DE2250315C2

DE2250315C2 - Verwendung eines Kälberfuttermittels

Info

Publication number: DE2250315C2
Application number: DE2250315A
Authority: DE
Inventors: Raymond Catworth Huntingdon Kenworthy; Philip Putnoe Bedford Porter
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1971-10-14
Filing date: 1972-10-13
Publication date: 1986-03-13
Also published as: DK144905B; IE37042L; YU257372A; FR2158219A1; NO135395B; ZA727241B; DK144905C; NO135395C; AT328280B; DE2250315A1; IN137496B; NL7213850A; BE789864A; SE421174B; ATA860872A; LU66264A1; FR2158219B1; IT1043895B; GB1401280A; AU4761472A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Futtermittels für Kälber, wodurch insbesondere die Anfälligkeit von Kälbern gegenüber Krankheiten des Darmtraktes und insbesondere gegenüber solchen Erkrankungen, welche Folge einer nach den ersten Lebenstagen zugezogenen Infektion sind, vermindert wird.

Eine solche Erkrankung ist die »Salmonellosis«, die vom Eintritt eines oder mehrerer Bakterienstämme von Salmonella dublin und Salmonella typhimurium in den Darm von Kälbern herrührt. Eine weitere jedoch gewöhnlicherweise weniger schwerwiegende Darmerkrankung, die bei Kälbern auftritt, ist die Folge einer Infektion durch pathogene Stämme von Bacterium Escherichia coli, und insbesondere solcher Stämme, welche die Serotypenbezeichnungen 08, 09, 015, 078, 0114, 0137 und 0139 (International Serotype Classification) besitzen.

Wenn die Umgebung oder das Futter von Kälbern verändert wird, beispielsweise bei ihrem Transport, der Aufnahme in den Stall oder beim Wegnehmen vom Muttertier bewirken die damit verbundenen Streß-Situationen, daß die Kälber gegenüber der Vermehrung von pathogenen Organismen weniger widerstandsfähig sind, und es besteht eine große Wahrscheinlichkeit, daß irgendwelche Erreger von Salmonella oder E. CoIi, welche mit der Nahrung aufgenommen wurden, einen schweren Durchfall (Diarrhö), welcher bei S. dublin und S. typhinurium sehr ernst werden kann, verursachen. Bei Kälbern, die für die Aufzucht gekauft wurden und welche üblicherweise etwa ein bis drei Wochen nach dem Kauf befallen werden, können die Sterberaten bei Infektion mit SalmonelleRstämmen 30% oder mehr betragen.

Aufgabe der Erfindung ist es, hiergegen ein Mittel zu liefern.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Futtermittels für Kälber, das neben den üblichen Futtermittelbestandteilen ein aus inaktivierten Zellen eines oder mehrerer gezüchteter pathogener Bakterientypen, die an der Auslösung von Erkrankungen des Darmtraktes von Kälbern beteiligt sind, stammendes Antigenmaterial enthält.

Kälberfuttermittel mit aus inaktivierten enteropathogenen Bakterien stammenden Antikörpermaterial sind bekannt Die US-PS 36 51 214 betrifft die Herstellung oraler Vaccine aus Bakterien, die für die Gastro-enteritis in Kälbern verantwortlich sind. Dieses bekannte Vacein wird aus abgetöteten Bakterien hergestellt, und es kann mit Futtermitteln gemischt werden. Wenngleich hierbei die Bakterien abgetötet und Endotoxine aus den Bakterien freigesetzt werden, werden solche freigesetzten Endotoxine nach der bekannten Arbeitsweise verworfen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, daß Endotoxine, die aus inaktivierten (abgetöteten) Zellen bestimmter Stämme enteropa'.hogener Bakterien freigesetzt werden können, Kälbern über ihr Futter oral verabreicht werden können, um sie wirksam gegen gastro-intestinale Erkrankungen zu immunisieren. Die Erfindung bietet somit eine Möglichkeit der Verstärkung der natürlichen Resistenz von Kälbern gegenüber diesen endemischen Erkrankungen, wodurch die Fleisch- und Miichproduktionsleistur.g unter modernen Intensivhaltungsbedingungen gesteigert wird. Wenngleich ältere Kälber auch erheblichen Nutzen aus der Erfindung haben können, ist sie von besonderer Bedeutung für das ganz junge Kalb. In den ersten Lebenstagen nach dem Setzen erwirbt das junge Kalb passive Immunität gegen Infektionen durch E. coli und andere gastro-enterische Bakterien, da es die jeweiligen, in der Kolostralmilch der Kuh enthaltenen Antikörper aufnimmt

Die erfindungsgemäße Verwendung eines Kälberfuttermittels das neben den üblichen Futtermittelbestandteilen ein aus inaktivierten Zellen eines oder mehrerer gezüchteter pathogener Bakterientypen, die an der Auslösung von Erkrankungen des Darmtraktes von Kälbern beteiligt sind, stammendes Antigenmaterial enthält, zur Verminderung der Anfälligkeit der Kälber gegenüber Krankheiten des Darmtraktes, ist dadurch gekennzeichnet, daß als Antigenmaterial Endotoxine eingesetzt werden, die erhalten worden sind durch Züchten von pathogenen, auf den Darmtrakt von Kälbern infektiös wirkenden Bakterien und Abtöten der gezüchteten Bakterienkulturen unter Freisetzen der Endotoxine und daß das Kälberfuttermittel in einer solchen Menge zur Verfügung gestellt wird, daß mindestens 1 bis 10 Hämagglutinations-Hemmeinheiten der Endotoxine eines jeden Bakterientyps pro Kalb pro Tag aufgenommen werden.

In dem älteren Patent P 21 '25 641 7 wird ein Schweinefuttermittel ähnlicher Zusammensetzung beansprucht.

Mit der Bezeichung »Endotoxine« für die in den Darm von Kälbern einzuführenden Materialien soll nicht gesagt werden, daß in diesen Materialien die Anwesenheit von Endotoxinen oder die Anwesenheit des Zellmaterials, in welchem die Endotoxine in dem lebenden Bacterium eingeschlossen sind, ausgeschlossen sein soll. Hierunter ist lediglich zu verstehen, daß Endotoxine bei der Erzielung des gewünschten immulologischen Effektes die Hauptbedeutung haben, während Endotoxine und Rückstände der Zellen diesen gewünschten immuologischen Effekt nicht aufweisen. Jedoch kann es gegebenenfalls bequemer sein, entweder Endotoxine oder Zellrückstände oder beide mit den Endotoxinen zusammen vorliegend zu haben, zunächst um sich die Arbeit ihrer Auftrennung zu sparen und dann auch, um die antigenen Wirkungen, die sie besitzen können, auszunützen.

Die Einführung in den Darm, d. h. die Applikation, der

Endotoxine von lediglich einem der zuvor genannten Stämme von Salmonella oder lediglich von einem der zuvor genannten Stämme von E. coli hat insoweit eine gewisse günstige Wirkung, als die Fähigkeit dieses Stammes Schaden anzurichten, vermindert wird. Jedoch wird es vorgezogen, die Endotoxine von sowohl S. dublin als auch von S. typhimurium und die Endotoxine aller Stämme von E. coli zu applizieren. Die zu applizierenden Endotoxine können durch Züchten eines jeden dieser Stämme, wobei eine Probe eines jeden Stammes vom Central Veterinary Laboratory, Ministry of Agriculture and Fisheries, New Haw, Weybridge, Surrey Großbritannien oder von der National Collection of Type Cultures erhältlich ist, und nach dem Voranschreiten des Wachstums des Mikroorganismus und damit der Erzeugung von Endotoxinen bis zu einem geeigneten Ausmaß durch Abtöten der sich vermehrenden Mikroorganismen und Freisetzung der Endotoxine erhalten werden. Letztere-, kann durch Abkochen oder durch Behandlung im Autoklaven erreicht werden. Die gesamten, sterilisierten Kulturen, wovon jede Exotoxine und die ZeI!rückstände wie auch die Endotoxine enthält, können dann zusammengegeben und appliziert werden.

Alternativ können jedoch auch statt der Sterilisation der gesamten Kulturen die Bakterien abgetrennt, üblicherweise durch Zentrifugieren, und in einem kleinen Volumen eines wäßrigen Mediums, z. B. in Wasser oder einer Salzlösung, zum Abtöten der Bakterien und zur Freisetzung der Endotoxine behandelt werden.

Die einfachste und wirtschaftlichste Weise zum Abtöten der abgetrennten Bakterien ist das Erhitzen. Falls das Erhitzen ausreichend lange andauert, z. B. eine Stunde bei 100° C, 20 Minuten bei 125° C, wird ein großer Teil des Endotoxins aus seiner Verbindung mit den Zellwänden der abgetöteten Bakterien gelöst und in das Medium, in welchem das Erhitzen durchgeführt wird, freigesetzt. Die restlichen, gebundenen Endotoxine können gegebenenfalls durch Behandlung mit einem Enzym wie Trypsin in Lösung gebracht werden, wie dies z. B. in der niederländischen Patentschrift 71 07 538 beschrieben ist.

In der Praxis erfolgt die Applikation der Endotoxine mit üblichen Futtermittelbestandteilen, z. B. Protein, Fett, Kohlehydrat, Vitaminen und mineralischen Elementen, z. B. Kalzium und Phosphor. Auf diese Weise können die Endotoxine für die Applikation mit Magermilchpulver, Getreide oder mineralischen Elementen vermischt werden, oder sie können einem vollständigen Futtermittel zugesetzt werden, d. h. einem Futtermittel, welches alle lebenswichtigen Komponenten wie Protein, Fett usw. der Nahrung enthält.

Die Erfindung ist bei der Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektion von Kälbern von besonderer Bedeutung, wenn diese vom Muttertier weggenommen und als Folge hiervon ganz besonders Streß-Situationen ausgesetzt sind. Durch Beginn der Eingabe des Endotoxinmaterials in einem frühen Alter, geeigneterweise mit vier bis zehn Tagen, und vorzugsweise zu der letzten Fütterungszeit mit dem Muttertier oder kurz danach und durch Fortführung während einer angemessenen Zeitspanne, vorteilhafterweise bis zu einem Alter von vier bis sechs Wochen, kann der Darm der Kälber zur Erzeugung geeigneter Antikörper angeregt werden, so daß zu dem Zeitpunkt, zu dem das Kalb einer starken Infektionsgefahr ausgesetzt ist, eine ausreichend hohe Zirkulation von Antikörpern in dem Darm vorhanden ist, um entweder mit der Vermehrung irgendwelcher, mit der Nahrung aufgenommener, pathogener Bakterien fertig zu werden oder zumindest die Schwere irgendeines Erkrankungszustandes, der sich dennoch entwickelt, herabzusetzen. Das Endotoxinmaterial kann zu diesem Zweck in einen sogenannten »Milchersatzstoff« eingegeben werden, d. h. in die Nahrung, welche speziell zusammengestellt wird, um den Ernährungsbedürfnissen von Kälbern Rechnung zu tragen, wenn sie von dem Muttertier weggenommen werden. Es kann ebenfalls in die erste, trockene Nahrung eingegeben werden, welche

ίο in Verbindung mit Milch oder einem Milchersatzstoff beim Entwöhnen gegeben wird. Es ist vorteilhaft, die Endotoxine in Form einer trocknen, festen Vormischung mit einem oder mehreren der Nahrungsmittelbenandteile Protein, Fett, Kohlehydrat oder mineralisehen Elementen zur Verfugung zu stellen, wobei der Verbraucher diese Vormischung mit den restlichen Bestandteilen des Futters vermischt.

Gegebenenfalls können Endotoxine der Salmonellenstämme zusammen mit denjenigen der Stämme von E.

coli enthaltende Futtermittel hergestellt werden.

Die minimalen Dosisraten liegen im Bereich von i bis 10 Einheiten der Endotoxine eines jeden Bakterientyps pro Kalb pro Tag, wobei hinsichtlich der Messung einer Einheit auf die folgenden Beispiele verwiesen wird. Es wurde jedoch gefunden, daß Kälber, denen die lOOOfache Menge dieses Wer'-^s gegeben wurde, keine Krankheitserscheinungen zeigten. Ein sehr geeigneter Wert für eine Eingabe in ein Futtermittel für Kälber beträgt 10 bis 1000 Einheiten der Endotoxine eines jeden Serotyps pro kg des Futtermittels.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1
Herstellung und Isolierung von Endotoxin

Endotoxine können aus den Salmonellenstämmen und den sieben Serotypen von E. coli nach folgender Methode hergestellt werden, welche im allgemeinen mit der Methode von Westphal, Luderitz und Bister, Z. Naturforsch. 7 (1952), S. 148 übereinstimmt.

Eine gefriergetrocknete Kultur des Mikroorganismus wird in Peptonwasser gequollen und 6 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach einem geeigneten Wachstum wird die Kultur auf ihre Reinheit auf einer gewaschenen Schafblutagarplatte untersucht und dann zur Impfung von Schrägnähragar (Oxoid) in Roux-Flaschen verwendet. 3ie Kultur wird über Nacht bei 37°C wachsen gelassen, und die Bakterien werden in sterilem, destilliertem Wasser gesammelt. Die erhaltene Bakteriensuspension wird aseptisch in 30 ml Universalflaschen gegeben und bei 4000 Upm während 10 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und das zurückbleibende Bakterienpellet wird in 4 ml sterilem, destilliertem Wasser erneut suspendiert und dann gefriergetrocknet.

Zur Isolierung der Endotoxine werden 0,5 g des gefriergetrockneten Materials in 5 ml 0,15 M NaCl suspendiert, und es werden 10 ml 90%iges wäßriges Phenol als lysierendes Mittel hinzugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten auf 68°C unter dauerndem Rühren erwärmt, anschließend wird es bei 4000 Upm zum Verdichten der Zellrückstände zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird entfernt und auf 4°C abgekühlt, hierzu werden langsam 10 Volumen von eisgekühltem Äthanol hinzugegeben. Der so gebildete Niederschlag wird in Wasser erneut aufgelöst und die Nukleinsäuren werden aus der Lösung

durch Zugabe von 2 Volumen Äthanol ausgefällt und entfernt. Aus der Restlösung werden die Endotoxine durch Zugabe von weiteren 8 Volumen Äthanol ausgefällt. Sie werden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit eisgekühltem Äthanol gewaschen und in 0,15 M NaCI erneut aufgelöst. Diese Lösung der Endotoxine wird im folgenden als Reagens 1 bezeichnet.

Beispiel 2

Untersuchung von Endotoxinen
a) Herstellung von Antiserum

Spezifische, hyperimmune Seren (Antiseren) werden in weißen, Neuseeländer Kaninchen gegen gewaschene, durch Hitze abgetötete (100⁰C, 2,5 Stunden) Organismen eines jeden der Serotypen von E. coli und Salmonella erzeugt.

Suspensionen der durch Hitze abgetötete Organismen werden in 0,15 M NaC! (etwa 3 χ 10^Λ Organismen/ ml) hergestellt, und intravenös injiziert. Das Immunisierungsprogramm beginnt mit einem Injektionsvolumen von 0,1 ml und wirkt an jedem vierten Tag unter Verdopplung der Volumen bis 1,6 ml fortgeführt. Von den Kaninchen wird zehn Tage nach Abschluß des Programmes das Blut entnommen und dieses erhaltene Blut zentrifugiert. Die obere Schicht des Hyperimmunserums wird gesammelt. Dieses Antiserum wird als Reagens 2 bezeichnet.

b) Messung der Antikörper (Anti-Endotoxine]
Aktivität im Antiserum

sungen gleichen Volumens (3 Vol.) mit den Endoioxinkonzentrationen 1/3, 1/6, 1/12, 1/24 usw. derjenigen der Lösung Y zu erhalten. Zu jeder dieser Lösungen werden Vol. des Reagens 2 (Antiserum), welches so verdünnt wurde, daß es einen Titer von 20 (siehe zuvor unter b)) besitzt, und dann nach einigen Minuten 1 Vol. des Reagens 3 (sensibilisierte Schaferythrocyten) hinzugegeben, wobei letztlich Endotoxinkonzentrationen von 1/5,1/10, 1/20 ... 1/(5 χ 2"-^!) derjenigen von Lösung Y erhalten werden. Die Hämagglutination wird in den stärkeren Endotoxinlösungen inhibiert, tritt jedoch in den schwächeren auf. und der Endpunkt der Titration wird bei der Lösung angenommen, in welcher eine Hämagglutination gerade noch verhindert wird. Bei einer typischen Arbeitsweise erfolgte dies bei der sechsten Lösung mit einer Endotoxinkonzentration = 1/(5 χ 2^s) derjenigen der Lösung Y. Hieraus ergibt sich, daß die Lösung Y einer Titer von 5 χ 2⁵(= 160) besitzt, der 160 Einheilen Endotoxin/ml äquivalent ist, siehe Beispiel 3).

Erythrocyten vom Schaf werden durch Behandlung einer 5%igen Suspension von gewaschenen, gepackten Zellen mit einem gleichen Volumen der Endotoxinlösung Reagens 1 bei 37^CC während 30 Minuten sensibilisiert. Di. sensibilisierten Zellen werden durch Zentrifugieren abgetrennt, frei von überschüssigen Endotoxinen gewaschen und erneut in 0,15MNaCl unter Bildung einer 2.5%igen Suspension von mit Endotoxin sensibilisierten Schaferythrocyten suspendiert. Diese Suspension wird als Reagens 3 bezeichnet.

Das -Reagens 2, d. h. das AntLerum, wird der Reihe nach mit 0.15 M NaCl verdünnt, um eine Reihe von Lösungen von gleichem Volumen (1 Vol.) mit einer Antikörperkonzentraiion von 1/5. 1/10, 1/20, 1/40 ... 1/(5 χ 2"-') derjenigen von Reagens 2 zu erhalten, und zu jeder dieser Lösungen werden 1/5 Vol. des Reagens 3 hinzugegeben. In den stärkeren Antiserumlösungen tritt eine Hämagglutination auf, jedoch nicht in den schwächeren Lösungen, und als Endpunkt der bei 4¹³C durchgeführten Titration wird die Lösung angesehen, in weleher die Hämagglutination gerade noch auftritt. Bei einer typischen Arbeitsweise liegt der Endpunkt bei der zwölften Lösung, d. h. bei der Lösung, welche eine Antikörperkonzentration von 1/5 χ 2") derjenigen von Reagens 2 besitzt.

Daher kann dem Reagens 2 ein Antiserumtiter von 5 χ 2" (—10.240)zugeschrieben werden.

c) Messung der Endotoxinkonzentration in Lösung
von unbekannter Konzentration

Die zu untersuchu.de Lösung (Y) wird der Reihe nach mit 0.15 M NaCI verdünnt, um eine Reihe von Lö-Beispiel 3
A. Herstellung von rohem Endotoxinmaterial

Die folgende Arbeitsweise wurde getrennt bei jedem der Salmonellenstämme und jedem der Seroiypen von E. coli, die zuvor genannt wurden, durchgeführt.

(i) Das Bakterium wurde von einer niedergelegten Vorratskultur auf gewaschenen Blutagarplatten im Falle von E. coli und auf Nähragarplatten im Falle von Salmonella aufgestrichen und 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann in geeigneter Weise auf Reinheit des Stammes untersucht.

(ii) Kolonien des Bakteriums wurden von den Platten in 50 ml Oxoid-Nährbrühe Nr. 2 (Katalog No. CM 67) überführt.

Die Brühe bzw. Nährflüssigkeit wurde 24 Stunden bei 37°C gehalten.

Die gesamte unter (ii) erhaltene Kultur wurde zum Impfen von 1,5 ml Oxoid-Nährbrühe Nr. 2 verwendet, und die Nährflüssigkeit wurde unter Schütteln 24 Stunden bei 37° C inkubiert. Jede auf diese Weise erhaltene Endkultur enthielt 10⁹ — 10¹⁰ lebensfähige 8akterien/ml. Proben der Kulturen von E. coli ergaben, wenn sie 2 Stunden bei 125° C mit Dampf behandelt worden waren und der Untersuchungsmethode des Beispiels 2) unterworfen wurden, einen Titer von 2560, was 2560 Einheiten Endotoxin pro ml der mit Dampf behandelten Kultur entspricht. Proben der Kulturen von S. dublin und S. typhimurium wurden gleicherweise wie die Kulturen von E. coli mit Dampf behandelt und untersucht und ergab;π einen Titer von 1280. jede der neuen Kulturen, d. h. 7 Arten von E. coli und jeweils eine der Salrnonellen-Serotypen, wurden zur Abtrennung der Bakterien zentrifugiert, welche dann teilweise erneut in der abgetrennten, überstehenden Muaerflüssigkeit suspendiert wurden, um eine Suspension mit einer 30fachen Konzentration derjenigen der Kultur vor dem Zentrifugieren zu erhalten. Jede Suspension wurde getrennt 2 Stunden in einem Autoklaven bei 125°C zum Abtöten der Bakterien mit Dampf behandelt, dann wurden die neuen mit Dampf behandelten Suspensionen zusammengegeben.

7
B. Herstellung des oralen Mittels für Kalber

Das unter A. erhaltene, zusammengegebene, mit Dampf behandelte Material (1 Gewiehtsteil) wurde mit 19 Teilen Molkepulver vermischt, und das entstandene Gemisch wurde in einem üblichen Milchersatzstoff der folgenden Zusammensetzung eingegeben:

Gew.-%

Magermilchpulver mit	77
zugesetztem Fett	17.1
Molkepulver	5
Glukose	0.3
gefällter Kalk	0.4
Dikalziumphosphat
.Spurenmineralien und	0,2
Vitamine auf Träger

In dem erhaltenen Produkt betrug die Konzentration der Endotoxine:

Endotoxine von jedem

Serotyp von E. coli 100 Einheiten/kg

des Futtermittels

Endotoxine von jedem

Serotyp von Salmonella 50 Einheiten/kg

des Futtermittels

30

40

50

Claims

Patentanspruch:

Verwendung eines Kälberfuttermittels das neben den üblichen Futtermittelbestandteilen ein aus inaktivierten Zellen eines oder mehrerer gezüchteter pathogener Bakterientypen, die an der Auslösung von Erkrankungen des Darmtraktes von Kälbern beteiligt sind, stammendes Antigenmaterial enthält, zur Verminderung der Anfälligkeit der Kälber gegenüber Krankeiten des Darmtraktes, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigenmaterial Endotoxine eingesetzt werden, die erhalten worden sind durch Züchten von pathogenen, auf den Darmtrakt von Kälbern infektiös wirkenden Bakterien und Abtöten der gezüchteten Bakterienkuliuren unter Freisetzung der Endotoxine und daß der Kälberfuttermittel in einer solchen Menge zur Verfugung gestellt wird, daß mindestens 1 bis 10 Hämagglutinationsriernmeinheiien der Endotoxine eines jeder. Bakterientyps pro Kalb pro Tag aufgenommen werden.