DE2336751A1

DE2336751A1 - Neue zusammensetzungen fuer die lokalisation von tiefliegenden gefaessthromben mit radioaktivem spuerstoff

Info

Publication number: DE2336751A1
Application number: DE19732336751
Authority: DE
Inventors: Mary Ann Dugan
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1972-08-21
Filing date: 1973-07-19
Publication date: 1974-02-28
Also published as: JPS4965890A; GB1432878A; FR2196788A1; US3812245A; BE802052A; FR2196788B1; JPS5346915B2; NL7309907A

Description

Patentanwalt· Dr.-Ing. Wilhelm Reichel Dipl-Ing. Wolf gang Reichel _ _ _ _ _ _ _Λ

6 Frankfurt a. M. 1 2336751

PatkBtrafie 13

.. . 74-59

Research Corporation, New York, USA

Heue Zusammensetzungen für die Lokalisation von tiefliegenden

Gefäßthromhen mit radioaktivem Spürstoff

Die Erfindung "betrifft radioaktiv markierte thrombolytische Enzyme.

Die Lokalisation von Thrombusembolie im Gefäßsystem ist lange als ein Problem angesehen worden, dessen schnelle und gute Lösung wünschenswert wäre. Eins der angewendeten Verfahren war die Injektion von radioaktiven Spürstoffmaterialien in den allgemeinen Blutkreislauf (Griep, Radiology, 97, 311» 1970). In dieser Arbeit wurden radioaktive Isotope durch das System verfolgt, von dem man glaubte, daß sich in ihm die Embolie befände. Da die Lokalisation des Gefäßsystems im menschlichen Körper sehr gut bekannt ist, zeigt die Blockierung des Flusses des radioaktiven Spürstoffes den Ort der Okklusion an. Dieses Verfahren erlaubt jedoch nicht die schnelle und genaue Lokali-

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sierung der Embolien. Mit . J markiertes Fibrinogen ist zum. nachweis von Thromben angewendet worden (Flanc, et al, Brit.J. Surg. 55, 742, 1968 and.O'Brien, Lancet, 32£, 1970). Unglücklicherweise kann Fibrinogen nicht in einem bestehenden Thrombus inkorporiert oder in diesen hineingezogen werden, wodurch die Konzentration der nachweisbaren Radioaktivität begrenzt ist· Es wäre daher wünschenswert, ein physiologisch aufnehmbares Material zu markieren, das von der Thrombusembolie angezogen und dort inkorporiert wird und so die Ursache für eine hohe Konzentration der Radioaktivität an dieser Stelle is.t. Es wäre

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damit gleichzeitig notwendig, ein markierendes Isotop mit einem hohen Photonenfluß innerhalb verträglicher Dosisgrenzen für die vom Patienten absorbierte Strahlung zu verwenden, das eine Halbwertslebenszeit aufweist, die hinreichend ist, um eine Zirkulation durch das Gefäßsystem zu gestatten·

Unter den Radioisotopen, die die oben angegebenen Kriterien erfüllen, sind J und ^yymTc zu nennen_o Ohne Frage ist ^y^^mSc das wünschenswerteste dieser radioaktiven Isotope. Wegen seiner kurzen physikalischen Halbwertszeit liefert es größere Mengen an Radioaktivität (i.e. 15 mC im Tergleich zu 300 /a C für J), wodurch der Photonenfluß gesteigert wird, während ein Strahlungsniveau aufrecht erhalten bleibt, das sicher von einem Patienten absorbiert werden kann.

In jüngster Zeit ist viel auf dem Gebiet der Inkorporation

QQm
von Tc in menschliches Serumalbumin, welches ein Protein ist, gearbeitet worden. Die auf diesem Gebiet angegebene Arbeit zeigt, daß die Reaktionsbedingungen für die Markierung

QQm von menschlichem Serumalbumin mit ^ Te äußerst empfindlich ist. Vorsicht muß walten gelassen werden, um Bedingungen zu vermeiden, die einerseits zur Denaturation des Proteins führen und die andererseits zur Absorption eines wesent-.liehen Anteils des radioaktiven Isotops an Nebenprodukten der Reaktion wie z.B. kolloidalem Stannohydroxid führen. Die Probleine bei diesen Arbeiten sind bei Eckelman, et al., Journal of Nuclear Medicine, 12, 707, 1971; Mn, et al., J. ITucl. Med., 12, 204, 1971 erwähnt; all diese Autoren haben gezeigt, daß der Anteil an Zinndichlorid als reduzierendes Mittel für den Erfolg der Kupplung oder Verbindung des radioaktiven Isotopes ait dem Protein kritisch ist.

Eckelman bestätigt die Ergebnisse von Richards, Jap. Hucl. Lied., 7, 165, 1968, daß das Entfernen von Stannohyaroxid, das sich während der Reaktion gebildet hat, im hohen Grade vorteilhaft ist, da offenbar ein gewisser Seil des radioaktiven

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Isotops an oder in des kolloidalen Stannohydroxid okkludiert ist. Eckelman schlägt vor, daß die optimalen Bedingungen für die Markierung menschlichen Serumalbumins die Behandlung des Serumalbumins mit Zinndichlorid, das Einstellen des pH-Wertes zwischen pH 2 und pH6, das Entfernen jeglichen ungebundenen ZinndiChlorids oder Stannohydroxidsund das anschließende Zugeben des Pertechnetates enthält.

Die Erfindung kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:

QQm Streptokinase und Urokinase werden kovalent mit Ic markiert. Bei dem Verfahren zur Herstellung dieser markierten Enzyme wird eine Lösung aus le-Pertechnetat zu dem geeigneten Enzym hinzugegeben und mit frisch hergestelltem Zinndichlorid in verdünnter Salzsäure "behandelt. Die Reaktionsmischung wird auf einen pH-Wert, der größer als 7 ist, gepuffert, kann einige Minuten reagieren, und die nicht umgesetzten Anionen werden entfernt, was geeigneterweise durch Hindurchleiten durch eine Anionenaustauschsäule geschieht.

Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Ausgangsmaterial zwischen 5000 und 250 000 internationalen Einheiten (weiterhin 5 "bis 250 Eiu genannt) .Streptokinase oder Urokinase verwendet. Streptokinase wird im allgemeinen bevorzugt, weil es leichter erhältlich ist. Zu' diesem Ausgangsmaterial wird ^y Sechnatiuia-Pertechnetat hinzugegeben. Uabei wird eine Menge hinzugegeben, die einer Anfangsradioaktivität von etwa 15 bis etwa 20 mC entspricht. Der Grad der Verdünnung des Pertechnetates ist nicht kritisch, jedoch wird im allgemeinen bevorzugt, eine wässrige Lösung, die etwa 5 bis etwa 10 pro ial enthält, zu verwenden.

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BAD ORIGINAL

Zu dieser Mischung aus Enzym und Pertechnetat wird frisch hergestelltes Zinndichloride in verdünnter wässriger Salzsäure hinzugegeben. Es kann zwischen 0,1 bis etwa 4 mg Zinndichlorid in 1 ml und zwischen 0,1 H und 23J HGl verwendet werden· Es wird im allgemeinen jedoch bevorzugt, etwa 0,1 bis etwa 0,5 mg Zinndichlorid in etwa 0,1 bis etwa 0,5 IT HCl zu verwenden. Zu dieser Mischung wird ein alkalisierendes Puffermittel hinzugegeben. Irgendein üblicherweise verwendetes alkalisches Puffermittel, das einen pH-Wert über 7 liefert, kann verwendet werden., Es wird jedoch insbesondere bevorzugt, Puffermittel zu verwenden, die einen pH-Wert zwischen etwa 8 und etwa 12 besitzen, was zu einem endgültigen pH-Wert der lösung zwischen 7 und 8 führt. Erwähnt werden können Phosphatpuffer, Barbitalpuffer und Glykokollpuffer. (leorell und Steinhagen, J.Biol.Chem. 49, 183, 1921; Michaelis, J.Biol.Chem., 87, 33, 1930 und idem., Bi ο ehem. Z, 234, 139, 1931? und Sorensen, Biochem. Z. 21, 131, 1909). Die Mischung wird etwa 5 Minuten stehen gelassen und durch eine Anionenaustauschsäule geschickt, die erlaubt, daß die radioaktiv markierte Enzymlösung hindurchströmt.

Es besteht Grund anzunehmen, daß ein oder mehrere ^yy Technetium-Atome in der Proteinkette des Enzyms inkorporiert werden, wahrscheinlich durch Ersetzen des zyklischen Hydroxylanteils oder eines diesem benachbarten Ringwasserstoffes in dem Tyrosir.-anteil des Proteins.

Bei der Verwendung der neuen mit Tc markierten Enzyme der vorliegenden Erfindung werden zwischen etwa 1 und etwa 10 ml der Lösung mit einer Radioaktivität zwischen 1 und 20 mC und einer Bioaktivität zwischen 80 und 350 Kiu in das Gefäßsystem injiziert.

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Es werden dann . G-esamtkörperaufnahmen in verschiedenen Zeitintervalle^ z.B. eine halte "bis vier Stunden nach Verabreichung, unter Verwendung geeigneter Detektoren aufgenommen, z.B. in rechtwinkligen Abtastverfahren oder durch Anger Scintillations-

amera-Verfahren. Patienten mit Ihrombusembolie werden aufgrund der erhöhten Radioaktivität an der Stelle der Embolie erkannt.

Beispiel 1

°°Tc - Streptokinase

Zu einer 100 Kiu-Streptokinase enthaltenden Ampulle werden zwei ml einer wässrigen Lösung aus Technetium-Pertechnetat mit einem 3?luß von 15 "bis 20 mC hinzugegeben. Zu dieser Mischung werden 1 ml frisch hergestelltes Zinndichlorid in Salzsäure (100 mg / 1, 0,2 H") hinzugegeben, worauf ein ml Phosphatpuffer (pH 12) folgt.

Die Mischung wird 5 Minuten lang stehen gelassen und durch eine Anionenaustauschsäule geschickt (Dowex 1-X8, 2 cm X 10 mm Säulendurchmessei; 2 ml). Die gekuppelte Tc-Streptokinaselösung läuft durch die Säule, die nicht umgesetztes kationisches Material zurückhält.

Gemäß dem vorstehend "beschriebenen Verfahren wird "^m Tc « Urokinase erhalten, wenn Urokinase an Stelle der Streptokinase verwendet wird»

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Claims

Patentansprüche

(1, Radioaktiv markiertes thrombolytisches Enzym, ausge— wählt aus der aus Te-Streptokinase und ³ Ic-Urokinase

"bestehenden Gruppe.
2. "^m Te-Streptokinase, die eine Verbindung nach Anspruch 1 darstellt.

Q Qjj)
3. Tc-Streptokinase nach Anspruch 2, mit einer Aktivität zwischen 0,8 und 2,5 mC pro 10 Kiu Streptokinase.
4. Eine kovalente Verbindung von -³^ Tc und Streptokinase mit einer Aktivität zwischen 0,8 und 2,5 mC pro 10 Kiu Strept okinas e.
5. Tc-Urokinase, die eine Verbindung nach Anspruch 1 darstellt.
6. ^J:7 Te-Urokinase nach Anspruch 5, mit einer Aktivität

zwischen 0,8 und 2,5 mC pro 10 Kiu Urokinase.
7. Eine kovalente Verbindung von ic und Urokinase mit einer Aktivität zwischen 0,8 und 2,5 mO pro 10 Kiu Urokinase.
8. Verfahren zum Herstellen eines radioaktivmarkierten tlircrfoolytischen Enzyms, ausgewählt aus der aus Streptokinase und Urokinase bestehenden Gruppe, markier" folgenden Verfahrensschritte enthält:

QQm Urokinase bestehenden Gruppe, markiert mit -³^ Sc, das die

a) Behandeln von etwa 5 bis etwa 250 Kiu dieses Enzyms mit etwa 15 bis -etwa 20 mC "^m TcO.,

b) Hinzugeben zu dieser Mischung aus Verfahrensachritt a) etwa 0,01 bis etwa 4 mg frisch hergestelltes Zinndichlorid und Salzsäule,

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c) Erhöhen des pH-Wertes auf etwa 7 Ms etwa 8 -und

d) Entfernen des nicht umgesetzten Perteohnetates aus . der Mischung,
9. Verfahren nach Anspruch 8, das die folgenden? aufeinanderfolgenden Verfahrenssehritte enthälts

a) Behandeln von etwa 50 "bis etwa 100 Kiu Streptokinase. mit etwa 15 his etwa 20 mC "^m TcO₄,

b) Hinzugeben zu dieser Mischung aus Verfahrensschritt a) etwa 0,1 Ms etwa 1 mg frisch hergestelltes Zinndichlorid in etwa 0,1 Ms etwa 1 H Salzsäure.,

c) Hinzugeben zu der sauren Lösung von Verfahrensschritt "b) eines alkalischen Puffers in einer Menge, die ausreichend ist 5 um den pH-Wert auf etwa 7 Ms etwa δ anzuheben, und

d) Hindurchleiten der Mischung aus Verfahrensschritt c) durch eine Anionenaustauschsäule.
10. Verfahren zum nachweis von Thrombusembolien in einea Gefäßsystem,

dadurch gekennzeichnet, daß es das Einführen von etv/a 8 Ms etwa 350 Kiu einer physiologisch aufnehmbaren Lösung aus mit ^^m Ec markierter Streptokinase oder Urokinase mit einer Intensität von etv/a 1 Ms etwa 20 mC / Kiu in das zu prüfende System und das Aufzeichnen bzw. Abtasten dieses Gefäßsystems enthält, un die Stelle der erhöhten Gammastrahlung zu bestimmen.

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11. Verfahren nach Anspruch 1O,
dadurch gekennzeichnet,

daß etwa 8 "bis etwa 350 Kiu einer physiologisch aufnehmbaren Lösung aus mit ^yym Sc markierter Streptokinase mit einer Intensität zwischen etwa 1 und etwa 20 mC /Kiu injiziert wird,
12. Verwendung von etwa 8 bis etwa 350 kiu einer physiologisch aufnehmbaren Lösung aus mit 99m Tc markierter Streptokinase nach Anspruch 2 mit einer Intensität von etwa 1 bis etwa 20 mC/kiu zum Nachweis von Thrombusembolien in einem Gefäßsystem.

13· Verwendung von etwa 8 bis etwa 350 kiu einer physiologisch aufnehmbaren Lösung aus mit 99m Tc markierter Urokinase nach Anspruch 5 mit einer Itensität von etwa 1 bis etwa 20 mO/kiu zum Nachweis von Thrombusembolien in einem Gefäßsystem.

ReHS/Gr.

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