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Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten, optimal wirksamen
Influenzavirus-Aluminiumoxid-Adsorbatimpfstoffen Die Wirksamkeit eines Influenzavirus-Aluminiumoxid-Adsorbatimpfstoffes
hängt einmal von der optimalen Auswahl der in ihm enthaltenen Influenzavirusstämme
und weiterhin vom Vorliegen eines optimalen Beladungsgrades des liuminiumoxids mit
Virus ab. Darüber hinaus ist Im Hinblick auf die Verträglichkeit des Impfstoffes
ein möglichst hoher Reinheitsgrad des Impfstoffes anzustreben.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung hochgereinigter, optimal
wirksamer Tnfluenzavirus-Aluminiumoxid-Adsorbatimpfstoffe umfaßt folgende Einzelelemente,
deren kombinierte Anwendung besonders vorteilhafte Ergebnisse bringt und daher
bevorzugt
ist: 1. Optimale Auswahl von Influenzavirusstämmen für Influenzavirusimpfstoffe,
II. Herstellung von hochgradig gereinigten Influenzavirus-Adsorbatimpfstoffen, III.
Herstellung von optimal wirksamen Influenzavirus-Adsorbatimpfstoffen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die
Auswahl der in den Impfstoff zu inkorporierenden Virus stämme durch einen mittels
der photometrischen ACU-Methode erhaltenen Vergleich der Reaktionsfähigkeit von
gegen sie gerichteten Immunseren mit homologem und heterologem intakten und Xther-behandeltem
Virus vorgenommen wird und solche Stämme in den Impfstoff inkorporiert werden, deren
Antikörper mit dem als Krankheitserreger zu erwartenden Influenzavirusstamm einen
Wert für den Reaktionsfähigkeitsquotienten R III von über 0,3 ergeben, das Virus
durch Adsorption an Delta-Aluminiumoxid und Ersatz der Wasserphase durch ein geeignetes
Suspensionsmittel gereinigt wird und die optimale Impfstoffwirksamkeit ergebende
Beladung des Aluminiumoxids mit Virus aufgrund der Freundlich'schen Adsorptionsisotherme
für die Adsorption des Virus an Delta-Aluminiumoxid vorausberechnet und eine entsprechende
Viruskonzentration mit dem Aluminiumoxid gemischt wird.
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Im folgenden wird eine Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens
gegeben. Dabei wird vorausgeschickt, daß die verwendeten Virusstsmme durchweg durch
72 Stunden langes Erhitzen auf 370 C thermisch inaktiviert wurden. Als Adjuvans
wurde Delta-Aluminiumoxid (Al203 - C der Firma Degussa, P P 10 0i verwendet. Zur
Herstellung einer Stammlösung wurden 10 g drei Stunden lang bei 1800 C sterilisiert.
Das sterilisierte Produkt wurde zu 100 -ml sterilem Aqua bidest. zugefügt und anschließend
geschüttelt, bis eine kolloidale Lösung entstand.
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Bei der Herstellung der Impfstoffe und Durchführung der Adsorptionsversuche
wurden entsprechende Verdiznnungen dieser g-Al205-Sts-mm1ösungen verwendet.
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1. Optimale Auswahl von Influenzavirusstämmen für Influenzaimpfstoffe
Influenzaviren zeichnen sich bekanntlich durch eine außer ordentlich große Variabilität-
ihrer Antigeneigenschaften aus, die die Bekämpfung der Influenza durch die Schutzimpfung
dadurch vor ständig neue Probleme stellt, daß eine optimale Schutzwirkung nur dann
erwartet werden kann, wenn das als Krankheitserreger auftretende Influenzavirus
antigenmäßig durch das im Impfstoff vorliegende Virus abgedeckt wird.
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Die Abwandlung der Antigenkonfiguration ist besonders beim epidemiologisch
wiehtigsten Typ A beobachtet worden und bezieht sich im wesentlichen auf die für
das immunisatorische
und serologisch faßbare Verhalten von Influenzaviren
maßgebliche Hämagglutinationskomponente.
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Eine Prüfung der Frage, ob ein bestimmter Influenzavirusstamm ausreicht,
um gegenüber antigenmäßig unterschiedlichen weiteren Stämmen noch Schutzwirkung
zu ergeben, kann bisher im wesentlichen nur durch außerordentlich aufwendige und
zeitraubende Tierversuche (Mäuseschutzversuche) vorgenommen werden.
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Es wurde nun gefunden, daß man genaue Aussagen über die Schutz wirkung
eines gegebenen Influenzavirusstammes gegenüber weiteren Stämmen dadurch in schnell
durchführbaren in vitro Versuchen erhalten kann, daß man Antiseren gegen den fraglichen
Influenzavirusstamm unter den Bedingungen der photometrischen ACU Methode (Drescher,
J. Davenport, F.M. and Hennessy, A.V.
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Photometric methods for the measurement of hemagglutinating virus
es and antibody. II. Purther experience with antibody determinations and the determinations
and the description of a technique for analysis of virus miitures. J. Immunol. 1962
: 89 : 805) sowohl gegen intaktes Virus als auch gegen Ätherbehandeltes Virus der
weiteren Stämme zur Reaktion bringt und die Anderung des durch Ätherbehandlung induzierten
Reaktionsvermögens gegenüber dem Antiserum als Maßstab für die serologisch-immunologische
Verwandtschaft zwischen den Teststämmen heranzieht.
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Dieses Verfahren wird im folgenden anhand von repräsentativen Influenzavirus
A 2 Stämmen, die in den Jahren von 1957 bis
1968 isoliert wurden,
demonstriert: Es wurden die Influenzavirusstämme A/2/Sing/1/57, A/2/AA/23/57 A/2/England/1
/61, A/2/Berlin/5/63, A/2/AA/1/65 und A/2/Hong Kong/1/68 verwendet.
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Das Virus wurde in typischer Weise durch Beimpfung der Allantoishöhle
von 10 Tage alten Hiihnerembryonen hergestellt.
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Von jedem Virusstamm wurde durch Ätherbehandlung (Drescher, J. Hennessy,
A.V. and Davenport, F.M. Photometric methods for the measurement of hemagglutinating
virus es and antibody. 1.
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Further experience with a novel photometric method for measuring hemagglutinins.
J. Immunol. 89 : 794, 1962) eine die hämagglutinierenden Untereinheiten enthaltende,
nachfolgend als "Hämagglutinin" bezeichnete Suspension hergestellt.
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Durch Impfung von Meerschweinchen mit intaktem Virus wurden Antiseren
gegen die verwendeten Influenzavirus A 2 Stämme gewonnen und diese in typischer
Weise durch Behandlung mit Z/90 KIO4 von unspezifischen Inhibitoren befreit.
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Unter Verwendung der photometrischen HCU-Methode (Drescher, J. Hennessy,
A.V. and Davenport, F.M. Photometric methods for the measurement of hemagglutinating
virus es and antibody.
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1. Further experience with a novel photometric method for measuring
hemagglutinins. J. Immunol. 89 : 794, 1962) wurde mehrfach für jedes Serum unter
Verwendung jedes Virus- und Hämagglutininpräparates die reziproke höchste Serumverdünnung
ermittelt,
die bei Vorliegen von 90 - 110 HCU-Einheiten an intaktem Virus oder Hämagglutinin
gerade ausreichte, um 50 % der vorgelegten Antigendosis zu binden.
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Die bei Reaktion eines Serums mit seinem zugehörigen (homologen) intakten
Virus erhaltenen d50-Werte wurden als d50* bezeichnet und die für die Reaktion eines
gegebenen Antiserums erhaltenen d50-Werte durch d d50* geteilt.
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c Tabelle 1 Resultate der Untersuchung der Kreuzreaktion zwischen
Influenzavirus A 2-Stämmen mittels der photometrischen ACU-Methode
| Antiserum Quotienten für die Reaktion der Seren |
| gegen Quotient mit Virusstamm |
| Virusstamm A/2/Sing/1/57 A/2/AA/23/57 |
| Va Hb V H |
| A/2/Sing/1/ R Ic: 1,00 7,65 0,81 4,36 |
| 57 R IId: 7,65+ 5,38+ |
| A/2/AA/23/ R I: 0,24 | 1,09 1,00 6,15 |
| 57 R II: 4,54 + 6,15+ |
| A/2/Engl/1/ R 1 : 0,077 0,13 0,22 0,41 |
| R II: 1 69+ 1,86+ |
| 61 R I : 0,37 0,41 0,36 0,65 |
| 63 R II: 1,52+1,80 |
| A/2/AA/1/65 R I: 0,086 0,15 0,22 0,49 |
| A/2/Hongk/1/ R I: <0,055 <0,055 <0,055 <0,055 |
| 68 R II: # # |
Fortsetzung von Tabelle 1
| Antiserum Quotienten für die Reaktion der Seren mit Virusstamm |
| gegen Quotient A/2/Engl/1/61 A/2/Berl/5/65 A/2/AA/1/65 A/2/Hongk/1/68 |
| Virusstamm V H V H V H V H |
| A/2/Sing/1/ R Ic: 0,62 2,27 0,45 1,18 0,56 0,74 0,32 0,045 |
| 57 R IId: 3,66+ 2,62+ 1,32+ 0,13+ |
| A/2/AA/23/ R I: 0,64 2,19 0,34 0,67 0,38 0,85 0,22 0,024 |
| 57 R II: 3,42+ 1,97+ 2,23+ 0,11+ |
| A/2/Engl/1/ R I: 1,00 9,52 0,53 1,78 0,71 2,47 0,20 0,022 |
| 61 R II: 9,52+ 3,35+ 3,48+ 0,11+ |
| A/2/Berl/5/ R I: 0,58 1,30 1,00 7,35 0,48 1,75 0,22 0,029 |
| 63 R II: 2,24+ 7,35+ 3,64+ 0,13+ |
| A/2/AA/1/65 R I: 0,81 1,45 0,26 0,91 1,00 10,5 0,18 0,016 |
| R II: 1,79+ 3,50+ 10,5+ 0,09+ |
| A/2/Hongk/1/ R I: 0,11 0,13 0,14 0,10 0,088 0,069 1,00 4,81 |
| 68 R II: 1,18 0,71+ 0,78+ 4,82+ |
aV = Reaktion mit intaktem Virus cR I = d50-Werte der Seren geteilt durch d50-Werte
erhalten für die Reaktion mit intaktem homologen Virus dR II = R I-Werte für Hämagglutinin
geteilt durch A 1-Werte für entsprechend intaktes Virus + = Werte des Quotienten
R II, wo signifikante Unterschiede zwischen den R I-Werten mit intaktem Virus und
dem R I-Wert mit Hämagglutinin gefunden wurden, wurden durch das Symbol +) gekennzeichnet
(P < 0,05)
Die so erhaltenen Quotienten sind in Tabelle 1 als
"R I-Werte" verzeichnet. Schließlich wurden die für die Verwendung von Hämagglutinin
erhaltenen R 1-Werte durch den für intaktes Virus des gleichen Stammes erhaltenen
R I-Wert dividiert, die Quotienten als "R II-Werte" bezeichnet und ebenfalls in
Tabelle 1 aufgeführt. Schließlich wurden die R II-Werte j jeweils durch den R II-Wert
dividiert, der für die Reaktion eines Stammes mit seinem zugehörigen (homologen)
Antiserum beobachtet wurde. Diese Quotienten wurden als "R II-Werte bezeichnet und
sind in Tabelle 2 aufgeführt.
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Zum Vergleich wurde die Schutzwirkung der einzelnen Influenzavirus-A
2-Stämme gegenüber Belastung mit diesen Stämmen im Mäuseschutzversuch geprüft.
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Es wurde pro A 2-Stamm ein 1000 HCU-Einheiten Virus enthaltender -Al203-Adsorbatimpfstoff
(5 mg {-A1203 pro ml) hergestellt. Gruppen von CF 1 Mäusen der Gewichtsklasse von
18 -22 g wurden einmal subcutan mit je 0,2 ml Impfstoff geimpft.
Tabelle
2 Serclogische Beziehung zwischen Influenzavirus A 2 Stämmen ausgedrückt durch den
Quotienten " R III " a Antiserum gegen Werte des Quotienten " R III " a für Reaktion
der Antiseren mit Virus Virusstämme A/2/Sing/1/57 A/2/AA/23/57 A/2/Engl/1/61 A/2/Berl/5/63
A/2/AA/1/65 A/2/Hongk/1/68 A/2/Sing/1/57 1,0 >b 0,70 > 0,48 > 0,34 >
0,17 > 0,017 A/2/AA/23/57 0,74 < 1,0 > 0,56 > 0,32 = 0,36 > 0,018
A/2/England/1/ 61 0,18 =c 0,19 < 1,0 > 0,35 = 0,36 > 0,011 A/2/Berlin/5/
63 0,21 = 0,24 < 0,30 < 1,0 > 0,49 > 0,018 A/2/AA/1/65 0,16 < 0,21
> 0,17 < 0,33 < 1,0 > 0,008 A/2/Hongkong/1/ 68 # 0,21 = # 0,21 = 0,24
> 0,15 = 0,16 < 1,0 aR III = R II Werte erhalten für heterologe Reaktion geteilt
durch R II Wert für homologe Reaktion b> und < : signifikante Differenz (P
< 0,05) c = keine signifikante Differenz (P < 0,05)
14 Tage
nach Impfung wurden die Tiere mit abgestuften Dosen der zuvor mäuseadaptierten Influenzavirusstämme
belastet und die Schutzwirkung der Impfung nach dem von Fazekas (Fazekas de St.
Groth, S.: Studies in experimental immunology of influenza.
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IV. The protective value of active immunization. The Australian Journal
of Experimental Biology and Medical Science. XXVIII:61 (1950)) angegebenen Verfahren
- ausgedrückt als Schutzindex P -ermittelt.
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Die erhaltenen Versuchsergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
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Ein Vergleich der in Tabelle 3 dargelegten Schutzindeiwerte mit dem
in Tabelle 2 aufgeführten Reaktionsfähigkeitsquotienten R III zeigt eindeutig, daß
ausreichender Schutz (d.h. P-Werte von 1000 oder darüber) immer dann erhalten wurde,
wenn der Reaktionsfähigkeitsquotient R III für die Reaktion des im Impfstoff vorliegenden
Stammes mit dem infizierenden Stamm den Wert 0,3 überstieg.
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Damit ist eindeutig nachgewiesen, daß aus dem Reaktionsfähigkeitsquotienten
R III in einfacher Weise verbindliche RUckschlüsse dahingehend gezogen werden können,
gegen welche Influenzavirusstämme ein im Impfstoff vorliegender Stamm ausreichend
zu schützen vermag.
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Tabelle 3 Ergebnisse der Testung der Schutzwirkung von monovalenten
Influenzavirusadsorbatimpfstoffen im Mäuseschutzversuch
| Impfung mit In- Schutzindex P für Belastung der Mäuse mit Influenzavirus
des Stammes |
| fluenzavirusstamm A/2/Sing/1/57 A/2/Engl/1/61 1/2/Berl/5/63
A/2/AA/1/65 A/2/Hongk/1/68 |
| A/2/Sing/1/57 18,320 16,520 3840 320 26 |
| A/2/England/1/61 110 11,210 5620 2520 32 |
| A/2/Berlin/5/63 64 1120 4,840 1280 2 |
| A/2/AA/1/65 18 89 110 9280 -4 |
| A/2/Hongk/1/68 -2 4 10 6 15,340 |
Aufgrund dieser Erkenntnis ist es erstmals möglich, die optimale
Stammzusammensetzung eines Influenzavirusimpfstoffes aufgrund von schnell und einfach
durchführbaren in vitro Tests im voraus zu bestimmen und darüber hinaus auch Aussagen
dahingehend zu machen, wann eine Änderung der Stammzusammensetzung durch Auftreten
neuer Stämme erforderlich ist.
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Die Stammauswahl für Influenzavirusimpfstoffe geschah bisher auch
auf der Basis der Messung der Kreuzreaktion zwischen Influenzavirusstämmen im Hämagglutinationshemmtest
mit visueller Ablesung unter Verwendung von intaktem Virus. Für die als Beispiele
angeführten Influenzavirusstämme sind die auf diesem Wege erhaltenen Reaktionsfähigkeitsquotienten,
bestimmt nach Archetti und Horsfall (Archetti, J. and Horsfall, F.L., Persistent
antigenic variation of influenza A viruses after incomplete neutralisation in ovo
with heterologius immune serum.
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J. Exp. Med., 1950, 92 : 441) in Tabelle 4 aufgeführt.
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Bei einem Vergleich dieser Daten mit den im Mäuseschutzversuch erhaltenen
Werten (s. Tabelle 3) ist offensichtlich, daß mit Ausnahme des Stammes A/2/Hongkong/l/68
keine Korrelation zwischen den serologischen Daten und der im Mäuseschutzversuch
beobachteten Kreuzimmunität beobachtet wurde. Im Gegensatz zu den mittels des neu
entwickelten Verfahrens erhaltenen Werten gelang es also mit dem Hämagglutinationshemmtest
mit visueller Ablesung in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle nicht, eine Vorhersage
über die für einen gegebenen Impfstoffstamm gegenüber anderen Influenzavirusstämmen
zu erwartende Schutzwirkung 1 m mach Pn
Tabelle 4 Kreuzreaktionen
zwischen Influenzavirus A 2-Stämmen, bestimmt durch die Reaktivitätsquotienten "R"
nach Archetti und Horsfall
| A/2/Sing/1/57 A/2/AA/23/57 A/2/Engl/1/61 A/2/Berl/5/63 A/2/AA/1/65
A/2/Hongk/1/68 |
| A/2/Sing/1/57 - 2,83 4 2,83 8 22,6 |
| A/2/AA/23/57 2,83 a - 4 4 2 90,5 |
| A/2/England/1/61 4 4 - 11,3 4 45,3 |
| A/2/Berlin/5/63 2,83 4 11,3 - 11,3 63,9 |
| A/2/AA/1/65 8 2 4 11,3 - 45,3 |
| A/2/Hongk/1/68 22,6 90,5 45,3 63,9 45,3 - |
aR Werte = #r1 x r2 wobei Hl Titer von Serum 1 gegen Virus 2 r1 = Hl Titer von Serum
2 gegen Virus 2 und Hl Titer von Serum 2 gegen Virus 1 r2 = Hl Titer von Serum 1
gegen Virus 1
II. Herstellung von hochgradig gereinigten Influenzavirus-Adsorbatimpfstoffen
Bei der Herstellung von Influenzavirusimpfstoffen muß allgemein ein möglichst hoher
Reinheitsgrad des Impfstoffes angestrebt werden, um die Gefahr des Auftretens von
Nebenreaktionen beim Impfling (z.B. anaphylaktischer Schock bei Uberempfindlichkeit
gegen Hühnereiweiß) zu reduzieren. Als Maß für den Reinheitsgrad eines Impfstoffes
sieht man dabei die Relation von virusspezifischer Aktivität (z.B. Hämagglutinintiter)
zum Stickstoffgehalt pro ml Impfstoff an.
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Bei der großtechnischen Herstellung von Influenzavirusimpfstoffen
stellt die Reinigung des Virus ein erhebliches Problem dar, da die bisher übliche
Methode, nämlich Reinigung des Virus durch Ultrazentrifugation, die Verfügbarkeit
extrem teurer Apparaturen voraussetzt und weiterhin den Herstellungsgang zeitlich
und arbeitsmäßig entsprechend belastet.
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Es hat sich nun gezeigt, daß man auf folgendem Wege ohne derartige
Nachteile Impfstoffe ausgezeichneten Reinheitsgrades gewinnenkann: Es wurde gefunden,
daß Delta-Aluminiumoxid-Influenzavirus so selektiv adsorbiert, daß durch Ersetzen
des Impfstoffüberstandes durch ein erwünschtes Suspensionsmittel (z.B. 0,15 M NaCl-Lösung
gepuffert auf pH 7 mit 0,01 M Phosphat) ein Impfstoff mit erwünscht hohem Reinheitsgrad
erhalten wird.
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Das Verfahren wird im einzelnen wie folgt durchgeführt: Der HCU-Titer
(J. Drescher, A.V.- Hennessy, S.M. Davenport: Photometric methods for the measurement
of hemagglutinating virus es and antibody. I. Further experience with a novel photometric
method for measuring hemagglutinins. J. Immunol.
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89, 794 - 804 (1962)) der geernteten Allantoisflüssigkeit wird bestimmt.
In Vorversuchen werden die Konstanten A und 1/N der Freundlich'schen Adsorptionsisotherme
für die Adsorption der in Frage kommenden Virusetämme an Delta-Aluminiumoxid ermittelt.
(Drescher, J. Amer. J. Hgg. 74:104 (1961)).
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In Tabelle 5 sind diese Konstanten für einige Virus stämme verzeichnet.
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Bei Kenntnis der Konstanten A und 1/N der Freundlich'schen Adsorptionsisothermen
kann diejenige Menge des Delta-Aluminiumoxid (m), die pro ml Virussuspension zugesetzt
werden muß, um z.B. 90 % des vorhandenen Virus zu adsorbieren nach folgender Gleichung
(1) berechnet werden:
A und 1/N sind hierin die Konstanten der Adsorptionsisotherme, m = Menge an Delta-Aluminiumoxid
(mg/ml), die erforderlich ist, um den erwünschten Adsorptionsgrad zu erzielen.
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C = Hamagglu-tinationskonzentration (BCU) vor Adsorption und C' =
Hämagglutinationskonzentration (HCU) in der Impfstoffwasserphase
nach
Einstellung des Adsorptionsgleichgewichtes.
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Tabelle 5 Konstanten A und 1/N der Breundlich'schen Adsorptionsisotherme
für die Adsorption an Delta-Aluminiumoxid.
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Stamm A i/N A/PR 8 508,9 0,290 A/2/Hongkong/l /68 403,8 0,267 B/Iowa
323,6 0,258 Durch Einsetzen der bekannten Werte für A und 1/N und C und Einsetzen
des dem erwünschten Adsorptionsgrade entsprechenden Wertes für C' kann aus Gleichung
(1) die Menge m an Delta-Aluminiumoxid bestimmt werden, die erforderlich ist, um
einen gewünschten Adsorptionsgrad des Virus an das Delta-Aluminiumoxid zu erzielen.
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Die Mischung aus Virus und Delta-Aluminiumoxid wird nach Einstellung
des Adsorptionsgleichgewichtes (20 Min. langes magnetisch bewirktes Schütteln) einen
Tag lang bei 40 C aufbewahrt Innerhalb dieser Zeit ist das Aluminiumoxid aussedimentiert.
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Der Überstand wird dann abgenommen (etwa 95 % der Gesamtwasserphase)
und durch sterile, phosphatgepufferte Kochsalzlösung ersetzt.
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Das Volumen an Kochsalzlösung, das zugesetzt wird, ergibt sich
nach
den im Abschnitt III dargelegten Gesichtspunkten dahingehend, daß nach erneuter
Einstellung des Adsorptionsgleichgewichtes ein optimaler Wert für die Beladung der
Oberfläche mit Virus gewährleistet ist.
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Repräsentative Beispiele für die Reinigung von Influenzavirus mittels
der genannten Methode sind in Tabelle 6 aufgeführt.
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Die jeweils verwendeten Virusausgangssuspensionen und deren HCU-Uiter
und Stickstoffgehalt (Gamma W/ml) sind in Spalte 2 - 4 aufgeführt.
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Zu den Virussuspensionen wurden die in Spalte 5 verzeichneten Konzentrationen
an Delta-Aluminiumoxid zugesetzt. Nach Einstellen des Adsorptionsgleichgewichtes
und Aussedimentieren des Aluminiumoxids wurden die in Spalte 6 verzeichneten Volumina
des Überstandes abgenommen und in diesen die in Spalte 7 und 8 aufgeführten HCU-iter
und Stickstoffwerte- / ml gefunden.
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Danach wurden die in Spalte 9 genannten Volumina an physiologischer
Kochsalzlösung zugesetzt. Nach erneuter Einstellung des Adsorptionsgleichgewichtes
lagen in den Impfstoffen die in Spalte 10 und 11 aufgeführten HCU bzw. Stickstoffwerte
/ ml vor.
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Tabelle 6 Beispiele für die Reinigung von Influenzavirus durch Adsorption
an #-Aluminiumoxid
| Ver- Ungereinigtes Zusatz Abgenommener Nach Zusatz von v ml
Reinigungsfaktor+ |
| such Virus von Überstand NaCl zum Sediment |
| (je 100 ml) #-Al2O3 |
| V |
| Stamm HCU #N/ml (mg/ml) ml HCU #N/ml (ml) HCU #N/ml |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 |
| 1 A/PR 8 2500 410 1,17 90 225 405 90 2297 45,5 8,2 |
| 2 A/PR 8 1870 387 0,95 90 157 380 90 1729 45,0 7,8 |
| 3 A/2/Honk. 2320 525 1,67 90 238 512 90 2106 64,2 7,2 |
| 4 A/2/Honk. 3480 448 2,25 90 327 440 90 3186 52,0 7,7 |
| 5 B/Iowa 2950 487 2,67 95 293 467 95 2672 43,3 9,8 |
HCU Endprodukt x # N/ml Ausgangsmaterial + Reinigungsfaktur = HCU Ausgangsmaterial
x #N/ml Endprodukt
Die Stickstoffbestimmungen erfolgten mittels
einer Mikro-Kjeldahl-Methode. Spalte 12 gibt das Ausmaß der Virusreinigung an.
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Es zeigte sich, daß der Reinheitsgrad des Impfstoffes, d.h.
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die Relation von Hämagglutinintiter in HCU-Einheiten zu Gamma-Stickstoff/ml,
bei den gereinigten Impfstoffen zwischen 7,2 bis 9,8 mal -höher lag als beim Ausgangsmaterial.
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Durch Wiederholung der beschriebenen Reinigungsverfahren kann der
Reinheitsgrad derartiger Impfstoffe. bis auf das 60-fache gesteigert werden.
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III. Herstellung von optimal wirksamen Influenzavirus-Aluminiumoxid-Impfstoffen.
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Für Influenzavirus-Delta-Aluminiumoxid-Adsorbatimprstoffe wurden folgende
Dosierungen als optimal gefunden: Bei Anwendung beim Menschen eine Dosis von 0,5
ml Impfstoff, die pro ml 5 mg Delta-Aluminiumoxid enthält und bei Anwendung am Pferd
(PferdQnfluenzavirus-Adsorbatimpfstoffe) eine Dosis von 2 ml, die pro ml 2,5 mg
Delta-Aluminiumoxid enthält.
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Die Wirksamkeit derartiger Impfstoffe hängt darüberhinaus jedoch ganz
wesentlich von der Beladung des Adsorbens (Aluminiumoxid) mit Virus ab.
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Bei Herstellung derartiger Adsorbatimpfstoffe ist man daher vor die
Aufgabe gestellt, für eine Reihe von Influenzavirusstämmen
diejenigen
Viruskonzentrationen zu ermitteln, die nach Mischung mit den obengenannten Konzentrationen
an6-Al203 jeweils einen optimalen Beladungsgrad des Adsorbens mit Virus ergeben.
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Die Bestimmung dieser jeweils einen optimalen Beladungsgrad des Adsorbens
mit Virus ergebenden Virusausgangstiter konnte bisher nur durch Herstellung einer
relativ großen Anzahl an Probeimpfstoffen abgestufter Zusammensetzung und tierexperimentelle
Bestimmung der Impfstoffwirksamkeit empirisch vorgenommen werden. Es liegt auf der
Hand, daß dieses Vorgehen außerordentlich zeitraubend und arbeitsaufwändig ist.
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Darüberhinaus ist zu bedenken, daß Impfstoffrezepte bei Auftreten
neuer Influenzavirusstämme möglichst umgehend abgeändert werden müssen, um zu gewährleisten,
daß ein der epidemiolot gischen Situation angepaßter Impfstoff rechtzeitig zur Verfügung
steht. Dies dürfte jedoch bei der Notwendigkeit, die optimale Mischungsrelation
zwischen Virus und Adjuvans erst in aufwendigen Tierversuchen ermitteln müssen,
auf erhebliche zeitliche Schwierigkeiten stoßen.
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Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es in schnell durchführbaren
in vitro Versuchen möglich, die optimale Viruskonzentration einer Influenzavirussuspension
zu bestimmen, die nach Mischung mit einer optimalen Dosis an Delta-Aluminiumoxid
einen optimalen Beladungsgrad des Adsorbens mit Virus ergibt.
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Die Grundlage des Verfahrens ist anhand der in Tabelle 7 dargelegten
Versuchs ergebnisse beschrieben.
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Unter Verwendung von Delta-Aluminiumoxid wurde eine Reihe von Influenzavirusimpfstoffen
hergestellt.
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Die Impfstoffe 1 - 26 enthielten dabei menschliche Influenzavirusstämme
und die Impfstoffe Nr. 27 - 34 Pferdestämme.
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Bei den Impfstoffen 1 - 26 betrug demnach die Konzentration an Delta-Aluminiumoxid
5 mg/ml und bei den Impfstoffen 27 -34 2,5 mg Delta-Aluminiumoxid.
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Die in Probeimpfßtoffen jeweils vorliegenden Influenzavirusstämme
sind in Spalte 2 verzeichnet. Die Konstanten A und 1/N der Freundlich'schen Adsorptionsisotherme
für die Adsorption dieser Influenzavirusstämme an Delta-Aluminiumoxid wurden in
der früher beschriebenen Weise (Drescher, J..Amer. J. Hyg.
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74:104, 1961) ermittelt und sind in Spalte 3 und 4 aufgeführt.
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Spalte 5 gibt die pro mg Al203 jeweils adsorbierte Virusmenge in HCU-Einheiten
an.
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Die adsorbierten Virusmengen wurden durch Messung des HCU-Titers der
verwendeten Virus suspension vor Adsorption und im überstand der Adsorbatmischungen
ermittelt.
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Mit jedem dieser Impfstoffe wurde jeweils 1 Gruppe von 10 Meerschweinchen
mit je 0,5 ml Impfstoff einmal subcutan geimpft.
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Tabelle 7 Abhängigkeit der Wirksamkeit von Influenzavirusimpfstoffen
von der pro mg Aluminiumoxid adsorbierten Virusmenge Impf- Konstanten für HCU adsorbiert
geometrisches stoff S t a m m Adsorption Mittel der pro Antikörper-NR. an Al2O3
mg titer vom 15.
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Al2O3 bis 90. Versuchstag 1 2 3 4 5 6 1 A/PR 8 508,9 0,290 25 642
2 50 1150 3 100 2560 4 200 820 5 300 506 6 A/2/Hongk/1/68 403,8 0,267 50 118 7 100
243 8 150 458 9 200 1052 10 300 751 11 500 527 12 B/Lowa 323,6 0,258 50 847 13 100
1120 14 200 1913 15 300 3560 16 500 2120 17 750 1686 18 A/2/AA/1/65 450 0,273 50
212 19 100 328 20 150 983 21 200 521 22 400 442 23 A/2/Engl/1/61 290 0,227 100 327
24 200 489 25 300 1570 26 400 781 27 A/Equine-2/Mil 225 0,198 50 252 28 200 270
29 400 432 30 600 1099 31 800 687 32 A/Equine-2/Miami 300 0,215 100 321 33 300 875
34 500 487 Die Impfstoffe 1 bis 26 enthielten jeweils 5 mg Delta-Aluminiumoxid pro
ml und die Impfstoffe 27 bis 34 je 2,5 mg Delta-Aluminiumoxid pro ml.
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Blutproben der Tiere wurden am Tag 0,15,30,45,60 und 90 gewonnen,
Sammelseren aus gleichen Anteilen hergestellt und diese nach Kaliumperjodatbehandlung
mittels der photometrischen ACU-Methode (Drescher, J., F.M. Davenport und A.V. Hennessy,
J. Immunol. 89:805, 1962) auf Antikörper gegen den im Impfstoff vorliegenden Virusstamm
geprüft.
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Die geometrischen Mittel der ACU-Titer vom 15. bis 90. Versuchstag
sind in Spalte 6 von Tabelle 7 angegeben. Es zeigte sich in jedem Versuchsansatz,
daß bei jedem Virusstamm ein Optimalwert für die Beladung des Aluminiumoxids mit
Virus existiert (z.B. bei A/PR 8 - Impfstoffen Impfstoff Nr. 3), der optimale Antikörperbildung
zur Folge hatte.
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Überschreitet oder unterschreitet dagegen der Wert für die Virusbeladung
des Aluminiumoxids den Optimalbereich (die Optimalwerte sind in Tabelle 7 durch
Unterstreichen gekennzeichnet), so wurde ein drastisches Absinken der Antikörperbildung
beobachtet.
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Vergleicht man für die einzelnen Impfstoffe jeweils den Optimalwert
für die Beladung des Aluminiumoxids mit Virus mit den in vitro Versuchen ermittelten
Konstanten der Adsorptionsisothermen für die Adsorption an Aluminiumoxid, so gelangt
man zu der überraschenden Feststellung, daß eine signifikante Korrelation zwischen
den Konstanten A der Freundlich1schen Adsorptionsisotherme für die Adsorption des
Virus an Aluminiumoxid und dem optimale Impfstoffwirksamkeit ergebenden Wert für
die
Beladung des Aluniniumoxids mit Virus besteht, die wie folgt formuliert werden kann:
(2) log mx = -2,00045 x log A + 7,4616 x ist hierin di adsorbierte Virusmenge in
HCU-Einheiten, m ist die Menge an Delta-Aluminiumoxid/ml und A ist die Konstante
der Freundlich'schen Adsorptionsisotherme für die Adsorption des Virus an Delta-Aluminiumoxid.
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Aufgrund der gefundenen Zusammenhänge ist es erstmals möglich, für
Influenzavirusstänin:e durch einfache Ermittlung der Konstanten A der Freundlich'schen
Adsorptionsisotherme für die Adsorption an Delta-Aluminiumoxid den Optimalwert für
die Beladung des Delta-Aluziniumoxids mit Virus vorherzusagen und dementsprechend
einen optimal wirksamen Influenzavirusimpfstoff ohne aufwändige Tierversuche herzustellen.
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Es hat sich gezeigt, daß die für monovalente (d.h. nur einen Influenzavirusstamm
enthaltende) Impfstoffe optimalen Beladungswerte auch für olyvalente (d.h. mehrere
Influenzavirusstamme enthaltendsso Empfstoffe gelten.
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Die Ermittlung der optimalen Zusammensetzung eines trivalenten, die
Influenzsviruzstämme A/PR 8, A/2/Uongkong/1/68 und B/losw enthaltendes Al2O3-Impfstoffes
sowie eines den Stamm A/Equine-2/Milford erthaltenden Pferdeinfluenzavirus-Aluminiumoxidimpfstoffes
ist
in Tabelle 8 dargelegt. Die einzelnen Intluenzavirusstämme sind in Spalte 2 aufgeführt
und die Konstanten A und 1/N für die Adsorption der Stämme an Delta-Aluminiumoxid
in Spalte 3 und 4. Durch Einsetzen des Logarithmus der Konstanten A in Gleichung
(2) wurden die Optimalwerte ( @ ) für die Beladung des Aluminiumoxids mit Virus
berechm net und in Spalte 5 verzeichnet0
Tabelle 8 Beispiele für
die Ermittlung der optimalen Zusammensetzung eines trivalenten Influenzavirus-Al2O3-Impfstoffes
und eines Pferdeinfluenza-Al2O3-Impfstoffes
| Optimalwert Viruskonzen- Optimale Konzentration |
| Bei- S t a m m A 1/N Adsorbiertes tration in der Virusaus-
an #-Al2O3/ml |
| spiel Virus Wasserphase gangskon- |
| pro mg Al2O3 zentration |
| (HCU/mg) (HCU) (C¹) (HCU) (C) |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 |
| 1 a A/PR 8 508,9 0,290 111 0,005 555 5,0 |
| 1 b A/2/Honkong 403,8 0,267 177 0,04 885 5,0 |
| 1 c B/Iowa 323,6 0,258 275 0,53 1375 5,0 |
| 2 A/Equine-2/ 225 0,198 570 110 1535 2,5 |
| Mil./63 |
Die von den einzelnen Virusstämmen jeweils mit dem Aluminiumoxid
zu mischende Viruskonzentration "C" (in HCU-Einheiten) wurde wie folgt berechnet:
Die Virusausgangskonzentration C ist gleieh der Summe der Optimaldosis an unadsorbiertem
Virus multipliziert mit der zugehörigen Konzentration an Delta-Aluminiumoxid (d.h.
2 0 m ) und der in der Impfstoffwasserphase damit im Gleichgewicht stehenden Konzentration
an nicht adsorbiertem Virus (d.h.
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C = x . m + C').
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Letztere als C' bezeichnete Größe kann nach der Freundlich'-schen
Adsorptionsisothermen wie folgt berechnet werden (3) @/m = A . C''/@ Die zu verwendende
Virusausgangskonzentration C ist damit in einfacher Weise berechenbar.
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Die so berechneten Werte für die Viruskonzentration in der Impfstoffwasserphase
sind in Spalte 6 der Tabelle 8 aufgeführt, die optimalen Adsorptionsgrad ergebenden
Virusausgangskonzentrationen (C) folgen in Spalte 7.
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Dementsprechend wurde als Beispiel 1 ein Impfstoff dadurch hergestellt,
daß 5 mg Aluminiumoxid mit 555 HCU des Stammes A/PR 8, 885 HCU des Stammes A/2/Hongkong/1/68
und 1375 HCU des Stammes B/Iowa gemischt wurden.
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Beispiel 2 betrifft die Herstellung eines Pferdeinfluenzavirusimpfstoffes,
wobei 1535 HCU des Stammes A/Euine-2/Milford/63 mit 2,5 mg Delta-Aluminiumoxid pro
ml gemischt wurden.
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Die Wirksamkeit dieser Impfbtoffe wurde in Meerschweinchenversuchen,
deren Ergebnisse in Tabelle 9 dargelegt sind, getestet.
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Gruppen von je 10 Meerschweinchen erhielten eine einmalige, subkutane
Impfung mit je 0,5 ml des trivalenten A1203-Impfstoffes, des Pferdeinfluenzavirus-Al2O3-Impfstoffes
sowie mit die gleichen Virus stämme in der gleichen Konzentration enthaltenden unadsorbierten
Vergleichsimpfstoffen. Blutproben wurden wiederum am Tag 0, 15, 30, 45, 60 und 90
gewonnen und nach Kaliinnperjodatbehandlung der Seren die ACU-Antikörpertiter gegen
die in den Impfstoffen vorliegenden Influenzavirusstämme bestimmt.
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Die geometrischen Mittel der Antikörpertiter vom 15. - 90.
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Versuchs tag sind in Tabelle 9 aufgeführt.
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Es zeigte sich in allen Fällen, daß die Impfung mit den gemäß der
vorliegenden Erfindung hergestellten Aluminiumoxidimpfstoffen ein Vielfaches an
Anttkdrperbildung ergab, als sie nach Impfung mit den vergleichbaren unadsorbierten
Impfstoffen beobachtet wurde.
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Zur Illustration wurden di geometrischen Mittel der Antikörpertiter
nach Impfung m t den Adsorbatimpfstoffen jeweils durch die analogen Titerwerte,
die nach Impfung mit den unadsorbierten Vergleichsimpfstoffen erhalten wurden, geteilt
und der Quotient als "Adjuvansaffekt" bezeichnet und in Tabelle 9 aufgeführt.
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Tabelle 9 Antikörperbildung in Meerschweinchen nach einmaliger subcutaner
Impfung mit je 0,5 ml eines trivalenten Al2O3 Impfstoffes und eines unadsorbierten
Vergleichsimpfstoffes sowie eines A/Equine-Mil./63-Al2O3 Impfstoffes und eines unadsorbierten
Vergleichsimpfstoffes
| Ver- Impfung Geometrisches Mittel der Antikörpertiterwerte |
| such mit (ACU-Einheiten) vom 15. - 90. Versuchstag |
| gegen Virusstamm |
| A/PR 8 A/2/Hongkong 8/Iowa A/Equine-2/Mil./63 |
| 1 3 4 5 6 |
| 1 a trivalentem Al2O3-Impfstoff¹ 3120 1517 4019 - |
| 1 b unads. Vergleichsimpfstoff² 110 209 139 - |
| Adjuvanseffekt 5 28,3 7,2 28,9 - |
| 2 a A/Equine-2/Mil. - Al2O3-Impfst.³ - - - 1230 |
| 2 b unads. Vergleichsimpfstoff 4 - - - 168 |
| Adjuvanseffekt 5 - - - 7,3 |
1 trivalenter Al2O3-Impfstoff = 555 HCU APR 8 + HCU A/2/Hongkong + 1375 HCU B/Iowa
adsorb. an 5 mg/ml Al2O3 2 unadsorbierter Vergleichsimpfstoff = identischer Impfstoff
ohne Al2O3 3 A/Equine-2/Mil.63 Al2O3 Impfstoff = 1535 HCU A/Equine-2/Mil.63 + 2,5
mg/ml Al2O3 4 unadsorbierter Vergleichsimpfstoff = identischer Impfstoff ohne Al2O3
5 Adjuvanseffekt = geom. Mittel der Antikörper nach Impfung mit Adsorbatimpfstoff
geteilt durch analogen Titerwert für unadsorbierten Vergleichsimpfstoff
Es
zeigte sich, daß gemäß der Erfindung hergestellte Impfstoffe zwischen 7-bis 28-fach
höhere Antikörperbildung ergaben als vergleichbare unadsorbierte Impfstoffe. Patentansprüche: