DE202010018378U1

DE202010018378U1 - PAR-1-Aktivierung durch Metalloproteinase-1 (MMP-1)

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Publication number: DE202010018378U1
Application number: DE202010018378.2U
Authority: DE
Original assignee: Tufts Medical Center Inc
Current assignee: Tufts Medical Center Inc
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2016-04-07
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: EP2416799A2; CA2758322A1; EP2990051B1; EP2416799A4; JP2012523438A; AU2010233089B2; US20120121706A1; CA2758322C; EP2416799B1; WO2010118435A3; EP2990051A1; US20170065668A1; US20150023975A1; EP3061460A1; US9376499B2; AU2010233089A1; WO2010118435A2

Abstract

Wirkstoff, der eine Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Signalisierungsaktivität eines Patienten wesentlich inhibiert, die durch die proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist, zur Verwendung bei der Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustands oder von Atherosklerose bei dem Patienten, die ein Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Wirkstoffs an den Patienten umfasst, bei dem ein thrombotischer Erkrankungszustand oder Atherosklerose diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko besteht, dieselben zu entwickeln.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität und den Nutzen der gleichzeitig anhängigen vorläufigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 61/168,353 und 61/168,360, beide unter dem oben genannten Titel und beide eingereicht am 10. April 2009, die hiermit im gesetzlich zulässigen Umfang in ihrer Gesamtheit durch Verweis hier aufgenommen werden.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose und Behandlung von thrombotischen Zuständen einschließlich solcher, die durch akutes Koronarsyndrom und Atherosklerose bedingt sind. Außerdem betrifft die Erfindung Mittel zum Konservieren von Plättchen zu Forschungszwecken oder klinischen Zwecken.
HINWEIS ZU MIT BUNDESMITTELN FINANZIERTER FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG
Die vorliegende Erfindung wurde von der Regierung unter den Stipendiennummern R01 HL-57905, R01 HL-64701 und R01 CA-122992, gewährt durch die National Institutes of Health, unterstützt. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der vorliegenden Erfindung.
HINTERGRUND
Plättchenaktivierung und -aggregation sind zwar für normale physiologische Funktionen wie etwa die Hämostase notwendig, können jedoch zu zahllosen, häufig letalen oder stark belastenden Zuständen und Pathologien führen, wenn ihre Regelmechanismen versagen. Diese pathologischen Zustände können akut oder chronisch sein und umfassen akutes Koronarsyndrom, Myokardinfarkt, instabile Angina, Schlaganfall, Koronarthrombose, Venenthrombose, Atherothrombose, Restenose und so weiter. In den USA, Europa und anderen Industrieländern hat der Myokardinfarkt durch Ruptur von atherosklerotischen Plaques führenden Anteil an Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit. Akute Plaqueruptur exponiert subendotheliales Kollagen, das die Plättchenaktivierung und Bildung eines potentiell okklusiven Thrombus an der Stelle der Gefäßbeschädigung fördert (Glass und Witztum, 2001; Ruggeri, 2002). Nach ihrer initialen Anbindung an subendotheliales Kollagen und Matrixproteine ist die Aktivierung von transitorisch adhärierten Plättchen durch autokrine Mediatoren entscheidend für die Propagation des formativen Plättchen-Thrombus. Eine Verstärkung der transitorischen adhäsiven Kontakte durch Aktivierung einer G-Protein-abhängigen Formveränderung, Freisetzung von Granula und von Integrinen ermöglicht das Wachstum eines stabilen Thrombus, der gegen die hohe Scher-Beanspruchung des arteriellen Blutflusses beständig ist (Jackson et al., 2003; Moers et al., 2003). Arzneimittel, die auf die sekundären autokrinen Mediatoren der Plättchen-Thrombusbildung abzielen, wie etwa Aspirin und Thienopyridine, haben sich als nützlich erwiesen, allerdings erleiden viele Patienten, die diese Mittel einnehmen, dennoch thrombotische Ereignisse und könnten daher von neuen Therapeutika profitieren, die die matrixabhängige Plättchenaktivierung behindern (Bhatt und Topol, 2003).
Zwei getrennte Wege wirken während der Hämostase parallel zur Aktivierung von Plättchen (Furie und Furie, 2008). Mit dem Durchbruch der Blutgefäßwand treffen im Blut zirkulierende Plättchen zum ersten Mal auf Kollagen, das in der subendothelialen Matrix eingebettet ist. Als erste Verteidigungslinie initiiert exponiertes Kollagen die Akkumulation und Aktivierung von Plättchen und beginnt mit der Bildung eines Thrombus. Mit dem weiteren Ausfließen von Blut begegnet es einer zweiten Verteidigungslinie, dem in der Mediaschicht und der adventiellen Schicht der Gefäßwand befindlichen Gewebefaktor, und ein zweiter unabhängiger Weg wird ausgelöst, der ebenfalls Plättchen zur Adhäsion aneinander und zur Beteiligung an dem entstehenden Thrombus aktiviert. Der durch den Gewebefaktor initiierte Weg generiert Thrombin, das wiederum den Protease-aktivierten Rezeptor 1 (PAR1) auf der Oberfläche menschlicher Plättchen spaltet, so dass sie Adenosindiphosphat (ADP), Serotonin und Thromboxan A₂ freisetzen. Diese Agonisten rekrutieren und aktivieren wiederum weitere Plättchen, wodurch das Signal verstärkt wird, um den Durchbruch in der Gefäßwand zu blockieren. Die vorliegende Erfindung beruht jedoch auf Entdeckungen, die sich auf den anderen, durch Kollagen initiierten Weg der Plättchenaktivierung beziehen, d. h. auf die erste Verteidigungslinie bei einem thrombotischen Ereignis.
Matrix-Metalloproteasen (MMPs) haben sich in letzter Zeit als wichtige Mediatoren der Plättchenfunktion und Gefäßbiologie erwiesen. Wurden sie anfänglich als Enzyme zur Umbildung der extrazellulären Matrix beschrieben, die an Gewebewiederherstellung und Krebsinvasion beteiligt sind (Egeblad und Werb, 2002), so stehen MMPs und die damit zusammenhängenden Metalloprotease-Disintegrine heute wegen ihrer wichtigen Rolle bei der Gefäßwandentzündung (Dollery und Libby, 2006) und der thrombotischen thrombocytopenischen Purpura im Fokus (Levy et al., 2001). Es wurde gezeigt, dass endogene Plättchen-Metalloproteasen die Plättchenfunktion durch Spaltung der Zelloberflächenrezeptoren beschädigen und Breitspektrum-Metalloproteaseinhibitoren die posttransfusionelle Wiederherstellung von Plättchenkonzentraten verbessern (Bergmeier et al., 2003; Bergmeier et al., 2004; Stephens et al., 2004). Plättchen exprimieren auf ihrer Oberfläche mehrere Metalloproteasen, einschließlich MMP-1, MMP-2, MMP-3 und MMP-14 (Chesney et al., 1974; Galt et al., 2002; Kazes et al., 2000; Sawicki et al., 1997). Insbesondere können endogene MMP-1 und MMP-2 tatsächlich die Plättchenaggregation fördern, jedoch sind das bzw. die Zelloberflächen-Target(s) und der Mechanismus ihrer Aktivierung noch nicht geklärt (Galt et al., 2002; Sawicki et al., 1997). In einer neueren Untersuchung der Wirkungen von MMP-1-Promotoren-Polymorphismen bei 2000 Patienten wurde bei Patienten mit Haplotypen mit hoher Promotorenaktivität ein signifikant erhöhtes Myokardinfarktrisiko und bei Patienten mit Haplotypen mit geringer Promotorenaktivität ein signifikant reduziertes Myokardinfarktrisiko festgestellt (Pearce et al., 2005).
In neuerer Zeit wurde gezeigt, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor PAR1 auf der Oberfläche von Krebszellen durch Fibroblasten-derivierte MMP-1 direkt gespalten und aktiviert wird (Boire et al., 2005). PAR1 ist der hauptsächliche Thrombin-Rezeptor von menschlichen Plättchen (Coughlin, 2000; Leger et al., 2006b) und ist ein wichtiger Mediator der Plättchenaggregation nach einer Gewebefaktor-(TF-)abhängigen Generierung von Thrombin (Mackman, 2004; Schwertz et al., 2006). Unter den pathophysiologischen Bedingungen einer akuten Plaqueruptur ist jedoch exponiertes Kollagen der effizienteste Stimulus für die kritischen frühen Ereignisse der Plättchenrekrutierung und -propagation unter arteriellem Durchfluss, wodurch eine Metalloprotease-Aktivierung auf der Plättchenoberfläche ausgelöst werden könnte.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf einem neuartigen Metalloprotease-abhängigen Weg der Plättchen-Thrombogenese durch PAR1. Die Exponierung von Plättchen gegenüber Kollagen bewirkte eine Aktivierung von MMP-1, die wiederum PAR1 auf der Oberfläche von Plättchen direkt spaltete. Überraschenderweise spaltete MMP-1 die N-terminale extrazelluläre Domäne von PAR1 an einer von der Thrombin-Spaltstelle getrennten Stelle. Dieses Spaltungsereignis generierte einen längeren angebundenen Peptidliganden, der ein Agonist der Plättchenaktivierung und PAR1-Signalisierung war. Eine Blockierung des MMP1-PAR1-Weges inhibierte physiologische Ereignisse wie kollagenabhängige Thrombogenese, Arterienthrombose und Gerinnselretraktion. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Therapeutika bereit, die auf dieses Metalloprotease-Rezeptorsystem bei der Behandlung von Patienten abzielen, bei denen ein thrombotischer Erkrankungszustand wie etwa akute Koronarsyndrome diagnostiziert wurde oder ein Risiko der Entwicklung desselben besteht.
In einem Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem ein thrombotischer Erkrankungszustand diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung desselben besteht, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Wirkstoffs vor, der eine proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) des Patienten wesentlich inhibiert. Die proteolytische Spaltung kann eine enzymatische Aktivität durch Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) erfordern.
Der Patient kann eines oder mehrere Symptome aufweisen oder aufgewiesen haben wie etwa Brustschmerzen, Kurzatmigkeit, Engegefühl um den Brustkorb, Engegefühl im linken Arm, Engegefühl im linken Kieferwinkel, übermäßiges Schwitzen, Übelkeit, Erbrechen, Herzklopfen, Angst oder atypisches Empfinden. Der Patient kann einen oder mehrere nachweisbare oder diagnostizierbare Risikofaktoren im Zusammenhang mit einem thrombotischen Erkrankungszustand aufweisen.
Ein thrombotischer Erkrankungszustand kann jede durch Plättchenaggregation hervorgerufene Pathologie sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, akutes Koronarsyndrom, Arterienthrombose, Venenthrombose, periphere arterielle Erkrankung, instabile Angina, Vorhofflimmern, ersten Myokardinfarkt, rezidivierenden Myokardinfarkt, ischämischen plötzlichen Tod, transitorische ischämische Attacke, Schlaganfall, Atherosklerose, tiefe Venenthrombose, Thrombophlebitis, arterielle Embolie, Koronararterienthrombose, cerebrale Arterienthrombose, cerebrale Embolie, Nierenembolie oder Lungenembolie.
In einer Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Behandlung eines mit Krebs diagnostizierten Patienten verwendet.
Gemäß einem Merkmal inhibiert die Verabreichung des Wirkstoffs wesentlich die Plättchenaktivierung bei einem Patienten. Der Wirkstoff kann ein Ligandenbindungsmolekül sein, das sich an PAR-1 bindet, die Spaltung von PAR-1 durch Bindung über der Spaltstelle wesentlich inhibiert oder die Spaltung von PAR-1 durch Induktion einer Konformationsveränderung in PAR-1 wesentlich inhibiert. Der Wirkstoff kann ein Ligandenbindungsmolekül, das sich an MMP-1 bindet, oder einen für MMP-1 oder PAR-1 spezifischen Antikörper umfassen. Der Wirkstoff kann auch ein Kleinmolekül umfassen, das sich an MMP-1 oder PAR-1 bindet.
In einigen Ausführungsformen inhibiert der Wirkstoff wesentlich die Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-enzymatische Aktivität, die Spaltung von proMMP-1 durch eine Protease, die Spaltung von proMMP-1 durch Matrix-Metalloprotease-2 (MMP-2) oder Kollagen-initiierte MMP-1-Aktivierung. Der Wirkstoff können FN-439, Gewebeinhibitoren der Metalloprotease (TIMPs), MMP-200, Cipemastat (Trocade), Prinomastat, BAY 12-9566, Batimistat, BMS-275291, Marimastat, MMI270(B), Metastat, Ro 32-3555, RS-130,830, PD 166793, Ancorinoside B-D, eine Tetracyclinverbindung oder Doxycyclin sein.
Weiterhin sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, einem Patienten einen zweiten Wirkstoff zu verabreichen, der mindestens einen der Thromboxan- und ADP-Signalisierungswege in den Plättchen des Patienten, mindestens einen Teil der enzymatischen Aktivität von PAR-1 oder die Thrombin-abhängige Aktivierung von PAR1 wesentlich inhibiert. Der zweite Wirkstoff ergänzt den ersten Wirkstoff, z. B. durch Inhibieren des Gewebefaktor-initiierten Hämostaseweges.
Weiterhin sieht das Verfahren die Verabreichung eines zweiten antithrombotischen Wirkstoffs vor, der Anti-Plättchen-Arzneimittel, gerinnungshemmende Arzneimittel oder thrombolytische Arzneimittel umfasst. Der zweite antithrombotische Wirkstoff können Thienopyridine, Prostaglandin-Analoga, COX-Inhibitoren, Vitamin-K-Antagonisten, Glycoprotein-IIB/IIIA-Inhibitoren oder Thrombin-Inhibitoren sein.
In einer weiteren Ausführungsform können der zweite Wirkstoff Aspirin, Clopidogrel, Ticlopidin, Prasugrel, Heparin, Abciximab, Eptifibatid, Tirofiban und Bivalirudin sein.
In einer weiteren Ausführungsform kann der zweite Wirkstoff ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R sein.
Weiterhin sieht das Verfahren die Verabreichung des Wirkstoffs durch intravenöse (i. v.) Injektion, subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion, orale Einnahme, nasale, topische, rektale, vaginale oder parenterale Aufnahme vor. Der Wirkstoff kann mit einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff, Träger oder Verdünnungsmittel formuliert sein.
In einem zweiten Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustandes bei einem Patienten vor, indem einem Patienten, bei dem ein thrombotischer Erkrankungszustand diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung desselben besteht, eine therapeutisch wirksame Menge eines Wirkstoffs verabreicht wird, der die Protease-aktivierter-Rezeptor-1 (PAR-1-)Signalisierungsaktivität des Patienten wesentlich inhibiert, die durch die proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist. In einer Ausführungsform umfasst der Wirkstoff SCH 530348.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Wirkstoff ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R.
In einem dritten Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem ein thrombotischer Erkrankungszustand diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung desselben besteht, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Wirkstoffs vor, der die Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-enzymatische Aktivität wesentlich inhibiert.
Der Wirkstoff inhibiert wesentlich eine Spaltung von proMMP-1 durch eine Proteinase, Spaltung von proMMP-1 durch Matrix-Metalloprotease-2 (MMP-2) oder Kollagen-initiierte MMP-1-Aktivierung. Der Wirkstoff können FN-439, Gewebeinhibitoren der Metalloprotease (TIMPs), MMP-200, Cipemastat (Trocade), Prinomastat, BAY 12-9566, Batimistat, BMS-275291, Marimastat, MMI270(B), Metastat, Ro 32-3555, RS-130,830, PD 166793, Ancorinoside B-D, eine Tetracyclinverbindung oder Doxycyclin sein.
In einem vierten Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem Atherosklerose diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung derselben besteht, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Wirkstoffs vor, der eine proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) des Patienten wesentlich inhibiert.
Der Wirkstoff kann verabreicht werden, nachdem an dem Patienten eine angioplastische Prozedur, ein koronarer Bypass oder eine Operation am offenen Herzen vorgenommen wurde, jedoch vorzugsweise für nicht mehr als zwei Wochen.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, um Atherosklerose zu behandeln, indem einem Patienten, bei dem Atherosklerose diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung derselben besteht, eine therapeutisch wirksame Menge eines Wirkstoffs verabreicht wird, der die Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Signalisierungsaktivität des Patienten wesentlich inhibiert, die durch proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist.
In einem Aspekt reduziert der Wirkstoff die Größe von atherosklerotischer Plaque in der Aorta des Patienten.
In einer Ausführungsform umfasst der Wirkstoff SCH 530348.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Wirkstoff ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R.
In einem sechsten Aspekt sieht die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten, bei dem Atherosklerose diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko der Entwicklung derselben besteht, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Wirkstoffs vor, der eine Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-enzymatische Aktivität wesentlich inhibiert.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung außerdem ein Medium zur Plättchenlagerung oder zum Plättchentransport mit einer wirksamen Konzentration eines Wirkstoffs vor, der eine proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) von Protease-aktiviertem Rezeptor-1 (PAR-1) auf darin enthaltenen Plättchen wesentlich inhibiert. Das Medium kann eine wässrige Lösung sein, die weiterhin Glucose enthält, und die durchschnittliche Halbwertzeit eines normalen darin enthaltenen Plättchens beträgt nicht weniger als circa 5 Tage oder 1 Monat oder 6 Monate. Das Medium kann eine effektive Konzentration eines Wirkstoffs aufweisen, der eine Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-enzymatische Aktivität inhibiert. Das Medium kann ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R umfassen.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung ein Medium zur Plättchenlagerung oder zum Plättchentransport vor, wobei das Medium eine effektive Konzentration eines Wirkstoffs aufweist, der eine Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Signalisierungsaktivität wesentlich inhibiert, die durch proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist.
In einer Ausführungsform umfasst der Wirkstoff SCH 530348.
In wiederum einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Risikos, ein hämorrhagisches Ereignis zu erleiden, bei einem Patienten durch Bestimmung dessen bereit, ob der Patient einen genetischen Defekt aufweist, der die Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-Aktivität in dem Patienten wesentlich inhibiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren eines hämophilen oder koagulopathischen Zustandes oder eines Risikos desselben bei einem Patienten durch Bestimmen dessen bereit, ob der Patient einen genetischen Defekt aufweist, der die Aktivierung von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) oder MMP-1-enzymatische Aktivität in dem Patienten überstimuliert.
Weiterhin stellt die Erfindung ein isoliertes Polypeptid mit einer Sequenz bereit, die nicht weniger als 5 zusammenhängende Aminosäurereste eines der beiden Fragmente umfasst, die durch eine proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) von menschlichem Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Polypeptid entstehen, das an einem Ende mit einer Spaltstelle endet, die durch die proteolytische Spaltung entstanden wäre. Das erfindungsgemäße Polypeptid kann ein Prolin an seinem N-Terminus aufweisen und z. B. die Polypeptidsequenz von PRSFLLRN (SEQ 1D NO. 1) aufweisen. Alternativ kann das erfindungsgemäße Polypeptid eine Asparaginsäure an seinem C-Terminus aufweisen und mindestens weitere vier Aminosäurereste aufweisen, wie links von D39 in 9B gezeigt, wo die gesamte Polypeptidsequenz von menschlichem PAR-1 angegeben ist und wo D39 und P40, die sich über die Spaltstelle erstrecken, fett und unterstrichen dargestellt sind.
Außerdem sieht die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren eines thrombotischen Erkrankungszustandes bei einem Patienten durch Messen der Menge des erfindungsgemäßen Polypeptids in Plättchen vor, die einem Patienten entnommen sind.
In wiederum einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Identifizieren eines PAR-1-Antagonisten mit folgenden Schritten offenbart: Bereitstellen eines isolierten erfindungsgemäßen Polypeptids mit einer Sequenz, die nicht weniger als 5 zusammenhängende Aminosäurereste eines der beiden Fragmente umfasst, die durch eine proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) von menschlichem Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Polypeptid entstehen, das an einem Ende mit einer Spaltstelle endet, die durch die proteolytische Spaltung entstanden wäre, Bereitstellen eines in Frage kommenden Wirkstoffs, Kontaktieren von Plättchen mit dem isolierten Polypeptid bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs, Messen einer PAR-1-Signalisierungsaktivität und Vergleichen der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs mit der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Fehlen des in Frage kommenden Wirkstoffs, wobei eine Reduzierung der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs um mindestens 10% gegenüber der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Fehlen des in Frage kommenden Wirkstoffs den in Frage kommenden Wirkstoff als einen PAR-1-Antagonisten identifiziert.
Die PAR-1-Signalisierungsaktivität kann Signalisierung auf dem Rho-GTP-Weg oder dem MAPK-Weg umfassen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zum Identifizieren eines PAR-1-Antagonisten mit folgenden Schritten offenbart: Bereitstellen von aktiviertem MMP-1, Bereitstellen eines in Frage kommendes Wirkstoffs, Kontaktieren von Plättchen mit dem aktivierten MMP-1 bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs unter Bedingungen, bei denen MMP-1 PAR-1 spaltet, Messen von PAR-1-Signalisierungsaktivität und Vergleichen der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs mit der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Fehlen des in Frage kommenden Wirkstoffs, wobei eine Reduzierung der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Vorhandensein des in Frage kommenden Wirkstoffs um mindestens 10% gegenüber der PAR-1-Signalisierungsaktivität bei Fehlen des in Frage kommenden Wirkstoffs den in Frage kommenden Wirkstoff als einen PAR-1-Antagonisten identifiziert.
Die PAR-1-Signalisierungsaktivität kann Signalisierung auf dem Rho-GTP-Weg oder dem MAPK-Weg umfassen.
In einem Aspekt offenbart die Erfindung eine medizinische Vorrichtung, die mit einer Matrixschicht beschichtet ist, welche einen Wirkstoff umfasst, der proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) des Patienten wesentlich inhibiert.
In einem weiteren Aspekt offenbart die Erfindung eine medizinische Vorrichtung, die mit einer Matrixschicht beschichtet ist, welche einen Wirkstoff umfasst, der Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Signalisierungsaktivität wesentlich inhibiert, die durch proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist. In einer Ausführungsform umfasst der Wirkstoff SCH 530348.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Wirkstoff ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R.
Die Matrixschicht kann eine biokompatible Peptidmatrix sein. Die medizinische Vorrichtung kann implantierbar sein. Die Matrix kann weiterhin ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie oder ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid aufweisen, wie etwa P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 oder P1i4pal13R.
Die vorangehend beschriebenen Ausführungsformen haben viele Vorteile, einschließlich Verfahren zum Finden und Verabreichen von Wirkstoffen, die den MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungsweg inhibieren. Die vorliegend offenbarten Verfahren, Zusammensetzungen und Kits sind daher besonders sinnvoll bei der Behandlung von Patienten, bei denen ein thrombotischer Erkrankungszustand diagnostiziert wurde oder ein Risiko der Entwicklung desselben besteht.
Es sei darauf hingewiesen, dass die vorliegende Anmeldung nicht auf die in dieser Zusammenfassung offenbarten Ausführungsformen beschränkt ist und auch im Rahmen des Handelns des Durchschnittsfachmanns liegende sowie durch die Ansprüche definierte Abwandlungen und Varianten einschließen soll.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die MMP-Aktivität in menschlichen Plättchen nach Behandlung mit ADP, U-46619 oder Kollagen Typ I.
1B zeigt ELISA-Messungen von freigesetzten und mit Plättchen assoziierten MMP-1-Prodomänen in den Pellets und Überständen, die aus den Plättchen aus 1 gesammelt wurden.
1C zeigt die Expression von MMP-1 auf der Oberfläche von Plättchen gemäß der Bestimmung durch Durchflusszytometrie.
1D zeigt, dass proMMP-1 sich in ruhenden menschlichen Plättchen mit Integrinen assoziiert.
1E zeigt, dass MMP-1 und Kollagen die Freisetzung eines N-terminalen Thrombin-Spaltungsfragmentes aus der extrazellulären Domäne von PAR1 bewirken.
1F stellt eine Dot-Blot-Analyse dar, die zeigt, dass MMP-3 und MMP-7 nicht fähig sind, ein N-terminales PAR-1-Peptid aus ruhenden Plättchen freizusetzen.
1G stellt eine Dot-Blot-Analyse dar, die zeigt, dass ein MMP-1-spezifischer Antikörper die Kollagen-induzierte Freisetzung des N-terminalen PAR-1-Peptids aus ruhenden Plättchen blockieren kann.
1H stellt eine Dot-Blot-Analyse dar, die zeigt, dass ADP und U-46619 die Freisetzung des N-terminalen PAR-1-Peptids aus ruhenden Plättchen fördern können.
1I stellt eine Dot-Blot-Analyse dar, die zeigt, dass eine Blockierung des P2Y12-ADP-Rezeptors mit AR-C69931MX (ARC) oder von Thromboxan mit Aspirin (ASA) keine Wirkung auf die kollagenabhängige Freisetzung des PAR1-N-terminalen Peptids hatte.
2A zeigt die Identifikation der MMP-1-Spaltstelle auf der TR26-N-terminalen Peptidregion von PAR1.
2B zeigt den Ort der Spaltung von N-terminalen extrazellulären PAR1-Mutanten durch Thrombin und MMP-1.
2C zeigt die Spaltung von N-terminalen extrazellulären PAR1-Mutanten durch Thrombin.
2D zeigt die Spaltung von N-terminalen extrazellulären PAR1-Mutanten durch MMP-1.
2E zeigt die RhoA-Signalisierung durch die unterschiedlichen PAR-1-Mutanten bei Vorhandensein von Thrombin oder MMP-1.
2F stellt die chemotaktische Wanderung von MCF-7-Zellen dar, die Thrombin und MMP1-Spaltstellen-Mutanten exprimieren.
2G zeigt die Spaltung von N-terminalen Extrazelluläre-Domäne-PAR1-Mutanten, die vermittels MMP-1, die aus einer anderen Quelle gereinigt ist, auf COS7-Zellen exprimiert sind.
2H zeigt die Spaltung von Wildtyp-PAR-2, exprimiert auf COS7-Zellen durch MMP-1 oder Trypsin.
2I zeigt die Spaltung von Wildtyp-PAR-3, exprimiert auf COS7-Zellen durch MMP-1 oder Thrombin.
2J zeigt die Spaltung von Wildtyp-PAR-4, exprimiert auf COS7-Zellen durch MMP-1 oder Thrombin.
3A zeigt, dass das PRSFLLRN-Peptid (PR-TRAP) PAR1-abhängige RhoA-Aktivierung in Plättchen induziert.
3B zeigt, dass das PRSFLLRN-Peptid (PR-TRAP) p38 MAPK in Plättchen aktiviert.
3C zeigt Veränderungen in der Plättchenform, induziert durch das PRSFLLRN-Peptid (PR-TRAP).
4A zeigt, dass MMP-1 Rho-GTP in Plättchen aktiviert.
4B zeigt, dass MMP-1 Veränderungen der Plättchenform induzieren kann.
4C zeigt, dass MMP-1 PAR1-abhängige Calciumflüsse in Plättchen induziert.
4D zeigt, dass MMP-1 Plättchenaggregation induziert.
4E zeigt, dass MMP-1 p38MAPK in Plättchen aktiviert.
4F zeigt, dass MMP-1 das nachgelagerte MAPKAP-K2 in Plättchen aktiviert.
5A zeigt die Wirkung einer pharmakologischen Blockierung von Metalloproteasen oder PAR1 auf die Plättchenaggregation bei Vorhandensein von 5 mg/ml Kollagen.
5B zeigt die Wirkung einer pharmakologischen Blockierung von Metalloproteasen oder PAR1 auf die Plättchen-p38-MAPK-Aktivität bei Vorhandensein von 5 mg/ml Kollagen.
5C zeigt die Wirkung einer pharmakologischen Blockierung von Metalloproteasen oder PAR1 auf die Plättchen-Rho-GTP-Aktivität bei Vorhandensein von 5 mg/ml Kollagen.
5D zeigt die Wirkung verschiedener blockierender Antikörper (Anti-MMP-1, Anti-MMP-8 und Anti-MMP-13) und verschiedener Inhibitoren (ARC (P2YI2-Antagonist AR-C69931 MX), ASA (Aspirin)) auf Plättchen-Rho-GTP-Aktivität bei Vorhandensein von 5 mg/ml Kollagen für sich oder zusammen mit MMP-1 (Calbiochem oder S2, BioMol).
5E zeigt die Wirkung eines bestimmten Pepducins (P1pal-7, bezeichnet mit ”PZ-128”) auf die Plättchenaggregation bei Vorhandensein von 5 mg/ml Kollagen.
6A–6B zeigen, dass eine Inhibition von MMP-1 oder PAR1 eine frühe Mikrothrombusbildung auf Kollagenoberflächen bei Vorhandensein von Heparin verhindert.
6C–6D zeigen, dass eine Inhibition von MMP-1 oder PAR1 eine frühe Plättchen-Mikrothrombusbildung auf Kollagenoberflächen unabhängig von Thrombin verhindert.
6E zeigt, dass P1pal-7 und FN-439 bei Meerschweinchen vor Kollagen-induzierter systemischer Plättchenaktivierung schützt.
6F und 6G zeigen, dass eine Inhibition von PAR1 und/oder MMP-1 bei Meerschweinchen eine Okklusion der Halsschlagadern verhindert.
6H zeigt die Detektion von MMP-1-Aktivität in Meerschweinchen-Plättchen-Überstand und durch Kollagen induzierten Arteriengerinnseln.
6I zeigt eine fotografische Darstellung von Gerinnselretraktions-Assays mit verschiedenen Wirkstoffen, die plättchenreichem menschlichem Plasma zugesetzt werden. Der obere Block sind Aufnahmen nach 90 Minuten Inkubation und der untere Block solche nach 240 Minuten.
7A zeigt die Oberflächenexpression von MMP-1 auf Meerschweinchen-Plättchen entsprechend der Bestimmung durch Durchflusszytometrie.
7B zeigt die enzymatische Aktivität von aktivem MMP-1 in Meerschweinchen-Plättchenlysaten und -überständen bei Vorhandensein oder Fehlen von FN-439, Kontroll-IgG oder einem MMP-1 blockierenden Antikörper.
7C zeigt die Wirkung einer pharmakologischen Blockierung von Metalloproteasen oder PAR1 auf eine Meerschweinchen-Plättchenaggregation bei Vorhandensein von 10 mg/ml Kollagen.
7D zeigt die Rho-GTP-Aktivität in den in 7C verwendeten Plättchen.
8A–8F zeigen, dass eine pharmakologische Inhibition von Matrix-Metalloprotease-2 (MMP-2) die kollagenabhängige Plättchenaggregation in ähnlichem Umfang abschwächt wie eine Blockierung von MMP-1.
9A stellt ein vorgeschlagenes Modell einer MMP-1-mediierten PAR-1-Aktivierung durch den angebundenen Liganden von PAR-1 dar.
9B zeigt die menschliche PAR-1-Polypeptidsequenz (Genbank-Akzessionsnr. NP_001983).
10A zeigt das durchschnittliche Gewicht von ApoE-defizienten Mäusen nach 15 Wochen westlicher Ernährung.
10B zeigt das gesamte Plasma-Cholesterin von ApoE-defizienten Mäusen nach 15 Wochen westlicher Ernährung.
11A stellt die atherosklerotische Läsionsfläche bei ApoE-defizienten Mäusen dar, die mit Vehikel, MMP-Inh-I (FN-439) oder P1pal-7-Pepducin-Lipopeptid behandelt wurden.
11B stellt eine atherosklerotische Läsionsfläche in der abdominalen/iliakalen Aorta dar.
12A–12C zeigen die Angiogenese in der abdominalen Aorta von ApoE-/- Mäusen.
13A–13C zeigen, dass P1pal-7 und MMP1-Inhibitoren die Angiogenese in der abdominalen Aorta von ApoE-defizienten Mäusen reduzieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten Fachausdrücke und wissenschaftlichen Ausdrücke die unter Fachleuten allgemein übliche Bedeutung. Die folgenden Definitionen werden zum leichteren Verständnis der Offenbarung und der Ansprüche der vorliegenden Anmeldung vorgelegt. Sofern eine Definition in diesem Abschnitt nicht mit andernorts vorgenommenen Definitionen übereinstimmt, gilt die in diesem Abschnitt vorgenommene Definition.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet der Ausdruck ”circa” oder ”ungefähr”, sofern er in Verbindung mit einer Zahl verwendet wird, jede Zahl mit einer Abweichung von der bezeichneten Zahl in einem Bereich von 5, 10 oder 15%.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnen die Ausdrücke ”Verabreichung”, ”verabreichen” oder dergleichen, soweit sie im Zusammenhang mit der Verabfolgung einer pharmazeutischen oder ernährungstechnischen Zusammensetzung zu einem Subjekt verwendet werden, allgemein eine Verabfolgung von einer oder mehr pharmazeutischen Zusammensetzungen, die den Wirkstoff, z. B. einen Agonisten oder Antagonisten des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungsweges, in Kombination mit einem geeigneten Zuführungsvehikel umfassen, an das Subjekt mit jedem Mittel in der Weise, dass die verabreichte Verbindung eine oder mehr der beabsichtigten biologischen Wirkungen erreicht, zu deren Zweck die Zusammensetzung verabreicht wurde. Als nicht-einschränkende Beispiele kann eine Zusammensetzung parenteral, subkutan, intravenös, intrakoronar, rektal, intramuskulär, intraperitoneal, transdermal oder über bukkale Zuführungswege verabreicht werden.
In einer Ausführungsform kann zur ”Verabreichung” des Wirkstoffs, z. B. eines Agonisten oder Antagonisten des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungswegs, an den Patienten eine kontrollierte Freisetzung erforderlich sein, d. h. die Freisetzung des aktiven Inhaltsstoffes aus der Formulierung auf anhaltende und geregelte Weise über einen längeren Zeitraum als eine unmittelbar freigesetzte Formulierung, die dieselbe Menge des aktiven Inhaltsstoffes enthält, während desselben Zeitraums freisetzen würde. Die verabreichte Dosis ist abhängig von Alter, Gesundheitszustand, Gewicht und/oder thrombotischem Erkrankungszustand des Empfängers und/oder anderen assoziierten Risikofaktoren, gegebenenfalls der Art der gleichzeitigen Behandlung, der Behandlungsfrequenz und/oder der Art der gewünschten Wirkung.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet ein ”Agonist” jedes natürliche oder synthetische Molekül oder jede ebensolche Molekülkombination, das bzw. die eine biologische Aktivität um mindestens oder mindestens circa das 2-fache, circa das 3-fache, circa das 4-fache, circa das 5-fache, circa das 7-fache, circa das 10-fache, circa das 20-fache, circa das 50-fache oder circa das 100-fache oder mehr erhöht, in einem Standard-Bioassay oder in vivo oder bei Verwendung in therapeutisch wirksamer Dosis. In einer Ausführungsform bezeichnet ein ”Agonist” jedes natürliche oder synthetische Molekül oder jede ebensolche Molekülkombination, das bzw. die eine MMP-1-mediierte PAR-1-Signalisierung aktiviert.
”Antagonist” und ”Inhibitor” können vorliegend austauschbar verwendet werden und bezeichnen jedes natürliche oder synthetische Molekül oder jede ebensolche Molekülkombination, das bzw. die eine biologische Aktivität in einem Standard-Bioassay oder in vivo oder bei Verwendung in einer therapeutisch wirksamen Dosis um mindestens oder mindestens circa 10%, circa 15%, circa 20%, circa 25%, circa 30%, circa 35%, circa 40%, circa 45%, circa 50%, circa 55%, circa 60%, circa 65%, circa 70%, circa 75%, circa 80%, circa 85%, circa 90%, circa 95%, circa 96%, circa 97%, circa 98%, circa 99% oder circa 100% behindern. In einer Ausführungsform bezeichnet ein ”Antagonist” oder ”Inhibitor” jedes natürliche oder synthetische Molekül oder jede ebensolche Molekülkombination, die bzw. das MMP-1-mediierte PAR-1-Aktivität behindert. In einer weiteren Ausführungsform bezeichnet ein ”Antagonist” oder ”Inhibitor” jedes natürliche oder synthetische Molekül oder jede ebensolche Molekülkombination, das bzw. die eine MMP-1-mediierte PAR-1-Aktivierung behindert.
In einer weiteren Ausführungsform bezeichnet ein ”Antagonist” oder ”Inhibitor” eine Verbindung, die eine Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) um mindestens oder mindestens circa 10%, circa 15%, circa 20%, circa 25%, circa 30%, circa 35%, circa 40%, circa 45%, circa 50%, circa 55%, circa 60%, circa 65%, circa 70%, circa 75%, circa 80%, circa 85%, circa 90%, circa 95%, circa 96%, circa 97%, circa 98%, circa 99% oder circa 100% behindert.
In einer Ausführungsform ist ein ”Antagonist” des MMP1-mediierten PAR-1-Signalisierungsweges durch seine Fähigkeit identifizierbar, die PAR-1-mediierte Signalisierungsaktivität vollständig oder partiell zu inhibieren, gemessen beispielsweise an der PAR1-abhängigen Rho- und p38-MAPK-Signalisierung. Eine Inhibition tritt dann ein, wenn intrazelluläre PAR-1-Signalisierung aus einem PAR-1-Rezeptor, der gegenüber einem erfindungsgemäßen ”Wirkstoff” exponiert ist, um mindestens oder mindestens circa 10%, circa 15%, circa 20%, circa 25%, circa 30%, circa 35%, circa 40%, circa 45%, circa 50%, circa 55%, circa 60%, circa 65%, circa 70%, circa 75%, circa 80%, circa 85%, circa 90%, circa 95%, circa 96%, circa 97%, circa 98%, circa 99%, oder circa 100% gegenüber der intrazellulären Signalisierung aus einem Kontroll-PAR-1, der nicht gegenüber dem ”Antagonisten” exponiert ist, reduziert ist.
Eine ”Agonisten-” oder ”Antagonisten-”Verbindung kann gemäß der vorliegenden Verwendung eine oder mehr schützende Gruppen umfassen, die unerwünschte Reaktionen (wie etwa eine Proteolyse) im Zusammenhang mit ungeschützten Gruppen verhindern. In einer Ausführungsform wird durch die vorliegende Erfindung erwogen, dass die schützende Gruppe ein Acyl oder ein Amid ist. In einer Ausführungsform ist das Acyl Acetat. In einer weiteren Ausführungsform ist die schützende Gruppe eine Benzylgruppe. In einer weiteren Ausführungsform ist die schützende Gruppe eine Benzoylgruppe. Auch Kombinationen solcher schützender Gruppen werden durch die vorliegende Erfindung erwogen.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnen ”gerinnungshemmende” Arzneimittel solche, die eine Koagulation verhindern; d. h. die eine Gerinnselbildung des Blutes verhindern. Nicht-einschränkende Beispiele für Gerinnungshemmer, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen beispielsweise Cumarine (Vitamin-K-Antagonisten, Warfarin (Coumadin, Acenocoumarol, Phenprocoumon) und synthetische Pentasaccharid-Inhibitoren des Faktors Xa (Fondaparinux oder ldraparinux).
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnen ”Anti-Plättchen-Arzneimittel” Vertreter einer Klasse von Pharmazeutika, die die Plättchenaggregation reduziert. Nichteinschränkende Beispiele für Anti-Plättchen-Arzneimittel sind beispielsweise Cyclooxygenase-Inhibitoren (Aspirin), Adenosindiphosphat-(ADP-)Rezeptor-Inhibitoren (Clopidogrel (Plavix), Ticlopidin (Ticlid)), Phosphodiesterase-Inhibitoren (Cilostazol (Pletal), Glycoprotein-IIB/IIIA-Inhibitoren und Adenosin-Wiederaufnahmeinhibitoren (Dipyridamol (Persantin)). In einer Ausführungsform umfasst ein Anti-Plättchen-Arzneimittel SCH 530348.
Gemäß der vorliegenden Verwendung umfassen ”Glycoprotein-IIB/IIIA-Inhibitoren”, jedoch nicht ausschließlich, (Abciximab (ReoPro), Eptifibatid (Integrilin) und Tirofiban (Aggrastat), Defibrotid. Abciximab (zuvor unter dem Namen c7E3 Fab bekannt), hergestellt durch Centocor und vertrieben durch Eli Lilly unter dem Handelsnamen ReoPro, ist ein Plättchenaggregations-Inhibitor, der vor allem während und nach Koronararterien-Prozeduren wie etwa einer Angioplastie verwendet wird, um zu verhindern, dass Plättchen aneinanderhaften und eine Thrombus-(Blutgerinnsel-)Bildung innerhalb der Koronararterie verursachen. Eptifibatid (Integrilin, Millennium Pharmaceuticals, auch von Schering-Plough/Essex mitvermarktet) ist ein Anti-Plättchen-Arzneimittel, das den Plättchen-Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor selektiv blockiert. Eptifibatid ist ein zyklisches Heptapeptid, das von einem Protein abgeleitet ist, welches man im Gift der Zwergklapperschlange (Sistrurus miliarius barbouri) findet. Es gehört zur Klasse der sogenannten Arginin-Glycin-Aspartat-Mimetika und bindet sich reversibel an Plättchen. Eptifibatid hat eine kurze Halbwertzeit. Das Arzneimittel ist nach der globalen Markteinführung des spezifischen Antikörpers Abciximab und des Nicht-Peptids Tirofiban der dritte Inhibitor für GPIIb/IIIa, der breite Akzeptanz gefunden hat. Tirofiban ist ein synthetischer Nicht-Peptid-Inhibitor, der an Glycoprotein-(GP-)IIb/IIIa-Rezeptoren in menschlichen Plättchen wirkt. Es stellt daher einen Gerinnungshemmer, spezifisch einen Inhibitor der Plättchenaggregation dar. Das Arzneimittel wird in den USA von Medicure Pharma unter dem Markennamen AGGRASTAT und im Rest der Welt von Iroko Pharmaceuticals vermarktet.
Der Ausdruck ”angehaftet” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung jede Interaktion zwischen einem Medium (oder Träger) und einem Wirkstoff, z. B. einem Agonisten oder Antagonisten des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungswegs. Die Anhaftung kann reversibel oder irreversibel sein. Eine solche Anhaftung umfasst, ist jedoch nicht begrenzt auf, kovalente Bindung und nicht-kovalente Bindung einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Ionenbindung, Van-der-Waals-Kräfte oder Reibung und dergleichen. Ein Wirkstoff ist an ein Medium (oder einen Träger) angehaftet, wenn dasselbe damit getränkt, darin aufgenommen, damit beschichtet, damit in Suspension, damit gemischt ist usw.
Gemäß der vorliegenden Verwendung ist eine medizinische Vorrichtung dann ”beschichtet”, wenn ein Medium, das einen Wirkstoff, z. B. einen Agonisten oder Antagonisten des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungswegs, umfasst, eine Anhaftung an der Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung entwickelt. Diese Anhaftung kann dauerhaft oder vorübergehend sein. Wenn sie vorübergehend ist, kann die Anhaftung eine kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs hervorrufen. Medizinische Vorrichtungen können mit einem dünnen Polymerfilm beschichtet sein, der mit dem Plättchenaktivierung inhibierenden Wirkstoff versetzt ist. Die Beschichtung wird auf die medizinische Vorrichtung vor dem Einführen in ein Blutgefäß mit Verfahren aufgetragen, die in der Technik bekannt sind, wie etwa einer Lösungsmittelverdampfungstechnik. Bei der Lösungsmittelverdampfungstechnik werden ein Polymer und Wirkstoff in einem Lösungsmittel gemischt. Die Polymer, Wirkstoff und Lösungsmittel umfassende Verbindung kann dann durch Tauchen oder Sprühen auf die Oberfläche der medizinischen Vorrichtung aufgetragen werden. Sodann wird die medizinische Vorrichtung einem Trocknungsprozess unterzogen, währenddessen das Lösungsmittel verdampft wird, und das Polymermaterial mit dem darin dispergierten Wirkstoff bildet eine Dünnfilmschicht auf der medizinischen Vorrichtung. Das US-Pat. Nr. 5,837,313 für Ding et al. beschreibt ein Verfahren zum Präparieren einer heparinhaltigen Beschichtungszusammensetzung. Das US-Pat. Nr. 5,525,348 für Whitbourne offenbart ein Verfahren zur Komplexbildung von pharmazeutischen Wirkstoffen (einschließlich Heparin) mit quarternären Ammoniumkomponenten oder anderen ionischen Tensiden, gebunden mit wasserunlöslichen Polymeren als antithrombotische Beschichtungszusammensetzung. Ein allgemeiner Ansatz zur Beschichtung von medizinischen Vorrichtungen, wie er in der US 2005/0191333 A1 , der US 2006/0204533 A1 und der WO 2006/099514 A2 , alle von Hsu, Li-Chien et al., offenbart ist, verwendet einen Komplex mit niedrigem Molekulargewicht aus Heparin und einem Gegenion (Stearylkonium-Heparin) oder einen Polyelektrolytkomplex mit hohem Molekulargewicht wie etwa Dextran, Pektin zur Bildung eines Komplexes.
Der Ausdruck ”Kollagen-induzierte Plättchenaggregation” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung eine Plättchenaggregation in Antwort auf das Vorhandensein des Proteins Kollagen.
Ein ”Homolog” eines MMP-1-Polypeptids bezeichnet ein Polypeptid mit mindestens circa 80%, bevorzugt mindestens circa 85%, weiter bevorzugt mindestens circa 90%, am meisten bevorzugt mindestens circa 95% Aminosäuresequenz-Übereinstimmung mit menschlichem MMP-1 der Aminosäuresequenz UniProtKB/Swiss-Prot P03956 (MMP1_HUMAN), die durch Verweis hier aufgenommen wird. In einer Ausführungsform umfasst beispielsweise ein MMP-1-Homolog diejenigen Varianten, die zum Spalten von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) fähig sind.
Ein ”Homolog” eines PAR-1-Polypeptids bezeichnet ein Polypeptid mit mindestens circa 80%, bevorzugt mindestens circa 85%, weiter bevorzugt mindestens circa 90%, am meisten bevorzugt mindestens circa 95% Aminosäuresequenz-Übereinstimmung mit der menschlichen PAR-1-Polypeptidsequenz mit der Genbank-Akzessionsnr. NP_001983. In einer Ausführungsform umfasst beispielsweise ein PAR-1-Homolog diejenigen PAR-1-Varianten, die zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) gespalten werden können.
Der Ausdruck ”Inhibierung der Plättchenaktivierung” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung eine Reduzierung oder Verlangsamung der Plättchenaggregation wie auch eine vollständige Eliminierung und/oder Verhinderung der Plättchenaggregation.
Der Ausdruck ”Ligandenbindung” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung einen Bestandteil eines Bindungspaars, d. h. zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle sich durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Neben Antigen- und Antikörper-Bindungspaarbestandteilen sind weitere Bindungspaare, als nicht-einschränkende Beispiele, unter anderem Biotin und Avidin, Kohlehydrate und Lektine, komplementäre Nukleotidsequenzen, komplementäre Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormoleküle, Enzym-Kofaktoren und Enzyme, Enzym-Inhibitoren und Enzyme, eine Peptidsequenz und ein Antikörper, der für die Sequenz oder das gesamte Protein spezifisch ist, polymere Säuren und Basen, Farbstoffe und Proteinbinder, Peptide und spezifische Proteinbinder (z. B. Ribonuklease, S-Peptid und Ribonuklease-S-Protein) und dergleichen. Außerdem können Bindungspaare Bestandteile umfassen, die Analoga des Original-Bindungsbestandteils sind, beispielsweise ein Analyt-Analogon oder einen durch rekombinante Techniken oder Molekulartechnik hergestellten Bindungsbestandteil. Wenn der Bindungsbestandteil ein Immunoreaktand ist, kann er beispielsweise ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, ein rekombinantes Protein oder ein rekombinanter Antikörper, ein chimärer Antikörper, (ein) Gemisch(e) oder Fragment(e) der Vorgenannten sowie ein Präparat aus solchen Antikörpern, Peptiden und Nukleotiden sein, deren Eignung zur Verwendung als Bindungsbestandteile dem Fachmann bekannt ist. Ein Ligandenbindungsbestandteil kann ein Polypeptid-Affinitäts-Ligand sein (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6,326,155 , dessen Inhalt hiermit durch Verweis in seiner Gesamtheit hier aufgenommen wird). In einer Ausführungsform ist der Ligandenbindungsbestandteil gelabelt. Das Label kann aus einem Fluoreszenz-Label, einem Chemilumineszenz-Label oder einem Biolumineszenz-Label, einem Enzym-Antikörper-Konstrukt oder anderen ähnlichen, geeigneten Labels ausgewählt sein, die in der Technik bekannt sind.
In einigen Ausführungsformen bezeichnet ein Ligandenbindungsmolekül einen ”Antikörper”, einschließlich sowohl polyklonaler als auch monoklonaler Antikörper; und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment eines solchen (wie etwa Fv, Fd, Fab, Fab' und F(ab)'2-Fragmente) oder Multimere oder Aggregate von intakten Molekülen und/oder Fragmenten umfassen und kann in der Natur vorkommen oder erzeugt sein, z. B. durch Immunisierung, Synthese oder Gentechnik. Ein Antikörper kann nach Verfahren humanisiert sein, die in der Technik bekannt sind.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein ”Ligandenbindungsmolekül” ein ”Aptamer” bezeichnen, d. h. Oligonukleotide, die zum Binden an ein Target von Interesse auf andere Weise als durch Basenpaar-Hybridisierung fähig sind.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet eine ”Matrixschicht” die Substanz, wie etwa ein Polymer, die zum Anhaften des hier beschriebenen ”Agonisten” oder ”Antagonisten” geeignet ist und auf die Oberfläche einer medizinischen Vorrichtung aufgetragen werden kann. Verfahren zur Beschichtung einer medizinischen Vorrichtung werden in der US-Patentveröffentlichung Nr. 2009/0018646 beschrieben, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen wird.
Der Ausdruck ”medizinische Vorrichtung” bezeichnet in der vorliegenden Verwendung breit gefasst alle Vorrichtungen, die im Zusammenhang mit einer medizinischen Prozedur verwendet werden. Spezifisch wird vorliegend jede Vorrichtung, die während einer medizinischen Prozedur oder Therapie mit dem Blut eines Patienten in Kontakt gelangt, als medizinische Vorrichtung betrachtet. Ebenso wird vorliegend jede Vorrichtung, die einem Patienten während einer medizinischen Prozedur oder Therapie ein Arzneimittel oder eine Verbindung verabreicht, als medizinische Vorrichtung betrachtet. ”Direkte medizinische Implantate” umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Harnwegs- und Gefäßkatheter, Dialysekatheter, Wunddrainageschläuche, Hautnähte, Gefäßersatzprodukte und implantierbare Netze, intraokulare Vorrichtungen, implantierbare Arzneimittelzufuhrsysteme und Herzklappen und dergleichen. ”Wundpflegevorrichtungen” umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, allgemeine Wundverbände, nichthaftende Verbände, Brandwundenverbände, biologische Implantationsstoffe, Wundverschlussstreifen und -verbände, Operationsabdecktücher, Schwämme und absorbierbare Arterienklemmen. ”Chirurgische Vorrichtungen” umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, chirurgische Instrumente, Endoskopsysteme (d. h. Katheter, Gefäßkatheter, chirurgische Werkzeuge wie etwa Skalpelle, Wundhaken und dergleichen) und temporäre Arzneimittelzuführungsvorrichtungen wie etwa Medikamentenzugänge, Injektionsnadeln usw. zum Verabreichen des Mediums.
Matrix-metalloproteinase-1 (MMP-1, Aliasnamen: CLG, CLGN, EC 3.4.24.7) ist auch bekannt als Fibroblast-Kollagenase, Interstitialkollagenase, Matrix-Metallopeptidase-1 oder Matrix-Metalloprotease-1 (HGNC: 71551; Entrez Gene: 43122; UniProtKB: P039563; Ensembl: ENSG000001966117; GenBank-Akzessionsnummer: NM_002421). Das MMP-1-Gen kodiert ein sekretiertes Enzym, das das Interstitialkollagene der Typen I, II und III zerlegen kann. Das Gen ist Teil eines Clusters von MMP-Genen, die auf das menschliche Chromosom 11q22.3 lokalisiert sind.
Matrix-Metalloprotease-2 (MMP-2; Aliasnamen: CLG4, CLG4A, EC 3.4.24.24, MMP-II, MONA, TBE-1) ist auch bekannt als 72-kDa-Gelatinase, Gelatinase A, Matrix-Metalloproteinase-2, Typ-IV-A-Kollagenase, Matrix-Metallopeptidase 2, 72 kDa-Typ-IV-Kollagenase oder neutrophile Gelatinase (HGNC: 71661; Entrez Gene: 43132; UniProtKB: P082533; Ensembl: ENSG000000872457).
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet ”Metalloprotease” oder ”MMP” eine Familie von Calcium- und Zink-abhängigen Endopeptidasen, denen Aminosäuresequenzen, Strukturdomänen und überlappende Substrate gemeinsam sind. Diese Enzyme werden als Zymogene sekretiert, und für ihre proteolytische Aktivität ist die Beseitigung eines Aktivierungspeptids erforderlich. MMPs sind beteiligt an der Zerlegung von Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und der Basalmembran wie etwa Aggrecan, Kollagen, Elastin, Fibronektin, Gelatine und Laminin. Die Fähigkeit der MMPs zum Abbauen von Komponenten der ECM ist für Zellwachstum, Zellteilung, Knochenwachstum, Wundheilung, Embryonalentwicklung und Angiogenese von wesentlicher Bedeutung. Die MMPs sind in unterschiedliche Klassen unterteilt. Man bezeichnet sie numerisch mit MMP-1, MMP-2 usw. sowie mit einer gemeinsprachlichen Benennung. Die MMPs haben mehrere strukturelle und funktionale Eigenschaften gemeinsam, unterscheiden sich jedoch in ihren Substratspezifitäten. Es gibt mindestens 25 Vertreter der MMP-Familie, kategorisiert nach ihren Domänestrukturen und ihren Präferenzen für makromolekulare Substrate (Nelson, A. et al., (2000) J. Clin. Oncol. 18, 1135–1149, Woessner, J. F. und Nagase, H. (2000) Matrix Metalloproteinases and TIMPs, Oxford University Press, Oxford). Die meisten MMPs enthalten eine Propeptiddomäne, eine katalytische Domäne und eine Hämopexin/Vitronektin-artige Domäne (Woessner, J. F. und Nagase, H., s. o.). Die MMP-Familie umfasst MMP-1 (Interstitialkollagenase, Kollagenase 1), MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin 1), MMP-7 (PUMP 1, Matrilysin), MMP-8 (neutrophile Kollagenase, Kollagenase 2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin 2), MMP-11 (Stromelysin 3), MMP-12 (Metalloelastase, Makrophagenelastase), MMP-13 (Kollagenase 3), fünf MMPs vom Membrantyp (MT-MMPs) (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-21), MMP-18 (Xenopus-Kollagenase 4), MMP-19, MMP-20 (Enamelysin), MMP-22 (Huhn, CMMP), MMP-23, MMP-24, MMP-25, MMP-26 (Endometase), MMP-27 und MMP-28 (Epilysin). Es besteht eine gewisse Redundanz bei der Nummerierung der Vertreter der MMP-Familie: Telopeptidase, später mit MMP-4 bezeichnet, und 3/4-Kollagenase (MMP-5) sind MMP-3 bzw. MMP-2; MMP-6 (Säure-Metalloproteinase) wurde als MMP-3 nachgewiesen.
In der vorliegenden Offenbarung ist ein Verweis auf Metalloproteasen im Allgemeinen oder auf jeden einzelnen Vertreter der MMP-Familie, wie etwa MMP-1 oder MMP-2, als Verweis auf alle Spleißvarianten, Mutanten (einschließlich, aber nicht begrenzt auf Deletionen, Insertionen oder Polymorphismen oder Aminosäuresubstitutionen), Isoformen und Homologa derselben zu verstehen.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bedeutet ”modulieren” eine Wirkung als Antagonist, d. h. ein teilweises oder vollständiges Inhibieren, Reduzieren, Abschwächen, Blockieren oder Verhindern; oder aber ein Erhöhen oder Stimulieren, d. h. eine Wirkung als Agonist. Die Modulation kann direkt oder indirekt erfolgen.
Nicht-kodierte Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, alpha-Aminosäuren, beta-Aminosäuren, gamma-Aminosäuren, delta-Aminosäuren und omega-Aminosäuren und können an jedem chiralen Atom R- oder S-Chiralität aufweisen. Nicht-kodierte Aminosäuren umfassen Isomere der kodierten Aminosäuren wie z. B. Stereoisomere (einschließlich z. B. D-Aminosäuren und Allo-Aminosäuren wie z. B. Allothreonin und Alloisoleucin) und Strukturisomere (einschließlich z. B. Beta-Alanin) der kodierten Aminosäuren. Nicht-kodierte Aminosäuren umfassen auch N-methylierte Aminosäuren. Wenn für eine alpha-Aminosäure keine spezifische Konfiguration angegeben ist, würde der Fachmann generell von einer L-Aminosäure ausgehen. In besonderen Ausführungsformen können nicht-kodierte Aminosäuren jedoch auch die Form racemischer, nicht-racemischer und diastereomerer Gemische haben. Nicht-kodierte Aminosäuren sind auf dem Gebiet der Peptide bekannt und umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, N-Acetylserin, alpha//o-Isoleucin, alpha//o-Threonin, Beta-Alanin (3-Amino-propionsäure), alpha-Aminoadipinsäure, 2-Amino-butansäure, 4-Amino-butansäure, 3-Amino-1-Carboxymethylvalerolactam, 1-Amino-cyclopentancarbonsäure, 6-Amino-hexansäure, 2-Amino-heptandisäure, 7-Amino-heptansäure, 2-Amino-isobutansäure, Aminomethylpyrrolcarbonsäure, 8-Amino-3,6-dioxa-octansäure, Aminopiperidincarbonsäure, Aminoserin, Aminotetrahydropyran-4-carbonsäure, Azetidincarbonsäure, Benzothiazolylalanin, Butylglycin, Carnitin, 4-Chlorophenylalanin, Citrullin, Cyclohexylalanin, Cyclohexylstatin, 2,4-Diamino-butansäure, 2,3-Diamino-propionsäure, Dihydroxyphenylalanin, Dimethylthiazolidincarbonsäure, 4-Guanyl-phenylalanin, Homoarginin, Homocitrullin, Homocystein, Homophenylalanin, Homoprolin, Homoserin, 4-Hydrazin-benzoesäure, 4-Hydroxyprolin, Isonipecotinsäure, Methanoprolin, Norleucin, Norvalin, Ornithin, p-Aminobenzoesäure, Penicillamin, Phenylglycin, (9-Phosphoserin, Piperidinylalanin, Piperidinylglycin, Pyrrolidinylalanin, Sarkosin, Statin, Tetrahydropyranglycin, Thienylalanin, [epsilon]-N,N,N-trimethyllysin.
Die menschliche PAR-Familie umfasst PAR-1 (Genbank-Akzessionsnummer AF019616); PAR2 (Genbank-Akzessionsnummer XM--003671); PAR3 (Genbank-Akzessionsnummer NM--0041101) und PAR4 (Genbank-Akzessionsnummer NM--003950.1), deren Sequenzen hiermit durch Verweis aufgenommen werden.
PAR-1 oder Protease-aktivierter Rezeptor 1 (weitere Aliasnamen: CF2R, HTR 2, PAR1 oder TR) ist dem Fachmann auch als Thrombin-Rezeptor oder Gerinnungsfaktor-II-(Thrombin-)Rezeptor bekannt (HGNC: 35371; Entrez Gene: 21492; UniProtKB: P251163; Ensembl: ENSG000001811047). Die menschliche PAR-1-Polypeptidsequenz hat die Genbank-Akzessionsnr. NP_001983, die ebenfalls durch Verweis hier aufgenommen wird und auch in 9B wiedergegeben ist.
In der vorliegenden Offenbarung versteht sich ein Verweis auf Vertreter der PAR-Familie allgemein oder auf jedweden einzelnen Vertreter der PAR-Familie, wie etwa PAR-1, als Verweis auf alle Spleißvarianten, Mutanten (einschließlich, aber nicht begrenzt auf Deletionen, Insertionen oder Polymorphismen oder Aminosäuresubstitutionen), Isoformen und Homologa derselben.
Der Ausdruck ”Patient” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung jeden individuellen Organismus. Beispielsweise kann der Organismus ein Säugetier wie etwa ein Primat (d. h. beispielsweise ein Mensch) sein. Weiterhin kann es sich bei dem Organismus um ein domestiziertes Tier (d. h. beispielsweise Katzen, Hunde usw.), Nutzvieh (d. h. beispielsweise Rinder, Pferde, Schweine, Schafe, Ziegen usw.) oder ein Labortier (d. h. beispielsweise Maus, Kaninchen, Ratte, Meerschweinchen usw.) handeln.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet ”Plättchenaktivierung” die Serie von Veränderungen der Plättchenfunktion, die letztlich zu Plättchenaggregation und zur Bildung eines stabilen hämostatischen Verschlusses oder ”Thrombus” führt. Die Plättchenaktivierung kann durch eine Gefäßverletzung ausgelöst werden, beispielsweise infolge der Ruptur von atherosklerotischer Plaque. Die anschließende Exponierung von zirkulierenden Plättchen gegenüber dem subendothelialen Gewebe und verschiedenen Plättchenaktivierungs-Molekülen wie etwa Kollagen, Thromboxan oder ADP leitet eine Kette von Ereignissen ein, die eine Veränderung der Plättchen-Stoffwechselbiochemie, -form, der Oberflächenrezeptoren, der Membran-Phospholipidorientierung und der Thrombusbildung hervorrufen.
Die Formulierung ”pharmazeutisch akzeptabel” wird vorliegend zur Bezeichnung solcher Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Darreichungsformen verwendet, die im Rahmen einer fundierten medizinischen Beurteilung, bei angemessenem Nutzen/Risiko-Verhältnis, zur Verwendung in Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen geeignet sind.
Gemäß der vorliegenden Verwendung sind ”Pepducin-Lipopeptide” zellpenetrierende Peptide, die als intrazelluläre Inhibitoren einer Signalübertragung von Rezeptoren an G-Proteine wirken. Pepducin-Lipopeptide nutzen lipidierte Fragmente von intrazellulären G-Protein-gekoppelten Rezeptorschleifen zum Modulieren der GPCR-Wirkung in den Signalisierungswegen angezielter Zellen. Ein Pepducin-Lipopeptid-Molekül umfasst ein kurzes Peptid, abgeleitet von einer intrazellulären GPCR-Schleife, angebunden an einen hydrophoben Anteil. Diese Struktur ermöglicht Pepducin-Lipopeptiden eine Verankerung in der Zellmembran-Lipid-Doppelschicht und ein Abzielen auf die GPCR/G-Protein-Grenzfläche über einen einmaligen intrazellulären, allosterischen Mechanismus. Beispiele für Pepducin-Lipopeptide sind in der US-Patentveröffentlichung US2007/0179090 beschrieben, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit durch Verweis aufgenommen wird.
Gemäß der vorliegenden Verwendung schließt der Ausdruck ”Peptid” oder ”Polypeptid” sowohl ein einzelnes ”Polypeptid” als auch mehrere ”Polypeptide” ein und bezeichnet ein Molekül, das aus Monomeren (Aminosäuren) zusammengesetzt ist, die durch Amidbindungen (auch als Peptidbindungen bekannt) linear verbunden sind. Der Ausdruck ”Polypeptid” bezeichnet jede Kette oder Ketten aus zwei oder mehr Aminosäuren und bezeichnet keine spezifische Länge des Produktes. Ein ”Peptid” oder ”Polypeptid” kann gemäß der vorliegenden Verwendung aus einer natürlichen biologischen Quelle abgeleitet sein oder durch rekombinatorische Technik erzeugt sein, ist jedoch nicht unbedingt aus einer ihm zugeordneten Nukleinsäuresequenz translatiert. Es kann auf jede Weise generiert sein, einschließlich durch chemische Synthese. Entsprechend dieser Definition kann ein in der vorliegenden Erfindung verwendetes ”Peptid” oder ”Polypeptid” eine Größe von circa 3 oder mehr, circa 5 oder mehr, circa 10 oder mehr, circa 20 oder mehr, circa 25 oder mehr, circa 50 oder mehr, circa 75 oder mehr, circa 100 oder mehr, circa 200 oder mehr, circa 500 oder mehr, circa 1.000 oder mehr oder circa 2.000 oder mehr Aminosäuren haben. Eine oder mehr der Aminosäuren in einem erfindungsgemäßen Polypeptid können modifiziert sein, beispielsweise durch die Hinzufügung einer chemischen Einheit wie etwa einer Kohlehydratgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Farnesylgruppe, einer Isofarnesylgruppe, einer Fettsäuregruppe, einer Acylgruppe (z. B. Acetylgruppe), eines Linkers zur Konjugation, Funktionalisierung oder andere bekannte schützende/blockerende Gruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform ergeben die Modifikationen des Peptids ein stabileres Peptid (z. B. eine längere Halbwertzeit in vivo).
Ein ”Peptid” oder ”Polypeptid” können gemäß der vorliegenden Verwendung Fragmente, Derivate, Analoga oder Varianten der vorgenannten Polypeptide sowie jede Kombination daraus sein. Fragmente von Polypeptiden umfassen gemäß der vorliegenden Verwendung dieses Ausdrucks oder dieser Formulierung proteolytische Fragmente wie auch Deletionsfragmente. Varianten von Polypeptiden, die entsprechend der vorliegenden Erfindung sinnvoll sind, umfassen Fragmente und Polypeptide mit veränderten Aminosäuresequenzen aufgrund von Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen. Varianten können natürlich auftreten oder nicht-natürlich auftreten. Nicht-natürlich auftretende Varianten können durch in der Technik bekannte Mutagenesetechniken erzeugt sein. Beispiele sind unter anderem Fusionsproteine, Polypeptide mit einem oder mehr Resten, die durch Reaktion einer funktionalen Seitengruppe chemisch derivatisiert sind, und Peptide, die ein oder mehr natürlich auftretende Aminosäurederivate der zwanzig Standard-Aminosäuren enthalten. Diese Modifikationen können auch eine Zyklisierung des Peptids, die Inkorporation von D-Aminosäuren oder anderen nicht-kodierten Aminosäuren umfassen. Keine der Modifikationen sollte die gewünschte biologische Aktivität des Peptids wesentlich behindern.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet eine ”Reduzierung der Größe von atherosklerotischer Plaque” die Größenreduzierung der atherosklerotischen Plaque infolge einer Behandlung mit einem Antagonisten des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungsweges gegenüber der Größe der atherosklerotischen Plaque vor Beginn der Behandlung. Die atherosklerotische Plaque ist in der Größe reduziert, wenn die Reduzierung gegenüber der Größe der atherosklerotischen Plaque vor Beginn der Behandlung mindestens oder mindestens circa 5%, circa 10%, circa 15%, circa 20%, circa 25%, circa 30%, circa 35%, circa 40%, circa 45%, circa 50%, circa 55%, circa 60%, circa 65%, circa 70%, circa 75%, circa 80%, circa 85%, circa 90%, circa 95%, circa 96%, circa 97%, circa 98%, circa 99%, circa 100%, circa 200%, circa 500% oder mehr beträgt.
Gemäß der vorliegenden Verwendung umfassen ”Risikofaktoren” für eine Venenthromboembolie, jedoch nicht ausschließlich, Krebs, frühere VTE (DVT/PE), Hyperkoagulabilität (genetische Prädisposition zu Blutgerinnseln), chirurgische Eingriffe, fortgeschrittenes Alter (> 70 Jahre), Fettleibigkeit (BMI > 29), Bettruhe oder längere Immobilität und orale Verhütungsmittel oder Hormonersatztherapie.
”Risikofaktoren” für Myokardinfarkt, Schlaganfall oder PAD (periphere arterielle Erkrankung) umfassen gemäß der vorliegenden Verwendung, jedoch nicht ausschließlich, hohen Blutdruck, Diabetes, hohen Cholesterinspiegel (einschließlich genetischer Prädisposition zu Hypercholesterämie), Alter (das Risiko verdoppelt sich mit jedem Jahrzehnt ab einem Alter von 55 Jahren), familiäre Vorbelastung mit Schlaganfall, Rauchen, orale Verhütungsmittel, Vorhofflimmern, Herzinsuffizienz, übermäßigen Alkoholgenuss, früheren Schlaganfall oder Herzanfall, Rassenzugehörigkeit (beispielsweise haben Afroamerikaner verglichen mit Kaukasiern nahezu das zweifache Risiko eines ersten Schlaganfalls) und Geschlecht (in den USA erleiden jedes Jahr circa 46.000 mehr Frauen als Männer einen Schlaganfall).
In weiteren Ausführungsformen bezeichnen ”Risikofaktoren” für eine Thrombose auch solche Risiken, die durch die Implantation einer Prothese im Körper entstehen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, künstliche Herzen, Lungen sowie Stents oder andere medizinische Vorrichtungen.
Der Ausdruck ”Kleinmolekül” und analoge Ausdrücke umfassen gemäß der vorliegenden Verwendung, jedoch nicht ausschließlich, Peptide, Peptidomimetika, Aminosäuren, Aminosäure-Analoga, Polynukleotide, Polynukleotid-Analoga, Nukleotide, Nukleotid-Analoga, andere organische und anorganische Verbindungen (d. h. einschließlich heteroorganischer und organometallischer Verbindungen) mit einem Molekulargewicht von weniger als circa 10.000 Gramm pro Mol. In einigen Ausführungsformen bezeichnet der Ausdruck organische oder anorganische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als circa 5.000 Gramm pro Mol, weniger als circa 1.000 Gramm pro Mol, weniger als circa 500 Gramm pro Mol, weniger als circa 100 Gramm pro Mol. Salze, Ester und andere pharmazeutisch akzeptable Formen solcher Verbindungen sind ebenfalls mit eingeschlossen.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnen ”thrombolytische Arzneimittel” Arzneimittel, die in Medikamenten zum Auflösen von Blutgerinnseln in einer Prozedur verwendet werden, die man als Thrombolyse bezeichnet. Nicht-einschränkende Beispiele für thrombolytische Arzneimittel umfassen #-Gewebe-Plasminogenaktivator – t-PA – Alteplase (Activase), Reteplase (Retavase), Tenekteplase (TNKase), Anistreplase (Eminase), Streptokinase (Kabikinase, Streptase) und Urokinase (Abbokinase).
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet ein ”thrombotischer Erkrankungszustand” jeden medizinischen Zustand bei einem Patienten, der zu Thrombose, d. h. der Bildung eines Blutgerinnsels oder ”Thrombus” in einem Blutgefäß führen kann, wodurch der Blutfluss durch das zirkulatorische System behindert werden kann. Es gibt zwei unterschiedliche Formen von Thrombose: Venen- und Arterienthrombose. Beispiele für Venenthrombose sind die venöse Thromboembolie (VTE), die tiefe Venenthrombose (DVT) und Lungenembolie (PE) umfasst, und das Thoracic-Outlet-Syndrom. Beispiele für Arterienthrombose sind Schlaganfall, Herzanfall und periphere arterielle Erkrankung. Weitere Beispiele für eine thromboembolische Störung umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, instabile Angina, ein akutes Koronarsyndrom, Vorhofflimmern, ersten Myokardinfarkt, rezidivierenden Myokardinfarkt, ischämischen plötzlichen Heztod, transitorische ischämische Attacke, Schlaganfall, Atherosklerose, periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAD), Venenthrombose, tiefe Venenthrombose, Thrombophlebitis, arterielle Embolie, Koronararterienthrombose, cerebrale Arterienthrombose, cerebrale Embolie, Nierenembolie, Lungenembolie, thrombotische Reokklusion nach einem koronaren Eingriff, Herzoperation oder Gefäßoperation und Thrombose als Resultat medizinischer Implantate, Vorrichtungen oder Prozeduren, bei denen Blut einer Thrombose fördernden künstlichen Oberfläche ausgesetzt wird. Der ”thrombotische Erkrankungszustand” bezeichnet auch Herz-Kreislauf-Erkrankungen infolge von Systemerkrankungen einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Diabetes mellitus, Syndrom X (metabolisches Syndrom) oder Krebs.
Der Ausdruck ”therapeutisch wirksame Menge” bedeutet gemäß der vorliegenden Verwendung diejenige Menge einer aktiven Verbindung oder eines pharmazeutischen ”Wirkstoffs”, welche die biologische oder medizinische Antwort in einem Gewebe, System, Tier oder Menschen hervorruft, welche von einem Forscher, Tierarzt, Humanarzt oder anderem Kliniker gewünscht wird.
Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnet ”Thrombin-abhängige Aktivierung von PAR-1” die Aktivierung einer PAR-1-Signalisierung durch eine Serinprotease (wie etwa Thrombin oder Plasmin oder APC), die den N-Terminus von PAR-1 zwischen dem Argininrest an Position 41 und dem Serinrest an Position 42 spaltet.
Gemäß der vorliegenden Verwendung schließen ”Behandeln” oder ”Behandlung” die Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustands bei einem Säugetier, insbesondere bei einem Menschen ein und umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf: (a) das Verhindern des Auftretens des Erkrankungszustandes bei einem Säugetier, insbesondere wenn das Säugetier für den Erkrankungszustand prädisponiert ist, jedoch noch nicht mit demselben diagnostiziert wurde; (b) Inhibieren des Erkrankungszustandes, d. h. Anhalten seiner Entwicklung; und/oder (c) Lindern des Erkrankungszustandes, d. h. Bewirken eines Zurückgehens des Erkrankungszustandes.
Der Ausdruck ”Behandeln eines thrombotischen Erkrankungszustandes” bezeichnet gemäß der vorliegenden Verwendung ein Modulieren der Plättchenaggregation einschließlich, aber nicht begrenzt auf eine Reduzierung der Menge der Plättchenaggregation und/oder Verlangsamen der Plättchenaggregation sowie eine vollständige Eliminierung und/oder Verhinderung der Plättchenaggregation. Durch Modulieren der Plättchenaggregation behandelbare Erkrankungen und/oder Zustände umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Embolusbildung, thrombolytische Komplikationen, Thrombose, koronare Herzkrankheit, thromboembolische Komplikationen, Myokardinfarkt, Restenose, atriale Thrombose, Induktion von Vorhofflimmern, chronische instabile Angina, transitorische ischämische Attacken und Schlaganfälle, periphere Gefäßerkrankung, Arterienthrombose, Präeklampsie, Embolie, Restenose und/oder Thrombose nach Angioplastie, Karotisendarteriektomie, Anastomose von Gefäßtransplantaten sowie chronische Exponierung gegenüber kardiovaskulären Vorrichtungen. Solche Zustände können auch aus einer Thromboembolie und Reokklusion während und nach thrombolytischer Therapie, nach Angioplastie und nach Koronararterienbypass resultieren.
I DER MMP1-PAR-1-SIGNALISIERUNGSWEG
I-(A) KOLLAGEN GENERIERT AKTIVE MMP-1 AUF PLÄTTCHEN, DIE DEN PAR-1 SPALTET
Menschliche Plättchen weisen signifikante Mengen von Kollagenaseaktivität auf, die bei Exponierung gegenüber verschiedenen Agonisten freigesetzt werden könnte. Die hauptsächliche Plättchen-Kollagenase MMP-1 kann in der Lage sein, die aggregatorische Antwort auf andere Agonisten vorzubereiten und eine Redistribution der β₃-Integrine zu der Zellperipherie zu bewirken. Zur Bestimmung dessen, ob die proaggregatorischen Wirkungen von Plättchen-MMP-1 durch den PAR1-Rezeptor mediiert werden, wurde die Menge der In-situ-Aktivierung von endogenem proMMP-1 auf der Plättchenoberfläche nach Stimulation mit dem primären Agonisten Kollagen gegenüber den sekundären Mediatoren ADP und Thromboxan gemessen.
Die Plättchen-Pellets und ihre Überstände wurden folgendermaßen präpariert. Die institutionelle Prüfungskommission am Tufts Medical Center führte an 20 gesunden freiwilligen Spendern eine Phlebotomie entsprechend dem üblichen Einwilligungsverfahren nach erfolgter Aufklärung durch. Es wurden 27 ml Blut mit einer Nadel der Stärke 18, befestigt an einer 30cc-Spritze mit 3 ml 3,2% Natriumcitratlösung (0,32% v/v final) entnommen. Plättchen aus plättchenreichem Plasma (PRP) wurden isoliert durch Gelfiltration mit einer Sepharose 2B (Pharmacia) in modifiziertem PIPES-Puffer (25 mM PIPES, 137 mM NaCl, 4 mM KCl, 0,1% Glucose, pH 6,6) bei Vorhandensein von 1 mM EDTA und 0,1 U/ml Apyrase. Alternativ wurde Vollblut von Meerschweinchen von Hartley Sprague (entnommen aus der Hohlvene) in 3% Citrat plus 10 U/ml Heparin gewonnen. Gewaschene Plättchen aus den Meerschweinchen wurden in PIPES-Puffer präpariert. Die Plättchenaggregation wurde mit einem Aggregometer Chronolog 560VS/490-2D unter Verwendung von modifiziertem PIPES-Puffer als Leerprobe gemessen. Die Proben wurden vor dem Zusatz eines Agonisten 5 min lang bei Vorhandensein von Inhibitoren und 1,8 mM CaCl₂ inkubiert. Alle Reaktionen erfolgten in finalen Volumina von 250 μl bei 37°C unter Rühren mit 900 UpM.
Sodann wurde die enzymatische Aktivität von aktivem MMP-1 in Überständen und Plättchenlysaten bestimmt. Menschliche oder Meerschweinchen-Plättchen aus PRP wurden durch Zentrifugieren mit 700 g für 25 min bei Raumtemperatur vierfach konzentriert und dann in 0,25 Volumen PIPES, enthaltend 1 mM EDTA, resuspendiert (die finale Plättchenzahl betrug 10⁹/mL). Die Plättchen wurden mit PBS (Puffer), 20 μM ADP, 20 μM U-46619 oder 20 μg/ml Kollagen bei Vorhandensein von 2,5 mM CaCl₂ behandelt. Die Plättchen wurden für 15 min bei 37°C unter gelegentlichem schonendem Mischen inkubiert. Die Plättchen wurden durch Zentrifugieren mit 10.000 g für 5 min bei 4°C gesammelt und in Lysepuffer resuspendiert (50 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 1 mM NaF, 5 mM EDTA, 0,1% (v/v) Triton X-100, 100 μM PMSF, pH 7,4) und dann mit einer Nadel der Stärke 27 geschert.
Die Messung der enzymatischen Aktivität von aktiver MMP-1 in Überständen und Plättchenlysaten erfolgte mithilfe von DQ-Kollagen I (Molecular Probes) als fluorogenem Substrat und Reporter für Kollagenase-Aktivität-Substrat (Boire et al., 2005) bei Vorhandensein oder Fehlen von 3 μM FN-439 oder jeweils 20 μg/ml Kontroll-IgG, MMP-1 blockierendem Antikörper, MMP-8 blockierendem Antikörper oder MMP-13 blockierendem Antikörper (2 h bei 37°C präinkubiert), wie angegeben mit APMA-aktivierter MMP-1 als Kontrolle (1A, gestreifte Balken). Eine mit APMA-aktivierter MMP-1 (Boire et al., 2005) und Kollagenaseaktivität generierte Standardkurve wurde in Einheiten pro Milliliter angegeben, wobei eine Einheit die Menge MMP-1 ist, die 1 μg Kollagen pro Minute abgebaut wird.
Die Stimulation von Plättchen mit Kollagen führt zur Freisetzung der Plättchen-Kollagenaseaktivität in den Überstand (1A). Der MMP-1-Inhibitor FN-439 blockierte die Spaltung des fluorogenen Kollagensubstrats vollständig. Blockierende Antikörper gegen MMP-1 inhibierten die durch Kollagen freigesetzte Plättchen-Kollagenaseaktivität ebenfalls vollständig, wohingegen blockierende Antikörper gegen die beiden anderen Kollagenasen, MMP-8 und MMP-13, oder eine IgG-Kontrolle keine Wirkung hatten. Dagegen hatte eine Stimulation von gelfiltrierten Plättchen mit ADP oder dem Thromboxanmimetikum U-46619 zum Ergebnis, dass ein überwiegender Teil der MMP-1-Kollagenaseaktivität an die Plättchen gebunden blieb.
Pellets und Überstände wurden durch Zentrifugieren des Lysats mit 12.000 g für 2 min aus Plättchen (250.000/μL) gesammelt, die mit den Agonisten, wie oben und in 1A beschrieben, oder mit Convulxin (1 μg/ml) stimuliert waren. Sodann wurde die Konzentration der freigesetzten und Plättchen-assoziierten MMP-1-Prodomänen durch ELISA mithilfe von Antikörpern gemessen, die die Prodomäne von MMP-1 (1B) erkannten. Eine Behandlung von gewaschenen Plättchen mit Kollagen, jedoch nicht ADP oder U-46619, führte zu einer effizienten Freisetzung der proMMP-1-Domäne (und/oder proMMP-1).
Sodann wurde die Oberflächenexpression der Gesamt-Plättchen-MMP-1 durch Durchflusszytometrie bestimmt (1C; grau gestrichelt: sekundäre Antikörper allein; durchgezogene Linien: FACS-Profile von Plättchen, die mit den angegebenen Konzentrationen von Kollagen für 15 min bei 37°C behandelt und dann mit primären (AB806) plus sekundären Antikörpern angefärbt wurden). Eine FACS-Analyse bestätigte, dass MMP-1 auf der Oberfläche von ruhenden Plättchen exprimiert wird, die durch Exponierung gegenüber Kollagen freigesetzt werden könnten. Das Lektin, Convulxin, das spezifisch mit dem GPVI/FcγR-Kollagenrezeptor ligandiert, bewirkte ebenfalls eine vollständige Freisetzung der proMMP-1-Domäne von der Plättchenoberfläche (1B). Somit sind Kollagenfibrillen zur Freisetzung von pro-MMP-1 von der Plättchenoberfläche per se nicht notwendig. Auch andere starke Plättchen-Agonisten können den Freisetzungsmechanismus auslösen.
(Eine) in Frage kommende Bindungsstelle(n) für das Plättchen-assoziierte proMMP-1 ist der a₂β₁-Kollagenrezeptor. Zur Bestimmung dessen, ob proMMP-1 sich mit Integrinen in ruhenden menschlichen Plättchen assoziiert, wurden Lysate aus gelfiltrierten Plättchen mit 4–5 μg/ml Anti-α₂ (Gi9 oder AK7), (β₁ (MAB1987), (β₃ (MAB1957), GPVI (SC20149), GPIBα (MM2/174) oder Maus-IgG-Kontrolle für 2–4 h bei 4°C inkubiert. Protein-G-Sepharose wurde zugesetzt und eine weitere Stunde inkubiert. Beads wurden gesammelt und 4-mal in mit 200 mM NaCl ergänztem Lysepuffer inkubiert. Plättchen-Proteine aus den Lysaten wurden durch 12% SDS-PAGE getrennt, und es wurden Western-Blot-Analysen mit einem polyklonalen Antikörper gegen den C-Terminus von MMP-1 (AB8105) oder die Gelenkregion (AB806) durchgeführt, wodurch ähnliche Ergebnisse erzielt wurden. Diese Co-Immunpräzipitationsversuche zeigen an, dass proMMP-1 einen stabilen Komplex mit dem α₂β₁-Integrin auf Plättchen bildet (siehe 1D). Außerdem wurde festgestellt, dass MMP-1 (vorwiegend in der Pro-Form) sich mit dem α_IIbβ₃-Integrin assoziiert, wie durch die bereits beschriebenen konfokalmikroskopischen Untersuchungen nahegelegt. Umgekehrt assoziierte sich proMMP-1 nicht mit GPIbα oder GPVI. Eine Präassoziation von proMMP-1 mit sowohl Kollagen- als auch Fibrinogen-Rezeptoren in ruhenden Plättchen ist daher wahrscheinlich.
Zum genaueren Verständnis dessen, wie Kollagen in der Lage ist, signifikante Mengen endogener MMP-1 Kollagenaseaktivität auf der Oberfläche von Plättchen zu aktivieren, wurden Versuche zur Bestimmung dessen entwickelt, ob PAR-1 nach der Exponierung gegenüber Kollagen auf autokrine oder parakrine Weise gespalten wird. Mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen die amino-terminale Thrombin-Spaltungspeptidregion von PAR1, Reste 32–46 erhöht war (Loew et al., 200), wurden die relativen Fähigkeiten von Thrombin, MMP-1 und Kollagen, eine Spaltung von Plättchen-PAR1 zu bewirken, beurteilt. Gelfiltrierte Plättchen wurden für 10 min mit Thrombin (3 nM), MMP-1 (3 nM), Kollagen (5 μg/ml), bei Vorhandensein oder Fehlen (PBS-Puffer) von 0,00013 U Hirudin oder 5 μM FN-439 bei 37°C behandelt. Überstände wurden 20-fach konzentriert, auf Nitrocellulose-Membranen aufgebracht und dann mit dem monoklonalen IIaR-A Antikörper untersucht. Das PAR1-N-terminale Thrombin-Spaltungspeptid (A₂₆-R₄₁) und das flexible PAR1-Linkerpeptid (N-Acetyl-T₆₇L₈₄-C) (Kuliopulos et al., 1999) dienten als positive bzw. negative Kontrolle (100 ng). Wie in 1E gezeigt, konnte durch Inkubation der Plättchen mit Thrombin oder MMP-1 eine Freisetzung des N-terminalen Spaltungspeptids von PAR1 in den Überstand bewirkt werden, was durch Hirudin bzw. FN-439 blockiert wurde.
Zur Bestimmung dessen, ob MMP-3 und MMP-7 die Freisetzung des PAR1-N-terminalen Peptids bewirken konnte, wurden gelfiltrierte menschliche Plättchen für 10 min mit APMA-Dialysatpuffer oder APMA-aktivierter MMP-3 (Chemicon, 3 nM), MMP-7 (Chemicon, 3 nM) oder MMP-1 (Biomol, 3 nM) behandelt. Plättchen-Pellets und Überstand wurden wie oben beschrieben getrennt. Die Überstände wurden 20-fach konzentriert, auf Nitrocellulose-Membranen aufgebracht und dann mit dem monoklonalen IIaR-A-Antikörper untersucht, um gespaltenes PAR-1-Peptid zu detektieren. Wie in 1F gezeigt, waren MMP-3 und MMP-7 nicht fähig, eine Freisetzung des PAR1-N-terminalen Peptids aus den behandelten Plättchen zu bewirken (1F).
Zur Demonstration der Rolle von MMP-1 wurden gelfiltrierte Plättchen mit IgG (20 μg/ml) oder MMP-1 blockierendem Antikörper (20 μg/ml) für 2 Stunden bei 37°C präinkubiert. Diese Plättchen wurden dann für 10 min. bei 37°C mit Kollagen (5 μg/ml) stimuliert. Die Überstände wurden 20-fach konzentriert, auf Nitrocellulose-Membranen aufgebracht und dann mit dem monoklonalen IIaR-A-Antikörper untersucht. Wie in 1G gezeigt, führte die Behandlung der ruhenden Plättchen mit Kollagen zur Freisetzung des N-terminalen Peptids. Diese Freisetzung wurde durch Inkubation mit dem MMP-1-Inhibitor FN-439 oder einem MMP1-blockierenden Antikörper (20 μg/ml) spezifisch blockiert, jedoch nicht durch Thrombin-Inhibitor, Hirudin (siehe 1E, 1G).
Eine Behandlung der gelfiltrierten Plättchen mit unterschiedlichen Konzentrationen von ADP (0,3–30 nM), U46619 (0,3–30 nM) für 10 min bei 37°C, gefolgt von einer Inkubation mit Kollagen (5 μg/ml) für 10 min bei 37°C, zeigte, dass ADP und U-46619 ebenfalls fähig waren, die Freisetzung des N-terminalen Peptids von PAR1 zu bewirken, wenn auch mit niedrigerem Wirkungsgrad (siehe 1H).
Dagegen vermochte eine Behandlung der gelfiltrierten Plättchen für 10 min mit Kollagen (5 μg/ml), bei Vorhandensein oder Fehlen (PBS-Puffer) von ARC (0,5 μM) oder Aspirin (ASA, 1 mM, 30 min Präinkubation) bei 37°C, das PAR1-N-terminale Peptid nicht freizusetzen (siehe 1I). Daher hatte ein Blockierung entweder des P2Y12-ADP-Rezeptors mit AR-C69931MX (ARC) oder von Thromboxan mit Aspirin (ASA) keine Wirkung auf die kollagenabhängige Freisetzung des PAR1-N-terminalen Peptids (siehe 1I).
Zusammen liefern diese Daten einen direkten Nachweis dafür, dass die endogen generierte MMP-1-Kollagenaseaktivität zum Spalten von PAR1 auf der Oberfläche menschlicher Plättchen unabhängig von Thrombin fähig ist.
I-(B) IDENTIFIKATION DER MMP-1-SPALTSTELLE AUF PAR1
Mehrere Studien haben gezeigt, dass Serinproteasen wie etwa Thrombin, Plasmin und APC PAR1 an LDPR₄₁↓S₄₂FL (P4P3P2P1↓P1'P2'P3') direkt hydrolysieren, um den S₄₂FLLRN-angebundenen Liganden (TRAP) zu generieren, der PAR1 in einem intramolekularen Modus aktiviert (Kuliopulos et al., 1999; Loew et al., 2000; Parry et al., 1996; Seeley et al., 2003; Vu et al., 1991). Matrix-Metalloproteasen wie etwa MMP-1 präferieren jedoch generell eine hydrophobe Aminosäure an der Stelle P1', eine basische oder hydrophobe Aminosäure an P2' und einen kleinen Rest (Alanin, Glycin oder Serin) an P3' (Netzel-Arnett et al., 1991; Turk et al., 2001). Daher spaltet MMP-1 unter Umständen an der Thrombin-Stelle R₄₁↓S₄₂FL nicht effizient. Zur Bestimmung der MMP-1-Spaltstelle wurde ein 26-Aminosäure-Peptid (TR26, PAR1-Reste 36–61) entsprechend der N-terminalen Domäne von PAR1 synthetisiert (2A–B). Die synthetischen 26mer-Peptide, welche die Thrombin-Spaltstellenregion und flankierende Region TR26 (A₃₆-S₆₁) oder TR26-P40N (A₃₆-K₆₁) umgeben, wurden mit 10 nM Thrombin, 10 nM MMP-1 (APMA-aktiviert, aus menschlichen Fibroblasten gereinigt) oder PBS-Puffer für 10 min bei 37°C inkubiert. Peptid-Spaltungs-Gemische wurden durch RP-HPLC getrennt und Spaltungsprodukte durch MALDI-Massenspektrometrie getrennt, wie beschrieben (Kuliopulos 1999). Eine Inkubation des TR26-Peptids mit Thrombin ergab laut Bestimmung durch Massenspektrometrie das erwartete Spaltungspeptid TR20 (Reste 42–61). Eine Inkubation des TR26-Peptids mit MMP-1 ergab dagegen TR22, was den PAR1-Resten 40–61 entspricht (2A–B). Dies zeigt an, dass MMP-1 die PAR1-Exodomäne an LD₃₉↓P₄₀RSFL spaltet, an einer Stelle, die sich 2-Aminosäurereste auf der N-terminalen Seite der Thrombin-Spaltstelle bei R₄₁-S₄₂ befindet.
Um den Ort dieser mutmaßlichen MMP-1-Spaltstelle in der vollen Länge des Rezeptors zu verifizieren, wurden die kritischen P1'-Reste von MMP-1 wie auch Thrombin-Spaltstellen mutiert.
Zur Inhibierung einer Spaltung durch MMP-1 wurde das vermutete P1'-Prolin durch Asparagin (P40N PAR1) ersetzt, eine Substitution, von der bereits nachgewiesen wurde, dass sie die Spaltung eines α1-Kollagen-Peptids auf weniger als 10% reduziert (Berman et al., 1992). Um eine Proteolyse durch Thrombin zu inhibieren, wurde das P1'-Serin der Thrombin-Spaltstelle zu Aspartat mutiert (S42D PAR1), eine Mutation, von der eine Unterdrückung der Spaltung durch Thrombin erwartet wurde (Chang, 1985). Menschliches PAR1 wurde in pcDEF3 geklont, wie bereits beschrieben (Kuliopulos et al., 1999) und wurde zum Generieren aller Mutanten verwendet. Die PAR1-Mutanten P40N und S42D wurden mit dem Quick-Change-Kit für ortsspezifische Mutagenese (Stratagene) generiert und sequenziert, um die Korrektheit der Mutagenese zu verifizieren. Sodann wurden die Wirkungen dieser Mutationen auf die Spaltungsraten eines mit T7-Tag markierten Rezeptors gemessen.
In 2D wurden COS7-Zellen, die transitorisch mit T7-Tag-markiertem WT, P40N oder S42D-PAR1 transfiziert waren, für 30 min bei 37°C in PBS mit 0,3–30 nM Thrombin (2C) oder APMA-aktivierter MMP-1 inkubiert.
In 2G wurden COS7-Zellen, die transitorisch mit T7-Tag-markiertem WT, P40N oder S42D-PAR1 transfiziert waren, für 30 min bei 37°C in PBS mit 0,3–10 nM APMA-aktivierter MMP-1 inkubiert (Biomol, Kat.-Nr. SE 361).
In 2H–2J wurden COS7-Zellen, die transitorisch mit T7-Tag-markiertem PAR-2, PAR-3 und PAR-4 transfiziert waren, für 60 min bei 37°C in PBS mit 0,3–10 nM Thrombin (für PAR3 oder PAR4) oder 0,3–10 nM Trypsin (für PAR2) oder APMA-aktiviertem MMP-1 inkubiert. Der Verlust an T7-Epitop wurde durch Durchflusszytometrie analysiert, wie bereits beschrieben (Boire et al., 2005; Kuliopulos et al., 1999).
Die Resultate zeigen, dass die P40N-PAR1-Mutante durch Thrombin vollständig gespalten wurde, jedoch durch MMP-1 nur schlecht gespalten wurde, wobei zwei unabhängige Quellen für MMP-1 verwendet wurden (2C–D, 2G). Umgekehrt wurde die S42D-PAR1-Mutante durch MMP-1 wesentlich gespalten, wurde jedoch durch Thrombin nur schlecht gespalten. Identische Ergebnisse zeigten sich bei der Spaltung eines mutierten TR26-P40N-Peptids, das durch Thrombin an der Bindung R₄₁-S₄₂ gespalten wurde, durch MMP-1 jedoch nicht gespalten wurde (2A). Die relativen Spaltungsspezifitäten der P40N- und S42D-Mutanten wurden für Thrombin und MMP-1 durch Funktionsuntersuchungen validiert.
Sodann wurde das Niveau der RhoA-Signalisierung der unterschiedlichen PAR-1-Mutanten bei Vorhandensein von Thrombin oder MMP-1 gemessen (siehe 2E). MCF-7-Zellen, für 48 h transitorisch mit T7-Tag-markiertem WT, S42D oder P40N-PAR1 transfiziert, wurden mit 10 nM Thrombin, 10 nM MMP-1 oder PBS-Puffer für 15 min bei 37°C stimuliert. In den Plättchenlysaten vorhandenes Rho-GTP (Mittelwert +/– Standardabweichung, n = 3) wurde mit Glutathion-S-Transferase-(GST)-Rhotekin-reduzierten Glutathion-Agarose-Beads präzipitiert, wie beschrieben (Kaneider et al., 2007), und das Rho-GTP wurde durch Untersuchung der Western-Blots mit monoklonalem Anti-RhoA-Antikörper (26C4 Ab) bestimmt. Plättchenlysate wurden auf einem separaten Gel ebenfalls untersucht und einem Immunblot mit Anti-RhoA unterzogen, um das Gesamt-RhoA zu beurteilen.
Wie in 2F gezeigt, wurde auch die chemotaktische Wanderung von MCF-7-Zellen beurteilt, die Thrombin und MMP1-Spaltstellen-Mutanten exprimieren. Mit den PAR1-Spaltungs-Mutanten transfizierte MCF-7-Zellen wurden in einer Transwell-Vorrichtung (8-μm-Poren) über Nacht in Richtung DMEM/0,1% BSA (Puffer) plus 3 nM Thrombin oder 3 nM MMP-1 wandern gelassen. Zellen, die zu der unteren Seite der Membran wanderten, wurden gezählt und in % relativ zu WT PAR1 und Thrombin ausgedrückt.
Thrombin ist fähig zur vollen Aktivierung von Rho-Signalisierung und chemotaktischen Wanderung in MCF-7-Zellen, die die P40N-Mutante exprimieren, zeigte jedoch im Wesentlichen keine Aktivität in Richtung der S42D-Mutante (2E–F). Umgekehrt war MMP-1 fähig zum Induzieren von Rho-Signalisierung und Chemotaxe in MCF-7-Zellen, die die S42D-Mutante exprimieren, zeigte jedoch wenig Aktivität in Richtung der P40N-Mutante. Demgegenüber waren 0,3–10 nM MMP-1 nicht fähig zu einer detektierbaren Spaltung von auf COS7-Zellen exprimierter, T7-Tag-markierter PAR2, PAR3, oder PAR4 (2H–2J). Zusammen zeigen diese Spaltungs- und Signalisierungsdaten an, dass MMP-1 durch Spalten bei L_D39↓_P40RSFL anstelle der LDP_R41↓_S42FL-Thrombin-Spaltstelle PAR1 spezifisch aktiviert und die anderen PAR nicht spaltet.
I-(C) AKTIVIERUNG VON PAR1-SIGNALISIERUNG MIT DEM MMP1-GENERIERTEN ANGEBUNDENEN LIGANDEN
Die MMP-1-Spaltung von PAR1 bei LD↓P₄₀RS generiert einen längeren angebundenen Liganden, P₄₀RSFLLRN–, als den durch Thrombin erzeugten. Zum weiteren Nachweis dessen, dass ein MMP1-generierter angebundener Ligand PAR1 aktivieren konnte, wurde die Fähigkeit des synthetischen Peptids, PR-SFLLRN (PR-TRAP), zum Stimulieren der PAR1-Signalisierung getestet.
Wie in 3A gezeigt, wurde die Wirkung des PRSFLLRN-Peptids (PR-TRAP) auf die PAR1-abhängige RhoA-Aktivierung in Plättchen gemessen. Gelfiltrierte menschliche Plättchen, ergänzt mit 0,3 mg/mL Fibrinogen, wurden mit 0,2% DMSO-Vehikel oder 30 μM SFLLRN (TRAP), PR-TRAP oder revertiertem Peptid (RP-TRAP) für 5 min bei 37°C bei Vorhandensein oder Fehlen von 1 μM RWJ-56110, wie angegeben, behandelt. Die Plättchen wurden lysiert, und Rho-GTP sowie Gesamt-Rho wurden durch Western-Blot-Analyse quantifiziert, wie in den Versuchsprozeduren beschrieben. Die Western-Blot-Streifen wurden durch Densitometrie quantifiziert und die Ergebnisse relativ zu der Vervielfachung im Verhältnis zur Basis ausgedrückt.
In 3B wurde die Wirkung des PRSFLLRN-Peptids (PR-TRAP) auf p38 MAPK in Plättchen gemessen. Die Plättchen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von PR-TRAP, RP-TRAP oder TRAP, wie angegeben, für 5 min bei 37°C stimuliert. Die Plättchen wurden mit Laemmli-Probenpuffer lysiert und Proteine durch einen Western-Blot der p38-MAPK-Aktivität mit phosphospezifischem p38-MAPK-Antikörper oder Gesamt-p38MAPK-Antikörper beurteilt.
In 3C wurde die Fähigkeit des PRSFLLRN-Peptids (PR-TRAP) zum Induzieren einer Veränderung der Plättchenform bestimmt. Gewaschene menschliche Plättchen wurden mit 2 mM EGTA vorbehandelt und dann unter Rühren mit 1100 UpM mit den angegebenen Agonisten bei Vorhandensein oder Fehlen von 1 μM RWJ-56110 behandelt. Die Reduzierung der Lichtdurchlässigkeit zeigt die Reaktion der Plättchenformveränderung an.
Die Ergebnisse zeigen, dass PR-TRAP ein voller Agonist von PAR1-abhängiger Rho- und p38-MAPK-Signalisierung in Plättchen ist (3A–B). Die Zusetzung des PAR1-Antagonisten, RWJ-56110, blockierte die durch PR-TRAP induzierte Signalisierung vollständig. Der PR-TRAP-Ligand aktivierte auch Veränderungen der Plättchenform (siehe 3C), ein kritisches frühes Ereignis bei der Plättchenaktivierung mit Mediation durch G_12/13-Rho-Signalisierung (Huang et al., 2007; Offermanns et al., 1994). Wiederum wurde eine durch PR-TRAP induzierte Plättchenformveränderung durch den PAR1-Antagonisten RWJ-56110 vollständig blockiert (3C).
Zwei weitere Peptide wurden auf eine Agonistenaktivität getestet, die durch eine vermutete Spaltung an den flankierenden Peptidbindungen generiert würde: das R-TRAP-Peptid, entsprechend einer Spaltung bei LDP₄₀↓R₄₁SFLLRN, und das DPR-TRAP-Peptid, entsprechend einer Spaltung bei L₃₈↓D₃₉PRSFLLRN (2B). Das R-TRAP-Peptid behielt eine partielle Agonistenaktivität für eine PAR1-abhängige Plättchenformveränderung bei, wohingegen das DPR-TRAP-Peptid nahezu keine Aktivität aufwies (3C). Ebenso wurden durch das Kontroll-Peptid, RP-TRAP, bei dem die ersten beiden Aminosäurereste revertiert waren, Rho oder p38 MAPK oder eine Plättchenformveränderung nicht stimuliert (3A–C).
Die Fähigkeit von exogen zugesetztem MMP-1 zum Aktivieren von PAR1-abhängiger Signalisierung in Plättchen wurde ebenfalls bestätigt.
In 4A wurde die Wirkung von MMP-1 auf Rho-GTP in Plättchen gemessen. Gelfiltrierte menschliche Plättchen wurden gegenüber 3 nM Thrombin oder 3 nM APMA-aktivierter MMP-1, wie angegeben, für 5 min bei 37°C exponiert, und Rho-GTP sowie Gesamt-Rho wurden wie oben beschrieben bestimmt.
In 4B wurde die Fähigkeit von MMP-1 zum Induzieren einer Plättchenformveränderung bestimmt. Gewaschene menschliche Plättchen wurden mit 2 mM EGTA vorbehandelt und dann unter Rühren mit 1100 UpM mit MMP-1 bei Vorhandensein oder Fehlen von 1 μM RWJ-56110 belastet. Die Formveränderung wurde wie oben beschrieben gemessen.
In 4C wurde die Induktion von PAR1-abhängigen Calciumflüssen durch MMP-1 gemessen. Die Calciumflussmessungen an gelfiltrierten Plättchen nach einer Belastung mit MMP-1 bei Vorhandensein oder Fehlen von RWJ-56110 wurden bei 25°C mit Aufzeichnung der Emission bei 510 nm und zweifacher Anregung bei 340 und 380 nm durchgeführt, wie beschrieben (Kuliopulos, 1999).
In 4D wurde die Induktion der Plättchenaggregation durch MMP-1 bestimmt. Gelfiltrierte Plättchen wurden bei Vorhandensein oder Fehlen (0,2% DMSO-Vehikel) des PAR1-Inhibitors 1 μM RWJ-56110 mit MMP-1 belastet.
Zuletzt wurde in 4E–4F auch die durch MMP-1 induzierte Plättchen-PAR1-abhängige MAPK-Signalisierung gemessen. Gelfiltrierte Plättchen wurden für 5 min mit den angegebenen Konzentrationen von Thrombin (Thr) oder MMP-1 belastet, wie in 4A, und p38MAPK (4E) oder nachgelagerte MAPKAP-K2-(4F)-Aktivierung wurde durch Densitometrie von Western-Blots mit einem Phospho-p38MAPK- bzw. Phospho-MAPKAP-K2-Antikörper quantifiziert. Die Blots wurden mit p38MAPK oder MAPKAP-K2 erneut untersucht, um eine in jeder Spur gleiche Last zu bestätigen (Daten nicht dargestellt).
Die Ergebnisse zeigen, dass MMP-1 (3 nM) fähig war, eine Rho-GTP-Aktivität im selben Umfang zu stimulieren wie äquimolares Thrombin (4A). MMP-1 war auch fähig, Plättchenformveränderung, Calciummobilisierung und Aggregation hervorzurufen, was durch den PAR1-Antagonisten RWJ-56110 inhibiert wurde (4B–D). Exogen zugesetzte MMP-1 aktivierte ebenfalls Phospho-p38-MAPK und sein Substrat, MAPKAP-K2; in einem Aktivitätsprofil ähnlich dem von Thrombin (4E–F). MAPKAP-K2 phosphoryliert das kleine Hitzeschockprotein HSP27, das an der Cytoskelett-Umordnung beteiligt ist (Sundaresan und Farndale, 2002), was weiterhin dafür spricht, dass MMP-1 bei den initialen Ereignissen eine Rolle spielt, die zur Plättchenformveränderung führen und zur Vorbereitung der Plättchen für die Aggregation beitragen.
I-(D) KOLLAGEN LÖST P38-MAPK-SIGNALISIERUNG, RHO-AKTIVIERUNG UND PLÄTTCHENAGGREGATION DURCH MMP1-PAR1 AUS
Sodann wurde die Wirkung einer pharmakologischen Blockierung von Metalloproteasen oder PAR1 auf die kollagenabhängige Plättchenaggregation getestet (siehe 5). Gelfiltrierte Plättchen von gesunden Individuen (ergänzt mit 0,3 mg/ml Fibrinogen) wurden bei Vorhandensein oder Fehlen (0,2% DMSO-Vehikel) der angegebenen Inhibitoren mit 5 μg/ml Kollagen belastet und in einer Aggregometerküvette (250 μL) bei 37°C mit 900 UpM gerührt. Es erfolgte eine Präinkubation der Plättchen für 5 min mit den Thrombin-Inhibitoren PPACK (200 μM) oder Hirudin (1 U/ml), dem Zn-Chelator 1,10-Phenanthrolin (1,10-PA; 100 μM), dem Breitspektrum-Metalloproteasehydroxamat-Inhibitor MMP-200 (200 nM), dem MMP-1-Inhibitor FN-439 (3 μM), dem PAR1-Liganden-Bindungsstellen-Inhibitor RWJ-56110 (1 μM), dem PAR1 blockierenden Antikörper (75 μg/ml), den PAR1-Pepducin-Lipopeptiden P1pal-12 (3 μM) oder P1pal-7 (3 μM), dem PAR4-Pepducin-Lipopeptid P4pal-10 (3 μM), MMP-8-Inhibitor (25 nM) oder MMP9/13-Inhibitor (10 nM).
In 5A wurde die Plättchenaggregation anhand der Lichtdurchlässigkeit überwacht.
In 5B wurden die Plättchen wie in 5A behandelt und dann 5 min nach Zusatz von Kollagen mit Laemmli-Probenpuffer lysiert. Die p38-MAPK-Aktivität wurde dann durch Western Blot mit einem p38-MAPK Phospho-Antikörper beurteilt, und die p38-Gesamtlast wurde vermittels eines p38-MAPK-Antikörpers bestimmt.
In 5C wurden die Plättchen wie in 5B behandelt, und dann wurde die Rho-GTP-Aktivität durch Western-Blot beurteilt.
In 5D wurden die Plättchen mit verschiedenen blockierenden Antikörpern für 2 h oder Inhibitoren vorbehandelt (ARC, 0,5 μM P2Y12-Antagonist AR-C69931MX; ASA, 1 mM Aspirin für 30 min) und mit entweder 5 μg/ml Kollagen, 10 nM MMP-1 (Calbiochem) oder 10 nM MMP-1 aus einer zweiten Quelle (S2, BioMol) wie angegeben stimuliert und die Rho-GTP Aktivität beurteilt wie in 5C. Repräsentative Blots sind unten in 5B–D gezeigt. Die Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Versuchen. P* < 0.01, # < 0,05.
In 5E wurden die Plättchen mit verschiedenen Konzentrationen von P1pal-7 (in der Figur mit ”PZ-128” bezeichnet und auch als P1i3pal-7 bekannt) in 0,2% DMSO-Vehikel vorbehandelt und mit SFLLRN, Kollagen, ADP und Ristocetin wie angegeben aktiviert. Die prozentuale Aggregation wurde am Maximalpunkt 7–15 min nach dem Zusetzen des Agonisten definiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass lösliches fibrilläres Kollagen Typ I die Plättchenaggregation mit einer EC₅₀ von 5 μg/ml stimuliert. Die Inhibition von Metalloproteasen mit dem Zinkchelatierenden Wirkstoff 1,10-Phenanthrolin ergab 80% Verlust der Aggregation zu 5 μg/ml Kollagen (5A). Ebenso bewirkte der Breitspektrum-Metalloproteasehydroxamat-Inhibitor MMP-200 (IC₅₀ = 7 nM für MMP-1, 2,3 nM für MMP-2, 135 nM für MMP-3, 10–100 nM für MMP-7, 1–10 nM für MMP-13) eine signifikante Inhibition der Kollagen-initiierten Aggregation um 50–60% Prozent. Eine Behandlung mit dem MMP-1-Inhibitor FN-439 inhibierte die Kollagen-induzierte Aggregation im selben Umfang wie MMP-200. Umgekehrt hatten Inhibitoren gegen MMP-8, MMP-9 und MMP-13 keine Wirkung auf die Kollagen-induzierte Aggregation (Daten nicht dargestellt). Der spezifische Thrombin-Inhibitor Hirudin oder der Breitspektrum-Serinprotease-Inhibitor PPACK hatten keine Auswirkung auf die Kollagenaggregation (5A). PAR1 wurde durch drei orthogonale Ansätze inhibiert, um ihren Beitrag zur kollagenabhängigen Aggregation zu bewerten. Der kleinmolekulare Inhibitor RWJ-56110 oder ein PAR1-blockierender Antikörper schwächte 50% der Kollagen-(5 μg/ml)-induzierten Aggregation ab, im selben Umfang wie der MMP-1-Inhibitor. Ebenso ergaben die zellpenetrierenden PAR1-Pepducin-Lipopeptide P1pal-12 und P1pal-7 (auch bekannt als P1i3pal-7), welche die PAR1-Signalisierung an intrazelluläre G-Proteine inhibieren (Boire et al., 2005; Covic et al., 2002a; Kaneider et al., 2007), identische Inhibitionsniveaus wie eine MMP1-Blockierung (5A und 5E). Eine Inhibition des PAR4-Thrombin-Rezeptors mit dem P4pal-10-Pepducin-Lipopeptid (3 μM) hatte nur eine leichte Wirkung (~10%) auf die Kollagen-induzierte Aggregation (5A).
Es ist bekannt, dass Kollagen p38-Beanspruchungs-aktivierte Proteinkinase-(MAPK-)Wege in menschlichen Plättchen induziert, wenn auch der Mechanismus noch unklar ist (Kuliopulos et al., 2004; Sundaresan und Famdale, 2002). Wie in 5B gezeigt, bewirkt ein Zusatz von Kollagen eine robuste Phosphorylierung von p38 MAPK. Das Kollagen-(5 μg/ml)-induzierte Phospho-p38-MAPK-Signal wurde durch die PAR1- und MMP-1-Inhibitoren effektiv blockiert, jedoch nicht mit Inhibitoren gegen MMP-8, MMP-9/13 oder Thrombin. Eine kollagenabhängige Aktivierung des p38-MAPK-Substrats MAPKAP-K2 ist ebenfalls sowohl von PAR1 als auch von MMP-1 abhängig. Die PAR1-Antagonisten RWJ-56110, P1pal-7 und FN-439, jedoch nicht durch MMP8-Inhibitor, blockierten eine Kollagen-Aktivierung von Phospho-MAPKAP-K2 (Daten nicht dargestellt).
Die Fähigkeit von Kollagen zum Stimulieren von Rho-GTP-Aktivität über den MMP1-PAR1-Weg wurde ebenfalls getestet. Kollagen bewirkte eine robuste Aktivierung von Rho-GTP, die mit Antagonisten gegen PAR1 und MMP-1 um 75% abgeschwächt wurde, jedoch nicht durch Inhibitoren oder blockierende Antikörper gegen MMP-8, MMP-9/13 oder Thrombin (5C–D).
Dagegen hatte auf Sättigungsniveus des Kollagens (20 μg/ml), die zum Hervorrufen einer vollen Aggregation von Plättchen ausreichend waren, keiner der PAR1- oder MMP-1-Inhibitoren große Wirkung (≤ 25%) auf die kollagenabhängige Aggregation, das Phospho-p38-MAPK-Signal oder die Rho-GTP-Aktivität (Daten nicht dargestellt), was anzeigt, dass der MMP1-PAR1-Weg bei Kollagen auf Niveaus oberhalb von EC₅₀ umgangen werden kann.
Mit Blick darauf, ob die beobachteten MMP-1-Wirkungen auf einer sekundären Sekretion von ADP oder Thromboxan nach der Kollagen-Stimulation beruhten, wurden die P2YI2-ADP- und Thromboxan-Wege mit ARC bzw. Aspirin (ASA) inhibiert (5D). Die Behandlung von Plättchen mit ARC oder Aspirin hatte keine Auswirkung auf die Fähigkeit von 5 oder 20 μg/ml Kollagen oder 10 nM MMP-1 zum Aktivieren von Rho-GTP (5D, 5E) oder Phospho-p38 MAPK, aber die Inhibitoren konnten die Aggregation zu Kollagen noch unterdrücken (5E). Dagegen inhibierte eine Blockierung des MMP1-PAR1-Weges die Aktivierung von p38 und Rho-GTP zu 5 μg/ml Kollagen nahezu vollständig (5B–D). Dies würde darauf hinweisen, dass MMP1-PAR1 bei EC50 Kollagen-Exponierung für die Aktivierung von p38 und Rho-GTP essentiell und für die Aggregation wichtig ist, wohingegen die sekundären ADP- und Thromboxan-Wege p38 und Rho-GTP in keinem Bereich der Kollagen-Konzentration aktivieren. Bei Kollagensättigung scheinen die Beiträge durch ADP und Thromboxan den MMP1-PAR1-Weg in der Plättchenaggregation über Mechanismen zu kompensieren, bei denen p38 oder Rho-GTP-Signalisierung keine Rolle spielen.
1-(E) FRÜHE PLÄTTCHEN-THROMBUSBILDUNG AUF KOLLAGENOBERFLÄCHEN WIRD DURCH MMP-1 UND PAR1 GEFÖRDERT
Eine Aktivierung von Plättchen in ruptierten atherosklerotischen Plaques erfolgt unter Bedingungen hoher Scher-Beanspruchung auf subendothelialen Oberflächen, die mit Kollagenfibrillen angereichert sind. Die Rolle von MMP-1 und PAR-1 bei der initialen Bildung und Propagation von Plättchen-Plättchen-Thromben auf Kollagenoberflächen durch spezifische Inhibierung von MMP-1 oder PAR1 untersucht (siehe 6A–6B).
Menschliches Vollblut wurde mit Heparin (10 U/mL) oder mit Mais-Trypsin-Inhibitor (CTI, 30 μg/ml final) antikoaguliert, mit anschließender Vorbehandlung für 10 min mit Vehikel (0,2% DMSO), MMP-200 (200 nM), MMP-1-Inhibitor FN-439 (3 μM), PAR1-Liganden-Bindungsstellen-Inhibitor RWJ-56110 (1 μM), PAR1-Pepducin-Lipopeptiden P1pal-12 oder P1pal-7 (3 μM), oder für 30 min mit 1 mM Aspirin vor dem Assay, wie angegeben. Nach der Inkubation mit Inhibitoren wurde das Blut über einem mit fibrillärem Kollagen Typ I beschichteten Glasträger perfundiert.
Eine Durchflusskammer (Glycotech) mit Glasträgern, die mit fibrillärem Kollagen Typ I beschichtet waren, wurde auf den Tisch eines IMT-2-Inversmikroskops (Olympus) montiert, das mit einer Digitalkamera Retiga 1300 (QImaging) und 40-fach-Objektiv ausgestattet war. Einer der Einlässe der Durchflusskammer wurde mit einer Spritzenpumpe (Harvard Apparatus) verbunden, die zum Erzeugen einer Scherrate von 1.000^s–1 kalibriert war. Sodann wurde das mit den verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren vorbehandelte Vollblut über dem Kollagen-beschichteten Glasträger perfundiert. Nach 2–15 min Perfusion wurde das Blut durch behutsames Verdrängen mit PIPES-Puffer aus der Durchflusskammer entfernt, und Bilder von 8–10 Feldern wurden mit OpenLab-Software (Improvision) erfasst. Die erfassten Bilder wurden mit der Software NIH Image 1.63 weiter ausgewertet. Zuerst wurden die Schärfe der Bilder erhöht und die Kanten von separaten Plättchen und Plättchenaggregaten bestimmt. Nach der Anpassung der Schwelle wurden die Bilder in das binäre Format konvertiert und die Partikelanalysefunktion wurde aktiviert, um die mit Plättchen bedeckten Regionen hervorzuheben, wobei die Empfindlichkeit auf einen einzelnen adhärenten Thrombozyten eingestellt war. Zur Konvertierung von Pixeln in Quadratmikrometer wurde eine Kalibrierungskurve mit 2,5-, 6-, 20-, 25- und 45-μm-Polystyrol-Beads (Polyscience) aufgebaut, wobei die Erfassungsbedingungen mit den experimentellen identisch waren. Die mittlere Fläche der gebildeten Thromben wurde bei 7 min bestimmt. Die Flächenmessungen in 6B repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei separaten Versuchen mit fünf unterschiedlichen Blutspendern.
Eine Behandlung mit MMP-1- oder PAR1-Inhibitoren hatte keine Auswirkung auf die primäre Adhäsion von Plättchen an die immobilisierten Kollagenfibrillen. Jedoch wurden Wachstumsrate und Größe von Plättchenaggregat-”Strings” mit dem MMP-1-Inhibitor FN-439 oder den PAR1-blockierenden Wirkstoffen P1pal-12, P1pal-7 oder RWJ-56110 um ~75% signifikant abgeschwächt (6A–B). Demgegenüber hatte eine Vorbehandlung mit Aspirin geringe oder gar keine Wirkung auf das Wachstum der Plättchen-Thromben. Dieses Ergebnis stimmt damit überein, dass Thromboxan im Vergleich zum MMP1-PAR1-Weg bei der Thrombogenese unter arteriellen Scher-Beanspruchungsbedingungen eine relativ geringe Rolle spielt (Jackson et al., 2003).
Kollagen-aktivierte Plättchen bieten außerdem eine gerinnungsfördernde Oberfläche und erzeugen Gewebefaktor, was zur Erzeugung von Thrombin beiträgt (Giesen et al., 1999; Mackman, 2004; Schwertz et al., 2006). Zur Bewertung dessen, ob die MMP1-PAR1-Aktivierung einer frühen Plättchen-Thrombenbildung auch unter Bedingungen relevant ist, bei denen die Thrombinaktivität nicht inhibiert wird, wurden arterielle Durchflussversuche bei Vorhandensein von Mais-Trypsin-Inhibitor (CTI) durchgeführt, der Faktor XIIa und den Kontaktweg der Koagulation blockiert, jedoch eine Thrombingenerierung in Vollblut nicht inhibiert (Mann et al., 2007; Rand et al., 1996).
Vollblut wurde mit CTI (30 μg/mL) antikoaguliert, um den Kontaktweg zu blockieren; im Übrigen wurden die Versuche identisch wie in 6A durchgeführt. Hirudin wurde wie angegeben mit 0,0013 U/mL verwendet.
Die Ergebnisse bei Verwendung des CTI-Gerinnungshemmers waren denen bei Durchführung mit Heparin sehr ähnlich. Wie in 6C und 6D, schwächte die Inhibition von MMP-1 oder PAR-1 die Größe der Plättchen-Mikrothromben auf den Kollagenoberflächen signifikant ab, wohingegen eine Hinzufügung des Thrombin-Inhibitors Hirudin keine Wirkung hatte. Ebenso hatte eine Vorbehandlung des Vollbluts mit Aspirin keine Auswirkung auf das Ausmaß der Plättchen-Thrombenbildung auf den Kollagenoberflächen. Somit fördert MMP1-PAR1 unter Bedingungen arterieller Scher-Beanspruchung signifikant die frühe Thrombogenese auf Kollagenoberflächen.
Sodann wurden Gerinnselretraktions-Assays durchgeführt, um die potentielle Rolle von MMP-1 auf die Struktur großer plättchenreicher Gerinnsel im Zeitverlauf zu untersuchen. Plättchenrezeptoren lösen eine Gerinnselretraktion durch Aktivieren einer Myosin-abhängigen Kontraktion des Cytoskeletts aus, das wiederum über fokale Adhäsionen mit der extrazellulären Matrix (Fibrinogen) verbunden ist (siehe 6I).
Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde aus menschlichem Vollblut isoliert, das mit 4% Natriumcitrat antikoaguliert war. Die Gerinnselretraktions-Assays erfolgten in Volumina von 1 ml, enthaltend 800 μl PBS und 200 μl PRP plus 10 μl rote Blutkörperchen zur Erhöhung des Kontrastes. Die Proben wurden für 15 min mit FN-439 (5 μM), MMP9/13 Inh. (10 nM) oder RWJ-56110 (1 μM) vorbehandelt, und die Gerinnselbildung wurde mit 1–20 μg/ml fibrillärem Kollagen Typ I initiiert. Die Proben wurden bei 37°C für 90 oder 240 min inkubiert und dann mit einer Digitalkamera fotografiert. Jede Fotografie in 6I steht für drei unabhängige Versuche.
Wie in 6I gezeigt, inhibierte der MMP-1-Inhibitor FN-439 die durch 2,5–5 μg/ml Kollagen induzierte Gerinnselbildung und -retraktion vollständig. Die Blockierung von PAR1 mit RWJ-56110 ergab ein nahezu identisches Inhibitionsmuster, wohingegen der MMP9/13-Inhibitor der negativen Kontrolle über die gesamte Kollagen-Titration vernachlässigbare Wirkung hatte. MMP-1 und PAR1 spielen daher eine signifikante Rolle bei der durch Kollagen initiierten Bildung und Retraktion großer plättchenreicher Thromben.
I-(F) PHARMAKOLOGISCHE INHIBITION VON MATRIX-METALLOPROTEASE-2 (MMP-2) SCHWÄCHT DIE KOLLAGEN-ABHÄNGIGE PLÄTTCHENAGGREGATION IN ÄHNLICHEM UMFANG AB WIE DIE BLOCKIERUNG VON MMP-1.
Um weiter zu demonstrieren, dass die Inhibition von MMP-1 eine Kollagen-induzierte Plättchenaktivierung unterbindet, wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um die Fähigkeit von Plättchen zum Aggregieren bei Vorhandensein der MMP-2-Inhibitoren zu testen, die eine Pro-MMP-1-Spaltung und -Aktivierung bekanntermaßen inhibieren.
Menschliche Plättchen wurden durch Gelfiltrations-Chromatographie von plättchenreichem Plasma unter Verwendung einer Sepharose-2B-Säule in modifiziertem PIPES-Puffer isoliert. Nach Zusatz von 2,0 mM CaCl₂ und 300 μg/ml Fibrinogen wurden die Plättchen für 2 Minuten mit Vehikel (0,2% DMSO), 5 μmol/L MMP2-Inhibitor I (8A), 51 μmol/L MMP2/3-Inhibitor I (8B), 15 μmol/L MMP3-Inhibitor III (8C), 5 μmol/L FN-439 (8D), 200 nM MMP-200 präinkubiert und dann durch Kollagen in verschiedenen Konzentrationen stimuliert. Die Aggregation wurde für 15 Minuten unter Verwendung eines Aggregometers Chronolog 560VS/490-2D gemessen. Der Aggregations-Assay wurde mit 3–6 gesunden Blutspendern wiederholt.
In 8E erfolgte eine Präinkubation der Plättchen für 5 min mit dem Thrombin-Inhibitor Hirudin (1 U/ml), den Metalloprotease-Inhibitoren 1,10-Phenanthrolin (1,10-P; 100 μM) oder MMP-200 (200 nM), dem MMP-1-Inhibitor FN-439 (3 μM), dem PAR1-Liganden-Bindungsstellen-Inhibitor RWJ-56110 (1 μM), dem PAR1-blockierenden Antikörper (75 μg/ml), den PAR1-Pepducin-Lipopeptiden P1pal-12 (3 μM) oder P1pal-7 (3 mM) oder dem PAR4-Pepducin-Lipopeptid P4pal-10 (3 μM). Die Daten sind der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Versuchen. P* < 0,01, # < 0,05.
Die Inhibition von MMP-2, jedoch nicht MMP-3, inhibiert die Kollagen-induzierte Plättchenaggregation.
I-(G) SYSTEMISCHE PLÄTTCHENAKTIVIERUNG UND ARTERIENTHROMBOSE DURCH MMP-1 UND PAR1 BEI MEERSCHWEINCHEN
Sodann wurde eine Reihe von Versuchen durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Blockierung des MMP1-PAR1-Weges vor Kollagen-mediierter systemischer Plättchenaktivierung in vivo schützen würde. Meerschweinchen dienen als relevantes Modell zum Testen der Plättchenfunktion, da sie wie Menschen ebenfalls PAR1 auf ihren Plättchen exprimieren (Leger et al., 2006a) und Meerschweinchen-MMP-1 eine 90%-ige Identität mit menschlicher MMP-1 aufweist (Huebner et al., 1998).
Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und durch den institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung am Tufts Medical Center genehmigt. 2–4 Wochen alte Hartley-Meerschweinchen (170–260 g) wurden durch intraperitoneale Injektion mit Xylazin (10 mg/kg) plus Ketamin (50 mg/kg) anästhesiert und dann über die linke Jugularvene katheterisiert und entweder mit Vehikel (20% DMSO/80% Wasser), mit P1pal-7 oder mit FN-439 injiziert (200 μL). Zur Bestimmung der kollagenabhängigen systemischen Plättchenaktivierung wurden 10 min nach Verabreichung der Inhibitoren 200 μg Kollagen in 200 μL PBS über die Jugularvene zugeführt. Zehn Minuten nach der Kollagen-Injektion wurde Blut aus der kontralateralen Jugularvene in Natriumcitrat (1% v/v final) gesammelt, und die Plättchenzahlen wurden mit einem Hemavet 850 gemessen. Die enzymatische Aktivität von aktivem MMP-1 in Überständen und Plättchenlysaten wurde unter Verwendung von DQ-Kollagen I als fluorogenem Substrat bei Vorhandensein oder Fehlen von 3 μM FN-439 oder 20 μg/ml Kontroll-IgG oder einem MMP-1-blockierenden Antikörper (für 2 h bei 37°C präinkubiert) bestimmt, wie angegeben.
7A zeigt die Oberflächenexpression von MMP-1 auf Meerschweinchen-Plättchen entsprechend der Bestimmung durch Durchflusszytometrie. Gestrichelte graue Linie: sekundärer Antikörper allein; durchgezogene Linien: FACS-Profile von Plättchen, die für 15 min bei 37°C mit den angegebenen Konzentrationen von Kollagen behandelt und dann mit primärer MMP-1 (AB806) plus sekundären Antikörpern angefärbt wurden. 7B zeigt die Aktivierung von Meerschweinchen-Plättchen, die für 15 min mit 20 μg/ml Kollagen Typ I bei Vorhandensein von verschiedenen Inhibitoren behandelt wurden, wie oben beschrieben.
Wie in 7A und 7B gezeigt, zeigte eine FACS-Analyse an Meerschweinchen-Plättchen, dass proMMP-1 auf ihrer Oberfläche exprimiert wird und eine Hinzufügung von Kollagen die Freisetzung einer Kollagenaseaktivität bewirkt, die durch FN-439 oder einen MMP1-neutralisierenden Antikörper vollständig blockiert wird. Ebenso ergab eine Inhibition von MMP-1 oder PAR1 eine Unterdrückung der Aggregation von 35–50% und eine vollständige Inhibition von Rho-GTP-Aktivität in Antwort auf 10 μg/ml Kollagen in Meerschweinchen-Plättchen (7C–D), was mit den zuvor erzielten Ergebnissen bei menschlichen Plättchen übereinstimmte.
Sodann wurde durch eine intravenöse Injektion von Kollagen in die Meerschweinchen intravaskuläre Plättchenaktivierung induziert. Vehikel, P1pal-7 (3 mg/kg) oder FN-439 (10 mg/kg) wurden intravenös in die innere Jugularvene von Meerschweinchen zugeführt (n = 6) und für 10 min zirkulieren gelassen. Vor und 10 min nach der Kollagen-(200 μg)Induktion einer systemischen Aktivierung von Plättchen wurde Blut entnommen. Das infundierte Kollagen bewirkte einen starken Abfall der mittleren systemischen Plättchenzahlen von einem Basisniveau von 309.000 ± 50.000/mL auf 194.000 ± 20.000/mL. Auffallenderweise schützte eine Vor-Verabreichung des PAR1-Pepducin-Lipopeptids, Plpal-7, bei den Meerschweinchen nahezu voll ständig vor einer Kollagen-induzierten Thrombozytopenie (6E). Der MMP-1-Inhibitor, FN-439, bot ebenfalls signifikanten Schutz vor intravaskulärer Plättchenaktivierung.
Zur Beurteilung der Wirksamkeit einer Blockierung von Thrombin, MMP-1 oder PAR1 auf Arterienthrombose wurde ein Standardmodell einer FeCl₃-Verletzung der Halsschlagader bei Meerschweinchen verwendet. FeCl₃ bewirkt eine Denudierung der Arterie und Exponierung von Kollagen Typ I und anderen subendothelialen Matrixproteinen. Die Wirkungen einer Blockierung von Thrombin mit Bivalirudin, von MMP-1 mit FN-439 und von PAR1 mit entweder dem kleinmolekularen Antagonisten RWJ-56110 oder dem P1pal-7-Pepducin auf Arterienthrombose wurden dann mithilfe einer Dopplersonde verglichen.
Für diese Arterienthromboseversuche wurden 10 min nach der i. v.-Verabreichung von Vehikel (-), Bivalirudin, RWJ-56110, P1pal-7 oder FN-439 (n = 4–5) in den angegebenen Konzentrationen durch die Jugularvene wurden die rechten Halsschlagadern für 20 min unter Verwendung eines mit 20% FeCl₃ getränkten 24-mm²-Stücks Bio-Rad-Trans-Blot-Papier verletzt. Der 5 mm distal von der Verletzungsstelle erfolgende Arterienfluss wurde mit einer 0,5-V-Dopplersonde (Transonic Systems) gemessen. Eine arterielle Okklusion war als eine Durchflussrate von < 0,01 V für ≥ 5 min definiert. Die Dopplermessungen wurden zum Zeitpunkt 30 min nach der Verletzung beendet (* bezeichnet p < 0,05).
Bivalirudin allein (0,18 mg/kg) verlängerte die mittlere arterielle Okklusionszeit von 13 min auf 20 min (6F). Der kleinmolekulare PAR1-Antagonist, 0,5 mg/kg RWJ-56110, hatte keine feststellbare Wirkung auf die mittlere Okklusionszeit, dagegen ergaben äquimolare Mengen P1pal-7 (0,13 mg/kg, 75% Lipopeptid, 25% Salz) tendenziell einen ähnlichen Schutz wie Bivalirudin (p = 0,10) (6F). Eine Ergänzung von 0,13 mg/kg P1pal-7 mit 0,18 mg/kg Bivalirudin ergab keine zusätzliche Verlängerung der arteriellen Okklusionszeit, jedoch ergab eine etwas höhere Dosis P1pal-7 allein (0,3 mg/kg) eine signifikante (p < 0,05) 80% Verlängerung der mittleren Okklusionszeit (6F). Des Weiteren ergibt das Ammoniumacetatsalz von P1pal-7 in 100% Wasser ähnliche IC50-Werte und erhält die Spezifität für PAR1. Eine Verabreichung des MMP-1-Antagonisten FN-439 allein (mit 2,0 mg/kg) ergab eine ähnliche Verlängerung (90%, 6F) der mittleren arteriellen Okklusionszeit. Eine Mitverabreichung der PAR1- und MMP-1-Inhibitoren führte nicht zu einer weiteren Verlängerung der mittleren Okklusionszeit, was mit dem Funktionieren von MMP-1 auf demselben Weg wie PAR1 übereinstimmt. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in 6G angegeben. Diese Beispiele liefern die Validierung eines der erfindungsgemäßen Prinzipien: dass die Inhibition von MMP1-PAR1 zum Bereitstellen eines wesentlichen Schutzes vor kollagenabhängiger Plättchenaktivierung und akuter Arterienthrombose unabhängig von einer Blockierung von Thrombin verwendbar ist.
Die MMP-1-Aktivität mit den Gerinnseln wurde durch Kollagen-Zymographie bestimmt (siehe 6H). Die Plättchen wurden aus Meerschweinchen isoliert und mit 20 μg/ml Kollagen für 15 min stimuliert und Plättchenüberstände und Pellets, oder ganze ruhende Plättchen (Kontrolle), wie oben beschrieben, präpariert. Die Proben wurden auf einem 8%-Kollagen-Typ-I/Acrylamid-Zymographie-Gel aufgelöst und Kollagenase-Zymogramm wurde wie von Gogly et al., 1998, beschrieben entwickelt oder einem Immun-Blot mit MMP1-Antikörper, AB806, unterzogen. Arterielle Gerinnsel wurden ebenfalls aus den Fe-Cl-verletzten Halsschlagadern von Tieren entfernt (n = 5), die mit FN-439 (”FN439 clot”) oder Vehikel (”veh clot”) behandelt waren, wie in 6F und 6G, und die Gerinnsel wurden in Lysepuffer aufgelöst und 5-fach durch eine Nadel der Stärke 21 passiert. Die Lysate wurden zentrifugiert und Überstände auf dem Zymographie-Gel gelöst. Die beiden Spuren auf der linken Seite des Western-Blots weisen 20 ng proMMP-1 oder 20 ng APMA-aktivierte MMP-1 auf, und die rechte Spur in dem Zymogramm weist 0,5 μg APMA-aktivierte menschliche MMP-1 auf.
In der Kollagen-Zymographie erwies sich, dass das aus verletzten Halsschlagadern von mit Vehikel behandelten Tieren isolierte plättchenreiche Gerinnsel (”veh clot”) signifikante MMP-1-Aktivität aufwies, die mit APMA-aktivierter MMP-1 und mit der MMP-1-Aktivität aus den Überständen von Kollagen-aktivierten Plättchen mitwanderte (6H). Umgekehrt enthielten ruhende Plättchen (Kontrolle) aus Vollblut oder arterielle Thromben aus mit dem MMP1-Inhibitor behandelten Tieren (”FN439 clot”) keine aktive MMP-1. Diese Daten weisen zusammen mit den vorherigen Ergebnissen darauf hin, das die Inhibition von MMP1-PAR1 bei Tieren einen wesentlichen Schutz vor kollagenabhängiger Plättchenaktivierung und akuter Arterienthrombose bieten kann.
MATERIALIEN
Natriumcitrat, EDTA, Apyrase, 1,10-Phenanthrolin, A-23187 und U-46619 wurden von Sigma bezogen. ADP und fibrilläres Kollagen Typ I stammten von der Chronolog Corp. MMP-200 wurde von Enzyme Systems Products bezogen.
ProMMP-1 (≥ 90% Reinheit, aus menschlichen synovialen Fibroblasten), proMMP-3, proMMP-7, FN-439 (MMP-Inh.-1), MMP8-Inh., MMP9/13-Inh., Hirudin und PMA stammten von Calbiochem. RWJ-56110 war eine freundliche Schenkung von Claudia Derian und Patricia Andrade-Gordon von Johnson & Johnson Pharmaceuticals Research and Development. AR-C69931MX war eine Schenkung von Astra Zeneca.
Die Pepducin-Lipopeptide, P1pal-12, P4pal-10 und P1pal-7 wurden mit C-terminalen Amiden synthetisiert und wie oben durch RP-HPLC gereinigt (Covic et al., 2002a).
SFLLRN, TFLLRN, PRSFLLRN, RPSFLLRN, PSFLLRN, DPRSFLLRN, PAR1-N-terminales Thrombin-Spaltungspeptid (N₂₆-R₄₁), flexibles PAR1-Linkerpeptid (N-Acetyl-T₆₇-L₈₄-C) und TR26 (A₃₆-E₆₀-S) und TR26-P40N (A₃₆-K₆₁) wurden durch die Tufts Peptide Core Facility mit C-terminalen Amiden synthetisiert und durch RP-HPLC auf ≥ 95% Reinheit gereinigt.
Der monoklonale IIaR-A-Antikörper, der auf das amino-terminale Thrombin-Spaltungspeptid von PAR1 reagiert, stammte von Biodesign (Kennebunk, ME).
Der gegen die Reste S₄₂FLLRNPNDKYEPF₅₅C erhöhte PAR1-blockierende Antikörper wurde aus Kaninchen erzeugt, wie bereits beschrieben (Kuliopulos 1999). Ein Festphasen-proMMP-1-ELISA-System von R&D Systems (Quantikine DMP100) nutzt 2 monoklonale Antikörper, welche die Prodomäne von MMP-1 erkennen.
Der ELISA-Assay detektiert proMMP-1 und lösliche Prodomäne, aber nicht aktives MMP-1. Der gegen den konservierten C-Terminus erhöhte MMP-1-blockierende Antikörper (polyklonaler Kaninchen-Antikörper AB8105) erkennt sowohl die Pro- als auch die aktive Form von MMP-1, kreuzreagiert jedoch nicht mit anderen Vertretern der MMP-Familie; Herkunft von Chemicon; die MMP-8 (IM38L) und MMP-13 (IM44L) blockierenden Antikörper stammten von Oncogene, das Anti-α₂ (Gi9 oder AK7), β₁ (MAB1987), β₃ (MAB1957) stammten von Chemicon, GPVI (5C20149) stammte von Santa Cruz, GPIBα (MM2/174) stammte von AbD Serotec, und ELISA-Kits für Antikörper gegen die MMP-1-Prodomäne (DMP100, R&D Systems) von MMP-1 wurden entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Anti-Phospho-p38MAPK, p38MAPK, Anti-Phospho-MAPKAP-K2 und Anti-MAPKAP-K2 stammten von Cell Signaling, Anti-RhoA (Klon 26C4) stammte von Santa Cruz Biotechnology.
Mais-Trypsin-Inhibitor und Thrombin stammten von Haematologic Technologies, das Quick-Change-Mutagenese-Kit stammte von Stratagene.
II INHIBITOREN DES MMP-1-PAR-1-SIGNALISIERUNGSWEGES
II-(A) MMP1-PAR1 ALS NEUES ZIEL ZUR PRÄVENTION EINES THROMBOTISCHEN ERKRANKUNGSZUSTANDES
Matrix-Metalloproteasen sind an den chronischen entzündungsfördernden und Gewebeumbau-Ereignissen beteiligt, die zu einer Spaltung von Intersitialkollagen und Entwicklung von verletzbaren atherosklerotischen Plaques führen (Sukhova et al., 1999). Zwar deuten pathoanatomische Untersuchungen an menschlichen atherosklerotischen Läsionen darauf hin, dass große Plaques ischämische Symptome hervorrufen können, jedoch ist der entscheidend beitragende Faktor für die mit Atherosklerose assoziierte Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit eine exzessive Plättchen-Thrombusbildung auf exponierten Kollagenoberflächen nach akuter Plaqueruptur (Glassand Witztum, 2001; Ruggeri, 2002).
Die vorliegende Erfindung offenbart einen neuen Kollagen-initiierten Weg der Thrombogenese, die durch die autokrine Wirkung von Plättchen MMP-1 auf den PAR1-Rezeptor mediiert ist. Die Exponierung von Plättchen gegenüber Kollagen bewirkte eine robuste Aktivierung von MMP-1 auf der Plättchenoberfläche, die wiederum PAR1 unabhängig von Thrombin direkt spaltete und aktivierte. Diese Untersuchungen liefern eine Verbindung zwischen matrixabhängiger Aktivierung von Metalloproteasen und Plättchen-G-Protein-Signalisierung und identifizieren MMP1-PAR1 als potentielles neues Ziel für die Prävention von Arterienthrombose.
MMP-1 spaltete PAR1 überraschenderweise an einer eigenständigen Stelle in seiner extrazellulären Domäne, wodurch ein längerer angebundener Ligand als der durch Thrombin erzeugte generiert wurde. Der MMP1-gespaltene Rezeptor oder das lösliche Peptid-Analogon stimulierte G_12/13-Rho-abhängige Wege, Chemotaxe und MAPK-Signalisierung in Plättchen und anderen Zellen stark. Die MMP-1-Spaltstelle auf PAR1 richtete sich mit einem optimierten MMP-1-Spaltstellenmotiv aus, das durch gemischbasiert orientierte Peptidbibliotheken (Turk et al., 2001) und durch Substratspaltungs-Untersuchungen bestimmt war (Berman et al., 1992; Netzel-Arnett et al., 1991). Die Mutation der jeweiligen P1'-Reste entkoppelte MMP-1 von der Thrombinspaltung und generierte PAR1-Rezeptoren, die Protease-spezifische Aktivität aufwiesen.
Die Kollagen-Signalisierung in menschlichen Plättchen durch die α₂β₁- und GPVI/FcγR-Kollagenrezeptoren ist nicht eindeutig geklärt, ist jedoch abhängig von der G-Protein-Signalisierung durch autokrine Stimulation von ADP- und Thromboxan-Rezeptoren (Jackson et al., 2003). Eine Blockierung des P2Y12 G_i-gekoppelten ADP-Rezeptors inhibiert die kollagenabhängige Thrombogenese unter Bedingungen des arteriellen Flusses, was eine wichtige Rolle für die nachgelagerte ADP-G_i-Signalisierung belegt. Thromboxan aktiviert den G_q- und G_12/13-gekoppelten TXA₂-Rezeptor, Aspirin jedoch kann eine Thrombogenese auf Kollagenoberflächen unter arterieller Scher-Beanspruchung nicht verhindern und verhindert nicht die Bildung okklusiver Thromben bei Patienten mit schwerer arterieller Stenose (Veen et al., 1993). Die aktuellen Untersuchungen zeigen, dass MMP-1 ein potenter Aktivator der PAR1-G_12/13-Wege ist, die an der Plättchenformveränderung und Rho-Aktivierung beteiligt sind, und daher synergetisch mit der P2Y12-G_i-Signalisierung wirken würde.
Eine Blockierung von MMP-1 oder PAR1 mit pharmakologischen Inhibitoren schwächte die Thrombogenese auf Kollagenoberflächen unter arteriellen Scher-Beanspruchungsbedingungen und Thrombose bei Tieren signifikant ab. Verglichen mit der MMP-1-Inhibition hatte der Antagonismus von Thrombin nur geringe Wirkung auf die frühe Thrombogenese auf den Kollagenoberflächen unter hohen arteriellen Durchflussraten. Thrombin ist möglicherweise wichtiger für die spätere Propagation und Stabilität der Plättchen-Thromben und ist an der Initiierung des Thrombuswachstums bei hoher arterieller Scher-Beanspruchung nicht beteiligt (Fressinaud et al., 1992; Gast et al., 1994; Inauen et al., 1990), wenn die Gewebefaktorniveaus nicht extrem hoch sind (Okorie et al., 2008). Ebenso haben Thrombin-Inhibitoren wie etwa Heparin nur unzureichende Wirkung auf die Plättchen-Thrombusbildung bei hohen arteriellen Durchflussraten, haben jedoch deutlichere inhibitorische Wirkung auf Wachstum und Gesamtstabilität von Plättchen-Thromben bei niedrigen und mittleren Scherraten (Inauen et al., 1990).
Im Gegensatz zu einer direkten Blockierung von MMP-1 oder Thrombin hat die nachgelagerte Inhibition von PAR1 möglicherweise das Potential, die initialen MMP1-abhängigen Ereignisse der Plättchen-Thromben-Propagation auf Blutgefäßkollagen zu verhindern, neben der späteren Thrombin-abhängigen Propagation und Stabilisierung, und könnte sich bei der Prävention von Arterienthrombose in akuten Situationen als nützlich erweisen. Zu diesem Zweck sieht die vorliegende Erfindung vor, dass verschiedene Wirkstoffe, z. B. das zellpenetrierende PAR1-Pepducin, eine effiziente Blockierung sowohl der Thrombin-mediierten als auch der Kollagen-MMP1-mediierten Aktivierung von PAR1 bereitstellen, wovon große Patientenpopulationen profitieren könnten, die wegen atherothrombotischer Herzerkrankung und ischämischem Schlaganfall behandelt werden.
11-(B) SCREENING NACH NEUEN MMP1-PAR1-INHIBITOREN
Das Finden von Wirkstoffen, die auf den MMP-1/PAR-1-Signalisierungsweg einwirken, kann mit Verfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. In einem ersten Schritt werden Wirkstoffe identifiziert, die sich an ein Target-Molekül innerhalb des MMP-1-PAR-1-Signalisierungsweges anbinden. Die Wirksamkeit eines ausgewählten Wirkstoffs kann dann mit In-vitro-PAR-1-Signalisierung oder Spaltungsassays, wie hier beschrieben, und dann in vivo mit Tiermodellen thrombotischer Erkrankungszustände bewertet werden. MMP-1/PAR-1-spezifische Wirkstoffe können als Agonist oder Antagonist des MMP-1-PAR-1-Signalisierungsweges wirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform wirkt ein Wirkstoff als direkter oder indirekter Antagonist des MMP-1-PAR-1-Signalisierungsweges. Direkte Antagonisten sind Verbindungen, die sich direkt an ihr Target-Molekül anbinden, wie etwa MMP-1 oder PAR-1, und die biologische Aktivität diese Target-Moleküls inhibieren.
Beispielsweise kann ein MMP-1-Antagonist eine Verbindung sein, die sich an MMP1 bindet und deren enzymatische Aktivität, d. h. die proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) inhibiert. In einer Ausführungsform kann der MMP-1-Antagonist sich direkt an die aktive Stelle von MMP-1 anbinden, um die enzymatische Aktivität von MMP-1 zu inhibieren. In einer weiteren Ausführungsform kann der MMP-1-Antagonist sich an eine andere Stelle als die aktive Stelle binden und die MMP-1-Aktivität durch Induzieren einer Konformationsänderung der MMP-1 oder Modifizieren des posttranslationalen Zustandes des Proteins inhibieren, wie etwa Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Glycosylierung, Acylierung, Alkylierung oder Lypoylierung.
In weiteren Beispielen kann ein PAR-1-Antagonist eine Verbindung sein, die sich an PAR-1 bindet und die proteolytische Spaltung zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) verhindert. In einer Ausführungsform kann ein PAR-1-Antagonist eine Verbindung wie etwa ein Antikörper sein, der sich direkt über die LD₃₉↓P₄₀RSFL-MMP-1-Spaltstelle an der N-terminalen Domäne von PAR-1 bindet und die proteolytische Spaltung an dieser Stelle verhindert. In weiteren Ausführungsformen kann ein PAT-1-Antagonist die proteolytische Spaltung von PAR-1 durch Induzieren einer Konformationsänderung in PAR-1 oder Veränderung der posttranslationalen Modifikation von PAR-1 inhibieren, wie etwa Phosphorylierung, Dephosphorylierung, Glycosylierung, Acylierung, Alkylierung oder Lypoylierung in der Weise, dass die proteolytische Spaltung an der LD₃₉↓P₄₀RSFL-MMP-1-Spaltstelle verhindert wird.
In wiederum weiteren Ausführungsformen kann ein PAR-1-Antagonist die Fähigkeit des MMP-1-generierten, angebundenen Liganden zur Interaktion mit anderen Domänen innerhalb von PAR-1 behindern und dadurch die Aktivierung von MMP-1-mediierter PAR-1-Signalisierung zu inhibieren. In wiederum weiteren Ausführungsformen kann ein PAR-1-Antagonist die PAR-1-Signalisierung durch Stören des Aufbaus von PAR-1 oder MMP-1 umfassenden Proteinkomplexen oder der Dimerisierung von PAR-1 mit anderen Vertretern der PAR-Familie verhindern.
In einer Ausführungsform ist der Wirkstoff ein PAR-1-Pepducin-Lipopeptid. In einer weiteren Ausführungsform ist der Wirkstoff SCH 530348, ein von Schering-Plough entwickelter PAR-1-Antagonist, oder ein Derivat desselben.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Inhibitor die Komplexbildung zwischen PAR-1 und verschiedenen Nukleotiden behindern, einschließlich, aber nicht begrenzt auf GTP, GDP oder GMP.
In wiederum einer weiteren Ausführungsform kann ein MMP-1- oder PAR-1-Wirkstoff die Genexpression anderer Faktoren modulieren, die zur MMP-1-mediierten PAR-1-Aktivierung erforderlich sind. In diesem Aspekt kann ein ”Wirkstoff” Modulatoren der Gentranskription oder Translation von Faktoren umfassen, die zur MMP-1-mediierten PAR-1-Aktivierung erforderlich sind.
Indirekte Antagonisten sind Verbindungen, die sich an Neben-Target-Moleküle binden, welche zur MMP-1-mediierten Aktivierung einer PAR-1-Signalisierungsaktivität erforderlich sind. Beispielsweise kann ein MMP-1-Antagonist die MMP-1-Aktivität durch Inhibieren der proteolytischen Spaltung von Pro-MMP-1 zu aktiver MMP-1 inhibieren. Beispielsweise kann ein MMP-1-Antagonist sich an die proteolytische Spaltstelle der Pro-MMP-1 binden und eine Spaltung verhindern.
In weiteren Ausführungsformen kann ein PAR-1-Antagonist die PAR-1-Signalisierungsaktivität durch Verhindern der Bildung von Proteinkomplexen zwischen MMP-1 und assoziierten Faktoren oder zwischen PAR-1 und assoziierten Faktoren inhibieren. In wiederum weiteren Ausführungsformen kann ein PAR-1-Antagonist die biologische Aktivität von nachgelagerten PAR-1 Effektormolekülen behindern, die für die MMP-1-mediierte PAR-1-Signalisierungsaktivität erforderlich sind.
Direkte Inhibitoren sind durch Screening nach Verbindungen mit In-vitro-Screening-Assays identifizierbar, die ein gereinigtes Target-Molekül erfordern, dessen Aktivität für die MMP-1 mediierte PAR-1-Signalisierung erforderlich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Target-Protein ein natives PAR-1-Protein oder eine PAR-1-Deletionsmutante, bei der die N-terminalen Reste 1 und 39 deletiert sind. Der vorliegend offenbarte experimentelle Ansatz kann jedoch auf jedes Target-Protein angewandt werden, das für die PAR-1-Funktion erforderlich ist. Beispielsweise können das Target-Molekül MMP-1 oder Faktoren sein, die für die MMP-1-Aktivierung erforderlich sind. In wiederum weiteren Beispielen kann das Target-Molekül ein Faktor wie etwa eine Kinase oder Phosphatase sein, der die PAR-1-Aktivität durch Verändern der posttranslationalen Modifikation von PAR-1 oder MMP-1 moduliert.
II-(C) PROKARYOTISCHE EXPRESSION VON REKOMBINANTEN PAR-1-POLYPEPTIDEN
In einer Ausführungsform erfordert die Erfindung die Reinigung eines Target-Proteins oder eines Fragmentes davon, z. B. PAR-1.
PAR-1 kann direkt aus einer biologischen Quelle, wie etwa menschlichen Plättchen, gereinigt sein. Alternativ kann PAR-1 kodierende DNA, oder Fragmente derselben, mit genetischen Konstrukten, z. B. Vektoren und Plasmiden zur Expression in einem prokaryotischen Wirt funktionsverbunden sein. In manchen Fällen ist eine Nukleinsäure mit einer Transkriptions- und/oder Translationssequenz in einem Expressionsvektor funktionsverbunden, um die Expression eines PAR-1-Polypeptids zu ermöglichen. Mit ”funktionsverbunden” ist gemeint, dass eine ausgewählte Nukleinsäure, z. B. eine Kodierungssequenz, so positioniert ist, dass sie eine Wirkung auf ein oder mehr Sequenzelemente hat, z. B. angrenzend an dieselben angeordnet ist, z. B. einen Promotor und/oder eine Ribosombindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz), wodurch die Transkription und/oder Translation der Sequenz gelenkt wird. Manche Sequenzelemente können so gesteuert sein, dass eine Transkription und/oder Translation der ausgewählten Nukleinsäure selektiv induzierbar ist. Beispiel-Sequenzelemente umfassen induzierbare Promotoren wie etwa tac-, T7-, P(BAD)-(araBAD)- und beta-D-Glucuronidase-(uidA-)Promotoren-basierte Vektoren. Die Steuerung von induzierbaren Promotoren in E. coli ist verbesserbar, indem der Promotor mit einem Repressorelement wie etwa dem lac-Operon-Repressor (lac(R)) funktionsverbunden wird. Im spezifischen Fall eines Repressorelementes bedeutet ”funktionsverbunden”, dass eine ausgewählte Promotorsequenz so nah an dem Repressorelement angeordnet ist, dass der Repressor die Transkription von dem Promotor (unter Repressionsbedingungen) inhibiert. Typischerweise umfassen Expressionsplasmide und -vektoren einen selektierbaren Marker (z. B. Antibiotikaresistenzgen wie etwa Tet(R) oder Amp(R)). Selektierbare Marker sind nützlich zur Selektion von Wirtszellentransformanten, die einen Vektor oder ein Plasmid enthalten. Außerdem sind selektierbare Marker dazu verwendbar, einen Vektor oder ein Plasmid in einer Wirtszelle (z. B. auf einer hohen Kopienzahl) zu halten. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, beispielsweise vermittels T7-Promotor-Regelsequenzen und T7-Polymerase.
In einigen Ausführungsformen kann die Polypeptidsequenz von Interesse als Teil eines Fusionsproteins durch Rekombinante-DNA-Technik exprimiert sein. Fusionsvektoren fügen zu einem darin kodierten Protein eine Anzahl von Aminosäuren hinzu, gewöhnlich an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise zu drei Zwecken: 1) zum Erhöhen der Expression von rekombinantem Protein; 2) zum Erhöhen der Löslichkeit des rekombinanten Proteins und 3) zur Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei einer Affinitätsreinigung. Häufig wird eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindung zwischen dem Fusionsanteil und dem rekombinanten Protein eingeführt, um eine Trennung des rekombinanten Proteins von dem Fusionsanteil nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und die mit ihnen verwandten Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa oder Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D. B. und Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N. J.), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-Bindungsprotein bzw. Protein A an das rekombinante Target-Protein fusionieren.
Das PAR-1-Polypeptid kann auch so manipuliert sein, dass ein Affinitäts-Tag an sein N- oder C-terminales Ende fusioniert ist. Beispielsweise kann das Target-Protein an ein kurzes Tag-Peptid fusioniert sein, wie etwa das Hexa-His-Peptid oder das synthetische HA-Epitop-Tag-(Influenza Hemaglutinin)-Peptid YPYDVPDYA. Diese Tag-Proteine oder -Peptide erleichtern auch eine nachfolgende Proteinreinigung durch Affinitätschromotographie.
Weitere häufig verwendete Bakterienwirtsplasmide umfassen die pUC-Serie der Plasmide und kommerziell verfügbaren Vektoren, z. B. pAT153, pBR, PBLUESCRIPT, pBS, pGEM, pCA T, pEX, pT7, pMSG, pXT, pEMBL. Ein weiteres Beispielplasmid ist pREV2.1. Plasmide, die eine hier beschrieben Nukleinsäure umfassen, können zur Expression von PAR-1-Polypeptiden in bakterielle Wirtszellen transfiziert oder transformiert sein. Techniken für die Transformation sind dem Fachmann bekannt, einschließlich Calciumchlorid oder Elektroporation. In weiteren Ausführungsformen ist die rekombinante DNA-Sequenz in einen Bakteriophagenvektor geklont. In bestimmten Ausführungsformen umfassen transformierte Wirtszellen nicht-pathogene Prokaryoten, die zur hohen Expression von rekombinanten Proteinen fähig sind. Beispiele für prokaryotische Wirtszellen umfassen Labor- und/oder Industriestämme von E.-coli-Zellen wie etwa BL21 oder K12-derivierte Stämme (z. B. C600, DH1alpha, DH5alpha, HB1O1, INV1, JM109, TB1, TG1 und X-1Blue). Solche Stämme sind von der ATCC oder von kommerziellen Anbietern wie etwa BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA) und Stratagene (La Jolla, CA) erhältlich. Zu ausführlichen Beschreibungen von Nukleinsäure-Manipulationstechniken siehe Ausubel et al., Hg., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 2006, und Sambrook und Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, 2001.
II-(D) EUKARYOTISCHE EXPRESSION VON REKOMBINANTEN PAR-1-POLYPEPTIDEN
In weiteren Ausführungsformen können PAR-1-Protein oder Fragmente davon in eukaryotischen Zellen exprimiert sein. Eine PAR-1-Nukleinsäure wird durch Standard-Rekombinante-DNA-Techniken in einen Vektor in einer Form geklont, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist. Bevorzugt umfasst der rekombinante Expressionsvektor eine oder mehr Regelsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz funktionsverbunden sind, wodurch die Expression innerhalb der eukaryotischen Zelle erleichtet wird. Der Ausdruck ”Regelsequenz” umfasst Promotoren, Verstärker und andere Expressionssteuerelemente (z. B. Polyadenylationssignale). Regelsequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz lenken, sowie gewebespezifische Regel- und/oder induzierbare Sequenzen. Die Gestaltung des Expressionsvektors kann von Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Expressionsniveau des Proteins und dergleichen abhängen. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Polypeptide, einschließlich Fusionsproteinen oder Polypeptiden, zu erzeugen, die durch Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, kodiert sind (z. B. PAR-1-Proteine, mutierte Formen von PAR-1-Proteinen, Fusionsproteine und dergleichen). Beispielsweise können PAR-1-Polypeptide in Insektenzellen (z. B. mithilfe von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert sein. Geeignete Wirtszellen werden näher behandelt in Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien.
In Säugetierzellen können die Steuerfunktionen des Expressionsvektors durch virale Regelelemente bereitgestellt werden. Häufig verwendete Promotoren sind beispielsweise von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian-Virus 40 abgeleitet. In einigen Ausführungsformen kann der Promotor ein induzierbarer Promotor sein, z. B. ein Promotor, der durch ein Steroidhormon, durch ein Polypeptidhormon (z. B. vermittels eines Signaltransduktionsweges) oder durch ein heterologes Polypeptid reguliert ist (z. B. die Tetracyclin-induzierbaren Systeme ”Tet-On” und ”Tet-Off”; siehe z. B. Clontech Inc., CA, Gossen und Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547 und Paillard (1989) Human Gene Therapy 9: 983). In einigen Ausführungsformen umfasst die PAR-1-Polypeptidsequenz eine Signalpeptidsequenz, die die Sekretion des PAR-1-Polypeptids fördert.
Für die Proteinexpression geeignete Säugetierzelllinien umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen (Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze, CV-1-originäre SV40-Zellen; Gluzman (1981) Cell 123: 175–182)). Weitere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann über herkömmliche Transfektionstechniken in die Wirtszellen eingeführt werden. Gemäß der vorliegenden Verwendung bezeichnen die Ausdrücke ”Transformation” und ”Transfektion” verschiedene fachlich anerkannte Techniken zum Einführen von fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, einschließlich Calciumphosphat-Kopräzipitation, DEAE-Dextran-mediierter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation.
II-(E) SREENING-ASSAYS – IDENTIFIKATION VON PAR-1/MMP-1-LIGANDEN-BINDUNGSMOLEKÜLEN
Die Erfindung stellt Verfahren (vorliegend auch als ”Screening-Assays” bezeichnet) zum Identifizieren von Modulatoren, d. h. in Frage kommenden oder Testverbindungen oder -wirkstoffen (z. B. Proteinen, Peptiden, Peptidomimetika, Peptoiden, Kleinmolekülen oder anderen Arzneimitteln) bereit, die sich an PAR-1 oder MMP-1-Proteine binden, eine inhibitorische Wirkung auf beispielsweise PAR-1 oder MMP-1-Expression oder PAR-1- oder MMP-1-Aktivität haben. Auf diese Weise identifizierte Verbindungen sind verwendbar zum Modulieren der Aktivität von Target-Genprodukten (z. B. PAR-1 oder MMP-1-Genen) in einem therapeutischen Protokoll, zum Ausarbeiten der biologischen Funktion des Target-Genproduktes, oder zum Identifizieren von Verbindungen, die normale Target-Gen-Interaktionen unterbrechen.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Assays zum Screening von in Frage kommenden Verbindungen oder Testverbindungen bereit, die sich an ein PAR-1- oder MMP-1-Protein oder -Polypeptid oder einen biologisch aktiven Teil davon binden oder eine Aktivität derselben modulieren.
Die erfindungsgemäßen Testverbindungen können über jeden der zahlreichen, Fachleuten bekannten Ansätze zu kombinatorischen Bibliotheksverfahren gewonnen sein, einschließlich: biologischer Bibliotheken; Peptoidbibliotheken (Bibliotheken aus Molekülen mit den Funktionalitäten von Peptiden, jedoch mit einem neuartigen Nicht-Peptid-Grundgerüst, die gegen enzymatischen Abbau resistent sind, dabei aber bioaktiv bleiben; siehe z. B. Zuckermann, R. N. et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678–85); räumlich adressierbarer paralleler Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken; synthetischer Bibliotheksverfahren, für die eine Dekonvolution erforderlich ist; des 'Ein-Bead-eine-Verbindung'-Bibliotheksverfahrens sowie synthetischer Bibliotheksverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographie-Selektion. Die Ansätze der biologischen Bibliothek und Peptoid-Bibliothek sind auf Peptid-Bibliotheken begrenzt, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nicht-Peptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145).
In einer Ausführungsform können die Testverbindungen peptidomimetische Verbindungen des PR-TRAP-Peptids, PRSFLLNRN oder Varianten davon sein.
In weiteren Ausführungsformen bezeichnet eine Testverbindung einen ”rekombinanten Antikörper”, der vermittels rekombinanter DNA-Technik generiert ist, wie beispielsweise einen durch einen Bakteriophagen exprimierten Antikörper. Unter dem Ausdruck ist auch ein Antikörper zu verstehen, der durch die Synthese eines DNA-Moleküls, das den Antikörper oder Teile davon kodiert und das ein Antikörperprotein oder Teile davon exprimiert, oder eine den Antikörper spezifizierende Aminosäuresequenz generiert ist, wobei die DNA- oder Aminosäuresequenz durch synthetische DNA- oder Aminosäuresequenztechnik gewonnen wurde, die zur Verfügung steht und dem Fachmann bekannt ist. Rekombinante Antikörper sind zum Zweck einer erhöhten oder verbesserten Affinität über das Screening einer kombinatorischen Antikörperbibliothek unter stringenten Bindungsbedingungen selektierbar. Beispielsweise können Nukleinsäuren, die eine chimäre oder humanisierte Kette kodieren, dazu exprimiert sein, ein zusammenhängendes Protein zu erzeugen. Siehe z. B. Cabilly et al., US-Pat. Nr. 4,816,567 ; Cabilly et al., Europäisches Patent Nr. 0 125 023 B1 ; Boss et al., US-Pat. Nr. 4,816,397 ; Boss et al., Europäisches Patent Nr. 0 120 694 B1 ; Neuberger et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO86/01533 ; Neuberger et al., Europäisches Patent Nr. 0 194 276 B1 für Winter et al., US-Pat. Nr. 5,225,539 für Winter et al., Europäisches Patent Nr. 0 239 400 B1 ; Queen et al., Europäisches Patent Nr. 0 451216 B1 sowie Padlan et al., EP 0 519 596 A1 . Siehe auch Newman et al., BioTechnology, 10: 1455–1460 (1992), zu primatisierten Antikörpern, und Ladner et al., US-Pat. Nr. 4,946,778 und Bird et al., Science, 242: 423–426 (1988)) zu einkettigen Antikörpern. Der Inhalt dieser Patentdokumente und Referenzen wird hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen.
In weiteren Ausführungsformen bezeichnet der Ausdruck Testverbindungen Aptamere. Aptamere umfassen typischerweise DNA, RNA, PNA, Nukleotid-Analoga, modifizierte Nukleotide oder Mischungen aus denselben. Aptamere können natürlich auftreten oder mit synthetischen oder rekombinanten Mitteln hergestellt sein. Aptamersequenzen werden typischerweise durch SELEX (Systematische Evolution von Liganden durch EXponentielle Anreicherung) gefunden. Dieses Verfahren sieht die In-vitro-Selektion von Nukleinsäuremolekülen vor, die fähig sind, sich mit hoher Spezifität an Target-Moleküle zu binden, und wird näher beschrieben in US-Patent Nr. 5,475,096 mit dem Titel ”Nucleic Acid Ligands”, US-Patent Nr. 5,270,163 (siehe auch WO 91/19813 ) mit dem Titel ”Nucleic Acid Ligands” und in jüngerer Zeit ”Method for generating aptamers with improved off-rates”, US-Patentanmeldung Nr. 2009/0004667, die jeweils spezifisch durch Verweis hier aufgenommen werden. Nukleinsäure-Aptamere sind auch selektierbar durch Screening von Bibliotheken von strukturell definierten RNA- oder DNA-Motiven, wie beschrieben in ”Methods for identifying ligands that target nucleic acid molecules and nucleic acid structural motifs”, US-Patentanmeldung Nr. 2008/0188377, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen wird.
Eine Testverbindung kann ein Nukleinsäuremolekül wie etwa ein kurzes Oligonukleotid sein, das zum Mediieren von sequenzspezifischer RNAi (RNA-Interferenz) fähig ist, beispielsweise kurze (oder kleine) interferierende RNA (siRNA), Doppelstrang-RNA (dsRNA), Mikro-RNA (miRNA), kurze Haarnadel-RNA (shRNA), kurzes interferierendes Oligonukleotid, kurze interferierende Nukleinsäure, kurzes interferierendes modifiziertes Oligonukleotid, chemisch modifizierte siRNA, posttranskriptionale Genstilllegungs-RNA (ptgsRNA), translationale Stilllegung und andere.
Beispiele für Verfahren zur Synthese von Molekülbibliotheken finden sich in der Technik beispielsweise in: De Witt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061 und Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.
Bibliotheken aus Verbindungen sind darstellbar in Lösung (z. B. Houghten (1992) Biotechniques 13: 412–421) oder auf Beads (Lam (1991) Nature 354: 82–84), Chips (Fodor (1993) Nature 364: 555–556), Bakterien (Ladner, US-Pat. Nr. 5,223,409 ), Sporen (Ladner US-Pat. Nr. 5,223,409 ), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865–1869) oder auf Phagen (Scott und Smith (1990) Science 249: 386–390; Devlin (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378–6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301–310; Ladner s. o.).
In einer Ausführungsform ist ein Assay ein zellbasierter Assay, bei dem eine Zelle, die ein PAR-1- und/oder MMP-1-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimiert, mit einer Testverbindung kontaktiert wird und die Fähigkeit der Testverbindung zum Modulieren der PAR-1- und/oder MMP-1-Aktivität bestimmt wird. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung zum Modulieren der PAR-1-Aktivität kann beispielsweise durch Überwachen der Rho- oder MAPK-Signalisierungsaktivität erfolgen, wie oben beschrieben. In weiteren Ausführungsformen kann die MMP-1-Aktivität durch Bestimmung des Spaltungsniveaus an der LD₃₉↓P₄₀RSFL-MMP-1-Spaltstelle überwacht werden. Die Zelle kann beispielsweise von einem Säugetier stammen, z. B. einem Menschen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle ein menschliches Plättchen. Eine In-vivo-Bindung der Testverbindung an PAR-1 oder MMP-1 kann ebenfalls bewertet werden. Dies ist beispielsweise durch Koppeln der Verbindung mit einem Radioisotop oder Enzym-Label in der Weise möglich, dass die Anbindung der Verbindung an PAR-1 und/oder MMP-1 durch Detektieren der gelabelten Verbindung in einem Komplex bestimmt werden kann. Alternativ könnten PAR-1 oder MMP-1 mit einem Radioisotop oder Enzym-Label gekoppelt werden, um die Fähigkeit einer Testverbindung zum Modulieren der MMP-1-Spaltung von PAR-1 zu überwachen. Beispielsweise können Verbindungen direkt oder indirekt mit 125I, 35S, 14C oder 3H gelabelt werden und das Radioisotop durch direkte Zählung der Radioemission oder durch Szintillationszählung detektiert werden. Alternativ können Verbindungen beispielsweise mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphotase oder Luciferase enzymatisch gelabelt werden und das Enzym-Label durch Bestimmung einer Umwandlung eines geeigneten Substrates in Produkt detektiert werden.
Die Fähigkeit einer Testverbindung zum Interagieren mit PAR-1 oder MMP-1 mit oder ohne Label-Markierung eines der Interaktanten kann bewertet werden. Beispielsweise kann ein Mikrophysiometer verwendet werden, um die Interaktion einer Verbindung mit PAR-1 oder MMP-1 ohne Label-Markierung der Verbindung oder der PAR-1 oder MMP-1 zu detektieren. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906–1912. Gemäß der vorliegenden Verwendung ist ein ”Mikrophysiometer” (z. B. Cytosensor) ein analytisches Instrument, das mit einem lichtadressierbaren potentiometrischen Sensor (LAPS) die Rate misst, mit der eine Zelle ihre Umgebung azidifiziert. Veränderungen dieser Azidifizierungsrate können als Indikator für die Interaktion zwischen einer Verbindung und PAR-1 oder MMP-1 verwendet werden.
In wiederum einer weiteren Ausführungsform wird ein zellfreier Assay bereitgestellt, bei dem ein PAR-1 oder MMP-1-Protein oder biologisch aktiver Teil desselben mit einer Testverbindung kontaktiert wird und die Fähigkeit der Testverbindung zum Anbinden an das PAR-1- oder MMP-1-Protein oder einen biologisch aktiven Teil desselben bewertet wird. Bevorzugte biologisch aktive Teile der PAR-1- oder MMP-1-Proteine, die in erfindungsgemäßen Assays zu verwenden sind, umfassen Fragmente, die an Interaktionen zwischen PAR-1 oder MMP-1 Molekülen beteiligt sind.
Zellfreie Assays erfordern das Präparieren eines Reaktionsgemisches des Target-Gen-Proteins und der Testverbindung unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichen, um die beiden Komponenten interagieren und sich binden zu lassen, so dass sie einen Komplex bilden, der entfernt und/oder detektiert werden kann. Die Interaktion zwischen zwei Molekülen kann ebenfalls detektiert werden, z. B. mithilfe von Fluoreszenz-Energie-Transfer (FRET) (siehe beispielsweise Lakowicz et al., US-Pat. Nr. 5,631,169 ; Stavrianopoulos et al., US-Pat. Nr. 4,868,103 ). Ein Fluorophor-Label auf dem ersten, 'Spender'-, Molekül wird so selektiert, dass seine emittierte Fluoreszenz-Energie durch ein fluoreszentes Label auf einem zweiten, 'Akzeptor'-, Molekül absorbiert wird, das wiederum aufgrund der absorbierten Energie fluoreszenzfähig ist. Alternativ kann das 'Spender'-Proteinmolekül einfach die natürliche Fluoreszenz-Energie von Tryptophanresten nutzen. Es werden Labels gewählt, die unterschiedliche Lichtwellenlängen emittieren, so dass das 'Akzeptor'-Molekül-Label von demjenigen des Spenders differenzierbar ist. Da die Effizienz des Energietransfers zwischen den Labels mit der Distanz zusammenhängt, durch die die Moleküle getrennt sind, kann das räumliche Verhältnis zwischen den Molekülen beurteilt werden. In einer Situation, in der eine Bindung zwischen den Molekülen auftritt, sollte die Fluoreszenz-Emission des 'Akzeptor'-Molekül-Labels in dem Assay maximal sein. Ein FRET-Bindungsereignis kann auf praktische Weise mit Standard-Fluorometrie-Detektionsmitteln gemessen werden, die in der Technik bekannt sind (z. B. mit einem Fluorimeter).
In einer weiteren Ausführungsform kann das Bestimmen der Fähigkeit von PAR-1- oder MMP-1-Protein zum Binden an eine Testverbindung durch in Echtzeit erfolgende biomolekulare Interaktionsanalyse (BIA) erfolgen (siehe z. B. Sjolander, S., und Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338–2345 und Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699–705). ”Oberflächenplasmonenresonanz” oder ”BIA” detektiert biospezifische Interaktionen in Echtzeit, ohne eine Label-Markierung eines der Interaktanten (z. B. BIAcore). Masseveränderungen an der Bindungsoberfläche (die ein Bindungsereignis anzeigen) führen zu Veränderungen des Brechungsindexes des Lichtes in der Nähe der Fläche (dem optischen Phänomen der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)), woraus sich ein detektierbares Signal ergibt, das als Anzeichen für Echtzeit-Reaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden kann.
In einer Ausführungsform ist das Target-Genprodukt oder die Testverbindung auf einer Festphase verankert. Die auf der Festphase verankerten Target-Genprodukt/Testverbindungs-Komplexe können am Ende der Reaktion detektiert werden. Bevorzugt kann das Target-Genprodukt auf einer festen Oberfläche verankert sein, und die Testverbindung (die nicht verankert ist) kann direkt oder indirekt mit vorliegend erläuterten detektierbaren Labels markiert sein.
Es kann wünschenswert sein, entweder PAR-1 oder MMP-1, einen PAR-1- oder MMP-1-Antikörper oder seine Target-Verbindung zu immobilisieren, um die Trennung der komplexierten von den unkomplexierten Formen eines oder beider Proteine zu erleichtern sowie einer Automatisierung des Assays Rechnung zu tragen. Die Bindung einer Testverbindung an ein PAR-1- oder MMP-1-Protein oder Interaktion eines PAR-1- oder MMP-1-Proteins mit einer in Frage kommenden Verbindung kann in jedem zur Aufnahme der Reaktionspartner geeigneten Gefäß erfolgen. Beispiele für solche Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Reagenzgläser und Mikrozentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die eine Anbindung eines oder beider Proteine an eine Matrix ermöglicht. Beispielsweise können Glutathion-S-Transferase/PAR-1- oder MMP-1-Fusionsproteine auf Glutathion-Sepharose-Beads (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nicht-adsorbierten Target-Protein oder PAR-1- oder MMP-1-Protein kombiniert werden, und das Gemisch wird unter Bedingungen inkubiert, die der Komplexbildung förderlich sind (z. B. bei physiologischen Bedingungen bezüglich Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Beads oder Mikrotiterplatten-Wells gewaschen, um alle ungebundenen Komponenten zu entfernen, im Fall der Beads wird die Matrix immobilisiert, und der Komplex wird beispielsweise direkt oder indirekt bestimmt, wie oben beschrieben. Alternativ können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden und das Niveau der PAR-1- oder MMP-1-Bindung oder -Aktivität mithilfe von Standardtechniken bestimmt werden.
Weitere Techniken zum Immobilisieren entweder eines PAR-1- oder MMP-1-Proteins oder von Testverbindungen können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) durch in der Technik bekannte Techniken präpariert werden (z. B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, III.) und in den Wells von Streptavidin-beschichteten Platten mit 96 Wells (Pierce Chemical) immobilisiert werden.
Zur Durchführung des Assays wird die nicht-immobilisierte Komponente zu der beschichteten Oberfläche hinzugefügt, die die verankerte Komponente enthält. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden unreagierte Komponenten (z. B. durch Waschen) unter solchen Bedingungen entfernt, dass alle gebildeten Komplexe auf der festen Oberfläche immobilisiert bleiben. Die Detektion von auf der festen Oberfläche verankerten Komplexen kann auf verschiedene Arten erfolgen. Sofern die zuvor nicht-immobilisierte Komponente vorab gelabelt ist, zeigt die Detektionen von immobilisierten Labels auf der Oberfläche an, dass Komplexe gebildet wurden. Sofern die zuvor nicht-immobilisierte Komponente nicht vorab gelabelt ist, kann ein indirektes Label verwendet werden, um auf der Oberfläche verankerte Komplexe zu detektieren; z. B. mithilfe eines gelabelten Antikörpers, der für die immobilisierte Komponente spezifisch ist (der Antikörper kann wiederum z. B. mit einem gelabelten Anti-Ig-Antikörper direkt gelabelt oder indirekt gelabelt sein).
In einer Ausführungsform wird dieser Assay unter Nutzung von Antikörpern durchgeführt, die mit PAR-1- oder MMP-1-Protein reaktiv sind, die jedoch die Bindung des PAR-1- oder MMP-1-Proteins an seine Testverbindung nicht behindern. Solche Antikörper können in die Wells der Platte derivatisiert werden und ungebundenes Target- oder PAR-1 oder MMP-1-Protein kann durch Antikörper-Konjugation in den Wells gesammelt werden. Verfahren zum Detektieren solcher Komplexe umfassen, neben den oben für die GST-immobilisierten Komplexe beschriebenen, eine Immundetektion von Komplexen mithilfe von Antikörpern, die mit dem PAR-1- oder MMP-1-Protein reaktiv sind, sowie Enzym-verbundene Assays, die auf dem Detektieren einer enzymatischen Aktivität beruhen, die mit dem PAR-1- oder MMP-1-Protein oder Target-Molekül assoziiert ist.
Alternativ können zellfreie Assays in einer flüssigen Phase durchgeführt werden. In einem solchen Assay werden die Reaktionsprodukte durch vielfältige Standardtechniken von unreagierten Komponenten getrennt, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf: Differenzialzentrifugation (siehe beispielsweise Rivas, G. und Minton, A. P. (1993) Trends Biochem Sci 18: 284–7); Chromatographie (Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie); Elektrophorese (siehe z. B. Ausubel, F. et al., Hg., Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York) und Immunpräzipitation (siehe beispielsweise Ausubel, F. et al., Hg. (1999), Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York). Solche Harze und chromatographischen Techniken sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Heegaard, N. H., (1998) J Mol Recognit 11: 141–8; Hage, D. S. und Tweed, S. A. (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699: 499–525). Des Weiteren kann auch Fluoreszenz-Energie-Transfer in praktischer Weise, wie hier beschrieben, zum Detektieren einer Bindung ohne weitere Reinigung des Komplexes aus der Lösung genutzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Assay ein Kontaktieren des PAR-1-Proteins oder eines biologisch aktiven Teils desselben mit MMP-1 zur Bildung eines Assaygemisches, Kontaktieren des Assaygemisches mit einer Testverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, sich bevorzugt an PAR-1 oder einen biologisch aktiven Teil desselben zu binden oder die Aktivität eines PAR-1 zu modulieren.
Die erfindungsgemäßen Target-Genprodukte können in vivo mit einem oder mehr zellulären oder extrazellulären Makromolekülen wie etwa Proteinen interagieren. Für die Zwecke dieser Eläuterung werden solche zellulären und extrazellulären Makromoleküle vorliegend als ”Bindungspartner” bezeichnet. Verbindungen, die solche Interaktionen unterbrechen, können zur Regulierung der Aktivität des Target-Genproduktes von Nutzen sein. Solche Verbindungen können Moleküle wie etwa Antikörper, Peptide und Kleinmoleküle umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die bevorzugten Target-Gene/Produkte zur Verwendung in dieser Ausführungsform sind die hier genannten PAR-1- oder MMP-1-Gene. In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung bereit, die Aktivität eines PAR-1- oder MMP-1-Proteins durch Modulation der Aktivität eines vorgelagerten Effektors eines PAR-1- oder MMP-1-Target-Moleküls zu modulieren. Beispielsweise kann die Aktivität des Effektormoleküls auf einem geeigneten Target bestimmt werden, oder es kann die Bindung des Effektors an ein geeignetes Target bestimmt werden, wie bereits beschrieben.
Zum Identifizieren von Verbindungen, die die Interaktion zwischen dem Target-Genprodukt und seinen zellulären oder extrazellulären Bindungspartner(n) behindern, wird ein Reaktionsgemisch, welches das Target-Genprodukt und den Bindungspartner enthält, unter Bedingungen und für eine Zeit präpariert, die für eine Komplexbildung der beiden Produkte ausreicht. Um einen inhibitorischen Wirkstoff zu testen, wird das Reaktionsgemisch bei Vorhandensein und Fehlen der Testverbindung bereitgestellt. Die Testverbindung kann initial in dem Reaktionsgemisch enthalten sein oder kann zu einer Zeit nach dem Zusatz des Target-Gens und seines zellulären oder extrazellulären Bindungspartners zugesetzt werden. Kontroll-Reaktionsgemische werden ohne die Testverbindung oder mit einem Placebo inkubiert. Sodann wird die Bildung von Komplexen zwischen dem Target-Genprodukt und dem zellulären oder extrazellulären Bindungspartner detektiert. Die Bildung eines Komplexes in der Kontrollreaktion, jedoch nicht in dem Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, zeigt an, dass die Verbindung die Interaktion des Target-Genproduktes und des interaktiven Bindungspartners behindert. Zusätzlich kann eine Komplexbildung innerhalb von Reaktionsgemischen, die die Testverbindung und das normale Target-Genprodukt enthalten, auch mit einer Komplexbildung innerhalb von Reaktionsgemischen verglichen werden, welche die Testverbindung und mutiertes Target-Genprodukt enthalten. Dieser Vergleich kann in solchen Fällen von Bedeutung sein, in denen eine Identifikation von Verbindungen wünschenswert ist, die Interaktionen von mutierten, jedoch nicht normalen Target-Genprodukten unterbrechen.
In wiederum einem weiteren Aspekt können die PAR-1- oder MMP-1-Proteine als ”Köderproteine” in einem Zwei-Hybrid-Assay oder Drei-Hybrid-Assay verwendet werden (siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,283,317 ; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques. 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und Brent WO94/10300 ), um andere Proteine oder Peptide zu identifizieren, die sich an PAR-1 oder MMP-1 binden oder damit interagieren und die PAR-1/MMP-1-Funktion behindern.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf den modularen Eigenschaften der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen bestehen. Für kurze Zeit nutzt der Assay zwei unterschiedliche DNA-Konstrukte. Bei einem Konstrukt ist das Gen, das für ein PAR-1- oder MMP-1-Protein kodiert, an ein Gen fusioniert, das die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors kodiert (z. B. GAL-4). Bei dem anderen Konstrukt ist eine DNA-Sequenz, aus einer Bibliothek von DNA-Sequenzen, die ein unidentifiziertes Protein kodiert (”Beuteprotein” oder ”Probe”) an ein Gen fusioniert, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. (Alternativ kann das PAR-1- oder MMP-1-Protein an die Aktivatordomäne fusioniert sein.) Wenn das ”Köder”- und das ”Beute”-Protein in vivo interagieren können, wobei ein PAR-1-abhängiger Komplex gebildet wird, werden die DNA-Bindungs- und Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors nah aneinander gebracht. Diese Nähe ermöglicht die Transkription eines Reportergens (z. B. lacZ), das mit einer Transkriptions-Regulationsstelle funktionsverbunden ist, in Antwort auf den Transkriptionsfaktor. Die Expression des Reportergens kann detektiert werden, und Zellkolonien, die den funktionalen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert werden und zur Gewinnung des geklonten Gens verwendet werden, welches das Protein/Peptid kodiert, das mit dem PAR-1-Protein interagiert.
In einer weiteren Ausführungsform werden Modulatoren der PAR-1-Expression identifiziert. Beispielsweise wird eine Zelle oder ein zellfreies Gemisch mit einer in Frage kommenden Verbindung kontaktiert und die Expression von PAR-1-mRNA oder -Protein relativ zu dem Expressionsniveau von PAR-1-mRNA oder -Protein bei Fehlen der in Frage kommenden Verbindung bewertet. Wenn die Expression von PAR-1- oder MMP-1-mRNA oder -Protein bei Vorhandensein der in Frage kommenden Verbindung geringer (statistisch signifikant geringer) als bei deren Fehlen ist, wird die in Frage kommende Verbindung als Inhibitor einer PAR-1/MMP-1-mRNA- oder Proteinexpression identifiziert. Das Niveau der PAR-1/MMP-1-mRNA oder Proteinexpression kann durch in der Technik bekannte Verfahren bestimmt werden. In einer Ausführungsform können eine Testverbindung RNAi oder microRNAs sein, welche die PAR-1- oder MMP-1-Genexpression inhibieren.
In wiederum einer weiteren Ausführungsform können die hier beschriebenen Assays zum Identifizieren der Bindungsstelle des MMP-1-generierten angebundenen Liganden verwendet werden (siehe 9A). Es könnten zellbasierte oder zellfreie Assays zum Testen dessen entwickelt werden, ob PR-TRAP-Peptid mit einer oder mehr der extrazellulären Schleifen von PAR-1 interagiert. Die Identität der Target-Polypeptidsequenz könnte dann durch eine ortsspezifische Mutagenese der Target-Sequenz mithilfe von etablierten Verfahren verifiziert werden, die in der Technik bekannt sind. Es können dann Wirkstoff-Bibliotheken nach Verbindungen gescreent werden, welche die Interaktion des angebundenen Liganden mit dieser Target-Sequenz spezifisch unterbrechen, wozu In-vivo-Bindungsassays wie etwa Zwei-Hybrid-Assays bei Vorhandensein von Testverbindungen verwendet werden. Alternativ können in Frage kommende Verbindungen nach ihrer Fähigkeit zur Unterbindung der Plättchen-PAR-1-Signalisierung bei Vorhandensein von aktivierter MMP-1 oder des PR-TRAP-Peptid-Liganden gescreent werden, wie oben beschrieben. Beispielsweise können in Frage kommende Testverbindungen nach ihrer Fähigkeit gescreent werden, Rho-GTP- oder Phospho-p38-MAPK-Signalisierungsaktivität in menschlichen Plättchen zu inhibieren, wie oben ausführlich beschrieben. In weiteren Ausführungsformen kann die Fähigkeit in Frage kommender Testverbindungen zum Inhibieren von Plättchenaggregation ebenfalls wie oben beschrieben per Assay untersucht werden. Ein Reportermolekül wie etwa GFP oder dergleichen, das auf PAR-1-Signalisierungsaktivität anspricht, würde das Screening nach geeigneten Verbindungen erleichtern.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Kombination aus zwei oder mehr der hier beschriebenen Assays. Beispielsweise kann ein modulierender Wirkstoff mithilfe eines zellbasierten oder eines zellfreien Assays identifiziert werden, und die Fähigkeit des Wirkstoffs zum Modulieren der Aktivität eines PAR-1-Proteins kann in vivo bestätigt werden, z. B. bei einem Tier, wie etwa bei einem Tiermodell für einen thrombotischen Erkrankungszustand. Neben dem oben beschriebenen Meerschweinchen-Thrombosemodell kann die Wirksamkeit von Testverbindungen auf Thrombose in vivo mithilfe sehr vielfältiger bekannter Tiermodelle der Thrombose beurteilt werden, beispielsweise wie in den US-Patentanmeldungen Nrn. 2005/0025705 und 2005/0120392 beschrieben, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen wird.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neuartige, durch die oben beschriebenen Screening-Assays identifizierte Wirkstoffe. Dementsprechend liegt es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, weiterhin einen wie hier beschrieben identifizierten Wirkstoff (z. B. einen PAR-1 oder MMP-1 modulierenden Wirkstoff, ein Gegensinn-PAR-1- oder MMP-1-Nukleinsäuremolekül, einen PAR-1-spezifischen oder MMP-1-spezifischen Antikörper oder einen PAR-1- oder MMP-1-Bindungspartner) in einem geeigneten Tiermodell zu verwenden, um die Wirksamkeit, Toxizität, Nebenwirkungen oder den Wirkmechanismus einer Behandlung mit einem solchen Wirkstoff zu bestimmen. Des Weiteren können neuartige Wirkstoffe, die durch die oben beschriebenen Screening-Assays identifiziert sind, zu Behandlungen, wie hier beschrieben, verwendet werden.
II-(F) WIRKUNGEN EINER BLOCKIERUNG VON MMP1-PAR1 BEI DER ENTWICKLUNG VON ATHEROSKLEROTISCHEN LÄSIONEN UND NEOVASKULARISATION DER VASA VASORUM AN APOLIPOPROTEIN-E-(APOE-)-DEFIZIENTEN MÄUSEN
Die Rolle von MMP-1 und PAR1 bei der Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen kann in einem Tiermodell der Atherosklerose untersucht werden, etwa an Apolipoprotein-E-(apoE-)-defizienten Mäusen.
Fünfundzwanzig (25) B6.129P2-Apoe^tmlUnc/J-Mäuse im Alter von 7 Wochen wurden in 3 Gruppen geteilt und für 15 Wochen ad libitum mit fettreicher/cholesterinreicher Nahrung ernährt (21% Fett, 0,21% Cholesterin) (D12079B, Research Diets). Gruppe I umfasste 8 Mäuse (n = 8), wurde als Kontrollgruppe verwendet und erhielt Vehikel (20% DMSO in 1 × PBS). Gruppe II umfasste 8 Mäuse (n = 8), die mit MMP-Inhibitor I FN-439 (Calbiochem) in einer Dosis von 5 mg/kg behandelt waren. Gruppe III schließlich umfasste 9 Mäuse (n = 9), behandelt mit 10 mg/kg des P1pal-7-Pepducin-Lipopeptids. MMP-Inhibitor I (FN-439) ist ein Inhibitor von MMP-1 und MMP-8 (IC₅₀ = 1 μM) und kann auch MMP-9 und MMP-3 inhibieren, allerdings bei viel höheren Konzentrationen (IC50 = 30 μM bzw. 150 μM). P1pal-7 ist ein zellpenetrierendes Pepducin-Lipopeptid auf Basis der dritten intrazellulären Schleife (i3) von menschlichem PAR1 und wirkt als Antagonist einer PAR1-Signalisierung. Allen Mäusen wurden für 6 Tage einer Woche subkutan 100 μl der entsprechenden Behandlung injiziert. Am Ende der Behandlung sowie nach 4 Stunden Fasten wurden die Mäuse mit Ketamin/Xylazin anästhesiert und mit 10% Formalin druckfixiert. Herz und Aorta jeder Maus wurden isoliert, entfernt und für 2 Tage in 10% Formalin fixiert, und adventitielles Fett wurde entfernt. Der abdominale Bereich der Aorta wurde geschnitten und zur Whole-Mount-Immunhistochemie verwendet. Der ”Aortenbogen/Thorax”-Bereich und der Rest des ”abdominalen/iliakalen” Bereiches der Aorta wurden aufgeschnitten, auf Dissektions-Schwarzwachs gesteckt und zur ”En-face”-Färbung mit Oil-Red-O verwendet.
Während der 15-wöchigen Periode wurde das Gewicht jeder Maus wöchentlich nach 4-stündigem Fasten gemessen. Es gab zwischen den 3 unterschiedlichen Behandlungsgruppen keinen signifikanten Unterschied im Gewicht der Mäuse (10A), was anzeigt, dass die Behandlungen anscheinend keine Auswirkung auf die Nahrungsaufnahme oder Gesundheit der Mäuse hatten. Die Entwicklung von atherosklerotischen Läsionen bei der apoE-defizienten Maus wird durch die Akkumulation von Cholesterin im Blutstrom induziert. Eine Verfolgung des Lipidprofils der Mäuse bei unterschiedlichen Behandlungen ist daher von großer Wichtigkeit. Wie in 10B gezeigt, erhöhte sich das Gesamt-Plasma-Cholesterin der Mäuse in der ersten Behandlungswoche von 350 mg/dl auf ungefähr 600–800 mg/dl und blieb für den Rest der Behandlung nahe bei 900 mg/dl. Plasmaproben wurden wöchentlich nach einer 4-stündigen Fastenperiode am Morgen desselben Tages entnommen, um mögliche Fluktuationen aufgrund von Nahrungsaufnahme auszuschließen. Zwischen den unterschiedlichen Behandlungsgruppen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, was anzeigt, dass die Inhibition von MMPs oder PAR1 sich nicht auf den Lipidstoffwechsel der Mäuse auswirkte.
Um den Umfang der atherosklerotischen Plaquebildung zu untersuchen, wurden die festgesteckten Aorten zuerst in 10% Formalin fixiert und in 1 × PBS aufbewahrt. Sodann wurden die Aorten der Mäuse einer ”En-face”-Färbung mit Oil-Red-O unterzogen, das Lipide rot färbt. Für kurze Zeit wurde das PBS aus den Proben abgelassen und die Färbelösung für 45 min hinzugefügt. Der Farbstoff wurde abgelassen, und die Proben wurden zuerst mit 70% Ethanol und dann mit Wasser gewaschen, um den Hintergrund zu entfernen. Es wurden digitale Bilder der gefärbten Aorten aufgenommen, und die Software MetaXpress (Molecular Devices) wurde zum Definieren und Quantifizieren der gesamten Aortafläche sowie der Läsionsflächen verwendet. Das Verhältnis von Läsionsfläche zur gesamten Aortafläche wurde für den ”Aortenbogen/Thorax”-Bereich und den ”abdominalen/iliakalen” Bereich berechnet. Die Aorta jeder Maus wurde isoliert und in drei Abschnitte unterteilt. Der abdominale Abschnitt (vor und hinter den Nierenarterien) wurde getrennt und zur Whole-Mount-Immunhistochemie verwendet. Die übrigen Abschnitte waren derjenige vom Aortenbogen bis zur Mesenterialarterie (aortal) und der andere, von hinter den Nierenarterien bis zu den Hüftarterien (abdominal). Diese Abschnitte der Aorta wurden für die ”En-face”-Färbung und die Einschätzung der atherosklerotischen Läsionsfläche verwendet.
Die Läsionsfläche im aortalen und abdominalen Abschnitt der Aorta, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtfläche der Abschnitte, ist in 11 gezeigt. Im aortalen Abschnitt beträgt die mittlere Läsionsfläche in der Kontroll-(Vehikel-)Gruppe 12,9%, in der FN-439-Gruppe 10,7% und in der P1pal-7-Gruppe 8,1% der Gesamtfläche. Die Läsionsfläche in der P1pal-7-Gruppe ist, verglichen mit der Kontrollgruppe, signifikant kleiner (p < 0,005).
Im abdominalen Abschnitt der Aorta beträgt die mittlere Läsionsfläche in der Kontrollgruppe 8,9%, in der FN-439-Gruppe 4,1% und in der P1pal-7-Gruppe 2,3%. Die Läsionsfläche in der P1pal-7-Gruppe ist, verglichen mit der Kontrollgruppe, signifikant kleiner (p < 0,05). In beiden Abschnitten hat die FN-439-Gruppe, verglichen mit der Kontrollgruppe, tendenziell eine kleinere Läsionsfläche, wobei allerdings mit der vorliegenden Probengröße keine Signifikanz erreicht wurde.
Insgesamt führt die Inhibition der PAR1-Signalisierung mithilfe des P1pal-7-Pepducin-Lipopeptids bei apoE-defizienten Mäusen zu einer signifikant reduzierten atherosklerotischen Last, während eine Inhibition der Aktivität von MMPs eine Tendenz zu kleineren atherosklerotischen Läsionen zeigt. Diese Ergebnisse weisen deutlich darauf hin, dass PAR1 bei der Progression von Atherosklerose im aortalen Gefäß eine wichtige Rolle spielt. Dass Plättchen von Mäusen, anders als menschliche Plättchen, keine PAR1 exprimieren, lässt darauf schließen, dass die obigen Beobachtungen nicht auf einer antithrombotischen Wirkung des Pepducin-Lipopeptids, sondern auf der Inaktivierung bestimmter Wege im vaskulären Gewebe beruhen.
II-(G) NEOVASKULARISATION
Angiogenese kann die Progression von Atherosklerose fördern und zu Plaque-Instabilität und -Ruptur beitragen. Daher kann die MMP-PAR1-Signalisierung durch Stimulieren der Angiogenese zur Atherosklerosebildung beitragen. Die Angiogenese wurde daher in der Adventitia der Aorten von apoE-/- Mäusen bewertet, die für 15 Wochen fettreich ernährt wurden und entweder mit dem MMP-1-Kollagenase-Inhibitor, MMP-Inh-1 (FN-439) oder dem PAR1-Antagonisten P1pal-7 behandelt wurden. Die Mäuse wurden dann mit Ketamin/Xylazin anästhesiert und mit 10% Formalin druckfixiert. Die abdominale Aorta wurde isoliert, entfernt und für 1 Stunde mit 10% Formalin fixiert, und adventitielles Fett wurde entfernt. Sodann wurden die abdominalen Aorten bezüglich CD31, eines Markers für Endothelzellen, Whole-Mountimmungefärbt, und aus mehreren konfokalen Schnitten wurden 3D-Projektionsbilder in folgendem Verfahren aufgebaut. Für kurze Zeit wurde das Gewebe für 1 Stunde mit 5% Ziegenserum in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,3% Triton-X 100 (TBST), blockiert und über Nacht bei 4°C mit 1:1000 in TBST diluiertem primärem Antikörper inkubiert. Nach mehrfachem Waschen mit TBST wurde das Gewebe mit fluoreszent Tag-markiertem sekundärem Antikörper inkubiert, der für 4 Stunden in TBST diluiert war. Das Gewebe wurde gewaschen und für 10 Minuten mit 4% Paraformaldehyd postfixiert. Sodann wurde die Aorta in Längsrichtung geschnitten und mit der Adventitiaseite nach oben auf einen Objektträger aufgespreizt. Das Gewebe wurde mit Vectashield-Einbettungsmedium als Whole-Mount präpariert und mit einem Leica-TCS-SP2-Konfokalmikroskop (Zeiss) abgebildet. Konfokale Bilder wurden in 3D-Projektionen von Z-Stapeln aufgebaut. Die Quantifizierung der Bilder erfolgte mit NIH ImageJ. Die verwendeten Antikörper waren: Hamster-Anti-Maus-PECAM-1 (Chemicon) und Cy3-Anti-Hamster (Jackson Immunolabs).
12 zeigt die Whole-Mount-Immunfärbung bezüglich CD31 in der abdominalen Aorta von ApoE-/- Mäusen, die mit Vehikel (12A), P1pal-7 (12B), MMP-Inh-I (FN-439) (12C) behandelt waren, wie in 10. Sowohl die P1pal-7-Behandlung als auch die FN-439-Behandlung reduzierten die Menge an CD31-positiven Gefäßen signifikant (12B und 12C). Die Quantifizierung der CD31-Färbung (13A) wurde in Gefäßbändern (13B) und Verzweigungspunkten (13C) der abdominalen Aorta von ApoE-/- Mäusen bewertet, die mit Vehikel, P1pal-7 oder MMP1-Inh-I (FN-439) behandelt waren, wie in 10. Die Angiogenese war nicht über die gesamte Adventitia der Aorta homogen, und Gefäßbänder erschienen an distinkten Orten, die möglicherweise den Orten mit atherosklerotischen Plaques entsprachen. Sowohl die P1pal-7-Behandlung als auch die FN-439 Behandlung reduzierten die Anzahl der Gefäßbündel in der Adventitia der Aorta signifikant (13). Zur Bewertung der Struktur der entstehenden Gefäße wurden die Verzweigungspunkte gezählt. Die P1pal-7- und FN-439-Behandlung inhibierte die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Gefäßfläche signifikant. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass sowohl MMP-1 als auch PAR1 die Plaque-Angiogenese fördern.
II-(H) WEITERE INHIBITOREN DER MMP-1/PAR-1-SIGNALISIERUNG
Der MMP-1/PAR-1-Signalisierungsweg kann in Plättchen vermittels weiterer potentieller Inhibitoren des MMP-1-PAR-1-Signalisierungsweges inhibiert werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Inhibitoren von MMP-1 oder MMP-2. Die Wirksamkeit dieser Verbindungen zur Inhibition der Plättchenaggregation kann vermittels der zellbasierten Assays und Tiermodelle eines thrombotischen Erkrankungszustandes, die hier beschrieben sind, bewertet werden.
Da MMPs ein Zinkatom in der katalytischen Domäne enthalten und zum Funktionieren Calcium benötigen, kann eine chelatisierende Verbindung die MMP-Aktivität inhibieren. Daneben sind synthetische Derivate, die natürlichen Substraten nachgebildet sind, als MMP-Inhibitoren entwickelt worden. Mehrere Strukturklassen wie etwa Carbonsäurederivate; heterozyklische Strukturen; Hydroxamatanteile mit einem Peptid-, peptidomimetischen oder Nicht-Peptid-Grundgerüst; Biphenylanteile mit Nicht-Peptid-Grundgerüst sowie Tetracyclinanaloga sind die häufigsten Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die in-vitro-inhibitorische Aktivität gegen MMPs aufweisen.
Nicht-einschränkende Beispiele für MMP-1-Inhibitoren umfassen FN-439, Gewebeinhibitoren der Metalloprotease (TIMPs), MMP-200, Cipemastat (rINN, auch bekannt als Ro 32-3555 sowie unter der vorläufigen Handelsbezeichnung Trocade, vermarktet durch Roche), Ancorinoside B-D (Fujita et al. Tetrahedron, Vol. 57, Ausgabe 7, 1229–1234, 2001).
Matrix-Metalloproteinase-Inhibitoren, die für eine onkologische Indikation in die klinische Versuchsphase eingetreten sind, umfassen Prinomastat (AG3340; Agouron/Pfizer), BAY 12-9566 (Bayer Corp.), Batimistat (BB-94; British Biotech, Ltd,), BMS-275291 (früher D2163; Celltech/Bristol-Myers Squibb), Marimastat (BB 2516; British Biotech, Ltd./Schering-Plough), MMI270(B) (früher CGS-27023A; Novartis) sowie Metastat (COL-3; CollaGenex) und Ro 32-3555 & RS-130,830 (Roche Bioscience).
Weitere MMP-Inhibitoren, die mit den Verbindungen und therapeutischen Anwendungen der vorliegenden Anmeldung verwendet werden können, sind offenbart in Design and Therapeutic Application of Matrix Metalloproteinase Inhibitors, Mark Whittaker, Floyd et al., Chem. Rev., 1999, 99 (9), 2735–2776, und Prevention of progressive joint destruction in collageninduced arthritis in rats by a novel matrix metalloproteinase inhibitor, FR255031 , Ishikawa et al., British Journal of Pharmacology (2005) 144, 133–143, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen wird.
Weitere MMP-Inhibitoren umfassen PD 166793 (erhältlich von Axon MedChem; H León et al., Br. J. Pharmacol. (2008) 153, 676–683.
Ferner werden durch die Erfindung weitere Peptid-Antagonisten erwogen, welche die Kollagen-induzierte Plättchenaktivierung behindern und mit den vorliegende beschriebenen Wirkstoffen kombinierbar sind, die die MMP-1-mediierte Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) des Protease-aktivierten Rezeptors 1 (PAR-1) des Patienten modulieren. MMP-Peptid-Inhibitoren auf Basis von synthetischen Tripelhelix-Peptiden (THPs) sind in der US-Patentanmeldung Nr. 2008/0125354 beschrieben. PAR-1-Antikörper oder Peptid-Antagonisten sind in der PCT-Anmeldung WO 2008/011107 beschrieben. Der Inhalt dieser Patentdokumente wird hiermit in seiner Gesamtheit durch Verweis hier aufgenommen.
Außerdem sieht die Erfindung eine Kombination der hier beschriebenen Modulatoren der MMP-1-mediierten PAR-1-Spaltung mit einem oder mehr PAR1-Pepducin-Lipopeptiden vor, einschließlich der Pepducin-Lipopeptide, die in der US-Patentveröffentlichung US2007/0179090 , beschrieben sind, deren Inhalt in seiner Gesamtheit durch Verweis hier aufgenommen wird.
Beispiele für PAR1-Pepducin-Lipopeptide sind unter anderem Pepducin-Lipopeptide, die eine aus den intrazellulären Schleifen i1, i2, i3 oder i4 von PAR-1 entnommene Polpeptidsequenz umfassen. In einer Ausführungsform können die hier verwendeten Pepducin-Lipopeptide ein N-terminales Lipid aufweisen, bei dem es sich um ein Palmitat, Myristat, Lithocholat, Fettsäuren, Steroide usw. handeln kann. In einer weiteren Ausführungsform können die hier verwendeten Pepducin-Lipopeptide ein C-terminales Lipid aufweisen, bei dem es sich um ein Palmitat, Myristat, Lithocholat, Fettsäuren, Steroide usw. handeln kann.
Beispiele für PAR1-Pepducin-Lipopeptide sind in TABELLE 1 dargestellt.
TABELLE 1
In weiteren Ausführungsformen sieht die Erfindung kleinmolekulare Inhibitoren von PAR-1-Signalisierungsaktivität vor, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, die Verbindung SCH 530348. SCH 530348 blockiert den Plättchen-PAR-1-Rezeptor, an den sich Thrombin bindet, inhibiert so die Thrombin-induzierte Aktivierung von Plättchen und ist daher als Thrombin-Rezeptor-Antagonist (TRA) klassifiziert. SCH 530348 ist näher beschrieben in Chintala et al., J Pharmacol Sci 108, 433–438 (2008), Chackalamannil et al., J. Med. Chem. 2008, 51, 3061–3064, und der veröffentlichten US-Patentanmeldung US 2008/0234236, deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit aufgenommen wird. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung schließt ein Verweis auf die Verbindung SCH 530348 alle Isomere, Enantiomere und chemischen Derivate von SCH 530348 ein.
In wiederum einer weiteren Ausführungsform kann ein Antagonist des MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungswegs eine Tetracyclinverbindung oder ein Tetracyclinderivat wie etwa Doxycyclin sein. Tetracycline sind eine Gruppe von Breitspektrum-Antibiotika. Sie werden wegen ihrer Vier-(”Tetra-”)Kohlenstoffring-(”-cycl-”)-Derivatbildung (”-ine”) so genannt. Spezifischer sind sie als ”eine Subklasse der Polyketide mit einem Octahydrotetracen-2-carboxamid-Skelett” definiert. Zusammen sind sie als Derivate von polyzyklischem Naphthacencarboxamid mit folgender Grundstruktur bekannt:
Beispiele für Tetracyclinderivate, die auf eine inhibitorische Aktivität auf dem MMP-1-mediierten PAR-1-Signalisierungsweg getestet werden können, umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, Demeclocyclin, Doxycyclin, Lymecyclin, Meclocyclin, Methacyclin, Minocyclin, Rolitetracyclin und Tigecyclin. Nicht-einschränkende Beispiele für Tetracyclinderivate sind beschrieben in US-Pat. Nr. 2,980,584 ; US-Pat. Nr. 2,990,331 ; US-Pat. Nr. 3,062,717 ; US-Pat. Nr. 3,165,531 ; US-Pat. Nr. 3,454,697 ; US-Pat. Nr. 3,557,280 ; US-Pat. Nr. 3,674,859 ; US-Pat. Nr. 3,957,980 ; US-Pat. Nr. 4,018,889 ; US-Pat. Nr. 4,024,272 und US-Pat. Nr. 4,126,680 , deren Inhalt durch Verweis hier aufgenommen wird.
III ARZNEIMITTELVERABREICHUNG
Inhibitoren der MMP-1-mediierten PAR-1-Aktivierung können Säugetieren, einschließlich Menschen, entweder allein oder in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, gemäß üblicher pharmazeutischer Praxis verabreicht werden. Die Verbindungen können oral oder parenteral verabreicht werden, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intraperitonealer, subkutaner, rektaler und topischer Verabreichungswege.
Inhibitoren der MMP-1-mediierten PAR-1-Aktivierung umfassen bekannte MMP-1- oder PAR-1-Inhibitoren, wie vorliegend definiert.
Die Verbindungen oder ”Wirkstoffe” können in Kombination mit einem oder mehr weiteren bekannten antithrombotischen Wirkstoffen oder pharmazeutischen Wirkstoffen verwendet werden, einschließlich z. B. eines TP-Antagonisten, eines Thromboxan-Antagonisten, eines ADP-Rezeptor-Antagonisten oder eines Faktor-Xa-Antagonisten. Bei Verwendung in Kombination versteht sich, dass niedrigere Dosierungen eines oder mehrerer der kombinierten antithrombotischen Wirkstoffe zum Erzielen einer gewünschten Wirkung genutzt werden können, da die zwei oder mehr antithrombotischen Wirkstoffe additiv oder synergistisch wirken können. Dementsprechend kann eine therapeutisch wirksame Dosierung eines oder mehrerer kombinierter antithrombotischer Wirkstoffe weniger als 90%, weniger als 80%, weniger als 70%, weniger als 60%, weniger als 50%, weniger als 40%, weniger als 30% oder weniger als 20% der therapeutisch wirksamen Dosierung entsprechen, wenn der antithrombotische ”Wirkstoff” allein verabreicht wird. Die zwei oder mehr antithrombotischen Wirkstoffe können gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten, auf demselben Verabreichungsweg oder auf unterschiedlichen Verabreichungswegen verabreicht werden. Beispielsweise können zu einer Regulierung des Dosierungsplans die antithrombotischen Wirkstoffe separat in individuellen Dosierungseinheiten gleichzeitig oder zu unterschiedlichen, koordinierten Zeiten verabreicht werden. Die jeweiligen Substanzen können auf ähnliche Weise wie oben beschrieben in separaten Einheitsdosierungsformen individuell formuliert sein. Feste Kombinationen der antithrombotischen Wirkstoffe sind jedoch praktischer und bevorzugt, insbesondere in Tabletten- oder Kapselform zur oralen Verabreichung. Somit sieht die vorliegende Erfindung auch Einheitsdosisformulierungen vor, die zwei oder mehr antithrombotische Wirkstoffe umfassen, wobei jeder thrombotische ”Wirkstoff” bei Verabreichung in der Kombination in einer therapeutisch wirksamen Menge vorhanden ist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die den aktiven Bestandteil enthalten, können in einer zur oralen Anwendung geeigneten Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Lutschtabletten, wässrige oder ölige Suspensionen, dispergierbare Pulver oder Granulate, Emulsionen, Hart- oder Weichkapseln oder Sirupe oder Elixiere. Zur oralen Anwendung bestimmte Zusammensetzungen können nach jedem in der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen präpariert sein, und diese Zusammensetzungen können einen oder mehr ausgewählte Wirkstoffe aus der Gruppe enthalten, die aus Süßmitteln, Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Konservierungsstoffen besteht, um pharmazeutisch elegante und wohlschmeckende Präparate bereitzustellen. Tabletten enthalten den aktiven Bestandteil in Beimischung mit nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen, die zur Herstellung von Tabletten geeignet sind. Diese Hilfsstoffe können beispielsweise inerte Verdünnungsmittel sein, wie etwa Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat; granulierende und disintegrierende Wirkstoffe, beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Natrium-Crosscarmellose, Maisstärke oder Alginsäure; Bindemittel, beispielsweise Stärke, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon oder Akazie, und Gleitmittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talcum. Die Tabletten können unbeschichtet sein, oder sie können durch bekannte Techniken beschichtet sein, um den unangenehmen Geschmack des Arzneimittels zu maskieren oder die Zersetzung und Absorption im Magen-Darm-Trakt zu verzögern und dadurch eine anhaltende Wirkung über einen längeren Zeitraum zu liefern. Beispielsweise können ein wasserlöslicher Geschmacksmaskierungsstoff wie etwa Hydroxypropylmethylcellulose oder Hydroxypropylcellulose oder ein Zeitverzögerungsstoff wie etwa Ethylcellulose, Celluloseacetobutyrat, eingesetzt werden.
Formulierungen zur oralen Anwendung können auch als Hartgelatinekapseln vorgelegt werden, bei denen der aktive Bestandteil mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, beispielsweise Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin, vermischt ist, oder als Weichgelatinekapseln, bei denen der aktive Bestandteil mit wasserlöslichem Träger wie etwa Polyethylenglykol oder einem Ölmedium, beispielsweise Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl, vermischt ist.
Wässrige Suspensionen enthalten den aktiven Stoff in Beimischung mit Hilfsstoffen, die zur Herstellung wässriger Suspensionen geeignet sind. Solche Hilfsstoffe sind Suspensionsmittel, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragantgummi und Gummiarabikum; Dispersions- oder Netzmittel können ein natürlich vorkommendes Phosphatid sein, beispielsweise Lecithin, oder Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit Fettsäuren, beispielsweise Polyoxyethylenstearat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, beispielsweise Heptadecaethylen-Oxycetanol, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Partialestern, die von Fettsäuren und einem Hexitol abgeleitet sind, wie etwa Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit Partialestern, die von Fettsäuren und Hexitolanhydriden abgeleitet sind, beispielsweise Polyethylensorbitanmonooleat. Die wässrigen Suspensionen können auch einen oder mehr Konservierungsstoffe enthalten, beispielsweise Ethyl oder n-Propyl-p-hydroxybenzoat, einen oder mehr Farbstoffe, einen oder mehr Geschmackstoffe und ein oder mehr Süßmittel wie etwa Sucrose, Saccharin oder Aspartam.
Ölige Suspensionen können durch Suspendieren des aktiven Bestandteils in einem pflanzlichen Öl formuliert sein, beispielsweise Arachisöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosöl, oder in Mineralöl wie etwa flüssigem Paraffin. Die öligen Suspensionen können ein Verdickungsmittel enthalten, beispielsweise Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol. Süßmittel wie etwa die oben aufgeführten sowie Geschmacksstoffe können hinzugefügt werden, um ein wohlschmeckendes orales Präparat bereitzustellen. Diese Zusammensetzungen können durch den Zusatz eines Antioxidationsmittels wie etwa Butylhydroxyanisol oder alpha-Tocopherol konserviert werden.
Dispergierbare Pulver und Granulate, die zum Präparieren einer wässrigen Suspension durch Zusatz von Wasser geeignet sind, stellen den aktiven Bestandteil in Beimischung mit einem Dispersions- oder Netzmittel, Suspensions-”Wirkstoff” und einem oder mehr Konservierungsstoffen bereit. Beispiele für geeignete Dispersions- oder Netzmittel und Suspensionsmittel sind die oben genannten. Zusätzliche Hilfsstoffe, beispielsweise Süßmittel, Geschmacks- und Farbstoffe, können ebenfalls vorhanden sein. Diese Zusammensetzungen können durch den Zusatz eines Antioxidationsmittels wie etwa Ascorbinsäure konserviert werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch die Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion haben. Die Ölphase können ein pflanzliches Öl, beispielsweise Olivenöl oder Arachisöl, oder ein Mineralöl, beispielsweise flüssiges Paraffin, oder Mischungen daraus sein. Geeignete Emulgationsmittel können sein: natürlich vorkommende Phosphatide, beispielsweise Sojabohnenlecithin, und Ester oder Partialester, abgeleitet aus Fettsäuren und Hexitolanhydriden, beispielsweise Sorbitanmonooleat, und Kondensationsprodukte der genannten Partialester mit Ethylenoxid, beispielsweise Polyoxyethylensorbitanmonooleat. Die Emulsionen können auch Süßmittel, Geschmacksstoffe, Konservierungsstoffe und Antioxidationsmittel enthalten.
Sirupe und Elixiere können mit Süßmitteln, beispielsweise Glycerin, Propylenglycol, Sorbitol oder Sucrose formuliert sein. Solche Formulierungen können auch ein Demulzens, einen Konservierungsstoff, Geschmacks- und Farbstoffe und Antioxidationsmittel enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Form steriler injizierbarer wässriger Lösungen haben. Zu den akzeptablen Vehikeln und Lösungsmitteln, die einsetzbar sind, zählen Wasser, Ringerlösung und isotonische Natriumchloridlösung.
Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Öl-in-Wasser-Mikroemulsion sein, bei welcher der aktive Bestandteil in der Ölphase aufgelöst ist. Beispielsweise kann der aktive Bestandteil zuerst in einem Gemisch aus Sojabohnenöl und Lecithin aufgelöst werden. Sodann wird die Öllösung in ein Wasser-Glycerin-Gemisch gegeben und zu einer Mikroemulsion verarbeitet.
Die injizierbaren Lösungen oder Mikroemulsionen können durch lokale Bolusinjektion in den Blutstrom eines Patienten eingeleitet werden. Alternativ kann es vorteilhaft sein, die Lösung oder Mikroemulsion so zu verabreichen, dass eine konstante zirkulierende Konzentration der vorliegenden Verbindung aufrechterhalten wird. Zum Aufrechterhalten einer solchen konstanten Konzentration kann eine Vorrichtung zur kontinuierlichen intravenösen Zuführung verwendet werden. Ein Beispiel für eine solche Vorrichtung ist die intravenöse Pumpe Deltec CADD-PLUS[TM], Modell 5400.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können die Form einer sterilen injizierbaren wässrigen oder öligen Suspension zur intramuskulären und subkutanen Verabreichung haben. Diese Suspension kann nach dem Stand der Technik unter Verwendung der oben genannten geeigneten Dispergier- oder Netzmittel und Suspensionsmittel formuliert sein. Das sterile injizierbare Präparat kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht-toxischen parenteral-akzeptablen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, beispielsweise als Lösung in 1,3-Butandiol. Daneben werden herkömmlicherweise sterile, nichtflüchtige Öle als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde nichtflüchtige Öl eingesetzt werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Daneben finden bei der Präparation von injizierbaren Stoffen Fettsäuren wie etwa Ölsäure Verwendung.
Die Verbindungen für die vorliegende Erfindung können in intranasaler Form durch topische Verwendung von intranasalen Vehikeln und Zuführungsvorrichtungen verabreicht werden, oder auf transdermalen Wegen mithilfe von transdermalen Hautpflastern, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Zur Verabreichung in Form eines transdermalen Zufuhrsystems erfolgt die Verabreichung der Dosis natürlich kontinuierlich und nicht mit Unterbrechungen über die Dauer des Dosierungsplans. Erfindungsgemäße Verbindungen können auch als Zäpfchen unter Einsatz von Basisstoffen wie etwa Kakaobutter, glycerinierter Gelatine, hydrierten pflanzlichen Ölen, Gemischen aus Polyethylenglycolen mit verschiedenen Molekulargewichten und Fettsäureestern von Polyethylenglycol zugeführt werden. Erfindungsgemäße Verbindungen können auch in Form von Liposom-Zufuhrsystemen verabreicht werden, wie etwa kleinen unilamellaren Vesikeln, großen unilamellaren Vesikeln und multilamellaren Vesikeln. Liposome können aus vielfältigen Phospholipiden gebildet sein, wie etwa Cholesterin, Stearylamin oder Phosphatidylcholin. Erfindungsgemäße Verbindungen können auch durch Verwendung von monoklonalen Antikörpern als individuellen Trägern zugeführt werden, an welche die Moleküle der Verbindung gekoppelt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch mit löslichen Polymeren an als Target verwendbare Arzneimittelträger gekoppelt sein. Solche Polymere können Polyvinylpyrrolidon, Pyran-Copolymer, Polyhydroxypropylmethacrylamidphenol, Polyhydroxyethylaspartamidphenol oder Polyethylenoxidpolylysin, das mit Palmitoylresten substituiert ist, umfassen. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen an eine Klasse biologisch abbaubarer Polymere gekoppelt sein, die zum Erreichen einer kontrollierten Freisetzung eines Arzneimittels sinnvoll sind, beispielsweise Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Copolymere von Polymilch- und Polyglycolsäure, Polyepsiloncaprolacton, Polyhydroxybuttersäure, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanacrylate und vernetzte oder amphipathische Blockcopolymere von Hydrogelen.
Wenn eine erfindungsgemäße Zusammensetzung einem menschlichen Subjekt verabreicht wird, bestimmt der verschreibende Arzt normalerweise die Tagesdosis, die allgemein nach Alter, Gewicht und Reaktion des individuellen Patienten sowie nach der Schwere der Symptome des Patienten variiert. In einer Ausführungsform wird eine geeignete Menge eines ”Wirkstoffs” einem Säugetier verabreicht, das einer Behandlung gegen Thrombose unterzogen wird. Die Verabreichung erfolgt in einer Menge des ”Wirkstoffs” zwischen circa 0,1 mg/kg Körpergewicht bis circa 60 mg/kg Körpergewicht pro Tag oder zwischen 0,5 mg/kg Körpergewicht bis circa 40 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Eine weitere therapeutische Dosierung, welche die vorliegende Zusammensetzung umfasst, enthält von circa 0,01 mg bis circa 1000 mg Wirkstoff. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Dosierung von circa 1 mg bis circa 5000 mg Wirkstoff.
IV KOMBINATIONSTHERAPIE
Eine bestimmungsgemäße Verwendung der hier beschriebenen PAR-1-Signalisierungs-Wirkstoffe ist die prophylaktische Behandlung von Patienten mit dem Risiko eines thrombotischen Erkrankungszustandes oder einer Rezidivierung eines thrombotischen Erkrankungszustandes, wie etwa Atherosklerose. Patienten, die sich mit Risikofaktoren wie etwa hohem Blutdruck oder hohen Cholesterinspiegeln vorstellen, würden nach einem vom Arzt verordneten täglichen Behandlungsplan eine therapeutisch wirksame Dosis des Wirkstoffs erhalten. Um sicherzustellen, dass die Behandlung keine unerwünschten Nebenwirkungen hat, wäre eine genaue Überwachung der Patienten erforderlich. Die angemessene Dosierung würde von der Schwere der Risikofaktoren sowie dem Alter, Geschlecht des Patienten und davon abhängen, ob der Patient familiäre Vorbelastung mit thrombotischem Erkrankungszustand oder eine andere genetische Prädisposition zu thrombotischem Erkrankungszustand mitbringt. In einer Ausführungsform kann der hier beschriebene Wirkstoff prophylaktisch einem Patienten verabreicht werden, der einem erhöhten Thromboserisiko unterliegt, beispielsweise nach einer Operation oder nach der Implantation einer medizinischen Vorrichtung wie etwa eines Stents oder von künstlichen Organen wie etwa einem künstlichen Herz.
Weiterhin wird durch die vorliegende Anmeldung die Kombinationstherapie des hier beschriebenen ”Wirkstoffs” mit einem oder mehreren Arzneimitteln erwogen, die für die Behandlung bei einem oder mehr Risikofaktoren für einen thrombotischen Erkrankungszustand bekannt sind.
In einer Ausführungsform können die Arzneimittel andere bekannte Inhibitoren von Plättchenaktivierung und -aggregation sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Inhibitoren von Protease-aktivierten (PAR-)Rezeptoren, Inhibitoren von MMP-1 oder MMP-2 Aktivität und Inhibitoren einer Thrombin-mediierten Aktivierung von PAR-1 sowie Kombinationen daraus.
Beispielsweise kann eine Kombinationstherapie bekannte Inhibitoren der Plättchenaggregation umfassen wie etwa diejenigen, die beschrieben sind in US-Patent Nr. 4,529,596 ; US-Patent Nr. 4,847,265 ; US-Patent Nr. 6,429,210B1 , US-Patent Nr. 5,288,726 ; US-Patent Nr. 6,693,115 und den US-Patentanmeldungen Nr. 2008/0214599 oder 2003/0224999, deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit aufgenommen wird.
In einem weiteren Beispiel kann eine Kombinationstherapie mit dem hier beschriebenen ”Wirkstoff” bekannte Inhibitoren der Matrix-Metalloproteinase einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, FN-439, MMP-200 und Gewebeinhibitoren der Metalloprotease (TIMPs einschließlich TIMP1, TIMP2, TIMP3 und TIMP4) umfassen. MMP-Inhibitoren sind näher beschrieben in US-Pat. Nr. 3,784,701 und WO 96/15096 . MMP-Peptid-Inhibitoren sind beschrieben in US-Pat. Nr. 5,300,501 ; 5,530,128 ; 5,455,258 ; 5,552,419 ; WO 95/13289 ; WO 96/11209 und US-Patentveröffentlichung Nr. 2004/0127420 , die alle durch Verweis hier aufgenommen werden.
In weiteren Beispielen kann eine Kombinationstherapie mit dem hier beschriebenen ”Wirkstoff” Gerinnungshemmer umfassen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf einen Thrombin-Inhibitor (z. B. Melagatran, E-5555, MCC-977 und Bivalirudin (Angiomax^TM)), Faktor-Xa-Inhibitor, Gewebefaktor-Inhibitor, Faktor-VIIa-Inhibitor, Faktor-IXa-Inhibitor, Faktor-Va-Inhibitor, Faktor-XIa-Inhibitor, Faktor-XIIa-Inhibitor, TAFI.alpha.-Inhibitor, .alpha.2-Antiplasmin-Inhibitor, PAI-1-Inhibitor, PAI-2-Inhibitor, PAI-3-Inhibitor, Prothrombinase-Inhibitor, gerinnungshemmendes Peptid der Zecke, Protein C, Warfarin, Heparin, Lepirudin, Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel, Tirofiban und Eptifibatid.
In weiteren Ausführungsformen kann eine Kombinationstherapie mit dem hier beschriebenen ”Wirkstoff” Inhibitoren der Plättchenfunktion umfassen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf GPIIb/IIIa-Rezeptor-Inhibitoren, ADP-Rezeptoren-(z. B. P2Y.sub.1- und P2Y.sub.12-)Inhibitoren, Thrombin-Rezeptor-(z. B. PAR-1- und PAR-4-)Inhibitor, CD40-Inhibitoren, CD40L-(CD40-Ligand-)Inhibitoren, Gas6-Inhibitoren, Gas6-Rezeptor-axl-Inhibitoren, Gas6-Rezeptor-Inhibitoren Sky, Gas6-Rezeptoren-Mer-Inhibitor, P-Selectin-Inhibitor, P-Selectin-Rezeptor-PSGL-1-Inhibitoren, Thromboxan-Inhibitoren, Synthetase-Inhibitoren, Fibrinogen-Rezeptor-Antagonisten, Prostacyclin-Mimetika, Phosphodiesterase-Inhibitoren, RANTES-Inhibitor, Phosphoinositide-3-Kinase-(PI(3)K-)Isoform.beta.-Inhibitoren, Phosphoinositid-3-Kinase-(PI(3)K-)Isoform.gamma.-Inhibitoren, Eptifibatid, Tirofiban, Ticlopidin und Clopidogrel.
In weiteren Ausführungsformen kann der hier beschriebene ”Wirkstoff” mit bekannten Arzneimitteln kombiniert werden, die ein Arzt zur Behandlung von medizinischen Zuständen verwenden kann, die bekanntermaßen das Risiko einer Herz-Kreislauf-Erkrankung erhöhen. Beispielsweise kann der hier beschriebene ”Wirkstoff” mit einem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor, auch als Statin bekannt, kombiniert werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Simvastatin, Pravastatin, Rivastatin, Mevastatin, Fluindostatin, Cerivastatin, Velostatin, Fluvastatin, Dalvastatin, Dihydrocompactin, Compactin oder Lovastatin; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz von Simvastatin, Pravastatin, Rivastatin, Cerivastatin, Mevastatin, Fluindostatin, Velostatin, Fluvastatin, Dalvastatin, Dihydrocompactin, Compactin, Lovastatin oder pharmazeutisch akzeptable Salze davon. Ähnliche Kombinationstherapiepläne unter Verwendung von Statinen sind offenbart in der US-Patentveröffentlichung Nr. 2005/0020607 , deren Inhalt hiermit in seiner Gesamtheit durch Verweis hier aufgenommen wird.
In bestimmten Ausführungsformen kann die Kombinationstherapie mit dem hier beschriebenen ”Wirkstoff” ein bekanntes Arzneimittel umfassen, das zur Prävention gegen oder Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustandes verwendet wird. Bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise, kann das Arzneimittel ein solches sein, das bereits durch die entsprechende staatliche Behörde oder das entsprechende regulatorische Gremium zur Anwendung an Menschen oder Tieren für unbedenklich und wirksam erklärt wurde. Beispielsweise sind zur Anwendung am Menschen zugelassene Arzneimittel durch die FDA unter 21 C. F. R., Sektionen 330.5, 331 bis 361 sowie 440 bis 460 aufgeführt, die durch Verweis hier aufgenommen werden; Arzneimittel zur veterinär medizinischen Verwendung sind durch die FDA unter 21 C. F. R., Sektionen 500 bis 589, aufgeführt, die durch Verweis hier aufgenommen werden.
V DIAGNOSTISCHE KITS
Zur Bestimmung des Niveaus aktivierter PAR-1 in einem Patienten entnommenen Plättchen können vielfältige Verfahren verwendet werden. Allgemein umfassen diese Verfahren ein Kontaktieren eines Wirkstoffs, der sich selektiv an das MMP-1-mediierte PAR-1-Peptid bindet (Reste 1–39), wie etwa eines Antikörpers mit einer Probe, um das Niveau des Peptids in der Probe zu bewerten. In einer weiteren Ausführungsform detektieren die Verfahren MMP-1-gespaltenen PAR-1 oder Parameter, die mit einer PAR-1-Aktivierung assoziiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Antikörper ein detektierbares Label. Antikörper können polyklonal oder bevorzugt monoklonal sein. Es kann ein intakter Antikörper oder ein Fragment davon (z. B. Fab oder F(ab)₂) verwendet werden. Der Ausdruck ”gelabelt” soll mit Bezug auf die Sonde oder den Antikörper ein direktes Labeln der Sonde oder des Antikörpers durch Koppeln (d. h. physisches Verbinden) einer detektierbaren Substanz mit der Sonde oder dem Antikörper sowie ein indirektes Labeln der Sonde oder des Antikörpers durch Reaktivität mit einer detektierbaren Substanz einschließen.
In-vitro-Techniken zur Detektion von PAR-1(1–39)-Peptid oder MMP-1-gespaltenem PAR-1 umfassen Enzym-verbundene immunosorbente Assays (ELISAs), Immunpräzipitationen, Immunfluoreszenz, Enzym-Immunassay (EIA), Radioimmunassay (RIA) und Western-Blot-Analyse.
Die Erfindung umfasst auch Kits zum Detektieren des Vorhandenseins von aktiviertem PAR-1 in einer biologischen Probe. Beispielsweise kann das Kit eine Verbindung oder einen Wirkstoff mit der Fähigkeit zum Detektieren von PAR-1-Peptid (1–39) oder MMP-1-gespaltenem PAR-1 in einer biologischen Probe und einen Standard umfassen. Die Verbindung oder der Wirkstoff kann in einem geeigneten Behälter verpackt sein. Das Kit kann weiterhin Anweisungen zur Verwendung des Kits zum Detektieren von PAR-1-Peptid (1–39) oder MMP-1-gespaltenem PAR-1 umfassen.
Bei Kits auf Antikörperbasis kann das Kit umfassen: (1) einen ersten Antikörper (z. B. angebunden an einen festen Träger), der sich an ein PAR-1-(1–39-)-Peptid bindet; und optional (2) einen zweiten, davon verschiedenen Antikörper, der sich entweder an das Peptid oder den ersten Antikörper bindet und an einen detektierbaren Wirkstoff konjugiert ist. Das Kit kann auch ein Puffermittel, einen Konservierungsstoff oder ein Proteinstabilisierungsmittel umfassen. Das Kit kann auch Komponenten umfassen, die zum Detektieren des detektierbaren Wirkstoffs notwendig sind (z. B. ein Enzym oder ein Substrat). Das Kit kann auch eine Kontrollprobe oder eine Serie von Kontrollproben enthalten, die im Assay verarbeitet und mit der enthaltenen Untersuchungsprobe verglichen werden können. Jede Komponente des Kits kann in einem individuellen Behälter eingeschlossen sein, und die verschiedene Behälter können sich alle in einer gemeinsamen Packung befinden, zusammen mit Anweisungen zur Interpretation der Ergebnisse von mit dem Kit durchgeführten Assays.
Die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren können Subjekte identifizieren, die einen thrombotischen Erkrankungszustand oder ein Risiko der Entwicklung eines solchen aufweisen. Die hier beschriebenen prognostischen Assays sind zur Bestimmung dessen verwendbar, ob einem Subjekt ein Wirkstoff (z. B. ein Antagonist, Peptidmimetikum, Protein, Peptid, eine Nukleinsäure, ein Kleinmolekül oder ein anderes in Frage kommendes Arzneimittel) verabreicht werden kann.
In einem weiteren Aspekt weist die Erfindung ein Computermedium mit mehreren digital kodierten Datensätzen auf. Jeder Datensatz umfasst einen Wert, der das Niveau von aktiviertem PAR-1 in einer Probe repräsentiert, und einen Deskriptor der Probe. Der Deskriptor der Probe kann eine Kennung der Probe, ein Subjekt, aus dem die Probe abgeleitet wurde (z. B. ein Patient), eine Diagnose oder eine Behandlung (z. B. eine bevorzugte Behandlung) sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Datensatz weiterhin Werte, die das Niveau anderer Risikofaktoren repräsentieren, die mit einem thrombotischen Erkrankungszustand assoziiert sind. Der Datensatz kann als Tabelle strukturiert sein, z. B. als eine Tabelle, die Teil einer Datenbank wie etwa einer relationalen Datenbank ist (z. B. einer SQL-Datenbank der Datenbankumgebungen von Sybase oder Oracle).
Außerdem ist ein Verfahren zur Bewertung einer Probe enthalten. Das Verfahren umfasst ein Bereitstellen einer Probe, z. B. von dem Subjekt, und ein Bestimmen einer PAR-1-Aktivierung. Das Verfahren kann weiterhin ein Vergleichen des Wertes oder des Profils (d. h. von mehreren Werten) mit einem Referenzwert oder Referenzprofil umfassen.
Das Verfahren kann zum Diagnostizieren und Überwachen eines thrombotischen Erkrankungszustandes bei einem Subjekt verwendet werden, wobei eine Erhöhung oder Reduzierung der PAR-1-Aktivierung darauf hinweist, dass das Subjekt einen thrombotischen Erkrankungszustand aufweist oder für denselben disponiert ist. Das Verfahren kann auch zum Überwachen der Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustandes bei einem Subjekt verwendet werden. Das PAR-1-Aktivierungsprofil kann mit einem Referenzprofil oder mit einem Profil, das dem Subjekt vor der Behandlung oder vor Einsetzen der Störung abgenommen wurde, verglichen werden.
In einem weiteren Aspekt weist die Erfindung ein Verfahren zum Bewerten eines Subjektes auf. Das Verfahren umfasst: a) Entnehmen einer Probe von einem Subjekt, z. B. durch eine Behandlungsperson, z. B. einer Behandlungsperson, die dem Subjekt die Probe entnimmt; b) Bestimmen eines PAR-1-Aktivierungsprofils für die Probe. Optional umfasst das Verfahren weiterhin einen oder beide der folgenden Schritte: c) Vergleichen des Subjektprofils mit einem oder mehr Referenzprofilen und d) Auswählen des Referenzprofils, das dem Subjekt-Referenzprofil am ähnlichsten ist. Zum Vergleichen von zwei Referenzprofilen sind vielfältige statistische Routinemaßnahmen verwendbar.
Außerdem werden durch die Erfindung Kits zur Detektion von Polymorphismus/Polymorphismen in MMP-1-Genen und assoziierten Faktoren erwogen (etwa natürliche MMP-1-Inhibitoren wie etwa TIMPs), die einen Patienten für einen thrombotischen Erkrankungszustand prädisponieren können. Mehrere Polymorphismen in den Promotoren einer Anzahl von MMP-Genen, einschließlich MMP-1, sind bereits gut charakterisiert. Es wird angenommen, dass diese Polymorphismen die jeweilige MMP-Produktion auf Allele-spezifische Weise beeinflussen. Beispielsweise enthält die Promotor-Region des MMP-1-Gens Konsens-Sequenzen für DNA-Bindungsproteine wie etwa AP-1, AP-2, Ets/PEA-3 sowie Elemente, die auf Glucocorticoide, Retinsäure und zyklisches AMP ansprechen (Rutter et al., 1997). Ein Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) wurde an Position –1607 bp innerhalb der MMP-1 Promotor-Region identifiziert, wodurch die Insertion eines zusätzlichen Guanin-(G-)Restes eine überzählige Ets-Bindungsstelle erzeugt (Rutter et al., (1998) Cancer Res 58: 5321–5325). Ein Promotor, der diesen SNP enthält (wodurch der 2G-Genotyp entsteht) zeigt signifikant 'höhere' Transkriptionsaktivität in normalen und malignen Zellen, verglichen mit Zellen, die ein 1G-Allel (Rutter et al., 1998; Wyatt et al., (2002) Cancer Res 62: 7200–7202) mit 'niedrigerer' Transkriptionsaktivität besitzen. Daher kann dieser MMP-1-Polymorphismus ein Prädiktor einer angeborenen Prädisposition für einen thrombotischen Erkrankungszustand sein.
Kit-Komponenten zur Detektion von Polymorphismus sind in der Technik bekannt und können Polymorphismus-spezifische Primer und Reagenz zur PCT-Amplifikation umfassen.
VI PLÄTTCHEN-LAGERMEDIUM
Plättchen können als Nebenprodukt aus Vollblutspenden und aus Plättchenpherese gewonnen werden. Gespendetes Blut wird typischerweise verarbeitet, um verschiedene Blutkomponenten zu trennen, einschließlich Plättchen, die separat verwendbar sind. Beispielsweise kann eine Einheit gespendetes Vollblut verarbeitet werden, um rote Blutkörperchen, gewöhnlich konzentriert als gepackte rote Blutkörperchen (PRC), Plättchen, gewöhnlich konzentriert als Plättchenkonzentrat (PC), und Plasma zu trennen. Nach typischen Verarbeitungsprotokollen kann Blut, neben anderen Fraktionen, zu einer plättchenhaltigen Flüssigkeit verarbeitet werden, z. B. zu plättchenreichem Plasma (PRP) oder Buffy-Coat, die weiter zu dem PC verarbeitet wird (einschließlich Zentrifugieren). Außerdem können mehrere Einheiten Plättchen oder Buffy-Coat vor der Herstellung des Transfusions-Endproduktes zusammengefasst werden.
Nach aktuell üblicher Praxis für Blutbanken kann in einem geschlossenen (sterilen) System produziertes Blut nur bis zu 5 Tage gelagert werden, bevor es als Transfusionsprodukt verwendet wird. Nach einigen Verarbeitungsprotokollen wird eine Plättchen-Additivlösung zu der plättchenhaltigen Flüssigkeit (z. B. dem Buffy-Coat) zugesetzt, und die Plättchen werden in der Additivlösung resuspendiert, bevor die Plättchen gelagert werden, wobei der größte Teil des Plasmas vor Zusatz der Additivlösung entfernt wird. Alternativ können Plättchen in ihrem eigenen Plasma gelagert werden.
Zum Bereitstellen einer optimalen Funktion und Verwendbarkeit der Plättchen während der Lagerung wird empfohlen, die plättchenhaltige Flüssigkeit (mit oder ohne eine Additivlösung) während der Lagerperiode auf einem pH-Wert im Bereich von 6,8 bis 7,4 (europäische Praxis) oder auf einem pH-Wert von 6,2 oder darüber (US-Praxis) zu halten. Außerdem wird empfohlen, die Plättchen bei Vorhandensein von Glucose oder Dextrose zu lagern, um die Plättchenqualität zu bewahren. Außerdem können Plättchen während der Verarbeitung von Blut zu Konzentrat aktiviert werden (unter anderem während der nachfolgenden Resuspendierung der Plättchen in der Additivlösung), was zu Plättchenaggregation und einem Verlust der Verwendbarkeit führt. Übliche, zu dem Plättchen-Lagermedium zugesetzte Komponenten umfassen daher einen Gerinnungshemmer, typischerweise ein Citrat.
Weitere Beispiele für das Medium und die Verfahren, die bei Blutspende, -präparierung, -lagerung und -transport üblicherweise verwendet werden, finden sich in vielfältiger Literatur, z. B. dem "Textbook Of Blood Banking And Transfusion Medicine" von Sally v. Rudmann, verlegt durch Elsevier Health Sciences, 2005.
Aufgrund der momentanen Entdeckung der Rolle von MMP-1-aktiviertem PAR-1 bei der Plättchenaggregation ist es ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, in einem plättchenhaltigen Medium zu jedem Zeitpunkt während Präparierung, Lagerung oder Transports eines solchen Mediums den erfindungsgemäßen ”Wirkstoff” bereitzustellen, der eine proteolytische Spaltung zwischen der Asparaginsäure an Position 39 (d39) und dem Prolin an Position 40 (p40) des PAR-1 auf der Oberfläche der Plättchen wesentlich inhibiert. In einer Ausführungsform inhibiert der erfindungsgemäße ”Wirkstoff” die Aktivierung von MMP-1 oder MMP-1-enzymatischer Aktivität. In einer weiteren Ausführungsform kann der ”Wirkstoff” die PAR-1-Signalisierungsaktivität nach der proteolytischen Spaltung zwischen der Asparaginsäure an Position 39 (d39) und dem Prolin an Position 40 (p40) der PAR-1 inhibieren. Der erfindungsgemäße ”Wirkstoff” kann zu einem Plättchen-Lagermedium zusätzlich zu oder anstelle eines herkömmlicheren Gerinnungshemmers zugesetzt werden. In einer Ausführungsform verlängert das Lagermedium mit dem erfindungsgemäßen ”Wirkstoff” die Haltbarkeit von darin enthaltenen Plättchen über die gegenwärtigen 5 Tage bei Raumtemperatur (circa 22°C), z. B. um 0, 5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder sogar 7 Tage.
VII MEDIZINISCHE VORRICHTUNGEN
Oberflächen von implantierbaren medizinischen Vorrichtungen wie etwa Stents.
Die hier beschriebene Verbindung ist allein oder in Kombination mit anderen bekannten antithrombotischen Wirkstoffen zum Beschichten medizinischer Vorrichtungen verwendbar.
Beschichtungsverfahren sind in der Technik bekannt. Beispielsweise offenbart die PCT-Anmeldung WO2005/097223 A1 , Stucke et al., ein Verfahren, bei dem ein Gemisch aus Heparin, konjugiert mit photoaktiven Vernetzungsmitteln, mit anderen haltbaren Polymeren wie etwa Poly(butylmethacrylat) und Poly(vinylpyrrolidon) in einer gleichen Beschichtungslösung gelöst oder dispergiert wird und in der Lösung oder nach dem Auftrag der Beschichtung mit UV-Licht vernetzt wird.
Ein weiterer allgemeiner Ansatz, wie er offenbart wird in der US 2005/0191333 A1 , der US 2006/0204533 A1 und der WO 2006/099514 A2 , alle von Hsu, Li-Chien et al., verwendet einen Komplex mit niedrigem Molekulargewicht aus Heparin und einem Gegenion (Stearylkonium-Heparin) oder einen Polyelektrolytkomplex mit hohem Molekulargewicht wie etwa Dextran, Pektin zum Bilden einer antithrombotischen Entität. Diese antithrombotischen Komplexe werden weiterhin in einer Polymermatrix dispergiert, die weiterhin ein Arzneimittel umfassen kann.
Die veröffentlichte US-Patentanmeldung Nr. 2008/0269875 offenbart auch Verfahren zum Aufbringen mehrerer Schichten polymerischer Zusammensetzungen auf eine medizinische Vorrichtung. Eine Schicht kann eine Basisbeschichtung umfassen, die eine Adhäsion weiterer Schichten daran ermöglicht. (Eine) zusätzliche Schicht(en) können in ihren Polymermatrizen bioaktive Wirkstoffe tragen.
Der Inhalt dieser Patentdokumente wird hiermit in seiner Gesamtheit hier aufgenommen.
VIII WEITERE THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN
Die hier beschriebenen MMP-1/PAR-1-Testverbindungen können auch zur Diagnose und Behandlung anderer medizinischer Zustände Verwendung finden, die mit einer PAR-1-Aktivierung assoziiert sind. Medizinische Zustände, bei denen die hier beschriebenen Verbindungen von Nutzen sein können, können beispielsweise, allerdings nicht ausschließlich, umfassen: chronische entzündliche Darmstörungen, einschließlich entzündlicher Darmerkrankung (IBD), Reizdarmsyndrom (IBS) und Colitis ulcerosa und fibrotische Störungen, einschließlich Leberfibrose und Lungenfibrose (siehe beispielsweise Vergnolle et al., J Clin Invest (2004) 114 (10): 1444; Yoshida et al., Aliment Pharmacol Ther (2006) 24 (Suppl 4): 249; Mercer et al., Ann NY Acad Sci (2007) 1096: 86–88; Sokolova und Reiser, Pharmacol Ther (2007) PMID: 17532472), Ischämie-Reperfusionsverletzung einschließlich myokardialer, renaler, cerebraler und intestinaler Ischämie-Reperfusionsverletzung (siehe beispielsweise Strande et al., Basic Res. Cardiol (2007) 102 (4): 350–8; Sevastos et al., Blood (2007) 109 (2): 577–583; Junge et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 100 (22): 13019–24 und Tsuboi et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol (2007) 292 (2): 0678–83. Eine Inhibierung von intrazellulärer PAR1-Signalisierung ist auch verwendbar zum Inhibieren einer Infektion von Zellen mit Herpes-simplex-Virus (HSV1 und HSV2), siehe Sutherland et al., J Thromb Haemost (2007) 5 (5): 1055–61), bei der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD) und Parkinson-Krankheit (siehe Nishimura et al., Cell, Vol. 116, Ausgabe 5, 671–682, (2004), Ishida et al. J Neuropathol Exp Neurol. 2006 Jan; 65 (1): 66–77; Rosenberg (2009), The Lancet Neurology, Vol. 8, 205–216, Sepsis (Kaneider et al., Nature Immunology 8, 1303–1312 (2007)) oder Endometriose (Hirota et al., J Clin Endocrinol Metab 2005; 90 (6): 3673–3679), Krebs und Angiogenese (überprüft von Tsopanoglou NE und Maragoudakis ME. Semin Thromb Hemost. 2007 Okt.; 33 (7): 680–7).
Die Biologie und Pathophysiologie der PAR-Aktivierung in unterschiedlichen Geweben, Zellen und Spezies wurde kürzlich untersucht durch Steinhoff et al., Endocrine Reviews, Februar 2005, 26 (1): 1–43.
Jedes Patent, jede Patentanmeldung, Veröffentlichung oder jedes andere in der Beschreibung genannte Offenbarungsmaterial wird hiermit in seiner Gesamtheit durch Verweis hier aufgenommen. Jedes Material oder jeder Teil davon, dessen Aufnahme durch Verweis in der vorliegenden Anmeldung angegeben ist, der jedoch zu bestehenden Definitionen, Aussagen oder anderem vorliegend genanntem Offenbarungsmaterial in Widerspruch steht, wird nur in dem Umfang aufgenommen, der keinen Widerspruch zwischen diesem aufgenommenen Material und dem Material der vorliegenden Offenbarung entstehen lässt.
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Claims

Wirkstoff, der eine Protease-aktivierter-Rezeptor-1-(PAR-1-)Signalisierungsaktivität eines Patienten wesentlich inhibiert, die durch die proteolytische Spaltung von PAR-1 zwischen Asparaginsäure an Position 39 (D39) und Prolin an Position 40 (P40) hervorgerufen ist, zur Verwendung bei der Behandlung eines thrombotischen Erkrankungszustands oder von Atherosklerose bei dem Patienten, die ein Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Wirkstoffs an den Patienten umfasst, bei dem ein thrombotischer Erkrankungszustand oder Atherosklerose diagnostiziert wurde oder ein wesentliches Risiko besteht, dieselben zu entwickeln.
Wirkstoff zur Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Wirkstoff ein Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie umfasst.
Wirkstoff zur Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Pepducin-Lipopeptid eines Vertreters der PAR-Familie ein PAR1-Pepducin-Lipopeptid umfasst.
Wirkstoff zur Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das PAR1-Pepducin-Lipopeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus P1i3pal-7, P1i3pal-12, P1i3pal-12S, P1i3pal-10S, P1i1pal-11, P1i2pal-7, P1i2pal-11, P1i2pal-16, P1i2pal-21, P1i4pal13 und P1i4pal13R besteht.
Wirkstoff zur Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Wirkstoff die Größe von atherosklerotischer Plaque in der Aorta des Patienten reduziert.