DE2038693A1 - Verfahren zur fermentativen Erzeugung von Hefezellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Hefez eiren" irfft^vhÖhem trö't eingehalt" auf wirtschaftlich vorteilhafte Weise durch Züchtung der neuen Hefeart Candida novellus (Al¹CC Ut. 20.275)., untei'Verwendung von- Kohlenwasserstoffen als ilaupckohlenstoffquelle. . .■...-, » -..,;- . .;.,:.--'-.

Sine große Anzahl von'Mkroorganismeh;'die Kohlenwasserstoffe assimilieren, sind seit langem bekannt, und in den ,letzten Jahren sind zahlreiche Vorschläge zur Produktion' von Hikroorganismonzellen unter Verwendung von Erdöl als .Rohmaterial gemacht worden. Die bekannten Hefes.tämme■ waren jedoch vom Standpunkt der Ausbeute, des Proteingehaltes und der V/achstumsgeschwindiglceit der Hefezellen nicht zufriedenstellend, wodurch Schwierigkeiten bei dor kommerziellen Herstellung von fief©zellen entstanden sind.

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Im Rahmen der Erfindung wurden Bodenproben von verschiedenen Orten entnommen, wobei versucht wurde, aus diesen i-roben nefen zu isolieren, die in ausgezeichneter V/eise Kohlenwasserstoffe assimilieren, mit hoher Geschwindigkeit wachsen und wellen mit hohem Proteingehalt ergeben. Ein neuer hefestamm wurde gefunden, der den bekannten Stämmen im oben genannten idinne überlegen und zur kommerziellen Produktion von Hefezellen cit hohem rroteingehalt geeignet sind. Anhand von taxonomischen Untersuchungen wurde ermittelt, da£ es sich um eine neue Are nandelt. hrfindungsgemuß können Hefe ζ eilen mit hohem Proteirigeh&it erzeugt werden, indem man diese neue Art in einem Kohlenwasserstoff-

medium züchtet.

Me erfindungsgemaß verbendete, neuei.efeart weist folgende mikrobiologische Eigenschaften auf:

1. 1-iORPhOLOGIöGKE EIGEi.oCH

1. Vegetative Zeilen

alzextrakt von <±y °'J besaßen die ^eJ

Mach 5 i'agen in malzextrakt von <±y ⁰^ besaßen die wellen runde bis ovale ion,, und eine Grö.„e vo.i '■':■ - 6 χ 4 Vegetative Yermehrung durch niulbilder·.';Ie ouro^sun

2. Ascosporen

Gebildet weaer aiit' JipsbiociC, ίΟΓοα^ον/=.-^. -.r aocn auf Karobtenstopfen (c&croc plu-.·,) , V-o-iL^ar oder i.cibriun:- acetabaaar.

3· Mycel (t-seud'uaycel; , '.lasbosporen, usv/.

Pseudomycel entwickelt; nich gut aur ei-nor Karbof'fe.Laga scheibe, ebenso v/OL-rlen Blasbof.poron und ßlasbokonidien reichlich gebLLdob.

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BAD ORIGINAL

^ί[.-. l-.olonienbildung nach einem Kona-c bei 1? ⁰C ist die Ausstrichkultur erhöht, cremefarben, glatt und glänzend mit ranz er liante.

11. JrLISIOLOGISGHE EIGELSChAi-¹TEIi

"I. Optimale V.<aclisturasbedingungen pH 5|0, temperatur $0 0, aerob

d. Vi/aciistuinsDvidmiguncen

pH 2,5 - y,0, ieiiperatur 2 - 39 °G

3· Assimilation von .Nitrat fehlt

'•i. Reaktion in Lakmusmilch

Keine Koa ulation; j?arbv€-ränderung nach blau

5· Beständigkeit gegen osiuotisciien Bruclv (auf jUatriumehloridinediuin)

nicht vorhanden

-6. Verflüssigung von Gelatine positiv

y. /itandntedürftigkeiu· i^x- Biotin

Bildung von Laroti^oid-Pirnienten

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9· Ausnutzung von Äthanol positiv

10. Spaltung von Artmtin positiv

11. Esterbildung nicht vorhanden

12. Bildung von stärkeartiger Substanz fehlt

13. SäureDildung nicht vorhanden

14. Ausnutzung von Stickstoffquellen

Pepton, Ammoniumsulfate Harnstoff und Asparagin werden ausgenutzt

15. Pellikelbildung

Wach einem Monat in Malzextrakt bei I7 °G wird ein King gebildet

16. Fermentation

Glukose (+), Galaktose (schwach), Saccharose (+), Maltose (sehr schwach), Laktose (-), Raffinose (-)

17- Ausnutzung von Kohlenstoffquellen

Glukose (+), Mannose (+), Galaktose (+), Pruktose (+), Laktose (-), Saccharose (+), Maltose (+), Trehalose (+), Raffinose (-), Aesculin (+), ok-hethylglukosid (+), Dextrin (-), Stärke (-), Inulin (+), helibiose (-), Xylose (+), /vrabinose (-) Salicin (♦)

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Eine vergleichende Untersuchung der obigen morphologischen und physiologischen Eigenschaften wurde auf der Grundlage des Verfahrens nach Lodder et al. in "The Yeasts, A Taxonomic Study", I952, durchgeführt. Es wurde gefunden, daß drei Stämme, nämlich Candida tropicalis, Candida guilliermondii und Candida Parapsilosis, der erfindungsgemäß verwendeten neuen Art ähnlich sind. Es ist jedoch deutlich, daß sich die neue Art von Candida tropicalis hinsichtlich der Fähigkeit, Maltose zu fermentieren und Stärke zu assimilieren, unterscheidet; von Candida guilliermondii unterscheidet sie sich hinsichtlich der Fähigkeit, Raffinose zu fermentieren und zu assimilieren, hinsieht-* lieh der Fähigkeit, Arabinose zu assimilieren sowie hinsichtlieh einer Reaktion in Lakmusmilch; und von Candida parapsilosis unterscheidet sie sich hinsichtlich der Fähigkeit, Saccharose zu fermentieren, und hinsichtlich der Fähigkeit, Arabinose-und oalicin zu assimilieren.

Da einige Zweifel hinsichtlich der Stabilität der fermentativem Eigenschaften bestanden, wurde eine Antigenanalyse der Stämme zur genaueren Identifikation gemäß dem serologischen Verfahren, das in "l'he Japan Journal of Medical Mycology", Seite 179 - 190, tiand 10, Nr. 3» November 1969, besehrieben ist, durchgeführt. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Antigenstruktur des erfindungsgemäß verwendeten, neuen Stammes hitzebeständiges Antigen 1, 2, 3, V 13 ist.

Ein Vergleich mit den Antigenstrukturen der biologisch verwandten Arten zeigte die folgenden Ergebnisse: -

Erfindungsgemäßer neuer Stamm Candida trdpicalis Candida guilliermondii Candida parapsilosis

1, 2, 3, A, 13

1, 2, 3, 4, 5, 6

1, 2", 3, 4, 9

1, 2, 3, 5, 13, 14, 15

Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße neue Art sich in der Antigenstruktur von. den drei nahe verwandten Arten klar

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unterscheidet. Dementsprechend wurde der erfindungsgemäß verwendete Stamm als neue Art identifiziert und Candida novellus genannt .

Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen mit hohem Proteingehalt vor, bei dem man die neue liefe, Candida novellus, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen iNährmedium züchtet, das η-Paraffine oder n-Paraffine enthaltende Kohlenwasserstoffe als Hauptkohlensboff-iuelle enuhält, wobei Kohlenwassersboff-assimilierende Hefezellen in hoher Ausbeute produziert werden; und bei dem man die Hefezellen dann abtrennt und mib Wasser v/äscht, um die Zellen mit hohem Proteingehalt zu erhalten.

Gemäß der Erfindung kann die Züchtung entweder ansatzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden, wobei jedoch für eine Massenproduktion der Hefezellen normalerweise ein koribinuierliches ^üchtungsverfahren angewendet wird.

Das Ausgangsmaterial ist eine Kohlenstoffquelle, die sich hauptsächlich aus η-Paräffinen oder n-Panaffine enthaltenden Kohlenwasserstoffen zusammensetzt« Die erfindungsgemäü verwendeten η-Paraffine enthalten 9 bis 30 Kohlenstoffatoise pro Molekül

und werden mittels der Molekularsiebmethode, über die Harnstoff-P einschlußverbindung oier durch ähnliche Verfahren erhalten. Als η-Paraffine kommen z.B. Kerosin, Gasöl, oder rohe n-Paraffine, welche bei einem Verfahren zur Gewinnung von Srdölfraktionen gereinigt werden und mehr als 50 % η-Paraffine enthalten, in Frage· Die Konzentrationen der η-Paraffine bei der kontinuier-J liehen Züchtung beträgt im allgemeinen 0,01 bis 1 #. Die Züch-] tungsteniperatur liegt im Bereich von 25 bis 4O C, vorzugsweise 27 hiß 55 G. D^r pH-Wert des Kulturmediums beträgt 3,5 bis 6,0, Vorzugsweise 4,0 bis 5»0.

Dem Züohtungsmedium müssen außer der Kohlenstoffquelle eine wachstumsfördernde Substanz sowie anorganische Substanzen suge-

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f ORIGINAL ih!SF!"CTED

setat werden. Es ist günstig, als wachstumsfördernde Substanz eine Spur an Biotin oder einem Homologen mit derselben Art der physiologischen Aktivität wie Biotin, z.B. Desthiobiotin, oder 0,02 bis 0,5 ,j eines Biotin enthaltenden Materials, z.B. Melassen, Hefeextrakte oder Haisguellflüssigkeit, zuzusetzen, da der erfindungsgemäße Stamm Biotin benötigt. Als v/eitere Aus- ;.-ari;^materialien werden !valium-, Iiacnesium-, Zink- oder Eisenquellen verwendet, z.L. Kaliumchlorid, hagnesiumsulfat, Zinksulfat, jjiisensulfat oder Eisen-III-sulfat; ferner werden wie bei jeder üblichen Züchtung von Hefe eine Stickstoffquelle, z.U. ^iamoniak, Ammoniuwsulfat oder Harnstoff, sowie eine Phospnorsäureciuelle, wie 1hocphorsäure, hononatriumphosphat, Dinatriuinphosphat, i-ionokaliumphosphat oder Dikaliumphosphat, augesetzt. In Abhängigkeit; von den Züchtungsbedingungen kann ein geeignetes Antischaumbildungsmittel hinzugegeben werden, z.si. bojabolmenöl, ein tiilikonharz oder ein Fettsäurederivat. 'Während der 2-üchtung wird das kulturmedium mit einem freien oruerstoff enthaltenden Gas belüftet.

Obgleich, wie oben angegeben, die Züchtungsbedingungen für den erXiiidungsgemäßen fctL-em nicht spezialisiert sind, wird eine .iüciitungsvorrichtung -mit hohem Koeffizienten der Sauerstoffabsorptionsgeschwinditkeit bevorzugt, um die Ausbeute, den I roteingehalt und die Zellproduktivität der liefezellen zu erhöhen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, die jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen sind.

Beispiel 1

200 ml eines /lüchtungsmediums, das aus 2 ,- η-Par äff inen (Reinheit ^8 >b, C-jo-ctP» °»² '" ^h⁰³P¹¹⁰¹¹Sa"¹*⁶> ^f2 % KCl, 0,06 % Ammoniumsulfat, ü,2 % Harnstoff, 0,06 ¹P MgSO^- 7HoO, 30 ppm

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. 7H₂O, 50 ppm FeSO₄. 7H₉O, 100 ppm CaCl₂. 2H₂O, 0,1 % Melassen und Leitungswasser (mit NaOH auf pH 6,0 neutralisiert) bestand, wurde jeweils in 2-Liter-Schüttelkolbe.n eingegossen und dann im Autoklaven sterilisiert; das Ledium wurde dann auf pH = 6,0 eingestellt. Candida novellus, Candida tropicalis, Candida lipolytica bzw. I^Jichia miso mogii wurden in die Züchtungsmedien eingeimpft. Jeder der Stämme wurde 24 Stunden lang der Schüttelkultur unterworfen, um eine Einsaatkultur zu erhalten. 20 Liter einer Nährflüssigkeit mit derselben Zusammensetzung wie das obige Züchtungsmedium, die jedoch keinen Harnstoff enthielt, wurden jeweils in einen Jar-lTermenter von 30 Liter Inhalt eingegossen und 15 Iiinuten lang bei 120 C sterilisiert. Nachdem der pH-V/ert auf 6,0 eingestellt worden war, wurden 600 ml von jeder der Einsaatkulturen in die jeweilige Nährflüssigkeit eingeimpft. 5/^Jiger wäßriger Ammoniak wurde hinzugegeben, um den pH-Wert der Nährflüssigkeit bei 4,5 zu halten. Die Züchtung wurde bei 30 ⁰C unter Rühren mit 700 rpm durchgeführt, während mit einer Geschwindigkeit von 30 Litern pro Minute belüftet wurde. Nachdem der Ammoniakverbrauch abgebrochen worden war, wurden die erhaltenen Zellen abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Die Ausbeute der Zellen, der Gehalt an Rohprotein und die Wachstumsgeschwindipkeiten wurden ermittelt. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle.

Ausbeute an Zellen, bezogen auf η-Paraffin (fr)	Rohprotexn- geha.lt	Wachstums geschwin digkeit
105,6	57,8	0,29
98,2	54,8	0,äj
101,5	45,6	0,23
105,3	4-3,2	0,24

Candida novellus
Candida tropicalis
Candida lipolytica
Pichia miso mogii

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Beispiel 2

Es wurden die gleichen Einsaatkultüren, Nährflüssigkeiten für die Hauptzüchtung (mit der Abwandlung, daß anstelle von Melasse Hefeextrakte verwendet wurden) und Stämme wie in Beispiel 1 verwendet. Auch hier wurde jede der Einsaatkulturen in einen Jar-ffermenter übertragen. An der logarithmischen Wachstumsphase wurde die Züchtung in eine kontinuierliche Züchtung umgewandelt. Während der kontinuierlichen Züchtung wurde eine Nährflüssigkeit mit der gleichen Zusammensetzung, wie sie die in Beispiel 1 angegebene Nährflüssigkeit aufweist, die jedoch kein n-Paraffin enthielt, kontinuierlich zugesetzt, wobei· eine getrennte kontinuierliche Zuführung von η-Paraffinen (Reinheit 99 $» ^A^-?⁷) erfolgte, während die Konzentration der Zellen bei 1,7 - 1,9 % und die Konzentration des n-Paraffinsubstrates bei 0,1 bis 0,3 ρ gehalten wurden. Die" Züchtung wurde bei 33 ⁰G unter Kühren mit 1000 rpm durchgeführt, während mit einer Geschwindigkeit von 30 Litern pro Minute belüftet und der pH-V/ert bei 4,5 gehalten wurde. pH-Wert und Temperatur wurden automatisch geregelt. Die Bedingungen der kontinuierlichen Züchtung waren gut, und die Züchtung wurde nach einem Zeitraum von 200 Stunden abgebrochen. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten aufgeführt·

Art

Ausbeute an Zellen, bezogen auf n-Paraffin (#)

Rohprotein- Zellprogehalt duktivität • (J*)

Candida novellus 106,5

Candida tropicalis 99,1

Candida lipolytica 100,1

Pichia misotmogii 1OJ,9

58,1

52,4

44,5

4,2

3,4 2,8

3,5

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- ίο -

Beispiel 3

Bine Einsaatkultur und eine kontinuierliche Züchtung v;urden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 unter Verwendung von Candida novellus durchgeführt. Als Grundflüssigkeit für die kontinuierliche Züchtung wurde jedoch ein Medium verwendet, das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 hatte, mit der Abwandlung, daß die Hefeextrakte fortgelassen wurden. Stattdessen wurden Biotin, Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt bzw. Melassen hinzugegeben. Die Züchtung wurde 120 Stunden lang kontinuierlich durchgeführt. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Zusatz zum Grundmedium	Konzen tration	Ausbeute an Kohprotem- Zeilen, be- gehalt sogen auf (#) n-iJaraffin (^)	Vermehrung4"	Zell produktivi tät (g/l/h)
kein Zusatz		keine	57,0
Biotin	3/Ug/l	105,5	57,9
Biotin	10/Ug/l	103,0	58,2
Haisquell flüssigkeit	0,2 Yo	101,5	57,0	V/
Hefeextrakte	0,05 io	106,0	56,8	4,1
Melassen	0,1 >	103,0	4,5

Die kontinuierliche Züchtung wurde nach 32 Stunden abgebrochen.

Patentansprüche

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ORIGINAL INSPECTED

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Erzeugung von Hefezellen mit hohem Proteingehalt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine neue Art, Candida novellus, unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmediur zücntet, welches als Hauptkohlenstoffquelle n-Paraffine oder η-Paraffine enthaltende Kohlenwasserstoffe aufweist.

   c.. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man η-Paraffine mit 9 bis 30 Kohlenstoffatomen pro Molekül verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium eine Quelle für Biotin enthält, die Biotin, belassen, Kefeextrakte oder Maisquellflüssigkeit sein kann.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige ^ährmediura eine Stickstoffquelle, eine Phosphorsäurequelle und Mineralsalze von K, Mg, Fe und Zn enthält·

   ^lj. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Mährmedium mit einem Gas, das freien Sauerstoff enthält, belüftet wird, während man den pH-Wert des wäßrigen währmediums bei 3,5 bis 6,0 hält.

   6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur des wäßrigen Nährmediums bei 25 bis 40 ⁰G hält.

   7- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung kontinuierlich durchführt, während man die Konzentration der Hauptkohlenstoffquelle in dem wäßrigen. Ivahrmedium bei 0,01 bis 1 % hält.

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   Ö. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium ein Antischaumbildungsmittel enthält.

   9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antischaumbildungsmittel Sojabohnenöl, ein Silikonharz oder ein Fettsäurederivat ist.

   iie/Ke

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