DE2111120A1 - Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-Haemagglutinationsantigen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-HaemagglutinationsantigenInfo
- Publication number
- DE2111120A1 DE2111120A1 DE19712111120 DE2111120A DE2111120A1 DE 2111120 A1 DE2111120 A1 DE 2111120A1 DE 19712111120 DE19712111120 DE 19712111120 DE 2111120 A DE2111120 A DE 2111120A DE 2111120 A1 DE2111120 A1 DE 2111120A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- culture medium
- rubella virus
- cell line
- hemagglutination
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18451—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den Kl/Ax/Hz
27, Doshomachi 2-chone, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-Hämaggluti-
nationsantigen
Die Rötelnkrankheit, eine durch den Rubella-Virus hervorgerufene, masernartige Infektionskrankheit, führt als
solche nicht zu ernsten Symptomen. Diese Krankheit ist jedoch ein· ernstes soziales Problem, weil die Infektion
über die Plazenta zum Fetus gelangt, wobei Kinder mit dem kongenitalen Rubellasyndrom, z.B. Katarakten, kongenitalen
Herzstörungen und hochgradiger Schwerhörigkeit, geboren werden, wenn die Mutter im Frühstadium der Schwangerschaft
von Röteln befallen wird. Daher ist die Entwicklung einer wirksamen Bekämpfungsmaßnahme der Röteln und gleichzeitig
die Entwicklung einer einfachen und schnellen serodiagnostischm Methode zur Erkennung von Immunität gegenüber
Rubella sehr erwünscht.
Von Stewart und Mitarbeitern wurde berichtet, daß durch Infizierung einer von Hamsternieren abgeleiteten stabilen
Zellreihe (cell line) (BHK-21) mit dem Rubella-Virus ein Antigen gebildet wird, das Erythrozyten von Eintagsküken
agglutiniert, und daß die Agglutination der Erythrozyten mit diesem Antigen durch einen Antikörper im Serum von
Menschen oder Tieren, die mit Rubella-Virus immunisiert
109839/1583
sind, gehemmt wird ("New England Journal of Medicine", 276 (1967), Seite 554 bis 557). Zur Zeit werden dieses
Antigen und der Antikörper allgemein als "Rubella-Virus--Hämagglutinationsantigen"
bzw. "Rubella-Virus-Häiaagglutinations-IIemmungsantikörper"
bezeichnet.
Mit Hilfe des Hämagglutinations-Hemmungstests unter Verwendung
von Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen ist es möglich, Rubella-Virus-Antikörper in Sera leicht und
schnell zu titrieren. Da dieser Hämagglutinations-Hemmungstest einfacher und bequemer durchzuführen und empfindlicher
ist als andere bekannte Methoden der Serodiagnose der Rötelninfektion, z.3. die Komplementbindung, Neutralisations-
und Fluoreszenz-Antikörpertestmethoden, wird zur Zeit die Serodiagnose zur Erkennung der Rubella-Infektion hauptsächlich
nach diesem Hämagglutinations-IIemmungstest durchgeführt
.
Zur Herstellung von Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen
ist außer dem oben genannten Verfahren, bei dem die stabile Zellinie von Hamsternieren als Wirtszellen verwendet wird,
ein Verfahren bekannt, bei dem eine von Affennieren stammende stabile Zellinie (VERO und BSC-1) mit Rubella-Virus
infiziert und bebrütet wird. Diese bekannten Verfahren sind jedoch unbefriedigend vom Standpunkt sowohl der Großherstellung
des Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigens als auch der Qualität der erhaltenen Antigenpräparate.
Insbesondere haben die bekannten Verfahren die Nachteile, daß es notwendig ist, eine große Menge des Impfvirus in
die Wirtszellen zu inoculieren, und daß nicht viele Entnahmen des gewünschten Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigens
vom Bebrütungssystem über eine längere Zeit möglich sind, weil die Wirtszellen nicht in der Lage sind,
lange Zeit in einer Einfachschicht zu bleiben und sich im allgemeinen innerhalb einer kurzen Zeit von einer Woche von
der Wand der Bebrütungsflasche lösen. Ferner sind die bei den bekannten Verfahren erhaltenen Antigenpräparate nicht
109833/1583
nur instabil, sondern sie "behalten im allgemeinen auch
die vom Rubella-Virus stammende Ansteckungsfähigkeit.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues, für die Großherstellung geeignetes Verfahren aur Bildung von Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen,
das nicht die Nachteile der bekannten Verfahren aufweist.
Die Erfindung umfaßt ferner ein neues Rubella-Virus-Hämagglutinations-Antigenpräparat
mit ausgezeichneten Eigenschaften für die praktische Anwendung·
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine wirksame und zuverlässige Serodiagnose der Rubella-Infektion unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Antigenpräparats.
Die Aufgaben, die die Erfindung sich stellt, werden gelöst, indem man Rubella—Virus in eine stabile Schweinenierenzellinie
(porcine stable kidney cell line) inoculiert, das inoculierte Virus in der Zellinie kultiviert
und die erhaltene Zellinie wenigstens so lange bebrütet, bis das Hämagglutinationsantigen von Rubella-Virus in
einer Menge von vier Hämagglutinationseinheiten pro 0,025ml im Kulturmedium angereichert worden ist. Die hier genannten
Hämagglutinationseinheiten werden nach der Methode von Stewart und Uitarbeitern bestimmt, die in dem bereits
genannten "Hew England Journal of Medicine" 22§ (1967),
S.554-557, beschrieben ist.
Für das Verfahren gemäß der Erfindung kann jeder Stamm des Rubella-Virus als Impfvirus verwendet v/erden.
Die für das Verfahren gemäß der Erfindung zu verwendenden stabilen Schweinenierenzellinien können in an sich bekannter
V/eise von Primärzellen von Schweinenieren entnommen werden.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird das Rubella-Virus
in eine stabile ßchweinenierenzellinie inoculiert. In der
109833/1583
Praxis ist es vorteilhaft, den Impfvirus des Rubella-Virus
bei etwa 1:0,01 bis 1:10 M.O.I. (Multiplicity of Infection), insbesondere bei etwa 1:0,1 bis 1:1 M.O.I., in die stabile
Schweinenierenzellinie zu inoculieren.
Das so inoculierte Rubella-Virus wird in der stabilen
Schweinenierenzellinie in einem Gewebekulturmedium kultiviert. Diese Kultivierung wird vorzugsweise bei einer
Temperatur zwischen etwa 30 und 380C vorgenommen. Als
Gewebekulturmedien können vorteilhaft beispielsweise das sogenannte "Eagle-Medium", die "Earle-Lösung" und "Hanks-Lösung"
verwendet werden. Diese Medien können nach Bedarf mit geeigneten Bestandteilen, z.B. Lactalbuminhydrolysat,
Tierserum usw., ergänzt werden. Ferner kann dem Medium ein Antibiotikum oder Antibiotikumgemisch, z.B. Penicillin,
Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin oder Kanamycin,
zugesetzt werden, um die Fortpflanzung von Freradmikroorganismen,
die durch zufällige Verunreinigung in das Medium gelangt sind, zu verhindern. In der Praxis ist es
vorteilhaft, die Kultivierung in einem Gewebekulturmedium durchzuführen, das ein Tierserum enthält. Das Serum ist
im Medium vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 bis 10% vorhanden. Die Kultivierung des Rubella-Virus
wird fortgesetzt, bis eine genügende Proliferation des Rubella-Virus stattgefunden hat. Die ausreichende Proliferation
des Rubella-Virus kann beispielsweise durch Beobachtung des sytopathogenen Effekts des Rubella-Virus
auf die stabile Schweinenierenzellinie bestimmt werden. Im allgemeinen proliferiert das Rubella-Virus ausreichend
in den Schweinenierenzellen bei einer Kultivierungsdauer von etwa 2 bis 7 Tagen,
Die erhaltene Zellinie, in der das Rubella-Virus ausreichend proliferiert hat* wird einer weiteren Bebrütung in
einem Gewebekulturmedium unterworfen. Diese Bebrütung wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 3° und .380O
vorgenommen. Als Gewebekulturmedium werden vorzugsweise
109839/1S83
die oben genannten Medien verwendet. Diese Bebrütung wird vorzugsweise in einem serumfreien Gewebekulturmedium vorgenommen.
Insbesondere ist es vom Standpunkt der Ausbeute an gewünschtem Antigen vorteilhaft, ein serumfreies Gewebekulturmedium
zu verwenden, das etwa 0,3 bis 0,5%
Natriumhydrogencarbonat enthält.
Die Bebrütung wird wenigstens so lange fortgesetzt, bis das gewünschte Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen
sich in einem Titer von vier Hämagglutinationseinheiten pro 0,025 ml Kulturmedium angereichert hat. Im allgemeinen
genügt für diese Anreicherung eine Bebrütungsdauer von etwa 2 bis 6 Tagen. In dieser Phase kann das Kulturmedium
zur Gewinnung des Antigens abgezogen und das Gewebekulturmedium erneuert werden. In diesem Fall sind zahlreiche
Entnahmen des gewünschten Antigens aus dem Kultivierungssystera
über eine lange Zeit möglich, indem die Bebrütung unter Erneuerung des Gewebekulturmediums in Abständen von
etwa 1 bis 3 Tagen fortgesetzt wird»
Es ist auch möglich, die Bebrütung ohne Erneuerung des Mediums fortzusetzen. In diesem Fall steigt die Menge des
im Medium angereicherten Antigens im Laufe der Bebrütungszeit schließlich auf 64 oder 128 Einheiten pro 0,025 ml
Kulturmedium während einer Bebrütungsdauer von etwa 10 bis 14 Tagen· Dieser maximale Titer des Antigens kann ohne Erniedrigung
aufrechterhalten werden, auch wenn die Bebrütung für eine längere Zeit von beispielsweise 1 Monat
fortgesetzt wird. Inzwischen wird das Rubella-Virus nicht nur im Kulturmedium, sondern auch in der stabilen Schweinenierenzellinie
während einer Bebrütungsdauer von etwa 12 bis 16 Tagen vollständig deaktiviert. Es ist somit durch
Fortsetzung der Bebrütung über etwa 16 Tage hinaus möglich, ein Kulturmedium zu erhalten, das einen hohen Titer des ·
Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigens enthält, aber
keinerlei Infektionskraft des Rubella-Virus zeigt.
109839/1583
Aus dem in dieser Weise erhaltenen Kulturmedium werden Feststoffe, z.B. Zellen und Zellfragmente, beispielsweise
durch. Filtration oder Zentrifugieren entfernt. Das Filtrat oder die überstehende Flüssigkeit kann in Abhängigkeit
vom Hämagglutinationstiter als solche oder nach Verdünnung
mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, z.B. einer mit Barbiturat gepufferten Lösung, als Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigenpraparat
verwendet werden.
Das auf diese Weise hergestellte Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigenpräparat
ist zwar bedeutend beständiger als die nach bekannten Verfahren hergestellten Antigenpräparate,
jedoch kann es durch Zusatz von Glycerin weiter stabilisiert werden. In der Praxis wird das Glycerin in
einer Menge von wenigstens etwa 0,1% (Vol./Vol.), vorzugsweise
etwa 1 bis 30/5, bezogen auf das Gesamtvolumen des
Antigenpräparats, zugesetzt. Die obere Grenze hängt in
erster Linie von wirtschaftlichen Erwägungen ab. Im allgemeinen wird durch eine Konzentration von mehr als etwa
50%, bezogen auf das Gesamtvolumen, kein weiterer Vorteil
erzielt.
Das in der beschriebenen V/eise hergestellte Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigenpraparat
ist gebrauchsfertig, jedoch kann es auch im gefrorenen Zustand mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer Stabilisationsmittel v/ie Glycerin,
Zucker, z.B. Saccharose, Glucose und Lactose, Aminosäuren, z.B. Kaliumglutanat und Natriumglutamat, aufbewahrt
werden. Es kann auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer der oben genannten Stabilisierungsmittel gefriergetrocknet
werden. Das gefriergetrocknete Produkt wird zum Gebrauch mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, z.B.
einer gepufferten Barbituratlösung, gelöst.
Das in der beschriebenen Weise hergestellte Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigenpräparat
zeichnet sich dadurch aus, daß es keine Virulenz des Rubella-Virus aufweist und
eine verhältnismäßig hohe Stabilität hat.
109839/1583
Das Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigenpräparat gemäß
der Erfindung kann beim Hämagglutinations-Hemmungstest
zur Serodiagnose der Rubella-Infektion verwendet werden.
Die zur Zeit bevorzugte Ausführungsform der Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Prozentangaben
beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.
Herstellung von stabilen Schweinenierenzellinien
Die Niere wird einem gesunden jungen Schwein aseptisch
entnommen und dekapsuliert, um das Nierenbecken zu entfernen. Die erhaltene Rierenrinde wird aseptisch zu Fragmenten
von 3 bis 5 emu Größe geschnitten. Die Gewebsfragmente
werden dreimal mit etwa dem zehnfachen Volumen der
von zweiwertigen Calcium- und Kagnesiumionen freien basischen
Phosphatlösung nach Dulbecco der nachstehend
genannten Zusammensetzung -(-Ρ» 7j2) gewaschen und in ungefähr
dem zehnfachen Volumen dieser Lösung, die durch
0,001% Trypsin rait Hilfe eines handelsüblichen Trypsinpräparats
(Hersteller Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, Handelsbezeichnung "Difco 1:250") ergänzt
ist, suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde gerührt
und 5 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Die erhaltenen
Zellen werden in einer solchen Menge einer Hanks-Lactalbuminlösung
der nachstehend genannten Zusammensetzung, der vorher 5% inaktiviertes Kalbsserum, 200 Einheiten
Penicillin/ml und 200 /ig Streptomycin pro ml zugesetzt
worden waren, suspendiert, daß die erhaltene Zellsuspension
etwa 2 χ 1Cr Zellen/ml enthält. Die Suspension wird
stationär in Houx-Flaschen 96 Stunden bei etwa 370C bebrütet,
wobei Monoschichtzellen der Schweineniere erhalten werden.
Die in dieser Weise erhaltenen Monoschichtzellen der
Schweineniere werden in si* sich bekannter Weise einer
Reihe von 50 Süchtungspassagen in der Hänks-Lactalbumiji-
109839/1583
lösung unterworfen, die die gleiche Zusammensetzung wie die oben genannte Hanks-Lösung hat, wobei eine stabile
Schweinezellinie erhalten wird.
Aus Roux-3? laschen, die die stabile Schweinezellinie enthält,
wird die Kulturflüssigkeit abgegossen, wobei die stabile Schweinezellinie auf der Innenwand der Flaschen
zurückbleibt. Die Zellen werden zweimal mit jeweils ungefähr dem 100-fachen Volumen der von zweiwertigen Calcium-
und Magnesiumionen freien basischen Phosphatlösung nach
Dulbecco gewaschen und 20 Minuten bei 37°C unter ungefähr dem 100-fachen Volumen dieser Lösung gehalten, die
0,00002% Trypsin und 0,02% Athylendiamintetraessigsäure
enthält, wobei Exfoliation der stabilen Schweinezellinie eintritt.
Die stabile Schweinezellinie wird 5 Minuten bei 1000 TJpM zentrifugiert. Die so konzentrierte stabile Zellinie
wird im Eagle-Medium der nachstehend genannten Zusammensetzung, das vorher durch 10% inaktiviertes Kalbsserum,
0,25% Lactalbuminhydrolysat und 100yag Kanamycin/ml ergänzt
worden ist, suspendiert, wobei das Eagle-Medium in einer solchen Menge verwendet wird, daß die Zellsuspension etwa
2 χ 105 Zellen/ml enthält.
Die Zellsuspension wird in Roux-Flaschen 96 Stunden bei
37°C stationär bebrütet, wobei die stabile Schweinenierenzellinie erhalten wird, die für die Proliferation des
Hubella-Virus verwendet werden kann.
Die oben genannte» von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen, freie basische Phosphat lösung nach Dulbecco hat
folgende Zusammensetzung:
FaGl 8,0 g
KCl 0,2 g
• Na2HPO4 1,15 S
KH2PO4 0,2 g
Wasser 800 ml
10983S/1583
-Die oben genannte Hanks-Lactalbuminlösung wird hergestellt,
indem 5 g Lactalbuminhydrolysat in Hanks-Lösung in einer
Menge, die insgesamt.1000 ml ergibt, gelöst werden. Die Hanks-Lösung hat folgende Zusammensetzung:
| NaGl | 8,0 | g |
| KCl | 0,4 | S |
| CaCl2 | 0,2 | g |
| MgSO^.7H2O | 0,2 | g |
| Na2HPO4.2H2O | 0,06 | g |
| KH2PO4 | 0,06 | g |
| NaHCO5 | 0,25 | g |
| d-Glucose | 1,0 | g |
| Phenolrot | 0,02 | g |
Destilliertes Wasser (3-fach destilliert) ad 1 1
Das oben genannte Eagle-Medium ist eine sterile wässrige
Lösung, die Aminosäuren, Vitamine, Zucker, anorganische Salze usw.·enthält. Die Zusammensetzung wird beispielsweise
in "Science" 1^O (1959), S.4-32-4-36, beschrieben.
Ein Impfvirus von Rubella, Stamm To-336 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection, Rockeville, Maryland,
USA, unter Nr. ATCC VR-553) wird bei etwa 1:0,1 M.O.I.
in die in der oben beschriebenen Weise hergestellte stabile Schweinenierenzellinie in Eagle-Medium inoculiert und
2 Tage bei etwa 35°C stationär in 3 Roux-Flaschen gezüchtetvNaeh
Erneuerung des Kulturmediums durch frisches Eagle-BeaiülSy das vorher durch 0,25% Lactalbuminhydrolysat
und 100 Aig/ml Kanamycin ergäiizt worden ist, wird die stabile
Schweinenierenzellinie für eine Dauer von 14- Tagen, gerechnet vom Beginn der Kultivierung, bei 35°C weiter
bebrütet. Während der Bebrütung werden die Kulturflüssigkeiten durch Erneuerung des Mediums durch das eben genannte
Eagle-Medium nach 3 Tagen, 7 Tagen, 9 Tagen, 11 Tagen
109839/1583
und 14 Tagen, gerechnet vom Beginn der Kultivierung, abgenommen,
worauf der Hämagglutinationstiter bestimmt wird.
Bei einem Vergleichsversuch wird das gleiche Impfvirus bei etwa 1:1 M.O.I, in die stabile Zellinie von Hamsternieren
(BHK-21) inoculiert und 14· Tage unter den oben genannten
Bedingungen bebrütet.
Die Hämagglutinationstiter der einzelnen Kulturen sind
nachstehend in Tabelle 1 genannt.
109839/1583
| Wirtszellen | * | BHK-21 | Flasche | Hämagglutinations einheit en ,"pro 0 | 7 Tagen 9 | ,025 ml | Ta^en. | 14 Tapen | |
| Nr. | Kulturmedium nach | 52 | einer Bebrütungszeit von | 64- ' | 52 '.: | ||||
| Stabile | 1 | 5 Ta^en | 52 | Tagen 11 | 64 ■· · | 52 :: | |||
| Verfahren | Schweinenieren- | 2 | 16 | 52 | 64 . | 64 : ; | 52 | ||
| gemäß der | zellinie | 5 | 16 | 52 | 64 - | .4 | <2 | ||
| Erfindung | 4 | 16 | 52 | 52 | 4 | <2 | |||
| VJl | 16 | 52 | .52 | 8 | 2 | ||||
| Vergleichs | 6 | 16 | 16 | ||||||
| versuch | 16 | 16 | |||||||
Ein Rubella-Impfvirus, Stamm M-33 (hinterlegt bei der
American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC VR-315)
wird bei etwa 1:0,1 M.O.I, in die in der oben beschriebenen Weise hergestellte stabile Schweinenierenzellinie
in Eagle-Medium inoculiert und 2 Tage bei etwa 37°C stationär
kultiviert. Nach Erneuerung des Kulturmediums durch frisches Eagle-Medium, das vorher durch 0,25% Lactalbuminhydrolysat,
0,18% Natriumhydrogencarbonat und 100yug
Kanamycin/ml ergänzt worden ist, wird die stabile Schweinenierenzellinie
18 Tage bei 37°C bebrütet. Das Kulturmedium wird vom Zellmaterial durch Zentrifugieren bei 1000 UpM
für 5 Minuten abgetrennt. Das in dieser Weise erhaltene Kulturmedium enthält 64- Hämagglutinationseinheiten/O,025
Wenn dieses Kulturmedium vier Blindpassagen unterworfen und die bei der letzten Passage erhaltene überstehende
Flüssigkeit dem Plaquebildungstest unterworfen wird (beschrieben
beispielsweise in "Archiv für die gesamte Virusforschung" 16 (1965), S.423), wird kein Plaque des Rubella-Virus
gebildet. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, daß dieses Kulturmedium keine Virulenz des Rubella-Virus aufweist.
Das Kulturmedium wird für die Lagerung gefriergetrocknet. Nach einjähriger Lagerung wird es aufgetaut und mit einer
gepufferten Barbituratlosung auf das 16-fache Volumen verdünnt. Das verdünnte Präparat wird als solches beim
Hämagglutinations-IIemmungstest für die Serodiagnose der
Rubella-Infektion verwendet.
Ein Impfvirus, Rubella-Stamm M-33, wird bei etwa 1:0,1
M.O.I, in die in der oben beschriebenen Weise hergestellte stabile Schweinenierenzellinie in Eagle-Medium inoculiert
und 2 Tage "bei etwa 35° C stationär kultiviert. Nach Erneuerung
des Kulturmediums mit frischem Eagle-Liedium, das
vorher durch 0,25% Lactalbuminhydrolysat, 0,18% Natrium-
109839/1583
hydrogencarbonat und 100 ug Kanamycin/ml ergänzt worden
ist, wird die stabile Schweinenierenzellinie 10 Tage bei 350C bebrütet.
Das Kulturmedium wird mit einer Säugpumpe abgezogen. Dieses
Kulturmedium enthält 128 Hämagglutinationseinheiten/ 0,025 ml. Zu Teilen von je 1 ml des Kulturmediums wird
Glycerin in verschiedenen Konzentrationen, die in Tabelle genannt sind, gegeben. Die Präparate werden 60 Minuten
bei 560C gehalten. Die Veränderungen der Hämagglutinationseinheiten
pro 0,025 ml während des Erhitzens werden für die jeweiligen Präparate ermittelt. Die Ergebnisse
sind nachstehend in Tabelle 2 genannt.
1 09839/1583
| co | O |
*
ϋ |
O | O | O | O | VD | CM | OJ | OJ | |
| VD | ο | LfN | V | V | V- | ||||||
| CO | •Η | OJ | LA | LfN | LA | ||||||
|
M
■Ρ |
O | •Ρ | O | O | O | O | VD | CVJ | CM | OJ | |
| •Η | OJ | CO | LfN | V | V | V | |||||
| si |
H
•Ρ |
CVJ | LfN | LA | LA | ||||||
| U | D- | β | O | O | O | co | VD | CM | OJ | OJ | |
| W | V | Φ | LA | V | V | V | |||||
| N | CM | LA | IA | IA | |||||||
| ω | LfN, | C! | O | O | CO | CM | VD | OJ | CM | CM | |
| φ | V | O | KN | LTN | V | V | V" | ||||
| ti | CVJ | IA | LA | LfN | |||||||
| CVJ | O | co | VD | co | VD | CM | OJ | CVJ | |||
| fn | V- | •rl | V | OJ | LfN | V | V | V | |||
| Φ | U | V | CM | LfN | LfN | LA | |||||
| ρϊ | O | Φ | O | OJ | OO | CO | φ | CM | OJ | CM | |
| CVJ | V | O | KN | OJ | OJ | ιΑ | V | V | V | ||
| Π) | f». | V- | V | OJ | LTN | LTN | LA | ||||
| H ι |
|||||||||||
|
ι—ι
φ |
Ι> | CO | CO | CO | CO | VD | CVl | CM | CM | ||
| OJ | OJ | OJ | LA | V | V | V" | |||||
| CO EH |
V- | V | V | OJ | LTN | LA | LfN | ||||
| IA | CM | OO | CO | CO | VD | CM | CM | CM | |||
| KN | OJ | OJ | CM | LA | V | V | V | ||||
| V- | V- | V- | OJ | LA | IA | LA | |||||
| CVJ | co | CO | CO | CO | VD | OJ | CM | CM | |||
| CM | OJ | OJ | CVJ | LfN | V | V | V | ||||
| V | V* | V | V- | CVJ | LTS | LfN | LA | ||||
| O | CO | CO | οο | CO | VD | OJ | CM | CM | |||
| CM | OJ | OJ | OJ | LA | V | V | V | ||||
| V | V | V- | V- | CVJ | LfN | LA | LA | ||||
| O | |||||||||||
| pi | |||||||||||
|
W
£ , |
|||||||||||
|
H
Φ |
|||||||||||
| |> | |||||||||||
| 03 | |||||||||||
| CJ | |||||||||||
| CU | O | ||||||||||
| ■Ρ | •Η | ||||||||||
| Φ | |||||||||||
| B | γ-1 | V" | IA | O | O | O | O | ο | |||
| •rl | V- | CM | LTN | ||||||||
| 53 | ^ | ||||||||||
| Φ | |||||||||||
1 OuQ 3.9/ 158 3
Versuch
Das gemäß Beispiel 1 nach 7 Tagen (gerechnet vom Beginn
der Kultivierung) erhaltene Kulturmedium mit 32 Hämagglutinationseinheiten
pro 0,025 ml und das bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Vergleichsversuch erhaltene
Medium mit dem gleichen Titer an Häiaagglutinationseinheiten
v/erden 14 Tage bei 37°C gehalten. Die Änderungen der Hämagglutinationseinheiten in den Kulturmedien wurden
nach 7 Tagen und nach 14 Tagen ermittelt. Die Ergebnisce
sind nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Hämagglutinationseinheiten pro 0^025 ml
Vor der Nach Nach Lagerung 7 Tagen 14 Tagen
Kulturmedium
gemäß Beispiel 1 32 32 32
Kulturmedium
aus Vergleichs- 32 4 1
versuch von
109839/1583
Claims (8)
- Patentansprüche\ 1y Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-Häinagglutinationsantigen, dadurch gekennzeichnet, daß man Rubella-Virus in eine stabile ßehweinenierenzellinie (porcine stable kidney cell line) inoculiert, das inoculierte Virus in den Zellen kultiviert und die erhaltene Zelllinie wenigstens so lange weiter bebrütet, bis das Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen in einer Konzentration von vier Hämagglutinationseinheiten pro 0,025 ml im Kulturmedium angereichert worden ist.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die Kultivierung als auch die Bebrütung bei einer Temperatur zwischen etwa JO und 38°C durchgeführt werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem serumhaltigen Gewebekulturmedium durchgeführt wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in einem serumfreien Gewebekulturmedium durchgeführt wird.
- 5· Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gewebekulturmedium verwendet wird, das etwa 0,3 bis 0,5/£ Natriumhydrogenearbonat enthält.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Bebrütung unter wiederholter Erneuerung des Gewebekulturraediums durchgeführt wird.
- 7, Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Bebrütung ohne Erneuerung des Gewebekulturmediums fortgesetzt wird, bis das Rubella-Virus im wesentlichen inaktiviert ist.T09839/1583I I I I- 1
- 8. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7> dadurch £;ekennze Lohnet, daß man das erhaltene Produkt mit Glycerin in Meri&en vrn etwa 0,1 bis 50 $, bezogen auf das Gesamtvolumen des Produkts, stabilisiert109839/1583
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2068970A JPS4910733B1 (de) | 1970-03-11 | 1970-03-11 | |
| JP5748670A JPS505258B1 (de) | 1970-07-01 | 1970-07-01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2111120A1 true DE2111120A1 (de) | 1971-09-23 |
| DE2111120B2 DE2111120B2 (de) | 1974-03-14 |
| DE2111120C3 DE2111120C3 (de) | 1974-10-17 |
Family
ID=26357663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19712111120 Expired DE2111120C3 (de) | 1970-03-11 | 1971-03-09 | Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| BE (1) | BE764049A (de) |
| CA (1) | CA958981A (de) |
| DE (1) | DE2111120C3 (de) |
| FR (1) | FR2088988A5 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU513684B2 (en) * | 1977-03-01 | 1980-12-18 | Abbott Laboratories | Soluble rubella antigen |
-
1971
- 1971-03-09 DE DE19712111120 patent/DE2111120C3/de not_active Expired
- 1971-03-10 BE BE764049A patent/BE764049A/xx not_active IP Right Cessation
- 1971-03-10 FR FR7108316A patent/FR2088988A5/fr not_active Expired
- 1971-03-11 CA CA107,482A patent/CA958981A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2111120C3 (de) | 1974-10-17 |
| BE764049A (fr) | 1971-09-10 |
| CA958981A (en) | 1974-12-10 |
| FR2088988A5 (en) | 1972-01-07 |
| DE2111120B2 (de) | 1974-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE2851928C2 (de) | ||
| DE69216732T2 (de) | Impfstoff gegen den Geflügelanämieerreger | |
| DE2552137A1 (de) | Attenuiertes felines calicivirus | |
| DE2423129C2 (de) | Temperaturempfindliche, nicht-pathogene Rinder-Adeno-Virus-Mutantenstämme, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Virusstämme enthaltender Lebendimpfstoff | |
| DE2553998C2 (de) | Mumpsvaccin und Verfahren zu seiner Herstellung | |
| DE1198489B (de) | Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Panleucopenie | |
| DE2111120C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Rubella-Virus-Hämagglutinationsantigen | |
| DE2058645C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines stark abgeschwächten Newcastle-Disease-Virus-Lebendimpfstoffs | |
| DE2620649A1 (de) | Immunstimulierendes agens | |
| DE2950004C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus(FSME-Virus)-Vakzinen | |
| DE2041647A1 (de) | Zellreihe aus der Leber menschlicher Embryonen,Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung | |
| DE2805311A1 (de) | Respiratorische synzytial-vakzine | |
| DE2613943A1 (de) | Verfahren zur herstellung von vaccinen auf ribonucleinsaeurebasis | |
| DE2023987C3 (de) | Verfahren zur Spaltung von Viren | |
| AT231068B (de) | Verfahren zur Herstellung von Vaccinzwischenprodukten | |
| DE1902590C2 (de) | Verwendung einer Immunribonucleinsäure (IRNS) zum Immunisieren lebender Tiere | |
| DE1617775B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines abgeschwächten R¦teln-Lebendvirusimpfstoffes | |
| DE1617775C (de) | Verfahren zur Herstellung eines ab geschwächten Röteln Lebendvirusimpfstof fes | |
| DE1941709C3 (de) | Verfahren zur enzymatischen Vermehrung von informatorischer Ribonucleinsäure | |
| DE2132911C2 (de) | Verfahren zum Herstellen eines stark abgeschwächte Rötelviren enthaltenden Impfstoffs | |
| AT216670B (de) | Verfahren zur Herstellung einer verbesserten Hundestaupevirusvaccine | |
| DE2225548B2 (de) | Intravenös verträglicher Impfstoff gegen Staupe- und Hepatits contagiosa canis | |
| DE2014200C3 (de) | Verfahren zur Gewinnung und Erhaltung von Bakterienvarianten und ihre Verwendung | |
| DD228737A1 (de) | Verfahren zur herstellung von influenza-inaktivimpfstoffen mit geringer stammabhaengigkeit | |
| DE2265620C2 (de) | Mittel zur passiven Immunisierung gegen die toxischen Effekte von Infektionen durch Elastase bildende Bakterien und Verfahren zur Herstellung desselben |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |