DE2335828A1

DE2335828A1 - Verfahren zur gewinnung von pepsin

Info

Publication number: DE2335828A1
Application number: DE19732335828
Authority: DE
Inventors: John B Gallagher; Laverne W Van Ness
Original assignee: WILSON PHARM AND CHEM CORP
Current assignee: WILSON PHARM AND CHEM CORP
Priority date: 1972-07-14
Filing date: 1973-07-13
Publication date: 1974-01-31
Also published as: CA1007588A; FR2193028A1; US3796636A; GB1384849A; BE802359A

Description

Verfahren zur Gewinnung von Pepsin

Pepsin wird aus tierischer Magenschleimhaut (stomach linings) durch Aufschließen (by digestion) eines Gemisches, umfassend eine wässrige Lösung,enthaltend Essigsäure, gewonnen. Nach dem Aufschließen "wTrdder^nicht^geloste-^est von—— der Lösung abgetrennt und die Lösung auf. eine Temperatur im Bereich von -1,11 bis+7,22⁰C abgekühlt. Ammoniumsulfat wird zu der abgekühlten Lösung in Mengen von 170 g/l bis zur Sättigung zugegeben, um ein Gemisch auszufällen, bestehend aus Pepsin und Ammoniumsulfat. Die ausgefallenen Feststoffe werden in Wasser gelöst und die Azidität des entstehenden Gemisches auf einen pH-Wert im Bereich von 4-,O bis 4-, 5 eingestellt. Die Ammoniumsulfatk omp on ent e der entstehenden Lösung wird durch Diffusion durch eine semipermeable Membran entfernt. Das aus der entstehenden ammoniumsulfatfreien Lösung gewonnene Pepsin kann eine so hohe proteolytische Aktivität wie 1 : 4-5 000 haben, wenn es zu einem trockenen Pulver umgewandelt wird.

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines proteolytischen Enzyms mit hoher Aktivität. Sie betrifft besonders ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Pepsin aus tierischer Magenschleimhaut, bei dem das Pepsin in einer Form ausgefällt wird, in der es im wesentlichen frei ist von verunreinigenden organischen Substanzen und das, wenn es von nicht organischen verunreinigenden Substanzen befreit worden ist, gekennzeichnet ist durch eine verhältnismäßig hohe proteolytische Aktivität.

Kurz gesagt umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren das Aufschließen von Magenschleimhäuten in einer wässrigen Lösung, enthaltend Säure in einer solchen Menge, daß ein pH-Wert von weniger als 5 eingestellt wird, Entfernen des nicht gelösten Anteils der Magenschleimhaut aus der Lösung, Abkühlen der Lösung auf eine Temperatur unter 7₅22°C und Zugabe von Ammoniumsulfat in einer solchen Menge, daß bei der Temperatur der abgekühlten Lösung Sättigung eintritt, d.h. 0,3 bis 1,0 Sättigung, um einen Niederschlag auszusalzen, Lösen des Niederschlags in~"entsalztem Wasser, das~auf einer"Temperatur^im Bereich"von 1,6? bis 26,7°C gehalten wird und Einstellung der Azidität der entstehenden Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von 4-bis 4-,5i Entfernung des Ammoniumsulfats der entstehenden Lösung durch Diffusion durch eine semipermeable Membran, wobei eine restliche wässrige Lösung entsteht, die im wesentlichen aus Pepsin besteht und Gewinnung des Pepsins aus dieser wässrigen Lösung.

Bei den üblichen Verfahren zur Gewinnung von Pepsin aus tierischer Magenschleimhaut wurde Pepsin mit verschiedenen sauren wässrigen Lösungen extrahiert. Nach der Entfernung der nicht gelösten Schleimhautbestandteile und Abtrennung der schleimartigen Bestandteile von der Aufschlußlösung, wurde

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das Pepsin aus der Aufschlußlösung durch Ausfällverfahren gewonnen, umfassend Stufen wie die Herabsetzung der Dielektrizitätskonstante durch Zugabe organischer Lösungsmittel wie Alkohol und durch Aussalzen von Pepsin durch Zugabe solcher anorganischen Salze wie Natriumsulfat. Derartige Verfahren sind mühsam und kostspielig und die Ausbeuten sind gering, da umfangreiche ßeinigungsschritte erforderlich sind, um die organischen und anorganischen Verunreinigungen zu entfernen.

Bei einem derartigen Verfahren, bei dem Alkohol zur Ausfällung verwendet wird (US-PS 2 305 714) liegt die Menge des gewonnenen Pepsins bei ungefähr 1 bis 3 %■> bezogen auf den üblichen berechneten proteolytischen Wert von 1 : 10 000 und das trockene Produkt besitzt eine maximale proteolytische Aktivität von 1 : 25 000.

Ein anderes derartiges Verfahren, das die aufeinanderfolgenden Ausfällschritte unter Verwendung von Alkohol und löslichen Zinksalzen umfaßt, führt zu Ausbeuten in der Grös-

sBnordnung von 5 %■> bezogen auf den üblichen "berechnet en —

proteolytischen Wert von Λ : 10 000. VJenn Reinxgungsschritte, wie Lösen und wieder Ausfällen durchgeführt werden, um die Aktivität zu erhöhen, erfordern diese Stufen eine Absetzzeit von 15 Stunden und die Zunahme der Aktivität von 1 : 15 bis 1 : 45 000 führt zu einer ungefähr 40 %-igen Verringerung der Pepsinausbeute, d.h. einer Verringerung von ungefähr 5 auf ungefähr 3 %·

Es hat sich nun gezeigt, daß ein Pepsinprodukt mit einer so hohen Aktivität wie 1 : 45 000 in einer verhältnismäßig hohen Ausbeute von ungefähr 5 %_r bezogen auf den üblicherweise berechneten proteolytischen Viert von 1 : 10 000, erhalten werden kann durch ein vereinfachtes Verfahren, das

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eine Kombination der Stufen des Auf schließ ens der Magenschleimhaut in Essigsäurelösung und Ausfällens im kritischen Konzentrationsbereich des spezifischen Ausfällmittels Ammoniumsulfat nahezu des gesamten, in der Aufschlußlösung vorhandenen Pepsins als Peststoffgemisch umfaßt, das im wesentlichen aus dem Ausfällmittel und Pepsin besteht, während ein Aussalzen mit Ammoniumhälogeniden als Ausfällmittel nicht möglich ist und Natriumsulfat nur einen wesentlich geringeren Teil des in der Aufschlußlösung vorhandenen Pepsins ausfällt, d.h. Mengen in der Größenordnung von 1/3 des Pepsins, das mit Ammoniumsulfat ausgefällt wird₍und zu Feststoffgemischen führt, die erhebliche Mengen organische Substanzen außer Pepsin enthalten und die eine Pepsinaktivität besitzen, die nur ein kleiner Bruchteil, d.h. so wenig wie 1/10 der Pepsinaktivität des erfindungsgemäß erhaltenen Niederschlags besitzen. Anschließend wird'das Feststoffgemisch in einem wässrigen Medium gelöst, wobei eine wässrige Lösung des Niederschlags entsteht_fund das Ammoniumsulfatausfällmittel aus der wässrigen Lösung des Nie·*· derschlags entfernt. Das nach der Entfernung von Ammoniumsulfat erhaltene Pepsin ist eine verhältnismäßig reine—sehr akti-_

ve Form, die nicht weiter bearbeitet werden muß, um die Reinheit und Aktivität zu erhöhen.

Mehr im einzelnen umfaßt das Verfahren zur Gewinnung von Pepsin aus tierischer Magenschleimhaut das Aufschließen der Magenschleimhaut von Schweinen und anderen Tieren in einer wässrigen Lösung, enthaltend Essigsäure in einer solchen Menge, daß ein pH-Wert im Bereich von 1,5 bis maximal 5 aufrechterhalten wird, der nicht überschritten werden kann, ohne daß ein Verlust an Pepsinaktivität auftritt, Entfernen des festen Rückstands der Magenschleimhaut aus der Aufschlußlösung, Kühlen der Aufschlußlösung auf eine Temperatur im Bereich von -1,11 bis +7,22⁰C, Zugabe von Ammoniumsulfat zu der Aufschluß-

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lösung in Mengen, die zu einer Sättigung von 0,3 bis 1,0 führen, wobei ein Gemisch ausfällt, das im wesentlichen aus Pepsin und Ammoniumsulfat besteht, Isolieren des ausgefällten Gemisches, Lösen des ausgefällten Gemisches in entsalz- ' tem Wasser, das auf einer Temperatur im Bereich von 1,67 bis 26,7°C gehalten wird und eine Azidität im pH-Bereich von 4,0 bis maximal 4,5 besitzt, um eine Zerstörung der Pepsinaktivität zu vermeiden, Einstellen der Azidität der entstehenden Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von 4 bis 4,5, wenn beim Lösen des Niederschlags eine Lösung außerhalb dieses gewünschten pH-Bereichs entsteht, Entfernen des Ammoniumsulfats aus der erhaltenen Lösung durch Diffusion durch eine semipermeable Membran und Gewinnung des Pepsins mit einer hohen proteolytischen Aktivität aus dieser im wesentlichen ammoniumsulfatfreien entstehenden Lösung.

Unter Sättigung ist zu verstehen, daß so viel der löslichen Substanz gelöst wird ,wie das Lösungsmittel unter Gleichgewichtsbedingungen bei einer bestimmten Temperatur absorbieren kann. Eine Sättigung der Aufschlußlösungen mit Ammoniumsulfat. in Mengen, die zu einer Sättigung von 0,3 bis 1,0 bei Temperaturen im Bereich von -1,11 bis + 7,22⁰C führen, umfaßt das Lösen von ungefähr 170 bis 780 g/l Lösungsmittel.

Bei einer bevorzugten Durchführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Magenschleimhaut von Schweinen mit Wasser im Gewichtsverhältnis von ungefähr 1 : 1 vermischt, wobei eine Aufschlämmung entsteht. Die Aufschlämmung wird auf eine Temperatur von ungefähr 50,O⁰C erhitzt. Es wird Eisessig zu der erhitzten Aufschlämmung in einer solchen Menge zugegeben, daß sich eine Azidität im pH-Bereich von ungefähr 4,0 bis 4,5 ergibt. Nach einer Aufschlußzeit von ungefähr 16 Stunden werden die nicht gelösten Anteile der Magenschleimhaut

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von der Aufschlußlösung abgetrennt und die Aufschlußlösung auf eine Temperatur von ungefähr O⁰C abgekühlt. Es wird zu der abgekühlten Aufschlußlösung Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugegeben, daß sich eine Konzentration im bevorzugten Bereich einer Sättigung von 0,4 bis 0,8 ergibt, um ein Feststoff gemisch auszusalzen, das aus Pepsin und Ammoniumsulfat besteht. Das Feststoffgemisch wird von der Lösung abgetrennt und in entsalztem Wasser gelöst, das auf einer Temperatur von ungefähr 22,2°G gehalten wird, wobei eine Lösung entsteht mit einer Konzentration an dem Feststoffgemisch von ungefähr 50 g/l. Die Azidität der Lösung dieses Feststoffgemisches wird auf einen pH-Wert von ungefähr 4,0 eingestellt. Das Ammoniumsulfat wird von der Lösung mit dem angegebenen pH-Wert durch Ultrafiltration entfernt, wobei eine Membran, wie sie z.B. unter der Bezeichnung "Abcor Nr. 300" bekannt ist,' verwendet wird, die in der zurückbleibenden Lösung Substanzen mit einem Molekulargewicht von über 30 000 enthält. Das Pepsin wird dann von der entstehenden im wesentlichen ammoniumsulfatfreien Lösung gewonnen.

In Beziehung auf die erste Stufe der Extraktion von Pepsin aus Magenschleimhaut hat es sich gezeigt, daß die Verwendung von Essigsäure und die Einstellung des pH-Wertes der Lösung wichtig ist, um hohe Ausbeuten an dem Endprodukt und eine hohe Aktivität zu erhalten. Andere Säuren wie Salz-r säure und Schwefelsäure führen, obwohl sie als Extraktionsmittel für Pepsin geeignet sind, zu Aufschlußlösungen, die eine ständige Einstellung des pH-Wertes erfordern, um einen pH-Wert der Aufschlußlösung in dem optimalen Bereich zu ermöglichen.

Die Azidität der essigsauren Aufschlußlösung wird im all gemeinen im pH-Bereich von 3 bis 4,5 und vorzugsweise 4 bis 4,2 gehalten. Die Menge an ßäurelÖBung, die zugegeben wird,

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um ungefähr 1816 kg Magenschleimhaut von Schweinen in ungefähr 34-07 1 (900 gallons) Wasser aufzuschließen, beträgt ungefähr 68,14 1 (18 gallons) Eisessig.

Die Suspension von ganzer oder vermahlener Magenschleimhaut wird ungefähr 3 bis 24- Stunden auf einer Temperatur von 37,8 bis 54-,4⁰C (100 bis 130⁰F) und vorzugsweise 6 bis 12 Stunden auf ungefähr 48,9 bis 54,4⁰C (120 bis 130° F) gehalten.

.Nach der Abtrennung des Restes von nicht gelöster Magenschleimhaut aus der Aufschlußlösung und Abkühlen der Aufschlußlösung auf eine Temperatur im Bereich von ungefähr -1,11 bis +7,22⁰C (30 bis 45⁰F) kann aus der Aufschlußlösung das Pepsin als Bestandteil eines Pepsin-Ammoniurosulfat-Gemisches ausgefällt werden. Die Ausfällung eines Gemisches, das sehr geringe organische Verunreinigungen wie Schleimhaut und Mucin enthält, erfordert eine minimale Konzentration an. Ammoniumsulfat von 0,3 Sättigung und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,5 -bis -1,0- Satt igung. - --■ --—

Bei den letzten Verfahrensstufen wird das Ammoniumsulfat von einer Lösung des ausgefallenen Pepsin-Amraoniumsulfat-Gemisch.es durch Diffusion durch semipermeable Membranen entfernt. Eine solche Diffusion kann erreicht werden durch Dialyse, durch die ein Übergang von Ammoniumsulfat aus der Lösung des Gemisches in eine wässrige Lösung und Übergang von Wasser in die Lösung des Gemisches erreicht wird. Bevorzugt ist jedoch eine Ultrafiltration, da der angewandte Druck das Ammoniumsulfat austreibt, ohne daß eine Verdünnung auftritt wie bei dem Dialyseverfahren durch die Einleitung von Wasser in die Lösung des Gemisches.

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Das lyophilisierte Pepsinprodukt besitzt eine proteolytische Aktivität von 1 : 30 000 bis 1 : 45 000 und die Ausbeute beträgt ungefähr 5 %, bezogen auf die üblicherweise berechnete Stärke von 1 : 10 000.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

726 kg Magenschleimhaut von Schweinen wurden auf ein Gesamtvolumen von 1363 1 mit Wasser verdünnt. Zu dem Gemisch wurden 27,25 1 Eisessig gegeben und das gesamte Gemisch unter Rühren 16 Stunden auf 48,9°C erhitzt. Der unlösliche Anteil' des Gemisches wurde abfiltriert und das klare Filtrat auf 0⁰C abgekühlt. Zu dem kalten Filtrat, das ungefähr 1514-betrug , wurden 4-68,5 kg Ammoniumsulfat (0,5 Sättigung) unter Rühren zugegeben. Der Ammoniumsulfat-Pepsin-Niederschlag wurde "unter- Verwendung von Filterhilfe-abfilt-riert. -Der-gesamte— Niederschlag wurde in Wasser mit einem Gesamtvolumen von ungefähr 379 1 suspendiert. Die Temperatur der Lösung wurde auf ungefähr 15,6° eingestellt und der pH-Wert auf 4,2. Der Anteil des Niederschlags,der unlöslich blieb, wurde von der Lösung des Niederschlags durch Trommelzentrifugation entfernt. Die entstehende klare Lösung wurde im Vakuum auf 94,6 1 eingeengt, wobei die Temperatur nicht über 26,7° hinaus ging. Die 94,6 Konzentrat wurden 5 Tage gegen Wasser mit einem pH-Wert von 4,0 unter Anwendung eines Visking-Dialyserohrs dialysiert. Nach der Dialyse betrug das Volumen des Produktes ungefähr 187 1 und wurde im Vakuum auf 45,4 1 eingeengt, wobei die Temperatur nicht über 26,7° stieg. Das Konzentrat wurde gefroren und gefriergetrocknet.

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Man erhielt als Endprodukt 7 387 g trockenes Pepsin mit einer Aktivität von 1 : 43 900.

Beispiel 2

100 1 Pepsinfiltrat, erhalten durch. EssigsäureaufSchluß von 4-7,6 kg frischer Magenschleimhaut von Schweinen, wurden auf 5°C abgekühlt und durch Eühren mit 26,71 kg Ammoniumsul— fat (0,45 Sättigung) ausgesalzen. Die Lösung und der Niederschlag wurden 2 Tage "bei 3»33 his 4,44°C aufbewahrt und dann zentrifugiert, um den unlöslichen Pepsin-Ammoniumsulfat-Niederschlag mit einem nassen Volumen von 2 1 abzutrennen. Der Niederschlag wurde in 50 1 Wasser von 21,7⁰C und einem pH-Wert von 4,0 gelöst. Die wässrige Lösung des Pepsin-Ammoniumsulfat-Niederschlags wurde mit Hilfe einer Abcor 300-Membran der Ultrafiltration unterworfen. Das zurückbleibende Konzentrat besaß einen Feststoff gehalt von 3*5 % und wurde im Vakuum bei einer Temperatur von nicht über 26,7°C bis zu einer Feststoff konzentration von 25,1- % -eingeengt. Das Konzentrat~ würde ~ gefriergetrocknet.

Eine Probe des Konzentrats der Ultrafiltration vor der Einengung im Vakuum wurde gefriergetrocknet und untersucht. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Entsprechend 126,9 kg Gesamtfeststoffgehalt 3,5 % 1 : 10 000 aus 2 270 kg

Aktivität 1 : 45 000 ¹

Pat ent ansprüche 62XXV

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Claims

8 MÜNOJIKN OO SCIIWEIOKHSTKASSE S TKl-KroN (0811) 66 20 51 TK ι.κι S 84 070

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PATENTANSPRÜCHE

Verfahren zur Gewinnung von Pepsin aus tierischer Magenschleimhaut durch Aufschließen der Magenschleimhaut in saurer "wäßriger Lösung, Entfernung der unlöslichen Bestandteile der Magenschleimhaut von der Aufschlußlösung und Aussalzen des Produktes, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wäßrige Lösung verwendet, di& üäure„ in eineiL solchen Menge enthält, daß der pH-Wert weniger als 5 "beträgt, die Aufschlußlösung nach der Entfernung der unlöslichen Bestandteile auf eine Temperatur unterhalt» von 7>22°C abkühlt, Ammoniumsulfat in einer solchen Menge zugibt, daß man eine Sättigung von 0,3 "bis 1,0 erreicht, den Niederschlag in Wasser löst, die Acidität der Lösung des Niederschlags auf einen pH-Wert von 4 Ms 4»5 einstellt, das Ammoniumsulfat durch Diffusion durch eine semipermeable Membran entfernt und aus der verbleibenden Lösung das Pepsin als trockenes Pulver gewinnt,

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2» Verfahren nach-Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Aufschlußlösung auf einem pH-Wert im Bereich von 1 "bis 5 hält und auf eine Temperatur im Bereich von -1,11 bis +7,22⁰C kühlt.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Ammoniumsulfat durch Ultrafiltration entfernt und das Pepsin aus der im wesentlichen ammoniumfulfatfreien Lösung durch lyophilisieren gewinnt,

4· Verfahren nach Anspruch 1 "bis 3» dadurch gekennzeichnet , daß man die Magenschleimhaut in einem Gewichtsverhältnis von 1:1 mit Wasser aufschlämmt, Essigsäure "bis zu einem pH-Wert von 4»0 bis 4,5 zugibt, die Temperatur während des Aufschließens auf 37,8 bis 54,4°G hält und Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 0,4 bis 0,8 zugibt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4» dadurch gekennzeichnet , daß man für die Diffusion eine semipermeable Membran verwendet, die Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 30 000 zurückhält.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet , daß man zum Aufschließen der Magenschleimhaut eine wäßrige Essigsäurelösung verwendet, die einen pH-Wert im Bereich von ungefähr 1,5 bis 5>0 ergibt.

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