DE2360118C3 - Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose - Google Patents
Impfstoff gegen Ferkel-ColibacilloseInfo
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Description
Die neonatale Colibacillose des Schweins ist eine
wichtige Todesursache bei Ferkeln. Es sind bereits zahlreiche Versuche unternommen worden, um diese
Krankheit durch aktives Immunisieren des Muttertieres gegen Escherichia coli entweder durch Tot- oder
Lebendimpfstoffe oder durch Verabreichen von Escherichia coli-Antiserum an die Schweine zu bekämpfen.
Die aktive Immunisierung der Mutterschweine ist durch parenterale Verabreichung von Escherichia
coli-Impfstoffen (vgl. z. B. M. R. Wilson und J. Svendsen,
Amer. J. VeL Res, Band 32 [1971], Seiten 891 bis 898)
vorgenommen worden. Da jedoch der bzw. die zur Immunisierung verwendeten Escherichia coli-Stämme
nur spezifische Antikörper hervorrufen, während mit einem bestimmten Ausbruch der Krankheit mehrere
und verschiedene Stämme verbunden sein können, haben diese Versuche zur Vorbeugung auf Basis einer
antibakteriellen Immunität widersprechende und im allgemeinen unbefriedigende Resultate ergeben. Selbst
wenn in einigen Fällen ein guter Schutz erhalten wurde, war er auf die in dem Impfstoff enthaltenen Serotypen
von Escherichia coli beschränkt.
Die Verabreichung von Antiserum (vgl. z. B. O. P.
Miniats, Can. VeL J, Band 11 [1970], Seiten 52 bis 56)
kann keine praktikable Vorbeugung gegen Ferkel-Colibacillose gewährleisten. Der durch die Verabreichung
von Antiserum erreichte Schutz ist tatsächlich von kurzer Dauer und erfordert eine kontinuierliche
Verabreichung an die Ferkel.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Verabreichung von hitzelabilem (LT) Escherichia
coli-Enterotoxin mit einem Adjuvans an trächtige Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln
anstelle der Verabreichung ganzer Zellen von Escherichia coli die geimpften Mutterschweine nicht nur
Antikörper in ihrem Kolostrum und in ihrer Milch entwickeln, sondern dadurch auch die Ferkel gegen die
Wirkung der Enterotoxine geschützt werden. Der Schutz erstreckt sich gegen die Wirkung von Enterotoxinen,
die durch Escherichia coli-Serotypen gebildet werden, weiche sowohl homolog als auch heterolog zu
dem Escherichia coli-Stamm sein können, aus dem das
hitzelabile (LT) Enterotoxin isoliert wurde. Mit anderen Worten, der Schutz besteht nicht nur gegenüber dem
Enterotoxin aus dem gleichen enteropathogenen E. coli-Stamm, aus dem das hitzelabile Enterotoxin
gewonnen wurde, sondern auch gegenüber jedem anderem Enterotoxin von enteropathogenen E. coli-Stämmen.
Die Verabreichung des hilzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins an das Muttertier schützt
die Ferkel nicht nur gegen die durch das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin verursachte Colibacillose,
sondern auch gegen die durch das hitzestabile (ST) Enterotoxin verursachte Colibacillose.
Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose zur Verfügung
zu stellen, mit dem diese Krankheit zuverlässig bekämpft werden kann. Diese Aufgabe wird durch die
Erfindung gelöst
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen bezeichneL
Das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin kann aus jedem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp
isoliert werden, der die Ferkal-Colibacillose hervorrufen kann und notwendigerweise das hitzelabile
(LT) Escherichia coli-Enterotoxin enthält Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen enteropathogene.i Escherichia
coli-Serotyps ist der bei der American Type Culture
Collection, Rockville, Maryland, V.SLA. unter der
Nummer ATCC 21 972 hinterlegte Escherichia coli-Stamm.
Die Isolierung des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins ist bekannL Sie ist von GYLES und
BARNUM (J. InfecL Dis, Band 120 [1969J Seiten 419 bis
426) beschrieben worden; Variationen dieses Verfahrens sind von H. W. SMITH und C. L GYLES (J. Med.
Microbiol, Band 3 [1970], Seiten 387 bis 401), H.W. SMITH und S. HALLS (J- Path. BacL, Band 93 [1967],
Seiten 531 bis 543) und M. R. WILSON, C. GYLES und J. SVENDSEN (Cand. J. Comp. Med, Band 35 [1971],
Seiten 294 bis 297) beschrieben worden. Sämtliche dieser Verfahren und sämtliche andere, bekannte
äquivalente Verfahren können zur Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten hitzelabilen (LT) Escherichia
coli-Enterotoxinpräparats benutzt werden.
Für die vorliegende Erfindung ist es nicht erforderlich, das hitzelabile (LT) Escherichia coli-Enterotoxin
rein herzustellen. Eine solche Reinigung könnte gegebenenfalls z. B. durch Elektrophorese, Dichtegradienten-Ultrazentrifugation
oder Adsorption, Elution an hydrophilen vernetzten Dextranen, wie Sephadex·, vorgenommen werden. Für die vorliegende Erfindung
ist es im wesentlichen ausreichend, daß das Enterotoxin freigesetzt und von den Escherichia coli-Zellen abgetrennt
wird und praktisch frei von Lipopolysacchariden ist.
Als Adjuvans, das die Aufgabe hat, eine starke Immunreaktion zu gewährleisten, kann erfindungsgemaß
jedes Produkt oder Gemisch verwendet werden, von dem man weiß, daß es bei Impfstoffen als Adjuvans
wirLt. Spezielle Beispiele adäquater Adjuvantien sind gelförmige Aluminiumverbindungen, wie Aluminiumhydroxid,
Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxid-
Gel, und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Adjuvans 65 (eine Wasser-in-ÖI-Emulsion von Antigen in Erdnußöl,
das durch Mannitmonooleat emulgiert und durch Aluminiummonostearat stabilisiert ist) und komplettes
Freund's Adjuvans (eine Wasser-in-Öl-Emulsion von Paraffinöl, das mit Mannitmonooleat emulgiert ist und
abgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält).
Zur Bekämpfung der Ferkel-Colibacillose wird eine wirksame Menge des hitzelabilen (LT) Escherichia
coli-Enterotoxinpräparats mit dem Adjuvans an trächtige Mutterschweine intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Die Dosiereinheit beträgt mindestens 5 mg und vorzugsweise 10 bis 150 mg gefriergetrockneten Extrakt.
Beispiel 1
Züchtungsmedium (fest)
Züchtungsmedium (fest)
130 g BACTO-TRYPTOSEe-Brüiie und 150 g BAC-TO-AGAR
werden mit 10 Liter Wasser versetzt Das Gemisch wird unter Rühren 60 Minuten auf 121°C
erhitzt 20 g BACTO-Dextrose werden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird durch
ein Millipore-Sterilisierfilter von 0,45 Mikron filtriert
Die beiden Präparationen werden vereinigt und in aliquoten Teilen von 110 ml in 500-cm2-Roux-Kolben
verteilt
Herstellung der Anzuchtkultur
Der Stamm Escherichia coli ATCC 21 972 wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung rehydratisiert
und 18 Stunden bei 37° C in Petri-Schalen inkubiert, die
jeweils 20 ml TRYPTOSE-AGAR-Festmedium enthalten, das durch Vermischen von 26 g TRYPTOSE-Brühee
und 30 g AGAR DIFCO® Auffüllen mit Wasser bis zu einem Volumen von 1 Liter und 45minütiges Erhitzen
des Gemisches auf 115°C hergestellt wird.
Sodann wird ein flüssiges Kulturmedium (als PP3
bezeichnet) wie nachstehend beschrieben hergestellt: 30 g Proteose-Pepton Nr. 3.
4 g Hefeextrakt und 5 g Glucose werden in 1 Liter Wasser bei 600C gelöst Nach dem Abkühlen wird die
Lösung mit 5 g NaCl, 5,05 g Na2HPO4 und 1,2 g KH2PO4
versetzt Das Medium, dessen pH-Wert 6,9 bis 7,0 beträgt, wird durch ein Seitz-EKS-Filter filtriert und in
100-ml-Kulturkolben verteilt
Diese Kulturkoiüen werden mit den auf den Petri-Schalen erhaltenen gtatten Kolonien beimpft,
wobei eine Kolonie auf 2OmJ flüssiges PP3-Medium
verwendet wird. Die beimpften KuItI kolben werden unter Schütteln auf einer Schütteleinrichtung (22 bis 24
Schüttelbewegungen pro Minute) 6 Stunden bei 37° C inkubiert
Züchtung von Escherichia coli
Jeder der das Züchtungsmedium enthaltenden 500-cm2-Roux-Kolben wird mit einem aliquoten Teil
von 4 ml der in dem flüssigen PP3-Medium erhaltenen
Escherichia coli-Kultur, d. h. mit etwa 4 χ 109 Bakterien,
beimpft Die Kolben werden unter Schütteln auf Schütteleinrichtungen mit 22 bis 24 Schüttelbewegungen
pro Minute einen Tag bei 37° C inkubiert. Jede Zellkultur wird in 25 ml destilliertem Wasser geerntet,
und die Ernten aus 15-Roux-Kolben (eine Serie) werden
in 1-Liter-Kolben vereinigt Aus jeder Serie wird eine
Probe von 1 ml zur Reinheitsprüfung entnommen.
Hierzu werden 04 ml auf TRYPTOSE-AGAR-Brühe®
in Petri-Schalen eingesät und 7 Tage bei 34° C inkubiert Die restlichen 0,5 ml werden in Petri-Schalen
eingesät, die 20 ml Sabouraud-Dextrose-Agar enthalten, der durch Auflösen von 65 g Sabouraud-Dextrose-Agar
DIFCO in 1 Liter heißem destilliertem Wasser und anschließendem Sterilisieren hergestellt wird. Die
Kultur wird 7 Tage bei 22° C inkubiert.
Die Ernten werden mit einer sterilen, wäßrigen lprozentigen Neomycinsulfat= Lösung (1,2 ml Neomy·
cinsuIfat-Lösung pro 100 ml Ernte) versetzt. Die Zellen werden durch 30minütiges Beschallen des Mediums in
einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 aufgebrochen, wobei das Medium in einem schmelzenden
Eisbad gehalten wird.
Nach dem Aufbrechen der Zellen wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 5°C und
2550 UpM zentrifugiert Der Oberstand wird zunächst durch ein Klärfilter und dann durch ein Millipore-Sterilisierfilter
filtriert
Das Filtrat wird mit zuvor durch Äthylenoxid sterilisiertem Ammoniumsulfat bis zur 50prozentigen Sättigung (380 g Ammoniumsulfat prc Liter Filtrat) versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird 2 Stunden bei 5° C und 2550UpM zentrifugiert Das Dediment wird in einen hauptsächlich aus regenerierter Cellulose bestehenden Beutel gegossen und gegen fließendes Wasser dialysiert, bis die mit Nesslers Reagens bestimmte Konzentration des Ammoniumsulfats auf 0,1 bis 0,01 Prozent gesunken ist
Das Filtrat wird mit zuvor durch Äthylenoxid sterilisiertem Ammoniumsulfat bis zur 50prozentigen Sättigung (380 g Ammoniumsulfat prc Liter Filtrat) versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird 2 Stunden bei 5° C und 2550UpM zentrifugiert Das Dediment wird in einen hauptsächlich aus regenerierter Cellulose bestehenden Beutel gegossen und gegen fließendes Wasser dialysiert, bis die mit Nesslers Reagens bestimmte Konzentration des Ammoniumsulfats auf 0,1 bis 0,01 Prozent gesunken ist
Die Sterilisation des Enterotoxinpräparats erfolgt durch Filtrieren durch ein Millipore-Sterilisierfilter von
0,45 Mikron und Gefriertrocknen.
Herstellung des Impfstoffes
Ein aliquoter Teil von 1 g des in Beispiel 1 erhaltenen gefriergetrockneten Enterotoxinpräparats wird durch
Zugabe von 20 ml steriler, Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) rehydratisiert Die
sterile, Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung besteht aus
8 g NaCl,
2 g KCl,
IUg Na2HPO4,
2 g KH2PO4,
1,325 g CaCI2 χ 2 H2O,
Ig MgCl2 χ 6 H2O
und 10 Liter destilliertem Wasser.
8 g NaCl,
2 g KCl,
IUg Na2HPO4,
2 g KH2PO4,
1,325 g CaCI2 χ 2 H2O,
Ig MgCl2 χ 6 H2O
und 10 Liter destilliertem Wasser.
Das so erhaltene Präparat wird unter sterilen Bedingungen mit 20 ml sterilem komplettem Freund's
Adjuvans, d. h. mit einer mit Mannitmonooleat emulgierten
und abgetötetem Mycobacterium tuberculosis versetzten Wasser-in-Öl-Emulsion von Paraffinöl,
gründlich vermischt. Der erhaltene Impfstoff wird in 4-ml-Ampullen verteilt, die entweder abgeschmolzen
oder dicht verschlossen werden und eine (LT) Enterotoxinmenge entsprechend 100 mg gefriergetrocknetem
Präparat pro Ampulle enthalten. Der Inhalt jeder Ampulle entspricht einer Impf-Dosiereinheit Der
Impfstoff wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan
verabreicht
Der Impfstoff kann auch in größere Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige Vielfache der Dosiereinheit
und somit die entsprechenden Vielfach-Dosen-Impfpräparate
erhalten werden.
Da» Verfahren wird bis einschließlich der östiindigen
Inkubation von Escherichia coli ATC 21 972 bei 37° C in
flüssigem PP3-Medium wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Züchtung von Escherichia coli wird dann in einem flüssigen Züchtungsmedium wie nachstehend beschrieben
vorgenommen:
Aliquote Teile von 6 ml der so erhaltenen Escherichia
coli·Kultur (d.h. etwa 6xlO9 Bakterien) werden in
300 ml flüssiges PP3-Medium enthaltende Züchtungskolben eingeimpft. Die Kulturen werden einen Tag
unter Schütteln auf Schütteleinrichtungen (22 bis 24 Schüttelbewegungen pro Minute) inkubiert. Die Ernten
aus 5 Züchtungskolben (eine Serie) werden vereinigt. Jede Ernteserie wird 2 Stunden bei 2550 UpM
zentrifugiert, das Sediment wird in 150 ml destilliertem
Wasser suspendiert, und eine Suspensionsprobe wird wie in Beispiel 1 auf Reinheit geprüft.
Die Zellsuspension wird 30 Minuten in einem Branson-Europa-Beschallungsgerät Modell J 22 beschallt,
wobei das Medium in einem schmelzenden Eisbad gehalten wird. Nach dem Aufbrechen der Zellen
wird die Suspension zum Abtrennen der Zelltrümmer 2 Stunden bei 500C und 2550 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wird durch ein Millipore-Sterilisierfilter von
0,45 Mikron filtriert, wobei 100 ml Filtrat erhalten
werden. Der pH-Wert des Filtrats wird mit n-Salzsäure
auf 6,4 eingestellt Das Filtrat wird dann mit Thiomersal
bis zu einer Endkonzentration von 0,02 Prozent versetzt
Herstellung des Impfstoffes
40 ml einer 2prozentigen wäßrigen Lösung von Aluminiumhydroxidgel werden gründlich mit 80 ml des
in Beispiel 3 erhaltenen Filtrats vermischt Die Adsorption des Enterotoxins an dem Gel wird mittels
des Ausfällungsversuchs mit Trichloressigsäure geprüft
20 ml des Überstands werden verworfen. Das restliche Gemisch wird in zehn 10-mI-Ampullen verteilt
die verschlossen werden. Der Inhalt jeder Ampulle (9 ml) entspricht einer Impfdosiereinheit von 100 mg
(auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxins.
Der Impfstoff wird trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder
subkutan verabreicht Der Impfstoff kann auch in größere Ampullen verteilt werden, wobei ganzzahlige
Vielfache der Dosiereinheit und somit die entsprechenden Vielfachdosen-Impfpräparate erhalten werden.
Das Verfahren wird wie in Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch das Gemisch in 100 Glasampullen verteilt
wird, die verschlossen werden. Der Inhalt jeder Ampulle
Tabelle I: Versuch 1
(0,9 ml) entspricht einer Impfdosiereinheit von 10 mg
(auf Trockengewichtbasis) des hitzelabilen (LT) Fseherichia
coli-Enterotoxinextrakts. Der Impfstoff wird
trächtigen Mutterschweinen 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln intramuskulär oder subkutan verabreicht
Wirkungsweise des Impfstoffes
Die Verhütung der Ferkel-Colibacillose durch subkutane
Verabreichung der erfindungsgemäßen hitzelabilen (LT) Escherichia coli-Enterotoxinpräparate wird
durch die nachfolgenden Versuche 1,2 und 3 gezeigt In jedem dieser Versuche werden die Mutterschweine 3 bis
6 Wochen vor dem Ferkeln geimpft und ein Mutterschwein wird als Kontrolltier verwendet 24
Stunden nach der Geburt werden die Ferkel pro kg Körpergewicht mit 400 mg des gemäß Beispiel 1
hergestellten (LT) Escherichia coli-Enterotoxins infiziert wobei für die Verabreichung ein Magenschlauch
verwendet wird. Bei drei Würfen werden einige Ferkel — wie aus den nachstehenden Tabellen I bis IU
ersichtlich — mit 660 mg ias aus dem Stamm
ATCC 21 972 erhaltenen hitzestabüen (ST) Escherichia coli-Enterotoxin infiziert Die klinische Entwicklung der
Ferkel wird fachgerecht verfolgt, wobei auf das Auftreten typischer Symptome der Colibacillose geachte'·,
ivird.
In den Tabellen I bis III bedeutet
Impfstoff A:
Impfstoff des Beispiels 1 mit rOO mg (auf Trockengewichtbasis)
Dosiereinheit
Impfstoff B:
Impfstoff des Beispiels 2 mit 100 mg (auf Trockengewichtbasis)
Dosiereinheit
Impfstoffe:
Impfstoff des Beispiels 3 mit 10 mg (auf Trockengewichtbasis) Dosiereinheit
Mutterschwein | geimpft | Ferkel | infiziert | Diarrhöe | Sterblich | Gewicht, Prozent |
Nr. | mit | Nr. | mit | Anzahl der Dauer, | keit | PA Stunden nach |
Stunden zwischen Stunden | der Infektion) | |||||
Infektion und | ||||||
Ausbruch | ||||||
A | LT | _ — | — | keine Änderung | ||
2 | 2-10 | LT | - | - | + 3,5 | |
2-11 | LT | - - | - | + 9,5 | ||
2-12 | LT | - | - | keine Änderung | ||
2-13 | ST | - | - | + 3,6 | ||
2-14 | ST | - | - | ireäne Änderung | ||
2-15 | ST | - | - | + 2,8 | ||
A | 2-16 | LT | _ _ | - | + 10,6 | |
3 | 3-17 | LT | - | - | + 11,8 | |
3-18 | LT | - | - | + 6,3 | ||
3-19 | LT | - | - | + 5,8 | ||
3-20 | ST | - - | - | + 10 | ||
3-21 | ST | _ | - | + 11,9 | ||
3-22 | ST | - | - | + 10,4 | ||
3-23 | ST | _ — | _ | + 7.5 | ||
3-24 | ||||||
Fortsetzung
Mutterschwein
geimpft
mit
mit
Ferkel
Nr.
13-119 13-120 13-121 13-122
infiziert mit
Diarrhöe
Anzahl der Stunden zwischen Infektion und Ausbruch
Dauer.
Stunden
Stunden
Sterblichkeit
Gewicht, Prozent (24 Stunden nach der Infektion)
10 | 10-01 | LT | 6 | 24 | - 10 |
(Kontrolle) | 10-02 | LT | 6 bis 12 | 24 | - 10,9 |
10-03 | LT | 6 | 12 | - 5.3 | |
10-04 | LT | 6 | 96 | + - 14,7 | |
10-05 | LT | 6 bis 12 | 10 | - 7.6 | |
10-06 | ST | - | - | keine Änderung | |
!0-07 | ST | 1 | 3 | _ keine Äridsmri" | |
10-08 | ST | - | - | - keine Änderung | |
10-09 | ST | 6 | 12 | keine Änderung | |
Tabelle II: Versuch 2 | |||||
Mutterschwein | Ferkel | ||||
Nr geimpft | Nr. | infiziert | Diarrhöe | Sterblich- Gewicht. Prozent. | |
mit | mit | Anzahl der | Dauer. | keit (24 Stunden nach | |
Stunden zwischen | Stunden | der Infektion) | |||
Infektion und | |||||
Ausbruch | |||||
47 A | 47-12 | LT | _ | _ | keine Änderung |
47-I3 | LT | - | - | + 9.2 | |
47-14 | LT | - | - | keine Änderung | |
47-15 | LT | - | - | + 6.4 | |
47-16 | LT | - | - | + 6.6 | |
48 B | 48-08 | LT | - | + 5,2 | |
48-09 | LT | - | - | + 6,7 | |
48-10 | LT | - | - | + 3.7 | |
48-11 | LT | - | - | + 10,5 | |
50 | 50-01 | LT | 5 | 21 | + - 19,8 |
(Kontrolle) | 50-02 | LT | - | - | keine Änderung |
50-03 | LT | - | - | + 2,6 | |
50-04 | LT | 6 | 14-21 | + -22,1 | |
50-05 | LT | 14 | 48 | + -18,8 | |
50-06 | LT | 21 | 10 | - 3,2 | |
50-07 | LT | 6 | 21 | + -28,5 | |
Tabelle III: Versuch 3 | |||||
Mutterschwein | Ferkel | ||||
Nr. geimpft | Nr. | infiziert | Diarrhöe | Sterblich- Gewicht, Prozent | |
mit | mit | Anzahl der Stunden zwischen |
Dauer, Stunden |
keit (24 Stunden nach Infektion) |
|
Infektion und | |||||
Ausbruch |
LT LT LT LT
+ 8,4
+ 11,4
+ 2
+ 11,4
+ 2
Fortsetzung
geimpft
mit
21*) C
20
(Kontrolle)
(Kontrolle)
l-erkel
Nr.
13-123
13-124
13-125
13-126
13-127
13-128
13-124
13-125
13-126
13-127
13-128
21-110
21-111
21-112
21-114
21-115
21-116
21-117
21-118
21-111
21-112
21-114
21-115
21-116
21-117
21-118
15-129
15-130
15-131
15-132
15-133
15-130
15-131
15-132
15-133
20-101
20-102
20-103
20-104
20-105
20-106
20-107
20-108
20-109
20-102
20-103
20-104
20-105
20-106
20-107
20-108
20-109
infi/iert | Diarrhöe | Dauer, | Sterblich | Gewicht, Prozent |
mit | Anzahl der | Stunden | keit | (24 Stunden nach |
Stunden zwischen | Infektion) | |||
Infektion und | ||||
Ausbruch | ||||
LT LT LT LT LT LT
LT LT LT LT LT LT LT LT
LT LT LT LT LT
LT LT LT LT LT LT LT LT LT 40
48
6-11
48
48
25
19
6
6
4
6
6
4-9
6
4
6
6
4-9
6
6
6
*) 48 Stunden nach dem Ferkeln tritt Mastitis auf. **) Gewichtsverlust 4 Stunden nach dem Auftreten der Diarrhöe.
+ 7,1 + 8,1 + 8 + 5,8 -21 + 8,4
-15
- 6,9 -14,3
- 5,9
- 6,3
- 3,6
- 2 -12,5
+ 7,4
+ 4,9
+ 13,2
+ 16
keine Änderung
-- 3,6 -16,5
- 5,3
- 4,7
keine Änderung
- 3,2
- 5,7
- 4,2
Die Ergebnisse der Versuche zeigen, daß 6 von Würfen von geimpften Mutterschweinen gegen die
orale Infektion mit Escherichia coli-Enterotoxinen geschützt sind. Der erreichte Schutz beträgt 90 Prozent
für einen Wurf und 100 Prozent für die 5 anderen Würfe.
Kein von den Kontrollschweinen stammender Wurf ist widerstandsfähig gegen die gleiche Infektion mit
Enterotoxinen; die Sterblichkeit und Morbidität unter den Kontrollferkeln beträgt 71,4 bis 88,8 Prozent
In fünf von sieben Würfen von geimpften Mutterschweinen
sind sämtliche Ferkel vollständig geschützt; in einem Wurf sind 8 von 10 Ferkeln vollständig
geschützt Für die mit LT-Enterotoxin infizierten und von Kontrollschweinen stammenden Ferkeln werden
folgende Ergebnisse erhalten: In einem Wurf zeigen von 5 Tieren, im zweiten Wurf 5 von 7 Tieren und im
dritten Wurf 8 von 9 Tieren typische Symptome.
Ein aliquoter Teil von 12 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten und gefriergetrockneten Enterotoxinpräparats
wird in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem Wasser suspendiert Die Suspension wird mit einer
Lösung von 20 g Aluminiumhydroxidgel in 1 Liter pyrogenfreiem destilliertem Wasser vermischt. Der
pH-Wert wird mit η Salzsäure auf 6 eingestellt und das , Gemisch wird zur Adsorption des Enterotoxins an dem
Gel 40 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei hin und wieder gerührt wird. Der
End-pH-Wert beträgt 6,3.
Nach dem Zentrifugieren wird der Oberstand
verworfen und das Sediment durch Zugabe von 2,2 Liter eines 50:50-Gemisches aus physiologischem Serum
und Puffer 22 g Na2HPO4 (m/10) und 78 g KH2PO4
(m/10) und 10 mg Thiomersal auf 100 ml; pH 6,3, rehydratisiert. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 4°C
gerührt und in zwei 1100-ml-Chargen geteilt, die mit A
und B bezeichnet werden. Charge A enthält 5,4 mg des Enterotoxinpräparats und 9 mg Aluminiumhydroxidgel
pro ml und wird in aliquote Teile von 5 ml aufgeteilt, die somit 27 mg des Enterotoxinpräparats enthalten. Die
aliquoten Teile werden in Glasampullen gefüllt, die anschließend abgt'schmolzen werden. Charge B wird
verdünnt durch Zugabe von 303 ml eines 50 :50-Gemisches aus physiologischem Serum und Puffer, 22 g
Na2HPO4 (m/10) und 78 g KH2PO4 (m/10) und 10 mg
Thiomersal auf 100 ml; pH 6,3, das mit 2,7 g Aluminiumhydroxidgel versetzt wurde. Charge B enthält 4,3 mg
des Enterotoxinpräparats und 9 mg Aluminiumhydroxidgel pro ml und wird in aliquote Teile von 2,5 ml
aufgeteilt, die somit 10,75 mg des Enterotoxinpräparats
enthalten. Die aliquoten Teile werden in Glasampullen gefüllt, die dann abgeschmolzen werden.
Die aus den Chargen A und B hergestellten Impfstoffe werden wie nachstehend beschrieben in Zuchtzentren, die m;t durch Colibakterien verursachte Diarrhöe verseucht nind, an Mutterschweinen geprüft. Hierzu werden die Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln subkutan mit einer Einzeldosis des Impfstoffes geimpft: 59 Mutterschweine erhalten eine Dosis des Charge-A-Impfstoffes und 28 Mutterschweine eine Dosis des Charge-B-Impfstoffs. 50 Mutterschweine dienen als Kontrolle und erhalten die gleichen Volumina
Die aus den Chargen A und B hergestellten Impfstoffe werden wie nachstehend beschrieben in Zuchtzentren, die m;t durch Colibakterien verursachte Diarrhöe verseucht nind, an Mutterschweinen geprüft. Hierzu werden die Mutterschweine 3 bis 6 Wochen vor dem Ferkeln subkutan mit einer Einzeldosis des Impfstoffes geimpft: 59 Mutterschweine erhalten eine Dosis des Charge-A-Impfstoffes und 28 Mutterschweine eine Dosis des Charge-B-Impfstoffs. 50 Mutterschweine dienen als Kontrolle und erhalten die gleichen Volumina
ίο desselben Aluminiutnhydroxidgel-Puffergemisches
ohne den Enterotoxinextrakt.
Sämtliche Ferkel werden auf das Auftreten von Diarrhöe beobachtet. Am und nach dem zweiten Tag
des klinischen Krankheitssymptoms werden die Ferkel
Ii täglich mit Chloramphenicol, Ampicillin oder Sulfadoxin/Trimethoprim
behandelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV unter Berücksichtigung der Konsistenz der
Fäzes, der Dauer der Diarrhöe, der Anzahl der Verabreichungen von Antibiotika und der Sterblirhlcpit
durch Wasserentzug zusammengestellt.
Vakzine-Dosis
Zahl der Würfe mit schwerer
Würfe Diarrhöe*)
Würfe Diarrhöe*)
Zahl Prozent
Würfe mit Sterblichkeit
Zahl
Prozent
5 ml von Charge A | 59 | 15 | 25,4 | 2 | 3,3 |
2,5 ml von Charge B | 28 | 10 | 35,7 | 2 | 7,1 |
Placebo**) | 50 | 24 | 48 | 8 | 16 |
*) Flüssige Fäzes während mehr als zwei Tagen, mehrere Verabreichungen von Antibiotika, mit
und ohne Sterblichkeit.
**) 25 Mutterschweine erhalten 2.5 ml und die anderen
25 Mutterschweine 5 ml.
25 Mutterschweine 5 ml.
Die in Tabelle IV zusammengestellten Ergebnisse 40 Prozentsatz beträchtlich herabgesetzt wird, wobei bei
zeigen, daß durch die Verabreichung des erfindungsge- Verabreichung der 27-mg-Enterotoxin-Dosiereinheit an
mäßen Impfstoffes der Krankheits- und Sterblichkeits- die Mutterschweine ein besserer Schutz erhalten wird.
Claims (1)
1. Impfstoff gegen Ferkel-Colibacillose, enthaltend
ein aus einem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp gewonnenes, im wesentlichen von
Lipopolysacchariden freies, hitzelabiles, zellfreies Enterotoxin sowie ein Adjuvans.
Z Verwendung von aus einem enteropathogenen Escherichia coli-Serotyp gewonnenes, im wesentlichen
von Lipopolysacchariden freies, hitzelabiles, zellfreies Enterotoxin zusammen mit einem Adjuvans
bei der Bekämpfung von Ferkel-Colibacillose.
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