Halogensilan durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schutz der funktionellen Gruppen und die Halogenierung durch Umsetzung des phosphorylierten Aminoglykosid-Antibiotikums mit Trimethylsilylchlorid und Hexamethyldisiläzan durchgeführt werden.

5« Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schutz der funktionellen Gruppen und die Halogenierung durch Umsetzung des phosphorylierten Aminoglykosid-

- 37 -

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Antibiotikums mit Trimethylsilylchloi-IdL ur,d Isis,-(Tr ine thy I-sllyl)-acetamid" durchgeführt werden.

6. Verfahren, nach Anspruch I₅ dadurch gekennzeichnet, daß der Schute der funktionellen Gruppen durch Umsetzung des phosphorylierten Äniinoglykosid-Antibiotikums mit einem · Silylierungsinittel durchgeführt wird»

7- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion auf katalytischem Wege vorgenommen tfird.

So Verfahren nach Anspruch 2₉ dadurch gekennzeichnet, daß als phosphoryliertes Aminoglykosid-Axitibiotikum ein solches vom Typ 3^!-tind/oder 5""Phosphonoxy-neomycin eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2_S dadurch gekennzeichnet, daß als phosphoryliertes Aminoglykosid-Antibiotikum ein solches vom Typ 3^s-und/oder 2" Phosphonoxy-kanamycin eingesetzt wird.

10. Halogeniert es Aminoglylcosid-Antibiotikunig dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Strukturkonfiguration aufweist;

(i) das Halogenatom ist an"ein sekundäres Kohlenstoffatom gebunden,

(ii) das Kohlenstoffatom ist an ein Kohlenstoffatom, welches eine primäre oder sekundäre Aminogruppe trägt, gebunden oder das Antibiotikum weist ein Halogenatom auf, welches an ein primäres Kohlenstoffatom gebunden ist.

11. 3'-Chlor-3¹-deoxyxylostasin.

12. 3"'-Chlor-3 ' -deoxyneomycin.Bo 13· 3'-Chlor-3'-deoxyneomycin A₉ Ik. 3'-Chlor-3'-deoxykanamycin B. 15· 3'-Chlor-3'deoxyparomomycino

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16. 5"-Clilor-5"-d.eoxyribostamycin, 17· 3 ' -Chlor-3 ' -deoxyribostainycln. 18. 3'-Deoxyxylostasin. 19· 3 ' -Deoxynconiycin B. 20. 3'-Deoxyribostamycin.

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