DE1598859C - Verfahren zur Herstellung von Reagen zien für immunochemische Bestimmungen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Reagen zien für immunochemische BestimmungenInfo
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Description
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gewicht und Proteine pflanzlicher Herkunft benutzt oder Milchalbumin, als inerte Proteine; geeignet sind
werden. ferner Serumglobuline, Hämoglobin und Lakto-
Die erfindungsgemäß hergestellten Teilchen er- globulin. Auch Gemische aus inerten Proteinen köngeben
mit dem korrespondierenden Antiserum, selbst nen verwendet werden, je nach der Art der bewenn
dieses in verhältnismäßig großer Verdünnung 5 treffenden immunochemischen Bestimmung,
vorliegt, eine spezifische Agglutinierung. Dies be- Das Mengenverhältnis zwischen inertem Protein deutet auch, daß eine Agglutinierungs-Verhinderung und Trägersubstanz und die zweckmäßigste Konmöglich ist, wenn in der zu untersuchenden Flüssig- zentration hängen ab von der Art des inerten keit sehr viel kleinere Mengen an Antigen anwesend Proteins, vom Träger und von dem betreffenden sind, so daß sich auf diese Weise sehr geringe io Antigen bzw. Antikörper.
vorliegt, eine spezifische Agglutinierung. Dies be- Das Mengenverhältnis zwischen inertem Protein deutet auch, daß eine Agglutinierungs-Verhinderung und Trägersubstanz und die zweckmäßigste Konmöglich ist, wenn in der zu untersuchenden Flüssig- zentration hängen ab von der Art des inerten keit sehr viel kleinere Mengen an Antigen anwesend Proteins, vom Träger und von dem betreffenden sind, so daß sich auf diese Weise sehr geringe io Antigen bzw. Antikörper.
Mengen, z. B. eine einzige internationale Einheit Das Verfahren kann bei verschiedenen pH-Werten
(I. U.) menschliches Choriongonadotropin (HCG) je und in verschiedenen Puffersystemen durchgeführt
ml Flüssigkeit nachweisen lassen. Eine I. U. ent- werden,
spricht praktisch 0,1 /<g Hormon. Die Stabilität des Reagenzmittels und die
Die erfindungsgemäß hergestellten Reagenzien 15 Agglutinierungsreaktion selbst werden verbessert,
haben den Vorteil, daß bei ihrer Verwendung wenn man die Vorsensibilisierung bei erhöhter Tem-
weniger Antigen für die Sensibilisierung benötigt, peratur, vorzugsweise zwischen 50 und 60° C, durch-
dabei aber die Qualität der Agglutinierung stark ver- führt. Es wurde gefunden, daß nach der Sensibili-
bcssert wird, so daß die Umschläge ausgesprochener sierung eine Inkubation der Teilchen von 1 bis
sind und besser abgelesen werden können. Die 20 20 Stunden, je nach der angewandten Temperatur,
Reaktion auf Verhinderung des Agglutinierens kann ihre Verwendbarkeit für immunochemische Be-
mit den erfindungsgemäßen Reagenzien auf einer Stimmungen verbessert. Insbesondere wurden durch
Platte mit völlig benetzbarer Oberfläche durchgeführt einstündige Inkubation bei 100° C (nach dem Sen-
werden (s. Beispiel 1). Nachdem die Reaktion statt- sibilisieren) Reagenzmittel mit ausgezeichneten
gefunden hat, kann man das Gemisch in horizon- 25 Eigenschaften erhalten.
taler Lage trocknen lassen. Das Resultat kann noch Erfindungsgemäß kann man Reagenzmittel für
von dem getrockneten Material abgelesen und dieses immunochemische Bestimmungen grundsätzlich auch
als Nachweis aufbewahrt werden. aus den verschiedensten anderen Trägersubstan-
Für den erfindungsgemäßen Verfahrensschritt zen herstellen, z. B. aus Bentonitteilchen, Quarz-
»Vorsensibilisierung« werden die Trägerteilchen, 30 teilchen, Erythrocyten, Cholesterinkristallen, Ionennachdem
sie aus ihrer Suspension durch Zentri- austauscherharzen, unlöslichen organischen Farbfugieren
sedimentiert wurden, in einer Lösung des stoffen oder Collodiumteilchen von entsprechender
inerten Proteins, beispielsweise in einem Puffer, Feinheit. Würde man nicht vorbehandelte Trägersuspendiert,
wobei eine Adsorption des Proteins an teilchen verwenden, so würden in dem adsorbierten
den Teilchen stattfindet. Der nächste Schritt ist die 35 Antigen bzw. Antikörper durch Anwesenheit von
Entfernung von überschüssigem inertem Protein, was stark aktiven Stellen an der adsorbierenden Fläche
beispielsweise durch Zentrifugieren der Teilchen ge- (Adsorptions-Denaturation) Strukturänderungen aufschehen
kann. Dann wird auf übliche Weise das treten, die sich auf das Agglutinieren der Antigene
Antigen bzw. der Antikörper auf die vorbeschichte- schädlich auswirken würden. Daher sind die erten
Teilchen aufgebracht (eigentliche »Sensibili- 40 findungsgemäß vorsensibilisierten Reagenzmittel, bei
sierung«). denen die stark aktiven Stellen durch das inerte
Die Sensibilisierung kann auch bereits in der Protein besetzt sind, den bisher verwendeten überLösung
von inertem Protein durchgeführt werden, legen. Außerdem sind offenbar an der Oberfläche
wobei dann das Antigen bzw. der Antikörper un- der Trägerteilchen tiefe Poren vorhanden, in denen
mittelbar nach der Homogenisierung der Teilchen in 45 bei fehlender Vorsensibilisierung Antigen adsorbiert
der Lösung des inerten Proteins zugegeben wird. wird, das dann nicht mehr mit dem Antikörper
Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit ganz reagieren und ein Agglutinieren verursachen kann,
besonderem Vorteil auf Latices von Kunstharzen, Bei den erfindungsgemäß vorsensibilisierten Rea-
z. B. Polystyrollatex, Styrol-Butadien-Latex, der vor- genzien sind dagegen diese tiefen Poren mit inertem
zugsweise eine Teilchengröße von etwa 0,5 bis 50 Protein ausgefüllt, so daß kein Antigen inaktiviert
1,3 /im haben soll, angewendet werden. Es ist be- wird.
kannt, daß ein solcher Latex durch Einarbeiten von In der Praxis lassen sich mit den erfindungsgemäß
oberflächenaktiven Substanzen stabilisiert werden hergestellten Reagenzien besonders gute Resultate
kann; obgleich aber die Suspensionsflüssigkeit vor erreichen, wenn sie für den bekannten Test zur Beder
Adsorption des Antigens entfernt wird, bleiben 55 Stimmung des menschlichen Choriongonadotropins
immer geringe Rückstände des Netzmittels an der im Urin schwangerer Frauen verwendet werden.
Oberfläche der Teilchen haften, durch die Proteine Wird beispielsweise als inertes Protein für die Vordenaturiert
werden können, so daß ihre immuno- sensibilisierung Rinderserumalbumin und als Träger
chemischen Eigenschaften ungünstig beeinflußt wer- Polystyrollatex verwendet, so erhält man ein Readen.
Bei Anwendung der erfindungsgemäß vor- 60 genz, das außerordentlich empfindlich und ausbehandelten
Reagenzmittel ist jedoch keinerlei gesprochen für den obigen Zweck spezifisch ist. Die
nichtspezifische Agglutination bzw. Agglutinations- vorsensibilisierten Reagenzmittel können aber auch
verhinderung zu beobachten. Offenbar wird der mit Vorteil verwendet werden für immunochemische
schädliche Einfluß eventueller Rückstände von ober- Bestimmungen, die auf der Agglutinierung von
flächenaktiven Stoffen durch die Vorsensibilisierung 65 anderen Antigenen oder ihren Antikörpern bzw. auf
mit inertem Protein neutralisiert. der Verhinderung dieser Agglutinierung beruhen.
Besonders gute Resultate erhält man mit Serum- Als Beispiele seinen erwähnt das Wachstumshormon
albumincn, z. B. mit Rinderserumalbumin, Eialbumin menschlicher oder tierischer Herkunft, das die
Follikelreifung bewirkende Hormon, Serumproteine, wie ^-Globulin (zum Nachweis des Rheumafaktors),
und Antigene bakteriellen Ursprungs, wie diejenigen von Treponema reiteri und T. pallidum.
Zu den in Frage kommenden immunochemischen Bestimmungen können Suspensionen der durch die
erfindungsgemäße Behandlung erhaltenen Trägerteilchen als solche verwendet werden; die vorsensibilisierten
Trägerteilchen können aber auch, z. B. durch Gefriertrocknen der Suspensionen, in iö
Pulverform erhalten und so verwendet werden. Gegebenenfalls kann man aus derartigen Pulvern
Tabletten herstellen, die neben entsprechenden Bindemitteln sämtliche zur Durchführung der
immunochemischen Bestimmung notwendigen Bestandteile enthalten. Diese Tabletten lassen sich in
Pufferlösungen ohne weiteres zu homogenen Suspensionen suspendieren, die für die immunochemischen
Reaktionen geeignet sind.
Die Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Aus einem handelsüblichen Polystyrollatex (10 ml) wurden die Teilchen durch Zentrifugieren abgeschieden
und in 10 ml eines 0,14-molaren Boratpuffers vom pH-Wert 8,3, in welchem je ml 2 mg
Rinderserumalbumin (BSA) gelöst waren, suspendiert. Die Suspension wurde 20 min bei 20° C gehalten
(inkubiert) und darauf wieder zentrifugiert. Dann wurden die Latexteilchen nochmals mit 20 ml
der Pufferlösung gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers, dem je ml 100 I. U. menschliches
Choriongonadotropin (HCG) zugefügt worden waren, resuspendiert. Das Gemisch wurde nun nochmals
90 min bei 20° C inkubiert, worauf die Teilchen aufs neue zentrifugiert und zweimal mit je 20 ml der
Pufferlösung gewaschen wurden. Der auf diese Weise erst vorsensibilisierte und dann endgültig sensibilisierte
Latex wurde nun in 6,7 ml einer 0,07-molaren Boratpufferlösung vom pH 8,3, der 4 % Sucrose und
0,01 % Merthiolat zugefügt worden waren, suspendiert. Die sensibilisierten Teilchen können mit
Antiserum gegen HCG agglutiniert werden.
Im nachfolgenden seien einige Methoden beschrieben, die sich für die Durchführung von Reaktionen
eignen, die zur Agglutinierung bzw. zur Verhinderung der Agglutinierung führen:
a) 2 Tropfen einer physiologischen Kochsalzlösung, 1 Tropfen des Antiserums gegen HCG,
verdünnt auf die gewünschte Stärke mit 0,15-molarem Imidäzolpuffe'r vom pH 7,8 und mit
einem Gehalt an 3 % Rinderserumalbumin, und 1 Tropfen der erfindungsgemäß behandelten
Latexsuspension werden auf einer Glasplatte mit dem Spatel vermischt und auf einen runden
Fleck von 2,5 bis 3 cm Durchmesser verrieben. Man neigt dann die Glasplatte leicht, indem
man sie langsam von einer Seite zur anderen hin und her rollt. Nach 1 oder 2 min agglutinieren
die Teilchen, was ohne weiteres mit deni bloßen Auge zu sehen ist. Bei der Durchführung
der Reaktion zur Verhinderung der Agglütinieruhg wird die physiologische1 Kochsalzlösung
durch die Afitigenlösung ersetzt.
Nachdem man die Glasplatte 1 bis 2 min bewegt häfj kann sie auf eine horizontale Fläche aufgelegt werden, so daß das Reaktionsgemisch trocknen kann. Auch nach dem Trocknen kann ohne weiteres noch festgestellt werden, ob eine Agglutinierung stattgefunden hat oder nicht. Auf diese Weise können die Versuchsresultate zum späteren Nachweis aufbewahrt werden.
Nachdem man die Glasplatte 1 bis 2 min bewegt häfj kann sie auf eine horizontale Fläche aufgelegt werden, so daß das Reaktionsgemisch trocknen kann. Auch nach dem Trocknen kann ohne weiteres noch festgestellt werden, ob eine Agglutinierung stattgefunden hat oder nicht. Auf diese Weise können die Versuchsresultate zum späteren Nachweis aufbewahrt werden.
b) Gemäß einer anderen Methode arbeitet man mit Zentrifugieren; sie wird wie folgt durchgeführt:
0,5 ml einer physiologischen Kochsalz- bzw. Antigenlösung werden vermischt mit 0,5 ml
Antiserum in geeigneter Verdünnung in einer 0,15-molaren Imidazolpufferlösung vom pH 7,8,
der Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 0,1 % zugefügt wurde. Hierzu gibt man
1 Tropfen der Latexsuspension, die verdünnt wurde mit der fünffachen Menge einer physiologischen
Kochsalzlösung. Dann wird das Gemisch 1 Stunde bei 37° C inkubiert und daraufhin
10 min mit 1500 UpM zentrifugiert. Eine überstehende klare Lösung deutet auf Agglutinierung,
während eine trübe Schicht anzeigt, daß keine Agglutinierung stattgefunden hat.
Verschiedene Methoden, um die Agglutinierung sichtbar zu machen, sind unter anderem beschrieben
von K. J. B1 ο c h in Bull. Rheum. Dis. 9, 185 (1959),
und von L. Fleck et al. in Nature 194, 548 (1962).
Bei dem gemäß diesem Beispiel hergestellten Latex tritt die Agglutinierung nur mit spezifischen
Antisera ein, und sie kann verhindert werden mit HCG in einer Konzentration von 21. U. je ml, was
die Sensibilität dieses Reagenzes beweist.
In einem Boratpuffer mit 4 % Sucrose und 0,01 % Merthiolat wurden gemäß Beispiel 1 zwei Suspensionen
bereitet. Eine davon wurde einer 20-stündigen Inkubation bei 56° C, die andere einer
einstündigen bei 100° C unterworfen; Die erhaltenen Suspensionen agglutinieren nur mit spezifischen
Antisera. Die Agglutinierungsreaktion kann verhindert werden mit HCG in einer Konzentration von
11. U. je ml. Die letztgenannte Suspension erwies sich als am empfindlichsten.
Eine Suspension des in Beispiel 1 verwendeten handelsüblichen Polystyrollatex wurde vorsensibilisiert
mit Rinderserumalbumin und daraufhin 2 Stunden
bei 60° C inkubiert; Nun wurden die Teilchen mit HCG sensibilisiert, worauf eine' zweistündige
Inkubation bei 60° C stattfand. Bei der Prüfung auf Agglutinierung bzw. Verhinderung der Agglutinierung
erwies sich das Reagenz als sehr spezifisch und außerordentlich sensibel.
Der Latex nach Beispiel! wurde, wie dort beschrieben,
vorsensibilisiert mit Ririderserumalbumin, worauf er hoch 180 min bei 45° G mit HCG sensibilisiert
wurde. Das erhaltene Reagenz agglutiniert nur mit einem spezifischen Antisefuin und ist sehr
empfindlich;
Die Teilchen von 10 ml des M Beispiel 1 verwendeten
Polystyrollatex wurden durch Zentrifu-
gieren sedimentiert und dann in 5 ml eines 0,14-molaren
Boratpuffers vom pH 8,3, worin 4 mg Rinderserumalbumin je ml gelöst waren, suspendiert.
Nach Homogenisieren wurden der Suspension sofort weitere 5 ml des gleichen Puffers zugefügt, worin
diesmal 200 I. U. HCG je ml gelöst waren. Nach neuerlichem Homogenisieren wurde die Suspension
90 min bei 20° C stehengelassen. Dann wurden die Teilchen abzentrifugiert und zweimal mit je 20 ml
des Puffers gewaschen. Schließlich wurden die gewaschenen Teilchen wieder in 0,07-molarem Boratpuffer
vom pH 8,3 mit 4 °/o Sucrose und 0,01 % Merthiolat suspendiert und 10 Stunden bei 56° C
inkubiert.
Die Teilchen aus 20 ml Polystyrollatex wurden durch Zentrifugieren sedimentiert und dann in 20 ml
0,14-molarem Boratpuffer vom pH 8,3, worin 2 mg Rinderserumalbumin je Liter gelöst waren, suspendiert.
Die erhaltene Suspension wurde inkubiert, zentrifugiert und gewaschen wie in Beispiel 1 und
dann in 20 ml Puffer, dem 100 /<g menschliches Wachstumshormon (HGH) je ml zugefügt worden
waren, suspendiert. Nun ließ man die Suspension 2 Stunden bei 20° C stehen, worauf die Teilchen
wieder abzentrifugiert und zweimal mit je 30 ml der Pufferlösung gewaschen wurden. Der so behandelte
Latex wurde in 14 ml 0,07-molarem Boratpuffer vom pH 8,3 mit 4 % Sucrose und 0,01 % Merthiolat
suspendiert.
Die sensibilisierten Teilchen können nur mit spezifischem Antiserum agglutiniert werden. Diese
Agglutinierung kann verhindert werden mit HGH in einer Konzentration von 0,5 /ig je ml.
Mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Methode wurde Polystyrollatex einer Vorsensibilisierung mit
Eialbumin unterworfen, wobei das Albumin in einer Konzentration von 6 mg je ml zur Anwendung kam.
Die so erhaltene Suspension wurde dann mit HCG endgültig sensibilisiert, wie oben beschrieben, und
ergab ein Reagenz, das mit spezifischem Antiserum agglutiniert werden kann. Diese Agglutinierung kann
bereits verhindert werden mit HCG in Konzentrationen von 1 bis 3 I. U. je ml.
Mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens wurde handelsüblicher Polystyrollatex vorsensibilisiert,
und zwar diesmal mit Lactalbumin in einer Konzentration von 2 mg je ml an Stelle des
Rinderalbumins. Die so erhaltene Suspension wurde sensibilisiert mit HCG in einer Konzentration von
100 I. U. je ml. Dieses Reagenz agglutiniert ebenfalls nur mit spezifischem Antiserum, während eine Verhinderung
der Agglutinierung bereits stattfindet mit HCG-Konzentrationen von wenigen I. U. je ml.
Analog Beispiel 1 wurden Latexteilchen vorsensibilisiert
mit Eialbumin in einer Konzentration von 6 mg je ml und daraufhin endgültig sensibilisiert
mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 300 //g je ml. Dieses Reagenz kann mit Antiserum
gegen Rinderscrumalbumin agglutinieren. Für die Agglutinierungsreaktion wird das Antiserum verdünnt
mit einem Puffer, dem 3% Eialbumin zugesetzt sind. Die Agglutinierung wird bei einer gewissen
Antiserumverdünnung verhindert durch Konzentrationen von 0,3 /ig Rinderserumalbumin je ml.
Eine Suspension von Latexteilchen mit 0,56 ^m
ίο Durchmesser und in einer Konzentration von 1,25 %
wurde vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin und dann gemäß Beispiel 1 endgültig sensibilisiert mit
HCG. Auf gleiche Weise wurden Latexteilchen von 0,80 μτη Durchmesser vorsensibilisiert und endgültig
sensibilisiert.
Auf die gleiche Weise wurde ein Latex mit Teilchen von 1,3 μΐη Durchmesser mit Rinderserumalbumin
und HCG behandelt. Die Reagenzien waren äußerst empfindlich und voll spezifisch.
20
20
Latexteilchen von 0,8O-Um Durchmesser wurden
gemäß Beispiel 1 vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 1 mg je ml und
daraufhin sensibilisiert mit menschlichem /-Globulin in einer Konzentration von 300 /ig je ml. Mit diesem
Reagenz kann eine Agglutination erreicht werden mit Pferdeserum gegen menschliche Serumproteine
und mit menschlichen Sera, die den Rheumafaktor enthalten.
Auf die oben beschriebene Art wurden Latexteilchen von 0,80 /im Durchmesser vorsensibilisiert
mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 2 mg je ml und dann endgültig sensibilisiert mit
Follikelreifungshormon menschlichen Ursprungs in einer Konzentration von 100 /ig je ml. Das Agglutinieren
kann veranlaßt werden mit einem spezifischen Antiserum, und es kann verhindert werden durch
das Hormon in einer Konzentration von etwa 1 /ig je ml.
Handelsüblicher Polystyrollatex wurde vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration
von 2 mg je ml und sensibilisiert mit der Euglobulinfraktion eines Kaninchenantiserums gegen
HCG in einer Konzentration von 5 /ig je ml.
Gemäß der Vorschrift von J. Bozicevich in Immunochemical Methods (Blackwell Scientific
Publications, Oxford 1964) wurde eine Bentonitsuspension bereitet. Für dieses Verfahren diente der
sogenannte Natrium-Bentonit als Ausgangsmaterial. Die Suspension wurde in einer Konzentration von
2 % mit Rinderserumalbumin vorsensibilisiert, welch letzteres in einer Konzentration von 1 mg je ml verwendet
wurde; die endgültige Sensibilisierung erfolgte mit HCG in einer Konzentration von 200 /ig
je ml gemäß Beispiel 1.
1 ml einer 10%igen Lösung von Mastix in absolutem Alkohol wurde unter kräftigem Rühren zu
24 ml eines 0,1-molaren Boratpuffers vom pH 8,2 zugegeben (s. A. A. P i t, Ned. T. Geneesk. 103,2310
209 547/355
9 10
[1959]). 5 ml der so erhaltenen Suspension wurden ohne weitere Behandlung verwendet. Mit Anti-HCG-
vermischt mit 0,3 ml 3%igem Rinderserumalbumin Sera kann man eine spezifische Agglutinierung her-
und dann mit 0,2 ml HCG in einer Konzentration vorbringen. HCG in einer Konzentration von 3 bis
von 750 I. U. je ml. Nach Inkubation von 20 Stun- 5 I. U. je ml kann das Agglutinieren verhindern,
den bei 20° C wurde die so vorbereitete Suspension 5 wenn man die korrekte Antiserumverdünnung wählt.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von für immunor so daß mehr Antiserum benötigt wird, um das
chemische Bestimmungen verwendbaren Rea- 5 Agglutinieren zu bewirken. Dies ist ein großer Nachgenzmitteln
in Form von feinteiligen festen teil, insbesondere bei Methoden, die auf der Ver-Trägern
mit an der Oberfläche der Träger- · hinderung des Agglutinicrens beruhen.
teilchen haftenden Antigenen oder Antikörpern, Es erscheint daher wünschenswert, die Teilchen
dadurch gekennzeichnet, daß man die eine solche Menge Antigen adsorbieren zu lassen,
Trägerteilchen zunächst ein gegenüber der io daß dann nur eine kleine Menge Antiserum (stark
immunochemischen Reaktion inertes und an verdünnt) ausreicht, um eine klare Agglutinierung zu
dieser nicht beteiligtes Protein adsorbieren läßt, bewirken. Mit einem Reagenz, das in diesem Sinne
worauf man in an sich bekannter Weise das wirkt, kann schon eine sehr geringe Menge Antigen
Antigen oder den Antikörper, auf die so vor- in der Flüssigkeit festgestellt werden, die mittels
beschichteten Trägerteilchen aufbringt. 15 Agglutinationsverhinderung untersucht werden soll;
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- man muß, mit anderen Worten, versuchen, Mittel zu
kennzeichnet, daß man als Träger einen Kunst- finden, durch weiche sich die Sensibilität derartiger
harzlatex, insbesondere einen Polystyrollatex, immunochemischer Reaktionen verbessern läßt,
verwendet, worin die Harzteilchen einen Durch- Außerdem müssen bei der Herstellung dieser Reamesser
von 0,5 bis 1,3 /im haben. 20 genzien die Bedingungen so gewählt werden, daß
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch das betreffende Mittel spezifisch für das zu begekennzeichnet,
daß man als inertes Protein ein stimmende Antigen bzw. die ihm entsprechenden ti
Serumalbumin, ein Eialbumin oder ein Milch- Antikörper ist.
albumin verwendet. Bei den bisher benutzten Trägern treten jedoch
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, da- 25 Erscheinungen auf, durch welche die Spezifität und
durch gekennzeichnet, daß man die Adsorption Sensibilität der Schätzungen stark beeinträchtigt werbei
Temperaturen zwischen 20 und 60° C be- den. Es darf hierbei nicht übersehen werden, daß es
wirkt. auch eine nichtspezifische Agglutinierung bzw.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, Agglutinierungs-Verhinderung gibt, und zwar auf
dadurch gekennzeichnet, daß man den beladenen 30 Grund von Reaktionen, die nicht durch immuno-Träger
noch weitere 1 bis 20 Stunden einer In- chemische Erscheinungen hervorgerufen werden. So
kubation bei 20 bis 1000C unterwirft. wurde beispielsweise beobachtet, daß mit Antigen
beladene Trägerteilchen auch in Abwesenheit von Antiserum spontan agglutinieren. In anderen Fällen
■ 35 zeigte sich, daß diese Teilchen nicht nur nach Vermischen
mit spezifischem Antiserum agglutinierten, sondern auch wenn sie mit normalem Serum oder
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- . mit Antiserum gegen andere Antigene in Berührung
stellung von für immunochemische Bestimmungen kamen. In wieder anderen Fällen schien die zu einer
verwendbaren Reagenzmitteln in Form von fein- 40 völligen Agglutinierung benötigte Quantität an Antiteiligen
festen Trägern mit an der Oberfläche der serum anormal hoch zu sein. Wahrscheinlich bc-Trägerteilchen
haftenden Antigenen oder Anti- ruhen diese Erscheinungen auf den physikalischkörpern.
chemischen, insbesondere den elektrochemischen Δ Bei immunochemischen Methoden werden oft Eigenschaften der benutzten Teilchen. Durch die V?
inerte Teilchen als Träger für das Antigen bzw. für 45 Adsorption von Proteinen werden diese Eigenden
Antikörper verwendet, damit die Reaktion zwi- schäften sehr stark beeinflußt, wobei selbstverständschen
Antigen und Antikörper durch Zusammen- Hch die Menge und Art des adsorbierten Proteins
klumpen (Agglutinieren) der Teilchen sichtbar wird. eine wichtige Rolle spielen.
Hierbei werden, gegebenenfalls unter Mitwirkung Es war somit die Aufgabe der Erfindung, ein Ver-
von Hilfsstoffen, das Antigen bzw. die Antikörper an 50 fahren zu entwickeln, um ein spezifisches und emp-
die Teilchen angelagert bzw. von ihnen adsorbiert. findliches Reagenz für immunochemische Be-
AIs Träger werden benutzt Erythrocyten (s. z. B. Stimmungen herzustellen. ;
die niederländische Patentschrift 106 360 und die Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß man bei j
dort erwähnte, Literatur), ferner unter anderem dem Verfahren der eingangs genannten Art die
Bentonit, Collodium, Cholesterinkristalle, Quarz und 55 Trägerteilchen zunächst ein gegenüber der immuno-
synthctische Harze (s. R. Wein bach in »Schweiz. chemischen Reaktion inertes und an dieser nicht be-
Z. Path. Bakt.«, 21, 1044, 1958) und häufig auch ge- teiligtes Protein adsorbieren läßt, worauf man in an
wisse synthetische Latices, z. B. Polystyrollatex sich bekannter Weise das Antigen oder den Anti-
(s. USA.-Patentschrift 3 088 875), die auf Grund ihrer körper auf die so vorbeschichteten Trägerteilchen
günstigen physikalischen und chemischen Eigen- 60 aufbringt. So erhält man ein Reagenz, mit dem über-
schaften besonders gut geeignet sind. ■ raschenderweise noch sehr kleine Mengen an Antigen
So werden zum Nachweis des Rheumafaktors bzw. Antikörpern selektiv bestimmt werden können,
meistens Latexpartikeln benutzt, die mit mensch- Als »inert« ist ein Protein zu bezeichnen, das nicht
Iichem Gammaglobulin sensibilisiert sind. Äußerst an der immunochemischen Reaktion selbst teilnimmt
günstig ist dabei, daß nur das an den Teilchen ad- 65 und das Antigen bzw. die Antikörper nicht schäd-
sorbierte Gammaglobulin mit dem Rheumafaktor lieh beeinflußt. Für das erfindungsgemäßc Verfahren
reagiert, während das überschüssige Gammaglobulin können konjugierte oder nichtkonjugierte Proteine,
in der Lösung praktisch die Reaktion nicht stört. außerdem Peptide von verschiedenstem Molekular-
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL6504823 | 1965-04-15 | ||
NL6504823A NL6504823A (de) | 1965-04-15 | 1965-04-15 | |
DEN0028393 | 1966-04-15 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1598859A1 DE1598859A1 (de) | 1972-03-16 |
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ID=
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