DE2023987C3 - Verfahren zur Spaltung von Viren - Google Patents

Description

den die Eier aufgebrochen und die Flüssigkeiten durch eine Zentrifuge hoher Geschwindigkeit zentrifugiert Die Viren werden aus der Flüssigkeit neben beträchtlichen Mengen von Eiprotein und dergleichen ausgeschleudert Der sich ergebende Niederschlag wird in Kochsalzlösung erneut suspendiert und kann dann ungefähr 12 bis 15 Stunden in einer Kugelmühle bearbeitet werden, wodurch man dann eine wäßrige Virussuspension erhält, die dann in einer langsam laufenden Zentrifuge unter Bildung eines Viruskonzentrats geklärt wird. Wie oben erwähnt, kann überraschenderweise das vorliegende Verfahren entweder die gesammelte allantoische Flüssigkeit oder das Viruskonzentrat als Ausgangsmaterial verwenden.

Das besondere, in dem vorliegenden Verfahren erforderliche Lösungsmittel ist ein Trialkylphosphat, das im wesentlichen in Wasser unlöslich ist, d. h, daß es eine Löslichkeit hat, die im wesentlichen nicht größer ist als 1% bei 25° C Damit ist eine besondere Klasse von organischen Lösungsmitteln vorgesehen, die auf wäßrige Suspensionen von Viren einwirken können, wodurch die gewünschte Spaltung in einer unerwartet wirksamen Weise gebildet und gleichzeitig die Toxizität gesenkt wird. Diese Ester sind im wesentlichen in dem Sinne wasserunlöslich, daß die Klasse dispergierfähige Materialien beinhaltet, die sich in einem Ausmaß von nicht mehr als ungefähr 1 g in 100 g Wasser bei 25° C lösen. Besonders brauchbare Phosphatester stammen von aliphatischen gerade- und verzweigtkettigen Alkoholen mit von 4 bis 10 Kohlenstoffatomen, wozu beispielsweise Tri-(n-butyl)-phosphat, Tri-(t-butyl)-phosphat, Tri-{nhexyl)-phosphat Tri-(2-äthyIhexyl)-phosphat Tri-(n-decyl)-phosphat und dergleichen gehören. Ein besonders bevorzugter Phosphatester ist Tri-(n-butyl)-phosphat Es ist bei dem Verfahren kritisch, dem Medium nichtionische Netzmittel einzuverleiben, da diese sich für diesen Zweck als besonders geeignet erwiesen haben. Bevorzugte Netzmittel sind polyoxyäthylensorbitanhöhere Fettsäure-Partialester, wobei beispielsweise zu diesen Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat und mono-Oleat gehören, die beide kommerziell verfügbar sind. Wie es nachfolgend noch erläutert wird, ist eine besonders bedeutende praktische Ausfuhrungsform dieser Erfindung die Spaltung von Influenzaviren sowohl der Typen A als auch B.

Bei der Durchführung des vorliegenden Verfahrens, das, wie oben angegeben, allgemein auf virusenthaltende Medien anwendbar ist aber zum Zwecke der Erläuterung nachfolgend nur unter besonderem Hinweis auf Influenza-Virus enthaltende Medien beschrieben wird, kann die Spaltung dadurch bewirkt werden, daß man die unverdünnte oder konzentrierte Viruslösung der Phosphatesterextraktion unterwirft In diesem Verfahren wird die Viruslösung mit Phosphatester gemischt, vorzugsweise ungefähr 1 bis 30 Teile Lösung pro Vol.-Teil Ester, und um beste Ergebnisse zu erhalten, hält man die Temperatur zwischen ungefähr 4° C und ungefähr 25°C so lange, bis im wesentlichen das vollständige Zusammenbrechen der Viruspartikel ermöglicht ist Die Phosphatesterbehandlung spaltet bzw. zerlegt das intakte Influenzavinis in kleinere lipoidfreie Partikel, die alle die Oberflächenantigene der intakten Viren tragen. Die bevorzugte Mischzeit ist ungefähr eine Stunde bei Influenzaviren, obgleich Zeiten wie 3 Minuten und 1 Stunde verwendet werden können. Nach dem Mischen läßt man die wäßrigen und Phosphatesterphasen, vorzugsweise in der Kälte, sich trennen und die wäßrige Phase, die das gewünschte Untereinheits-Virus

antigen enthält, wird gewonnen. In jedem Falle wird, wenn eine allantoische Flüssigkeit verwendet wurde, die Phasenabtrennung durch Zugabe von Paraffinöl, ungefähr 1 VoL-%, zu der Viruslösung, nach der Phosphatesterbehandlung erleichtert Die Extraktion der wäßrigen Phase mit Phosphatester muß mit einem nichtionischen Netzmittel, das der wäßrigen Phase einverleibt wird, durchgeführt werden, da sonst die gewünschten Ergebnisse nicht erzielt werden. Bevorzugte Netzmittel sind die polyoxyäthylensorbitan-höhere Fettsäure-Partialester, wie Polyoxyäthylensorbitan-mono-laurat und -mono-oleat Die verwendete Menge ist nicht besonders kritisch, und es können beispielsweise von ungefähr 0,01 bis ungefähr 1% verwendet werden, jedoch ist es zweckmäßig, ungefähr 0,1% Netzmittel, bezogen auf das Gewicht der wäßrigen Flüssigkeit, zu verwenden. Die sich ergebenden Extrakte, die nicht infektiös sind, können zur Herstellung von Vakzinen oder diagnostischen Mitteln oder sie können Tieren zur Herstellung von spezifischen Antiseren und dergleichen injiziert werden. Im Falle der Vakzinherstellung wird beispielsweise ein geeignetes Influenzavirusvakzin, entweder durch bakteriologisch steriles Filtrieren (ein Vorteil im Vergleich zu dem Stand der Technik) oder durch herkömmliche Mittel, wie durch Zugabe eines Konservierungsmittels wie Thiomersal (1 :10 000) und eines Stabilisierungsmittels wie Formalin, erhalten. Die optimale Konzentration zur Stabilisierung ist ungefähr 0,1%.

Die nach dieser Erfindung hergestellten Extrakte sind besonders als Ausgangsmaterialien für chromatographische Reinigungsverfahren des Influenzavinis geeignet Nur zum Zwecke der Erläuterung soll darauf hingewiesen werden, daß gegenüber allen herkömmlichen Verfahren verbesserte Reinigung dadurch erhalten werden kann, wenn man mit Calciumdihydrogenorthophosphatmonohydrat mit Wasser, dann mit Alkali so wäscht daß der pH-Wert auf ungefähr 6,5 eingestellt wird, dann mit Wasser wäscht, bis der pH-Wert auf ungefähr 7,2 bis 7,4 angestiegen ist, dann mit einer Alkalimetalltrimetaphosphat-(TMP)-lösung auf einen pH-Wert von ungefähr 8,0 wäscht und das zur Reinigung vorgesehene Material in eine chromatographische Kolonne einbringt und mit TMP auf pH 8 bis 8,1 wäscht Dann wird ein virusenthaltender Extrakt, der nach dieser Erfindung hergestellt wurde, wenn gewünscht, verdünnt wobei der Virus mit einem Alkalimetalltrimetaphosphat bei einem pH-Wert von ungefähr 8,0 behandelt wurde, in die Kolonne gegossen. Die Kolonne wird mit 0,01 TMP-Puffer, pH 8,0, gewaschen und dann mit einem Puffer, d.h. einem 1,0-M-Phosphatpuffer, mit einem pH-Wert von ungefähr 5,0 bis 9,0 eluiert. Es wird vorgezogen, den Influenzatyp A bei pH 6,0 und den Influenzatyp B bei pH 8,0 zu eluieren. Die Eluate können dann nach völlig herkömmlichen Verfahren, wie sie oben beschrieben wurden, in außergewöhnlich brauchbare Vakzine formuliert werden. Untersuchungen der Fieberbildung bei Laboratoriumstieren sind ein Standardmaßstab für den Grad der Toxizität bei Virussuspensionen. Ein weitgehend verwendetes Verfahren besteht darin, gering'; Mengen der Testflüssigkeit Kaninchen zu injizieren und die Körpertemperatur in 15-Minuten-Abständen zu messen. Die Untersuchung wird über 8 Stunden durchgeführt und Virussuspensionen, die unerwünscht toxische Materialien enthalten, veranlassen einen Temperaturanstieg bei dem Tier. Bei unbehandeiten Lösungen von Viren ist es üblich, daß

man Erhöhungen von 2" C oder mehr feststellt. Es ist anerkannt üblich, Viruslösungen mit Formaldehyd zu behandeln, der die Temperaturerhöhung etwas, aber nicht vollständig auf normal senkt. Weiterhin hat die Extraktion von Viruslösungen mit Äther ebenso die Neigung, die Temperaturerhöhung zu senken. Aber bei der vorliegenden Erfindung ist die Wirkung der Verringerung der Fieberbildung der Virussuspension besonders bemerkenswert im Vergleich zu den Verfahren nach dem Stand der Technik. Diese Wirkung wird durch die Zeichnung erläutert, worin

F i g. 1 das Temperaturansprechen von Kaninchen zeigt, denen Dosen von wäßrigem Influenzavirus Typ A-2/Taiwan, 4000 Hämaggkitinierungseinheiten (HA)/ml — unbehandelt formalinbehandelt, ätherbehandelt und behandelt mit Tri-(n-butyl)-phosphat nach dieser Erfindung injiziert wurde;

Fig.2 das Temperaturansprechen von Kaninchen zeigt, denen wäßriger Infiuenzavirus Typ B/Mass. — unbehandelt formalinbehandelt, ätherbehandelt und behandelt mit Tri-(n-butyl)-phosphat nach der Erfindung gespritzt wurde;

Fig.3 das Temperaturansprechen von Kaninchen zeigt, denen wäßriger Infiuenzavirus Typ A2/Japan/170 — unbehandelt, formalinbehandelt, ätherbehandelt und 2s behandelt mit Tri-(n-butyl)-phosphat nach der Erfindung gespritzt wurde.

Ein Vergleich der in diesen Figuren durch die verschiedenen Linien aufgezeigten Temperaturhöhen zeigt, daß die Behandlung mit Tri-(n-butyl)-phosphat weit wirksamer ist zur Senkung der fieberbildenden Stoffe in den Virus enthaltenden Flüssigkeiten als die Behandlung mit Äther, und in der Zeit nach ungefähr 3 Stunden ist sie auch viel wirksamer als die Behandlung mit Formalin.

Die vorliegende Erfindung schafft, wie durch die nachfolgenden Beispiele erläutert wird, ein Verfahren, um Viren zu spalten unter gleichzeitiger Senkung der Pyrogenität und ohne wesentliche Senkung des Neuraminidasespiegels oder Abnahme der Immunisierung im Vergleich zu intakten Viren. Die Erfindung schafft weiterhin eine Möglichkeit, Viren zu spalten, wozu im kommerziellen Umfang Produktionsvorrichtungen ohne Explosions- oder Feuergefahr verwendet werden können.

Die Erfindung schafft weiterhin gespaltene Viren, die zur Herstellung von Vakzinen für diagnostische oder immunisierende Zwecke brauchbar sind, und solche Vakzine fallen in den Bereich der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Ein zentrifiigiertes Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt: 11 Tage alte befruchtete Hühnereier wurden mit Infiuenzavirus des Typs A geimpft und 48 Stunden bei 35° C bebrütet Nach dem Brüten wurde die Allantois-FIüssigkeit gesammelt zentrifugiert und die sich ergebenden Sedimente erneut in Kochsalzlösung suspendiert und 12 bis 15 Stunden in der Kugelmühle bearbeitet Die sich ergebende wäßrige Virussuspension fco wird dann in einer langsam laufenden Zentrifuge geklärt

Polyoxyäthylensorbitan-mono-oleat wird jedem Viruskonzentrat in einer Konzentration von 1 mg/ml (0,1%) zugegeben. 100 Vol.-Teile des sich ergebenden f>5 Gemische werden mit 33 VoL-Teilen Tri-(n-butyl)-phosphat zusammengegeben und das sich ergebende wäßrige Tri-in-butyOphosphatgemisch bei 23° C ungefähr 1 Stunde so schnell gerührt, daß keine Schaumbildung erfolgt und noch keine Abtrennung der zwei Phasen stattfindet. Dann läßt man die wäßrige und Tri-(n-butyl)-phosphatphase sich während ungefähr 16 Stunden trennen, entfernt die Tri-(n-butyl)-phosphatschicht und sammelt die wäßrige Phase. Die sich ergebenden wäßrigen Antigenprodukte sind nicht infektiös und können für immunisierende, prophylaktische oder diagnostische Zwecke verwendet werden. Beispielsweise können Vakzine mit geringer Fieberbildung aus den wäßrigen Produkten hergestellt werden, wozu man die gewünschte immunisierende Wirkung mit entionisiertem Wasser einstellt und danach unter sterilen Bedingungen filtriert

Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle des Zentrifugats die unreinen, zusammengegossenen allantoischen Flüssigkeiten, die das Virus des Typs A₂/Taiwan, Typs A₂/Japan/170 oder Typ B/Mass. enthalten, verwendet Nach Beendigung der Extraktion wird in diesem Falle 1 Vol.-% Paraffinöl zugegeben, um die Phasentrennung zu erleichtern. Die Phasentrennung erfolgt in diesem Falle durch Zentrifugieren. Die wäßrige Phase kann zu hochwertigen Vakzinen nach dem Verfahren von Beispiel 1 aufgearbeitet werden. Jedoch werden besonders hochwirksame Vakzine dann erreicht, wenn die nachfolgenden Stufen eingehalten werden:

100 g Calciumphosphat-monobasisches Monohydrat

[Ca(H₂PO₄J₂ · H₂O]

und 400 ml entionisiertes Wasser werden 15 Minuten bei pH 23 gerührt Unter fortdauerndem Mischen wird eine kalte (4°C) 3 N-Natriumhydroxidlösung tropfenweise während einer halben Stunde zugegeben, bis ein pH-Wert von 6,5 erreicht ist Der Inhalt des Reaktionsgemischs wird dann durch ein äußeres Eisbad bei 20 bis 23° C gehalten. Nach halbstündigem Rühren läßt man das Adsorbens absitzen, und die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert Das Adsorbens wird ansatzweise mit '/21 Portionen entionisiertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der überstehenden Flüssigkeit 7,2 bis 7,4 ist Das Adsorbens wird dann ansatzweise mit einer gepufferten 0,01-M Natriumtrimetaphosphat-(pH 9,0)-!ösung gewaschen, bis ein pH-Wert von 8,0 erreicht ist (vier, 500-mI-Portionen).

100 g Ca(H₂PO₄J₂ · H₂O, behandelt wie beschrieben, werden in eine Glaskolonne eingeführt, die eine gesinterte Glasscheibe enthält um das Bett zu tragen und mit TMP-Puffer gewaschen, bis der Abfluß einen pH-Wert von 8,0 hat Der Kolonne werden dann 750 ml infizierte allantoische Flüssigkeit die das esterextrahierte Virus enthält verdünnt mit einem gleichen Volumen sterilem destilliertem Wasser, zugeführt Die verdünnte Flüssigkeit wird auf pH 8,0 mit 0,01-M Natriumtrimetaphosphat eingestellt und fließt durch die Kolonnen während einer Zeitdauer von zwei Stunden. Die Kolonne wird dann mit 200 ml 0,01-M Natriumtrimetaphosphat-(pH 8)-lösung gewaschen und das Virus Typ A mit 0,1-M Phosphatpuffer (pH 6,0) und das Virus Typ B mit 0,1-M Phosphatpuffer (pH 8,0) eluiert

Nach dem oben beschriebenen Verfahren erhält man den Virusstamm in hoher Ausbeute und mit einem guten Reinigungsfaktor. Dieser kann dann in überlegene Vakzine nach dem Verfahren von Beispiel 1 formuliert werden. Auf diese Weise werden Vakzine mit

Influenzariven Typ A2/Taiwan Typ B/Mass. und Typ A2/Japan/170 erhalten.

Beispiel 3

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man das Influenzavirus durch die nachfolgenden Stämme ersetzt: A/PR-8, A/Jap 305, A/Ann Arbor, B/Great Lakes und B/Maryland. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle von Tri-(n-butyl)-phosphat gleiche Volumen Tri-(t-butyl)-phosphat, Tri-(n-hcxyl)-phosphat, Tri-(2-äthylhexyl)-phosphat und Tri-(n-decyl)-phosphat verwendet. Mit allen diesen Estern konnien in den chromatographischen Stufen von Beispiel 2 Esterspuren aus der wäßrigen Phase wünschenswerterweise entfernt

werden. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle von Polyoxyäthylensorbitan-mono-oleat ein gleiches Volumen Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat verwendet. Es werden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, wobei man anstelle des Zentrifugats der influenzainfizierten allantoischen Flüssigkeit eine wäßrige Suspension von Gewebekulturflüssigkeit verwendet, die mit Tollwutvirus infiziert war. Es wird ein gereinigtes, antigenes Produkt aus Untereinheiten erhalten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Spaltung von Viren, dadurch gekennzeichnet, daß man das intakte Virus in einem wäßrigen Medium mit einem nichtionischen Netzmittel und einem Trialkylphosphat mit einer Löslichkeit in Wasser, die im wesentlichen nicht größer ist als 1 % bei 25⁰C, in Kontakt bringt und das wäßrige Medium und das gespaltene Virus von dem Trialkylphosphat abtrennt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das verwendete Trialkylphosphat Alkylgruppen aufweist die 4 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten.

Diese Erfindung betrifft die Behandlung von Viren, die zur Herstellung von Vakzinen für diagnostische und immunisierende Zwecke geeignet sind. Im besonderen betrifft die Erfindung die Spaltung von Viren in Untereinheiten, die besonders wertvoll sind, um kräftige immunisierende Mittel herzustellen.

Es besteht seit langem ein Bedürfnis nach zufriedenstellenden Verfahren zur Spaltung von Viren, besonders von lipoidenthaltenden Viren, beispielsweise den Viren von Influenza, Newcastle-disease, Tollwut und dergleichen. Nach dem Stand der Technik verfügbare Verfahren zur Herstellung von Virusantigenen beinhalten das Isolieren des Virus aus natürlichen Vorkommen und die nachfolgende Züchtung des Virus in den Zellflüssigkeiten von Hühnerembryonen, Gewebekulturflüssigkeiten und ähnlichen wäßrigen Medien.

Die in diesen Medien gebildeten Viren bestehen aus getrennten Partikeln, die beispielsweise gebundene Lipoide enthalten. Neuerding? wurden verbesserte Vakzine in der Weise hergestellt daß man intakte Viren in Untereinheiten spaltet, die noch antigen sind.

Es wurden verschiedene Verfahren nach dem Stand der Technik im kommerziellen Umfang verwendet, um die gewünschte Spaltung der Viren in Untereinheiten zu erreichen. Dies geschieht im allgemeinen einerseits durch die Verwendung von Detergentien oder andererseits durch die Verwendung vor. Äther, einer flüchtigen, sehr leicht entzündbaren Substanz. Ein detergensgespaltenes, aus Untereinheiten bestehendes Vakzin, das durch Natriumdesoxycholatbehandlung von Influenzaviren hergestellt ist, ist kommerziell verfügbar, leidet jedoch im Vergleich zu intakten Viren an beträchtlich verringerter Immunisierungswirkung, wie bei Untersuchungen der Wirksamkeit an Mäusen festgestellt wurde. (Rubin u.a.. Arch. Virus-forsch. 20: 268 [1967]; Webster, J. Immunol, 96: 598 [1966]). Ein weiterer wesentlicher Vorschlag bestand darin, Äther als Spaltungsmittel zu verwenden. Jedoch entfernt im Gegensatz zu einigen Behauptungen in der Literatur und wie dies noch in der Zeichnung gezeigt wird, Äther die Pyrogenität nicht vollständig, wie dies durch Standard-Fieberuntersuchungen an Kaninchen festgestellt wurde. Weiterhin verursacht Äther einen wesentlichen Verlust an dem Enzym Neuraminidase. Dies ist sehr nachteilig, weil bis heute angenommen wird, daß die besten Vakzine einen hohen Gehalt dieses Enzyms haben müssen. Es wäre daher wünschenswert, Mittel zur Spaltung von Viren, besonders von Influenzaviren zu schaffen, wobei diese Mittel wirksamer ais Äther sein

sollen, um pyrogene Stoffe zu entfernen, ohne gleichzeitig wesentliche Verluste sui Neuraminidase zu bewirken, und sie sollten weiterhin nicht die Wirksamkeit des Produktes als Immunisierungsmittel verringern, wie dies Detergentien wie Natriumdesoxycholat tun. Es wäre weiterhin wünschenswert Mittel zu schaffen, die sowohl konzentrierte Viren als auch unreine Viren in Allantois-Flüssigkeit spalten.

Es wurde nunmehr ein neues und verbessertes Verfahren zur Zerlegung der Viren geschaffen.

Das neue Verfahren der vorliegenden Erfindung beruht im wesentlichen auf der Spaltung der Viren, wozu man das intakte Virus in einem wäßrigen Medium mit einem nichtionogenen Netzmittel und einem Trialkylphosphat in Kontakt bringt das eine Löslichkeit in Wasser aufweist die nicht wesentlich größer als 1 % bei 25° C und danach das wäßrige Medium und das gespaltene Virus von dem Trialkylphosphat abtrennt

Gemäß der Erfindung kann ein Influenza- oder Tollwutvirus gespalten werden. Beispielsweise kann das Ifluenzavirus ein solches des Typs A₂/Taiwan, Typ B/Massachusetts oder Typ A2/Japan 170 sein.

Das Netzmittel ist zum Beispiel ein Polyoxyäthylensorbitan-höhere-Fettsäure-Partialester.

Das wäßrige Medium kann eine Allantois-Flüssigkeit sein. Das Verfahren zur Spaltung eines Influenzavirus besteht dann, daß man das intakte Virus in einer allantoischen Flüssigkeit mit dem Trialkylphosphat besonders Tri-n-butylphosphat mit einem nichtionisehen Netzmittel, besonders Polyoxyäthylensorbitan- mono-oleat, in Kontakt bringt und dann die Flüssigkeit und das zerlegte Virus von dem Trialkylphosphat abtrennt

Die Bezeichnung »Virus«, wie sie hier und in den Ansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf infektiöse lipoidenthaltende Viren, wie Influenzavirus und ebenso Tollwutvirus, Newcastle-disease-Virus, Mumpsvirus, Pheumonievirus bei Mäusen, »eastern equine«-Encephalomyelitis-Virus, Saint-Louis-Encephalitis-Virus, Japanischer Encephalitis-Virus, Gelbfiebervirus, Der.guefieber-Virus, West-Nil-Virus. Theileria GD VH-Virus, Encephalomyocarditis-Virus, lymphocytischer Chorimeningitidis-Virus, vesiculärer Stomatitis-Virus und dergleichen. Das wäßrige, den intakten Virus enthaltende Medium kann jede Art von Flüssigkeit sein, die dem Fachmann dafür bekannt sind, daß man aus ihnen Viren isolieren und in ihnen züchten kann, wie beispielsweise allantoische Flüssigkeit Gewebekulturflüssigkeit ein wäßriger Extrakt oder eine Suspension von Zentralnervensystemgewebe, Blutzelleneluat, ein wäßriger Extrakt oder eine Suspension von Hühnerembryo und dergleichen. Die antigene Wirksamkeit der als Ausgangsmaterial verwendeten Viruslösung ist nichtkritisch und kann nach Wunsch geändert werden. Für das Influenzavirus würde beispielsweise ein geeignetes intaktes Virusmedium, das zur Verwendung bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist die allantoische Flüssigkeit sein, die man dadurch erhält daß man 11 Tage alte befruchtete geprüfte Eier verwendet, die man mit dem Influenzavirus (zum Beispiel des Typs A, A-I, A-2 oder B, zum Beispiel der Pr-8-, Ann-Arbor-, Asien-, Taiwan-, Japan/170-, B/Mass.- oder Great-Lakes-Stämme) impft und 48 Stunden bei ungefähr 35°C bebrütet. Bei der Herstellung von Vakzinen des Influenzatyps ist es im allgemeinen üblich, die Eier in Ansätzen von ungefähr 20 000 Stück zu impfen. Die Viren werden in den allantoischen Flüssigkeiten der infizierten Eier entwickelt. Nach der geeigneten Inkubationszeit wer-