DE2307504A1

DE2307504A1 - Fermentationsverfahren zur herstellung von cyclischem adenosin-3',5'-phosphat

Info

Publication number: DE2307504A1
Application number: DE19732307504
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Jyoji Kato; Tomofumi Uchida; Taizo Watanabe
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1972-02-17
Filing date: 1973-02-15
Publication date: 1973-09-06
Also published as: FR2172371B1; FR2172371A1; US3808100A; JPS4885792A; GB1373608A; JPS4930112B2

Description

Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka / Japan

Fermentationsverfahren zur Herstellung von cyclischen!

Adenosin-3'.5'-phosphat

Die Erfindung betrifft ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von cyclischem Adenosin-3¹,5'-phosphat (hierin als cAMP bezeichnet).

Es ist bekannt, daß cAMP in verschiedenen Organismen weit verbreitet ist und daß es einen wichtigen Effekt auf den Glycostoffwechsel ausübt. Neuerdings ist auch seine Einsetzbarkeit als Arzneimittel rasch zunehmend.

Es sind bereits einige Fermentationsverfahren zur Herstellung von cAMP bekannt, beispielsweise solche, bei denen

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Mikroorganismen der Arten Corynebacteriuin, Arthrobacter, Microbacterium und Brevibacterium verwendet v/erden (bekanntgemachte Unterlagen der japanischen Patentanmeldungen 42958/1971, 33/1972, 1838/1972 und 1839/1972 sowie "Amino acid and Nucleic acid", Band 10, Seite 117, 1964).

Es wurden nun Untersuchungen durchgeführt, um besser geeignete Fermentationsverfahren zur Herstellung von cAIIP aufzufinden.

Es wurde festgestellt, daß cAMP in einer Brühe gebildet und angesammelt werden kann, wenn man einen Stamm der Art Sarcina in Gegenwart einer Purinverbindung kultiviert. ILs wurde weiter gefunden, daß die Menge des angesammelten cAI-IP in der Brühe vergrößert wird, wenn man dem Kulturmedium eine Ketosäure oder ein Salz davon zusetzt.

Das Fermentationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Art Sarcina in ein Kulturmedium okkuliert, welches eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine verwertbare Stickstoffquelle und andere enthält, den Stamm in Gegenwart einer Purinverbindung und weiterhin einer Ketosäure oder ihres Salzes kultiviert, bis cAMP in der Kulturbrühe sich angesammelt hat, und daß man das auf diese Weise angesammelte cAMP aus der Kulturbrühe gewinnt.

Die Kultivierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise bei aerobischen Bedingungen, beispielsweise als Schüttelkultur oder als Belüftungs-Rühr-Kultur, und bei einer Temperatur von etwa 10 bis 40°C so\yie einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Kulturmedium kann Kohlenstoffquellen (z.B. Glucose, Dextrin oder Saccharose), Stick-

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stoffquellen (z.B. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Peptone, Malzextrakt, Fischmehl oder Hainquellflüssigkeit), anorganische Materialien (z.B. Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat oder Calciumchlorid) und weiterhin Vitaraine (z.B. Pantothensäure, Thiamin, Biotin, Foliiisäure, Pyridoxin oder deren Salze) sowie Purinverbindungen (z.B. Adenin, Guanin oder Adenosin) enthalten.

Cine Purinverbindung wird im Kulturmedium entweder vor oder vorzugsweise während der Kultivierung zugesetzt. Sie wird gewöhnlich innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden nach beginn der Kultivierung zugesetzt.

Die dem Medium zugesetzte Purinverbindung kann vorzugsweise Adenin, Hypejcanthin oder ein Derivat hiervon (z.B. Adenosin oder Inosin) sein. Die Purinverbindung wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 bis 0,5 Gew.-% zugesetzt.

Weiterhin ist es zu bevorzugen, eine Ketosäure oder ihr Salz dem Kulturmedium zuzusetzen, um die Menge des cAIIP zu vergrößern, die sich in der Kulturbrühe ansammelt. Die Ketosäure oder ihr Salz kann gleichzeitig oder getrennt mit der Purinverbindung vor oder während der Kultivierung zugefügt werden, jedoch wird sie vorzugsweise innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden nach Beginn der Kultivierung zugesetzt. Die Ketosäure oder ihr Salz kann z.B. Brenztraubensäure, o6-Ketobuttersäure oder oC-Isovaleriansäure oder deren Salz mit einem Alkalimetall (z.B. Natrium oder Kalium) oder einem Erdalkalimetall (z.B. Magnesium) sein. Die Menge der zugesetzten Ketosäure oder ihres Salzes kann im Bereich von etwa 0,5 bis 3,0 Gew.-% liegen.

Geeignete Beispiele von Stämmen der Art Sarcina sind Sarlute** EiA 1099 (ATCC Hr.9341) und dessen Mutanten, wie

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der Stamm FERM-P Nr. 1333 (ATCC Nr. 21880), der Stamm FERK-P Nr. 1334 (ATCC Nr. 21882) und der Stamm FERIl-P Nr. 766 (ATCC Nr. 21881). Dabei bedeutet FEFM das "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan", und ATCC American Type Culture Collection, USA.

Der Stamm mit der FEIiIi-P Nr. 1333 ist eine Purin erfordernde Mutante von Sarcina lutea IAIi 1099. Der Stamm FERH-P I»r. 1334 ist eine adenosin-deaminase-lose Mutante von Sarcina lutea IAM 1099. -Der Stamm FERM-P Nr. 766 ist eine Purin erfordernde und adenosin-deaminase-lose Mutante von Sarcina lutea IAM 1099. Diese v/erden erhalten, wenn man Sarcina lutea IAM 1099 mit Nitrosoguanidin behandelt.

Nach der Kultivierung kann das in der Kulturbrühe angesammelte cAMP ohne weiteres isoliert und auf herkömmliche Weise gereinigt werden, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz oder Aktivkohle oder Ausfällung mit einem Lösungsmittel.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin sind die Prozentmengen auf Gewicht-je-Volumen-Basis bezogen.

Beispiel 1

In einen 500 ml-Schüttelkolben wurde portionsweise ein Samenkulturmedium (pH 7,0, 25 ml), enthaltend Saccharose (105a), Pepton (2°/o), Kaliumphosphat (0,75?0, Magnesiumsulfat'7HgO (0,1^), Calciumchlorid·2H₂O (0,01Jj), Hefeextrakt (1,0^), Adenin (0,02%), Guanin (0,02?£) und Calciumpantothenat (5 mg/l), gegeben. Das Medium wurde sterilisiert. Das Medium wurde mit einer Schleifenfüllung Sarcina lutea IAM 1099 inokkuliert und 48 Stunden einer Schüttelkultur bei 30⁰C ausgesetzt (120 Upm, Sohlagfrequenz 8 cm), wodurch eine Besamungskultur erhalten wurde.

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In einen 500 ml-Schüttelkolben wurde portionsweise ein Kulturmedium (25 ml), enthaltend Saccharose (10%), Pepton (2 %), Kaliumphosphat (0,75%), Magnesiumsulfat·7H₂O (0,1%) Calciumchlorid· 2H₂O (0,0190, Hefeextrakt (0,5%), Adenin (0,02%) Guanin (0,02%), Calciumpantothenat (5 mg/l) und Thiaminhydrochlorid (10 mg/l), gegeben und das Medium wurde sterilisiert. In das Medium wurde die Besamungskultur, wie oben erhalten, inokkuliert (0,5 ml). Es wurde eine Schüttelkultur bei 30°C (120 Upm, Schlagfrequenz 8 cm) durchgeführt. 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde sterilisiertes Adenin zugesetzt, so daß die Endkonzentration 0,2% betrug. Es wurde weitere 144 Stunden kultiviert. Auf diese Weise wurde cAMP in einer Menge von 0,5 mg/ml Medium angesammelt,

Beispiel 2

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde die Kultivierung durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung Natrium-cG-ketobutyrat zugesetzt wurde, so daß die Konzentration, wie die von Adenin, 1,0% betrug. Es sammelte sich cAMP in einer Menge von 1,1 mg/ml Medium an.

Beispiel 3

In der gleichen V/eise wie im Beispiel 1 wurde die Kultivierung durchgeführt, v/obei eine Purin erfordernde Mutante von Sarcina lutea (FEm-I-P Nr. 1333) anstelle von Sarcina lutea IAM 1099 verwendet wurde. Das cAHP sammelte sich in einer Menge von 0-,8 mg/ml des Mediums an.

Beispiel 4

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde die Kultivierung durchgeführt, wobei eine adenosin-deaminase-lose Mutan-

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te von Sarcina lutea (FERM-P Nr. 1334) anstelle von Sarcina lutea IAM 1099 verwendet wurde. Das cAMP sammelte sich in einer Menge von 0,85 mg/ml des Mediums an.

Beispiel 5

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 v/urde die Kultivierung durchgeführt, wobei eine Purin erfordernde und adenosin-deaminase-lose Mutante von Sarcina lutea (FERiI-P ITr. 766) anstelle von Sarcina lutea IAM 1099 verwendet wurde. 24 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde Natriumpyruvat in einer Menge von 1,096 zugesetzt. Das cAMP hatte sich in einer Menge von 2,0 mg/ml Medium angesammelt. Die überstehende Flüssigkeit (2,5 l) der Kulturbrühe, die auf diese Weise erhalten worden war, wurde durch eine Kolonne eines Ionenaustauscherharzes (Dowex 1X2, des Salzsäuretyps, hergestellt von Dow Chemical Co.) geleitet. !lach dem Waschen mit 0,005n Salzsäure wurde die absorbierte Substanz mit 0,05 η Salzsäure, enthaltende 0,5m Calciumchlorid, eluiert. Das anfangs erhaltene Nucleotid wurde auf aktivierter Kohle adsorbiert und sodann mit äthanolischem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde konzentriert und lyophilisiert, wodurch cAMP (3,6 g) erhalten wurde.

Beispiel 6

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde die Kultivierung durchgeführt, wobei eine Purin erfordernde und adenosindearainase-lose Mutante von Sarcina lutea (FERM-P Nr. 766) anstelle von Sarcina lutea IAM 1099 verwendet wurde. Dabei wurde Adenosin anstelle von Adenin als Purinverbindung so zugesetzt, daß eine Endkonzentration von 0,2% erhalten wurde. Weiterhin wurde Natriumpyruvat gleichzeitig zu einer Konzentration von 1,09<j zugesetzt. Das cAMP sammelte sich in einer Menge von 1.9 mg/ml Medium an.

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Beispiel 7

In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 wurde die Kultivierung durchgeführt, wodurch eine Purin erfordernde und adenosin-diaminase-lose Iiutante von Sarcina lutea (FERM-P Nr. 766) anstelle von Sarcina lutea IAIl 1099 verwendet wurde. Es wurde Hypoxanthin anstelle von Adenin als Purinverbindung zu einer Endkonzentration von 0,2% zugesetzt. Weiterhin wurde gleichzeitig Natriumpyruvat zu einer Konzentration 1,05έ zugesetzt. Das cAMP sammelte sich in einer Menge von 1,9 mg/ml des Mediums an.

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Claims

Patentansprüche

1. Fermentationsverfahren zur· Herstellung von cyclischem Adenosin-3¹,5 '-phosphat, dadurch g e k e η η ζ e i c. h net, daß man einen Stamm der Art Sarcina in ein Kulturmedium einokkuliert, die Kultur in Gegenwart einer Purinverbindung kultiviert, bis sich in der Kulturbrühe cyclischen Adenosin-3',5'-phosphat angesammelt hat, und daß man dieses aus der Kulturbrühe gewinnt.

2. Fermentationsverfahren nach Anspruch 1, dadurch Gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in Gegeiv.vart einer Ke to säure oder ihres Salzes durchfahrt.

:>. Fermentationsverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

(T e k e η nz e i c h η e t , daß man als Stamia eier Art Sarcina Sarcina lutee IAII 1099, eine Pur in erfordernde liutrmte, eine adenosin-deaminase-lose iiutante oder eine Purin erfordernde und adenosi::-deamino.so-lose I-iutante ver-./endet.

4. Femientationsverfpliren nach iuispruch 1 odo: L:, ('irdurcli gekennzeichnet , daß man als Stamm der .-irr. Sarcina Sarcina lutea IAIi 1099 (ATCC Ur. 934-1), eine Pur in erfordernde ilutante von Sarcina lutea IAII 1099 (A'.i'CC Mr. 21880), eine adenosin-deaminase-lose 1-Jutonte von L>arci;;r, lutea I/J'i 1099 (ATCC Hr. 21882 oder eine Purin erfordernde und adenosiii-deaminase-losG llutante von Sarcina lut.or:. IAiI 1099 (ATCC Mr. 21881) verwendet.

5. Fermentations verehren nacli einen der i-.nspc'ic] c 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , drß mp.n die Kultivierung unter aerobj.sche"u Bedinßui"i.':^-en, bei Teriporf-.-turen von 10 bis 4-Q C und bei pll-V/erten von etwa 3 bis 9 durchführt.

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β. Fermentationsverfahren nach einem der Ansprüche 1

bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man die Pur inverbind long innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden nach Beginn der Kultivierung zusetzt.

7. Fermentationsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man als Purinverbindung Adenin, Ilypoxanthin, Adenosin und/oder Inosin verwendet.

8. Fermentationsverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ketosäure oder ihr Salz innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden npch Beginn der Kultivierung zusetzt.

9. Fennentationsverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ketosäure oder ihr Salz Brenztraubensäure, o6-Ketobuttersäure, oL -Isovaleriansäure und/oder ein Salz dieser Säuren verwendet.

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