JP4469467B2 - 細胞増殖抑制剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はトロンビンによる細胞の増殖を抑制しうる薬剤に関する。さらに詳しくは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの特定の領域に結合して該レセプターの細胞増殖に関する機能を阻害する薬剤に関する。本発明はまた、新規なヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプター、ならびにそれをコードするＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンは血液凝固カスケードの最終段階に関与し、血栓止血において極めて重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである。一方、トロンビンは血管内皮細胞上のトロンボモジュリンと結合すると、凝固促進的な働きは全くなくなり、逆にプロテインＣの活性化能が数千倍も増強される。このようにして活性化されたプロテインＣは、第Ｖ因子や第ＶIII因子を分解して抗凝固作用を示す。したがって、トロンビンは抗凝固因子としての働きももっていることになる。トロンボモジュリンはトロンビン受容体の一種であるが、最近トロンビンのシグナルを伝達するタイプの受容体（レセプター）が発見された（Vu, T. K. H. et al. :Cell, 64, 1057-1068 (1991)）。最初にクローニングされたシグナル伝達型のトロンビンレセプター（ＰＡＲ１）のｃＤＮＡは４２５個のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、７個の膜貫通領域をもつ典型的なＧ蛋白共役型レセプターの構造を有している。
【０００３】
トロンビンはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞外Ｎ末端側の部位Ａｒｇ（４１）−Ｓｅｒ（４２）を限定分解する。ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＮ末端側が遊離すると、新たに露呈してきたＮ末端部位がアゴニストとして働くという極めて特徴的な構造をしている。すなわちトロンビンはリガンドとして働くのではなく、レセプターに内在しているリガンド（ＴＲＡＰ： Thrombin Receptor Agonist Peptide）を露呈させる役目をもっているだけである。このリガンド部位のＣ末端側には隣接して酸性アミノ酸に富んだ部位がある（−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−）。この部位はトロンビンの天然インヒビターであるヒルの唾液中のヒルジンに相同性が高く、ヒルジン様ドメインとよばれており、トロンビンが結合する部位と考えられている（医学のあゆみ、167, 484-487 (1993)）。
【０００４】
トロンビンのシグナルにより、血小板や血管内皮細胞のみならず、血管平滑筋細胞やマクロファージなども活性化され、遊走し、増殖する。粥状硬化、ＰＴＣＡ後などにＰＡＲ１型トロンビンレセプターが過剰発現していることからみて、このレセプターが各種血管病変の成立に重要な役割を果たすと考えられてきた。
【０００５】
抗トロンビン剤、すなわちトロンビン阻害剤は、前述したようなトロンビンの機能を考えると、血液凝固カスケードを阻害するばかりでなく活性化プロテインＣの生成も抑制することになる。すなわち血管内皮上の凝固と抗凝固のバランスがくずれることが予想され、副作用として、例えば出血が懸念される。
【０００６】
一方、トロンビンレセプター阻害剤は、その作用機序からみて、血液凝固系には全く影響を及ぼさずに細胞表面のレセプターを調節することで、細胞増殖や細胞遊走などの細胞活性化のみを抑制することが期待できる。つまり、トロンビン阻害剤と異なり、トロンビンレセプター阻害剤は、出血という副作用の少ない薬剤となりうると考えれる。さらに、対象疾患のすみわけも可能である。例えば、トロンビン阻害剤は血栓症が対象になるのに対し、トロンビンレセプター阻害剤は細胞増殖性の疾患が対象となる。
【０００７】
次に、トロンビンと細胞上のレセプターとの反応が各種疾患といかに関連するかについて説明する。例えば、リウマチにおける滑膜細胞増殖や、動脈硬化における血小板凝集、平滑筋細胞増殖、あるいはマクロファージ遊走に細胞上のトロンビンレセプターが関与していることを示唆する報告を以下に示す。
【０００８】
リウマチ患者の滑膜組織においてＰＡＲ１型トロンビンレセプターは過剰発現している（Ann. Rheum. Dis., 55: 841-843 (1996)）。また、リウマチ患者の滑液中には活性化トロンビンが多量に存在し、さらに滑液中ではトロンビン生成量を反映するメルクマールであるＴＡＴ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ）が健常人血漿値に比べて数千倍も高値になっていることが最近明らかにされている（J. of Rheumatology, 23, 1505-1511 (1996); Clin. Exp. Rheumatol., 17, 161-170 (1999)）。
【０００９】
さらに、リウマチ患者由来の滑膜細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養液中にトロンビンあるいはＴＲＡＰを添加することによって、トリチウムチミジンの取り込みが増加すること、すなわちトロンビンレセプターの作用を介して増殖することが示唆されている（Clinical Immunology and Immunopathology, 76: 225-233 (1995)）。
【００１０】
また、慢性関節リウマチにおいては増殖した滑膜組織内に新生血管が多くみられることが特徴であるが、トロンビンは血管内皮細胞の管腔形成など血管新生の過程に関与することが示唆されている（Am. J. Physiol., 273, c239-245, 1997）。
【００１１】
さらに、慢性関節リウマチ患者の病態においてマトリックスメタロプロテアーゼの発現が亢進していることが知られている。トロンビンは血管内皮細胞に作用してマトリックスメタロプロテアーゼ−１および−３の発現を亢進するが、そのうちのマトリックスメタロプロテアーゼ−３の発現にＰＡＲ１型トロンビンレセプターが関与していることが報告されている（Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol., 17, 1731-1738 (1997)）。このことから、トロンビンレセプターは慢性関節リウマチの滑膜増生、およびそれに引き続いて起きる骨軟骨破壊の過程に関与していると考えられる。
【００１２】
これらの報告をまとめてみると、関節局所で生成したトロンビンが滑膜組織あるいは滑膜細胞表面上のトロンビンレセプターを介してシグナル伝達を起こし、滑膜細胞増殖が惹起されていると考えられる。
【００１３】
リウマチの発症機序は、最近の研究から滑膜細胞増殖が骨軟骨破壊に到るステップであることが明らかにされている。しかしながら、現行の抗リウマチ薬の作用をみると、痛みを和らげる抗炎症薬が主流であり、滑膜細胞増殖を有効に阻害調節する薬剤は未だない。早期リウマチ治療を考えた場合、滑膜細胞増殖阻害剤は、対症療法のための薬剤ではなく根治薬となりうる。
【００１４】
また、粥状動脈硬化やＰＴＣＡ後の再狭窄などの血管病変の病態進展においては新生内膜肥厚がその大きな要因となっており、その新生内膜組織にはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの過剰発現が認められることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 90, 1614-1621 (1992)）。
【００１５】
一方、トロンビンはｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板の凝集、平滑筋細胞の増殖、マクロファージの遊走を惹起することから、病変部位においても浸潤したマクロファージや血小板、内膜平滑筋細胞表面上のトロンビンレセプターを介するシグナル伝達に関与し、局所炎症亢進、平滑筋細胞増殖を起こしていることが強く示唆される。
【００１６】
また、上記以外にもＰＡＲ１型トロンビンレセプターと疾患に関する報告例のひとつとして、脳神経細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）がトロンビンあるいはＴＲＡＰによってアポトーシスを起こすことが最近報告されており（The Journal of Neuroscience, 17, 5316-5326, (1997)）、トロンビンレセプターと脳神経障害との関連性が示唆されている。また、トロンビンレセプターはある種のヒト肺ガン細胞の転移にも関与しているとの報告もある（Nature Med., 4, 909-914,1998）。
【００１７】
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、その生体内における分布や機能から考えると、上述のリウマチや動脈硬化、脳神経障害に限らず、各種疾患の発症あるいは増悪に関連していると考えられる。
【００１８】
しかしながら、一部の報告ではＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位に対する抗体でラットの血管平滑筋細胞の増殖を抑制しうることが示されているものの（Circ.Res. 82, 980-987 (1998)）、ヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対する阻害剤で細胞増殖を抑制したという報告は現在のところない。また、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位による刺激は細胞の増殖には不十分である可能性も報告されている（FEBS Lett., 15, 225-228 (1993); J Surg. Res., 68, 139-144 (1997); Circulation 95, 1870-1876 (1997)）。さらに近年トロンビンに反応するといわれる複数のレセプター（ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、Ｎ−ＰＡＲ）が報告されており、それらのレセプターと細胞の増殖作用などとの関連については明らかになっていない（Nature, 386, 502-506 (1997); Nature, 394, 690-694 (1998); Biochem. J., 313, 353-368 (1996)）。
【００１９】
次にファージミド技術すなわちファージディスプレイライブラリーについて詳述する。
ファージ表面上に発現されたタンパク質をあたかもファージと融合した巨大タンパク質として扱うことが可能となり、目的の物質（例えば抗原タンパク質）に結合するファージクローンを効率的に選別できるようになった。いったん選択されたファージはたとえ少数であろうとも、大腸菌での感染、増殖過程を経ることにより大量のファージとすることができる。
【００２０】
また、ファージディスプレイベクターの最大の特長は、ファージ表面に提示されたタンパク質の性質（表現型）を指標として選択を行うことにより、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子型）を同時に回収できることであり、したがって遺伝子レベルでの解析を行うことが容易な点である。
【００２１】
特異的結合能をもつファージクローンをライブラリーから選択的に分離するためには、基本的に標的タンパク質への結合、洗浄、そして溶出という操作を行う。さらに、標的タンパク質に特異的に強く結合するファージクローンを濃縮するために、溶出操作後に得られたファージを大腸菌に感染してその増殖を行い、標的タンパク質での選択操作を繰り返す必要がある。このような結合、洗浄、溶出、増殖という過程はパンニングとよばれており、通常この操作を５回程度繰り返すことにより、ライブラリーより特異的結合能をもつファージを選択的に分離することができる。
【００２２】
ファージの結合対象としては、タンパク質のみならずターゲットタンパク質を表面に発現している細胞そのもの、炭水化物、核酸、化学薬品などがある。
また、溶出過程では、酸あるいはアルカリによる処理が一般的に用いられている。
【００２３】
ファージディスプレイは、その原理上いかなるポリペプチドにも応用可能である。例えば抗体のＶＨとＶＬ領域をペプチドリンカーでつないだ一本鎖抗体すなわち単鎖型Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ； ｓｃＦｖ）断片の形で、外殻タンパク質IIIとの融合タンパク質としてファージ表面上に提示することができる。
【００２４】
抗原（標的タンパク質あるいは細胞など）を免疫したマウスのＢリンパ細胞に由来するｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨとＶＬ遺伝子をそれぞれ増幅すると共にクローン化することにより、さまざまな抗原結合部位を提示するファージミドライブラリーを作製することができる。そのライブラリーの大きさは、通常の分子生物学的手法によれば１０の８乗程度である。この方法を用いることで特定の抗原に対して異なる結合特性をもつ単鎖抗体を同時に多種類取得することが可能となる。
【００２５】
従来のトロンビンレセプターに対する抗体は、アミノ末端の細胞外部分のペプチドを合成し、抗原として動物に免疫して取得されている。例えば、ウサギポリクローナル抗体の調製が報告されている（Circulation., 91, 2961-2971 (1995)）。また、ラットのトロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含むペプチドＳＦＦＬＲＮＰＳＥＤＴＦＥＱＦをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体は、ラットの平滑筋細胞のトロンビンによる増殖を抑制したことが報告されている（Circ. Res., 82, 980-987 (1998)）。
【００２６】
しかしながら、本発明者らの検討では、ヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含むペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦを免疫して得たウサギポリクローナル抗体によっては、ヒト血管平滑筋細胞およびヒト関節滑膜細胞のトロンビンによる細胞増殖を抑制することはできなかった。
【００２７】
トロンビンレセプターはリガンドを分子中に内在し、トロンビンによってアミノ末端側が切断されて露呈したＴＲＡＰ部分が分子内の特定部分と相互作用をすることによってシグナル伝達が起こると考えられている。また、トロンビンはトロンビンレセプターを切断した後、レセプター分子から離れて次々とレセプターを活性化していくものと考えられる。こうしたことから、トロンビンレセプターはトロンビンと結合した後に、さらにはトロンビンによって切断された後に、分子内で立体構造変化を起こしていることが示唆されている（米国心臓学会、１９９６年）。
【００２８】
一方ファージミド技術によって得られたｓｃＦｖは、１回のライブラリーの作成により多数の独立したクローンが得られること、またその各クローンは単一の抗原決定基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に産生できるという利点をもつことから、リガンドとレセプターの機能解析、アンタゴニストあるいはアゴニスト分子デザイン、構造活性相関研究に近年利用されるようになってきた。
【００２９】
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖シグナル伝達においては、ＴＲＡＰ部位以外の部位が関与している可能性が考えられてきたが、その部位については今までの情報では特定できていない。
【００３０】
しかしながら、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上に存在する未知の細胞増殖に関与する部位に対する抗体を作成するために、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの全配列を分割した複数の部分ペプチドを作成して免疫し、得られたそれぞれの抗体について細胞増殖抑制活性を検討する方法では効率が悪いといわざるを得ない。
【００３１】
そこで本発明者らは、トロンビン切断部位およびＴＲＡＰ部位を欠損させた組み換えＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを細胞上に発現させ、その機能および構造活性相関に関して鋭意研究を重ねた。その結果、このヒトトロンビンレセプター改変体を発現した細胞を抗原としてマウスに免疫し、構築したファージディスプレイライブラリーからヒトトロンビンレセプターに対するｓｃＦｖを作製することで、トロンビンレセプターの機能を特異的に抑制する薬剤を得ることができた。
【００３２】
本発明のｓｃＦｖは、慢性関節リウマチ患者より取得した関節滑膜細胞のトロンビン惹起増殖を特異的に抑制する活性を有する。現在まで、トロンビンレセプターに対する抗体を含むトロンビンレセプター阻害剤によってトロンビンによる細胞増殖を有意に抑制したと報告はなく、この活性は本発明の薬剤において初めて認められたものである。
【００３３】
例えば特表平６−５０８７４２号公報にはトロンビンレセプターに対する抗体を含むアンタゴニストの取得についての記載があるものの、トロンビンレセプターのアンタゴニストによる細胞増殖作用の抑制についての記載はない。
【００３４】
さらに、本発明に至る過程で、種々のＰＡＲ１型トロンビンレセプターと結合しうるｓｃＦｖおよび抗体についてトロンビンによる細胞増殖の抑制の検討を行ったところ、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上の特定の配列を認識するｓｃＦｖクローンのみが有意に抑制活性を示した。すなわち、従来ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのトロンビンとの結合に関与する部位といわれていたＹＥＰＦＷ配列を認識するｓｃＦｖのうち、一部のｓｃＦｖクローンのみが細胞増殖抑制活性を有することも明らかになった。この細胞増殖抑制活性をもつｓｃＦｖクローンは、該活性をもたないｓｃＦｖクローンと比較してトロンビンによる細胞でのＣａ流入反応、血小板凝集に対する抑制効果、およびエピトープペプチドに対するアフィニティの強さにおいて特に強い活性を示すことはなく、したがって従来の技術により細胞増殖抑制活性をもつｓｃＦｖや抗体を取得することは困難と考えられる。
【００３５】
さらに、本発明者らが鋭意検討を行ったところ、トロンビンによる細胞増殖を抑制する活性のあるｓｃＦｖクローンは、その認識エピトープであるヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターの５２番目から５６番目のアミノ酸配列のうちの５６番目のトリプトファン残基をアラニン残基に置き換えることで、該エピトープへの結合性を失った。
【００３６】
これに対し、同様のエピトープに結合しうる細胞増殖抑制活性のないｓｃＦｖクローンは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターエピトープの５６番目のトリプトファンをアラニンに置き換えてもそれへの結合性を保持していた。つまり、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞増殖に関与する部位は、従来のトロンビンに対するアニオン外部部位結合領域では規定されず、そのすぐ下流に位置するヒルジン様配列（ＥＤＥＥ）の間に位置する５６番目のトリプトファン残基を中心にした部位であることが示された。
【００３７】
以上のことから、本発明はトロンビンによる細胞の増殖を抑制しうる薬剤を効率よく取得するための技術を含んでいる。すなわち、従来のトロンビンレセプター阻害剤の取得方法であるトロンビンによる細胞でのＣａ流入反応の抑制や、血小板の凝集抑制を評価項目とする方法では、トロンビンによる細胞の増殖を有効に抑制しうる薬剤を取得することは困難であり、本明細書に示されているように、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖に関連する特定の配列の情報を得たことによってトロンビンの細胞増殖作用を有効に阻止しうる抗体や薬剤の取得が可能になったのである。
【００３８】
本発明の薬剤の一例は、マウス抗体骨格をもつｓｃＦｖであるが、該遺伝子配列をもとにＣＤＲグラフティングなどの技術を利用することによって、ヒト化抗体を作製することが可能である。またｓｃＦｖを改変してＦｃ部分を付加したり、あるいは二本鎖の完全分子型の抗体にすることも可能である。これらは血中半減期が異なると予想され、対象疾患、投与部位、投与方法によって抗体の剤型を変えることができる。
【００３９】
また、本発明のｓｃＦｖはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖に重要な部位を認識するため、このｓｃＦｖを用いてより活性の高い抗体やＰＡＲ１型トロンビンレセプターと結合してその活性を修飾しうる化合物を選別、取得するためのツールとして用いることが可能である。
【００４０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対する多種類の抗体を取得することによってＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖への関与を検証するとともに、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上の増殖に強く関与する部位を特定し、その情報をもとにトロンビンによる細胞増殖を有効に抑制しうる薬剤を取得する点にある。
【００４１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを特異的に認識するポリペプチドを見出し、本発明に到達した。
【００４２】
すなわち本発明者らは、遺伝子工学的に各種ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを昆虫細胞表面に機能を有する蛋白として発現させた。本発明者らが作製したＰＡＲ１型トロンビンレセプター改変体は次の３種類である。
（１）△１−４９ＴＲ
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端の１番目から４９番目までのアミノ酸を欠失させたレセプター：内在性リガンドであるＴＲＡＰ部分やトロンビンによって切断されて遊離するペプチド部分を欠失させたレセプター。トロンビン結合部位すなわちヒルジン様ドメインは有している。△１−４９ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（２）△１−８０ＴＲ
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端１番目から８０番目のアミノ酸を欠失したレセプター：ＴＲＡＰ部分、遊離ペプチド、ヒルジン様ドメインを含まないレセプター。△１−８０ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（３）Ｆｕｌｌ ＴＲ
天然に存在するＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプター：各機能部位を分子内に有する。Ｆｕｌｌ ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００４３】
本発明者らは上記（１）〜（３）の各レセプターを発現させた昆虫細胞を抗原としてマウスに免疫し、得られたマウス抗血清から抗体を調製し、それぞれの抗体のプロファイルを検討した。その結果、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を抗原として免疫し得られた抗体にアンタゴニスト的な活性プロファイルが認められた。
【００４４】
そこで本発明者らは、△１−４９ＴＲ発現細胞を抗原として免疫したマウスの脾臓細胞よりファージミドライブラリーを作製し、そのライブラリーから吸脱着すなわちパンニング法によってヒトトロンビンレセプターを特異的に認識して結合するｓｃＦｖを選別、取得した。
【００４５】
本発明者らは、さらに研究を進めた結果、取得したＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを認識するｓｃＦｖの中に、次のような特徴を有するものがあることを見出した。すなわち、ヒト細胞表面上のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに結合し、トロンビンによるトロンビンレセプターを介したカルシウム流入を抑制する活性を有すること、さらにはヒト血小板上のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに結合して、トロンビンによるトロンビンレセプターを介した血小板凝集を阻害する活性を有すること、さらにはヒト滑膜細胞のトロンビンレセプターに結合して、トロンビンによるトロンビンレセプターを介した滑膜細胞増殖を阻害する活性を有することが明らかになった。
【００４６】
さらに本発明者らは、取得した抗体の結合部位のアミノ酸配列を決定した。該エピトープの解析手法としては、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの部分合成ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡおよび各種トロンビンレセプター発現細胞を用いるＥＬＩＳＡを行った。また、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのすべての細胞外領域を包含するように１つのピン当たり１５アミノ酸の長さのペプチドを計９４種類ピン上に固相合成したマルチピンＥＬＩＳＡを行った。
【００４７】
トロンビンレセプターの内在性リガンドであるＴＲＡＰ部分に対するポリクローナル抗体、あるいはトロンビン結合部位であるヒルジンライクドメインに対するポリクローナル抗体は、それぞれの機能部位に対して複数のエピトープで結合するため、トロンビンレセプターの機能に影響を与える可能性はある。しかしながらどのエピトープをブロックすることがアンタゴニストとして有効かはこれまで明らかではなかった。そこで、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ヒルジン様ドメインに包含されるＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５５番目のアミノ酸が増殖惹起を含むトロンビンレセプター機能に重要であり、その部分に由来する機能を抑えることが該レセプター阻害剤として有効であることがわかった。
【００４８】
このエピトープのアミノ酸配列は、トロンビンレセプターの活性化および機能発現において重要な部位であると考えられる。例えばこの部位に抗体が結合することによってトロンビンとトロンビンレセプターの相互作用が阻害されること、またトロンビンはレセプターに結合するが、ＴＲＡＰによるレセプターの細胞外ループ部分への相互作用を阻害していることなど種々の可能性が考えられる。
【００４９】
また、このヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５５番目の配列の中でも増殖に関与する部位があることが判明した。すなわち本発明者らは同様の部位に結合し、かつ同様のエピトープに対する親和性を示す複数のｓｃＦｖを取得しているが、トロンビンの細胞の増殖を抑制しうるのはその一部のｓｃＦｖであった。そのトロンビンによる細胞増殖を抑制しうるｓｃＦｖは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのアミノ末端側から５５番目のトリプトファン残基をアラニンに置換するとその配列に対する結合性が消失するのに対し、トロンビンによる細胞増殖を抑制しないｓｃＦｖにおいては同様な置換を行ったエピトープに対する結合性は維持されていた。すなわち、トロンビンによる細胞増殖を抑制しうるｓｃＦｖのＰＡＲ１型トロンビンレセプターへの結合には該レセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン残基が重要であり、また該レセプターの細胞増殖に対する作用にはこの該レセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン残基の周辺の配列が重要な役割をもつことが示された。
【００５０】
本発明者らは、前記のトロンビンレセプターおよび改変体を作製する研究過程で詳細な検討を進めた結果、新しい事実を見出した。それは従来知られているＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターをコードする遺伝子とは２箇所異なる塩基配列があることが判明した点である。本発明者らは、該遺伝子が細胞表面上にＰＡＲ１型トロンビンレセプターとしての機能を有する形で発現していることを確認した。つまりトロンビンおよびＴＲＡＰ（内在性リガンド部分の合成ペプチド：Ｈ2Ｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ）いずれにおいても細胞内シグナル伝達が認められた。また、ＴＲＡＰ部分に対するウサギポリクローナル抗体の結合性がフローサイトメトリーによって認められた。この点からも本発明者らが新たに見出した遺伝子配列は機能しているものであることが明らかになった。
【００５１】
既報のＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、最初に巨核球細胞株Ｄａｍｉ細胞のｃＤＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞にトランスフェクトし、トロンビン刺激に対する応答性からクローニングされた。これに対し、本発明者らはＰＡＲ１型トロンビンレセプターをコードする遺伝子をヒト大動脈と胎盤由来の正常組織のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。既報のｃＤＮＡの由来がガン細胞の一種であるＤａｍｉ細胞だとすると、遺伝子変異もしくは遺伝子多型による可能性もある。
【００５２】
また、上述のことから、本発明者らが見出したＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、アミノ酸配列が既報のものに比べて２箇所異なったものであることがわかる。したがって本発明の薬剤は、新規なレセプターを認識し、結合するものである。
【００５３】
すなわち本発明は下記の発明を包含する。
１）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうるポリペプチドまたは化合物。
２）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの構造のうち細胞増殖に関与する特定の領域に結合するポリペプチドまたは化合物。
３）ペプチド配列Ｘ1−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ2−Ｔｒｐ−Ｘ3に結合する前記ポリペプチドまたは化合物。ここで、Ｘ1は任意のアミノ酸またはペプチド配列であり、Ｘ2は任意のアミノ酸を、Ｘ3は任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。
４）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列：Ｘ4−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｘ5なる部分に結合するポリペプチドまたは化合物。ここでＸ4およびＸ5は、任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。
５）単鎖型Ｆｖあるいはその断片であるＰＡＲ１型トロンビンレセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチド。
６）抗体あるいはその断片であるＰＡＲ１型トロンビンレセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチド。
７）トロンビンレセプターを介した細胞増殖に関わるシグナル伝達系を阻害する、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター阻害剤としての前記ポリペプチド。
８）前記ポリペプチドを取得するために用いることが可能な改変型ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの遺伝子またはその断片、ならびにそれを発現する細胞。
９）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうる前記ポリペプチドまたは化合物を取得するための方法。
【００５４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるｓｃＦｖの作製方法について詳細に説明する。
Ａ．ファージミドライブラリーの作製
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞をアジ化ナトリウムによって死細胞化し、死菌体（シグマ社製）と混合して生理食塩水に懸濁した。細胞の形態が生細胞と同程度であることを確認し、マウス腹腔に投与した。この免疫を２週間間隔で５回行い、最終免疫の４日後に心臓から採血すると同時に脾臓細胞を摘出した。
【００５５】
上記抗原の細胞を調製する際、アジ化ナトリウムを細胞と接触させることによってレセプターの細胞内へのインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を防ぐことができる。細胞表面に存在するレセプター蛋白数をインタナーナリゼーションを防いで恒常的に維持することは、免疫感作を十分に行うために必要である。
【００５６】
一般的には純化精製された抗原蛋白であれば、免疫の際の必要量は比較的少量でよいと考えられている。例えばモノクローナル抗体の例では、マウス１匹あたり１回投与量として数μｇ〜数十μｇでよい。
【００５７】
しかしながら、細胞表面上のレセプターを抗原とする場合では細胞表面上には各種蛋白が存在する。レセプターに対する免疫動物の抗体価を上げるためには、レセプターの数がこれら細胞表面上の夾雑蛋白に比べてある程度多量に必要である。本発明者らはアジ化ナトリウムによってレセプターの細胞内へのインタナライゼーションを防ぎ、該トロンビンレセプター発現昆虫細胞を抗原として動物に免疫することによってレセプターの構造を反映した機能部位を特異的に認識するファージミド抗体を取得した。
【００５８】
ファージミド抗体の作成はアマーシャムファルマシア・バイオテク社より市販されている「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ」を用いて業者添付のプロトコールにしたがって行った。キットに含まれるｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターについては、このベクターのＮｏｔＩ部位に塩基配列ｇｇｃｃｇｃａｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｇｇを挿入し、クローニングした遺伝子が発現される際にＨｉｓ６配列およびＥ−ｔａｇ配列が付加されるようにデザインした（ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥ）。上記のトロンビンレセプター発現昆虫細胞を免疫したマウスの脾臓よりｍＲＮＡを取得し、抗体ｃＤＮＡを作成した。そのｃＤＮＡよりキットに含まれるＰＣＲプライマーを用いて免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の抗原結合部位（それぞれＶＨおよびＶＬ）の遺伝子を取得した。このＶＬおよびＶＨ遺伝子断片をキットに含まれるリンカー遺伝子を用いて一本のＤＮＡとして連結させ、さらにＶＨの５’側を認識し、制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を含むプライマーおよびＶＬの３’側を認識し、制限酵素ＮｏｔＩ認識部位を含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、このＶＨ−ＶＬ連結遺伝子を増幅して取得した。この増幅ＤＮＡ産物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで処理し、ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥベクターのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩクローニング部位に挿入し、大腸菌ＴＧ１株に導入した。この遺伝子導入大腸菌にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を添加することで抗体蛋白質を発現し、かつ抗体遺伝子を含有するファージミドライブラリーを作成した。
【００５９】
Ｂ．パンニング
上記のように作成したファージミドライブラリーは、目的のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対するファージミド抗体以外のものを多数含んでいる。たとえば、ここで用いた抗体遺伝子はバキュロウイルス法でトロンビンレセプターを発現させた細胞そのものを免疫しているため、細胞自体の成分やウイルスの構成成分に対するファージミド抗体も多種類存在することが考えられる。したがって、パンニング法による目的のファージミド抗体の濃縮を行った。すなわち、このファージミド抗体を天然型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶを感染させた昆虫細胞と反応させることで目的以外のファージミド抗体を吸着除去を行った後、トロンビンレセプター（△１−４９ＴＲ）を発現させた昆虫細胞と反応させ、結合したファージミド抗体のみを取得することでトロンビンレセプターと結合するファージミド抗体を濃縮した。この濃縮ファージミドライブラリーを大腸菌ＨＢ２１５１に感染させ、アンピシリン含有寒天培地上で生育させた各コロニーを取得することで可溶型ｓｃＦｖを産生しうる大腸菌クローン（ｓｃＦｖ産生大腸菌株）を取得した。
【００６０】
Ｃ．キャラクタリゼーション
標準的な方法によりｓｃＦｖ産生株の培養およびペリプラズム画分取得を行い、標準的な方法により精製を行った。ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの機能阻害活性を評価するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法として、ヒト巨核芽球系細胞を用いたカルシウム流入阻害評価、ヒト血小板を用いた凝集阻害評価、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞を用いた増殖阻害評価を実施した。また、上記評価にてトロンビンレセプターの機能阻害活性を認めたｓｃＦｖおよび該活性を認めなかったｓｃＦｖについてＰＡＲ１型トロンビンレセプター上のエピトープを決定したうえで、さらに詳細な認識ペプチド配列の解析を行った。
【００６１】
以下に、標準的なｓｃＦｖの産生、ペリプラズム画分取得、および精製について述べる。
ｓｃＦｖ産生大腸菌株を２×ＹＴ培地にて終夜培養を行い、終夜培養液と本培養液を１：１０の割合で混合した。３０℃、１６０回転／分で１時間培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度で１ｍＭ加えて６時間培養し、ｓｃＦｖ産生を誘導した。本発明者らの用いたｓｃＦｖ産生システムではｓｃＦｖは大腸菌のペリプラズム画分に産生、集積することが知られている。このため、培養液を遠心操作し、菌体沈殿物を１０倍濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁したのち、再度遠心操作により得た沈殿物を超純水に懸濁し、浸透圧ストレスを加え、再度遠心して上清を回収してペリプラズム画分を得た。
【００６２】
本発明者らの調製したｓｃＦｖは、そのアミノ酸配列内にポリＨｉｓ領域を有しており、この領域の金属イオン結合性を利用したＮｉ−ＮＴＡカラムによるアフィニティーカラムクロマトによる精製が可能である。取得したペリプラズム画分をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムにロードし、数回洗浄の後にイミダゾールを含むＨｅｐｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液により溶出した。さらに、溶出物を限外濾過膜を用いて濃縮してからＨｅｐｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して透析を行い、精製ｓｃＦｖを取得した。
【００６３】
次に、上記工程Ａ、Ｂで取得した各ｓｃＦｖ産生大腸菌株の産生するｓｃＦｖのトロンビンレセプター結合性について解析した。トロンビンレセプター発現昆虫細胞に精製ｓｃＦｖを反応させ、未反応のｓｃＦｖを洗浄除去した。次にｓｃＦｖのＣ末端に反応するホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ｅ−Ｔａｇ抗体を結合させ、ＨＲＰの発色基質である２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）による発色法で結合性を解析した。また、野生型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶを感染させた細胞においても同様に結合性を解析し、トロンビンレセプター発現昆虫細胞に結合してＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖ産生大腸菌株を選択した。この選択した大腸菌株の産生するｓｃＦｖについてトロンビンレセプターの機能阻害活性を評価した。
【００６４】
以下にトロンビンレセプターの機能阻害活性を評価する方法について述べる。ヒト巨核芽球系の株化細胞にはトロンビンレセプターの発現が認められており、またトロンビンにより細胞内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、トロンビンにより惹起された細胞内カルシウム濃度上昇を測定し、上記方法により取得したｓｃＦｖに機能阻害活性があるかどうか調べた。すなわち、ヒト巨核芽球系の株化細胞に蛍光色素（Ｆｕｒａ２−ＡＭ）を取り込ませ、室温で３０分間ｓｃＦｖとインキュベートした後にヒトトロンビンを添加し、添加３０秒後の細胞内カルシウム流入量を測定し、ｓｃＦｖのカルシウム流入阻害活性を調べた。その結果、トロンビンによる細胞内カルシウム濃度上昇を抑制する複数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６５】
上述のように、血小板上にはトロンビンレセプターが発現し、トロンビンにより凝集が惹起されることが知られている。そこで、トロンビンで惹起した血小板凝集に対するｓｃＦｖの効果について検討した。健常人ヒト血液から血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液を調製した。得られた血小板浮遊液に上記方法にて取得したｓｃＦｖを添加し、室温で２０分間静置した。さらに３７℃で２分間で安定化し、ＣａＣｌ2（最終濃度１．５ｍＭ）を添加した。次にヒトトロンビン（最終濃度０．１〜０．２ｕ／ｍｌ）を添加して血小板凝集を惹起し、その濁度の変化からｓｃＦｖによる血小板凝集阻害を評価した。その結果、血小板凝集を抑制する数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６６】
また、本発明者らにより慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞はＬＰＳ（リポポリサッカライド）感受性を有し、ＬＰＳにより増殖が惹起されることが判明したため、ゲルろ過法およびカニ外殻キトサン多孔性粒子を用いたアフィニティー吸着除去法を併用し、上記のように精製、取得したｓｃＦｖサンプルに含まれる大腸菌由来のエンドトキシンを除去した。
【００６７】
上述のように、滑膜細胞にはトロンビンレセプターが発現しており、トロンビン刺激により細胞増殖が惹起されることが知られている。そこで、トロンビンにより惹起した滑膜細胞増殖能に対して上記方法によりエンドトキシンを除去したｓｃＦｖに阻害活性があるかどうか調べた。すなわち、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞を血清飢餓状態にしてから３７℃で３０分間ｓｃＦｖとインキュベートした後、ヒトトロンビンで増殖を惹起した。そしてトロンビン添加２４時間から４８時間までの間のチミジンアナログ（ＢｒｄＵ）取り込みを測定することによってＤＮＡ合成能を測定し、ｓｃＦｖの細胞増殖阻害活性を調べた。その結果、滑膜細胞増殖を抑制する数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６８】
上記の滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンのエピトープを決定するためにエピトープマッピング解析を行った。すなわち、１ペプチド当たり１５アミノ酸の長さで、ヒトトロンビンレセプターのすべての細胞外領域を包含するように、９４種類のペプチドをピン上に固相合成し、上記方法で取得した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖの結合性を調べた。その結果、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのヒルジン様ドメインに包含されるアミノ末端側の５１番目から５５番目のアミノ酸が滑膜細胞増殖阻害ｓｃＦｖのエピトープであることがわかった。同様に滑膜細胞増殖を示さなかったｓｃＦｖについても同様の解析を行ったところ、その中にＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５０番目から５５番目のアミノ酸を認識するｓｃＦｖクローンが見出された。
【００６９】
さらにこのＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクローン、およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、そのエピトープを含むＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から４７番目から６７番目のアミノ酸に相当する合成ペプチドを作成し、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲート化した。これを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップ上に固定化し、それぞれの該ペプチドに対するアフィニティを計測した。滑膜細胞増殖抑制活性を有するｓｃＦｖクローンと増殖抑制活性を有しないｓｃＦｖクローンの間でアフィニティの差は認められなかった。
【００７０】
また、以下にＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクローン、およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、エピトープのアミノ酸配列の一部を置換したペプチドに対する結合性を解析した。前記ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から４７番目から６７番目のアミノ酸に相当する合成ペプチドをＫＬＨにコンジュゲート化したものを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップに固定化し、この滑膜細胞増殖抑制活性を有するｓｃＦｖクローンとＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファンをアラニンに置き換えた４７番目から６７番目のアミノ酸に相当するペプチドとを混合して解析を行ったところ、センサーチップに固定化したペプチドへの結合は阻害されなかった。しかしながら滑膜細胞増殖抑制活性をもたないｓｃＦｖクローンについて同様の解析を行ったところ、センサーチップに固定化されたペプチドへの結合は強く阻害された。このことはエピトープペプチドの５５番トリプトファンをアラニンに置換したことにより滑膜細胞増殖抑制活性を有するクローンのエピトープへの結合が失われたことを示しており、ひいてはこのＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン周辺がトロンビンの細胞増殖活性に関与していることを示している。
【００７１】
本発明の一態様である前記ｓｃＦｖあるいはその断片を有効成分として含有する薬剤（ポリペプチドまたは低分子化合物）は、炎症性の細胞、増殖した組織あるいは血小板を主体とする血栓に接触させることにより、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を抑制し、細胞増殖阻害やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制し、あるいは血小板凝集を阻害することにより血栓形成進展を阻害するので、各種炎症性疾患、細胞増殖性疾患、血栓性疾患の治療薬として利用できる。
【００７２】
例えば本発明のトロンビンレセプター阻害剤は、静脈用注射用製剤として使用することができる。その場合、上記ｓｃＦｖあるいはその断片は広い範囲の含有割合でよく、投与量は種々の条件によって変動する。またこれらは通常静脈注射用として使用されている水性媒体中に溶解ないしは分散して使用することができる。また、注射剤以外にも外用剤または座薬として用いられる。非経口投与のための注射剤としては無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。非経口投与のためのその他の組成物としてはひとつ、またはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤のような外用剤、直腸内投与のための座薬およびペッサリー等が含まれる。
【００７３】
【実施例】
実施例１：各種組換えＴＲ発現細胞の調製
［ヒトトロンビンレセプターｃＤＮＡの取得］
ヒト大動脈由来ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入）１μｇからｃＤＮＡ合成キットＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡの１／１００量を用いてプライマーＴＲ１［配列番号４］およびＴＲ４［配列番号５］によりトロンビンレセプターのｃＤＮＡ部分をＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動した結果、約１．３ｋｂ付近にトロンビンレセプターのｃＤＮＡフラグメントと推定されるバンドが認められた。このＤＮＡフラグメントをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲルから抽出、精製した。精製したＤＮＡフラグメントをＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＣＲII ｐＣＲ２．１（ＴＭ）ベクターに挿入し、数クローンについてプラスミド精製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使用）を行った。これらの精製したプラスミドを用いて日立ＤＮＡ蛍光自動シーケンサーによりＤＮＡ配列を決定した。塩基配列決定に用いたプライマー６種を［配列番号６−１１］で示す。その結果、このＤＮＡフラグメントがトロンビンレセプターをコードしていることが明らかになった。決定したヒト大動脈由来のトロンビンレセプターの全塩基配列を［配列番号３］に示す。同様に、本発明者らはヒト胎盤由来のｃＤＮＡ配列も決定したが、ヒト大動脈由来のものと一致した。この得られたヒト大動脈由来およびヒト胎盤由来のトロンビンレセプターｃＤＮＡ配列と、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録されているトロンビンレセプターのｃＤＮＡ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｍ６２４２４）との比較を行ったところ、トロンビンレセプターの蛋白質をコードしている部分の５’末端より７１１番目の塩基がＣがＧに、７１２番目の塩基がＧからＣに、１０９１番目の塩基がＣからＧに、１０９２番目の塩基がＧからＣにデータベースでの表示から置き換わった形のｃＤＮＡとなっていることがわかった。また、ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ中のトロンビンレセプター遺伝子についてもこの部位の塩基配列を解析したところ、本発明者らが取得した配列と同様の配列であることが確認された。このヒトトロンビンレセプターｃＤＮＡを挿入したｐＣＲIIプラスミドをｐＣＲ−ＴＲ１４と命名した。
【００７４】
［トロンビンレセプターｃＤＮＡ含有トランスファーベクターの作製］
上記ｐＣＲ−ＴＲ１４を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。そしてトロンビンレセプターｃＤＮＡを含む約１．３ｋｂフラグメントをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲルから抽出、精製した。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［Technique, Vol. 2, No. 4, pp.173-188, 1990]を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、上記ＤＮＡフラグメントとライゲーション反応を行った。この反応液で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、いくつかの形質転換体のコロニーからプラスミドを抽出して約１．３ｋｂフラグメントが挿入されたプラスミドを得た。これをｐＡｃ−ＴＲ１４と命名した。このトロンビンレセプターｃＤＮＡ含有トランスファーベクターを精製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使用）してトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作製に用いた。
【００７５】
［トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作製］
組換えバキュロウイルスの作製にはファーミジェン社製のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）キットを用いた。Ｓｆ９昆虫細胞１×１０6 細胞を３０ｍｍディッシュに播種し、３０分間室温にて接着させた。一方、０．２５μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）ＤＮＡと２μｇのｐＡｃ−ＴＲ１４プラスミドＤＮＡを混ぜ、室温に５分間静置し、その後０．５ｍｌトランスフェクション緩衝液Ｂ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えてよく混ぜた。次に播種したＳｆ９細胞の培地を抜き取り、０．５ｍｌのトランスフェクション緩衝液Ａ（グレース培地、１０％牛血清含有）を加えた。ここに、トランスフェクション緩衝液ＢとＤＮＡの溶液を少しずつ滴下していくことによりコトランスフェクションを行った。２７℃でインキュベーションして４時間後に新しいグレース培地（１０％牛血清含有）に取り換えた。５日後、組換えウイルスを含む培養上清を回収し、１０倍、１００倍、１０００倍希釈液を作成し、Ｓｆ９細胞（１×１０6 細胞／ｄｉｓｈ）に室温で１時間感染させた。上清を抜き取り、１％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース含有グレース培地（４２℃）を２ｍｌ滴下して加え、アガロースが固まるまで１０分間程度室温に放置した。その後、２７℃で３日間培養を行った。３日目にニュートラルレッド／ＰＢＳ（１ｇ／ｌ）を１ｍｌ／ｄｉｓｈ加えた。４日目にウイルスプラークを観察したところ、１００培希釈液を感染したディッシュに６個のプラークを確認した。数個のシングルウイルスプラークをアガロースごとパスツールピペットで抜き取り、グレース培地と混ぜて、ウイルスを培地中に拡散させた。このシングルプラーク由来のウイルス液を単層培養したＳｆ９細胞（２５ｃｍ2フラスコ培養）に感染させた。これを２７℃で４−５日間培養してウイルス液を回収した。このウイルス液を１ｍｌとって１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１５０００回転／分で３０分間遠心し、ウイルス粒子を沈殿させた。沈殿物を２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に懸濁し、５０μｌのＬｙｓｉｓ緩衝液（１０％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、６０℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により反応液中のウイルスＤＮＡを回収した。回収したウイルスＤＮＡの１／５を使用し、プライマーＢａｃＦ［配列番号１２］およびＴＲ−Ｓ２［配列番号７］によってＰＣＲ増幅を行い、ＤＮＡ中にトロンビンレセプターｃＤＮＡが含有されていることを確認した。このトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスをＡｃＴＲＦと命名した。ウイルス液は適宜希釈してプラークアッセイを行い、タイターをチェックした。さらに、ウイルス液をＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．２５でＳｆ９細胞に感染させることで１〜５×１０7程度の高濃度のウイルス液を得た。ウイルス液は４℃および−８０℃で凍結保存した。
【００７６】
［改変型トロンビンレセプターｃＤＮＡの構築］
トロンビンレセプターの構造の内在性リガンドペプチド部分（ＴＲＡＰ）を欠損させ、トロンビン結合部位は保持させた形の改変トロンビンレセプター△１−４９ＴＲ、および内在性リガンドペプチド部位およびトロンビン結合部位の両方を欠損させた形の改変トロンビンレセプター△１−８０ＴＲのｃＤＮＡを構築し、バキュロウイル−昆虫細胞系での発現を行った。△１−４９ＴＲｃＤＮＡは完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐＣＲ−ＴＲ１４）の遺伝子配列のうち、塩基番号７９〜１４７の部位を、△１−８０ＴＲｃＤＮＡは完全長トロンビンレセプターの塩基番号７９〜２４０の部位を遺伝子工学的に欠損させて構築した。これらの遺伝子は、細胞でトロンビンレセプターが発現したときに除去されるシグナルペプチド部位（アミノ酸残基番号１〜２６）に、さらに、△１−４９ＴＲでは完全長トロンビンレセプターにおいてシグナルが除去されたときにアミノ末端となる部位から３３アミノ酸残基を、△１−８０ＴＲでは６４アミノ酸残基を欠損させた形のアミノ酸配列を付加した形のトロンビンレセプターとなるように設計されている。△１−４９ＴＲと△１−８０のｃＤＮＡの塩基配列、ならびにそれらによってコードされているアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１と配列番号２に記載する。
【００７７】
［△１−４９ＴＲｃＤＮＡの構築］
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐＣＲ−ＴＲ１４）よりその塩基番号７９〜１４７の部位を欠損させて△１−４９ｃＤＮＡを作成する手順を以下に示す。
▲１▼ｐＣＲ−ＴＲ１４より△１−４９ｃＤＮＡの塩基配列１−１８５に相当する部位を含む遺伝子断片である△１−４９−５’（１９０ｂｐ）断片を作成した。
▲１▼−１
ｐＣＲ−ＴＲ１４のｐＣＲIIベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）の部位に相同なプライマー Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー［配列番号１０］、および完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号５９〜７８に相当する部位と塩基番号１４８〜１５７に相当する部位に相補的なプライマーであるＴＲ△２７−４９Ｒプライマー［配列番号１３］を用いてＰＣＲ反応を実施した。反応液組成はｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ ２００ｎｇ／ｍｌ、Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー ３００ｎＭ、ＴＲ△２９−４９プライマー ３００ｎＭ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ｛２０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ｍｉｘ｝（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）１０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社）１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社）１０μｌ／ｍｌのものを用い、５０μｌの反応スケールで行った。反応条件はＧｅｎｅＡｍｐ ｓｙｓｔｅｍR ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で９４℃２分間反応した後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分間のサイクルを１０サイクル行い、その後に７２℃７分間反応させる温度サイクルであった。反応後のサンプルは４％ ＮＵＳＩＥＶＥR ＧＴＧR ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）−ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液ゲルを用い、１００Ｖで１時間電気泳動し、２２４ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部分のゲルを切り出した。切り出したゲルはＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡを抽出、精製して約２００ｎｇのＤＮＡを得た。
【００７８】
▲１▼−２
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号１４８〜３６７に相当する部分の遺伝子断片を取得するため、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号６９〜７８に相当する部位と塩基番号１４８〜１６９に相当する部位よりなるＴＲ△２７−４９Ｆプライマー［配列番号１４］と、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号３５０〜３６７に相補的な配列よりなるＴＲＳ１プライマー［配列番号６］を用いたＰＣＲを行った。反応液組成は▲１▼−１に示した反応組成中のＭ１３ＲＥＶ２２プライマーおよびＴＲ△２７−４９ＲプライマーをＴＲ△２７−４９ＦプライマーとＴＲＳ１プライマーに置き換えた他は同様に実施した。反応条件も▲１▼−１と同様に行った。得られたＰＣＲ反応物は４％ ＮＵＳＵＥＶＥTM ＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを用い、１００Ｖで１時間電気泳動を行った。２２０ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部位のゲルを切り出し、Ｈｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。得られたＤＮＡ断片は約２４０ｎｇである。
【００７９】
▲１▼−３
ＴＲ△２７−４９ＲプライマーとＴＲ△２７−４９Ｆプライマーの間には２０ｂｐの相補的な部分が生じるようにデザインされているため、▲１▼−１で得られた２２４ｂｐのＤＮＡ断片と▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片をａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ法での連結を行った。まず、▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片８０ｎｇと▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片９６ｎｇを混合した。反応液組成は ＤＮＡ ｐｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ １０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ７．５μｌ／ｍｌであり、４０μｌの反応スケールで実施した。反応は、ＧｅｎｅＡｍｐRＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで９４℃２分間反応後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間のサイクルを５サイクル行い、その後７２℃で７分間反応を行う温度サイクルプログラムで行った。次にその反応によって得られた反応産物４０μｌに、Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー １５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＳ１プライマー １５０ｎｇ／ｍｌ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ１０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ６μｌ／ｍｌになるように各試薬を加え、蒸留水で全量４００μｌになるように調整し、５０μｌづつ５本の反応チューブに分注してＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９４℃２分間反応させた後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行い、その後９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間＋各サイクルごとに２０秒間延長のサイクルを１０サイクル行い、最後に７２℃７分間で反応させる温度サイクルプログラムで行った。得られたＰＣＲ反応物からエタノール沈殿法でＤＮＡを回収した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−１００ ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）で精製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社）３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）３０Ｕで切断した。制限酵素処理を行った産物を４％ ＮＵＳＩＥＶＥTM ＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを用い、５０Ｖで１時間電気泳動を行った。その１９０ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部位のゲルを切り出してＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。その結果、△１−４９−５’（１９０ｂｐ）ＤＮＡ断片に相当するＤＮＡ約４００ｎｇを得た。
【００８０】
▲２▼完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号２５５〜１２７８と△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１８６〜１２０９は配列が同一であるため、ｐＣＲ−ＴＲ１４に含まれる完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ部分のうちの塩基番号１〜２４４の部分を切り出して、その部分を△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１〜１８５を含むＤＮＡ断片である△１−４９−５’（１９０ｂｐ）とおきかえることで△１−４９ｃＤＮＡの塩基番号１〜１２０９の部分を構築した。
【００８１】
▲２▼−１
ｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ ２．３μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ ３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ ３０Ｕで切断し、それを０．７５％ ＳＥＡＰＬＡＱＵＥTMＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）−ＴＡＥ緩衝液ゲルにのせて５０Ｖで１時間電気泳動を行った。その４．１ｋｂｐに相当するＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、そこからＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法で抽出、精製して約６４０ｎｇのＤＮＡ断片を得た。
【００８２】
▲２▼−２
▲１▼で得られた△１−４９−５’（１９０ｂｐ）断片８０ｎｇと、▲２▼−１で得られたｐＣＲ−ＴＲ１４ ４．１ｋｂｐ断片 ６４ｎｇとを、ＵＮＩ−Ａｍｐ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のｌｉｇａｔｉｏｎ試薬（Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ３７．５Ｕ／ｍｌ）を用い、２０μｌスケールで４℃２０時間反応させて結合させた。得られた結合ＤＮＡは大腸菌 ＤＨ−１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に、ＢＲＬ Ｃｅｌｌ ＰｏｒａｔｏｒR Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｕｌｓｅｒR（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子を導入した大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に播き込み、３７℃で一晩培養して可視的に見られるコロニーを組換え体クローンとした。それらについて△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１−２０に相当するプライマーＴＲ１プライマーとＴＲＳ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、電気泳動的に３００ｂｐの増幅産物がみられる△１−４９ｃＴＲＤＮＡを含むベクターが導入されたクローンの有無を解析したところ、組換え体クローン８４クローン中１７クローンに目的のＤＮＡが導入されていることが確認された。このうちの１クローンｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１についてＤＮＡ塩基配列解析を行った。詳細にはｐＣＲIIR ベクター部位に対するシークェンスプライマー Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー［配列番号１０］、およびＭ１３ＦＯＲ２４プライマー［配列番号１１］、△１−４９ＴＲｃＤＮＡのシークェンスプライマーＴＲ１、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２［配列番号４、６、および７］、ＴＲＳ３［配列番号８］、ＴＲＳ４［配列番号９］ならびに、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑR ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＦＳ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用い、業者添付のプロトコールに従った。解析装置としてはＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いた。その結果、ｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−１の△１−４９ＴＲｃＤＮＡに相当する部分のＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示したＤＮＡ塩基配列と完全に一致したことから、目的の△１−４９ＴＲｃＤＮＡが正しく構築されていることが確認された。このｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１を含有する大腸菌を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＣＩＲＣＬＥＧＲＯＷR培地で３７℃で一晩培養し、その含有するプラスミドをＱＩＡＧＥＮR ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＤＩＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）で抽出、精製し、３４μｇのｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１プラスミドを得た。
【００８３】
［△１−４９ＴＲｃＤＮＡ含有トランスファーベクターの作成］
△１−４９ＴＲｃＤＮＡを含有するバキュロウイルストランスファーベクターの作成は、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡのトランスファーベクターｐＡＣ−ＴＲ１４作成と同様の方法で行った。方法を簡単に示すと、ｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１の△１−４９ＴＲｃＤＮＡ部分１．２ｋｂｐを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切り出し、そのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理したｐＶＬ１３９３ベクター中へサブクローニングした。得られた組換え体クローン８４クローンについてＢａｃＦプライマーとＴＲＳ２プライマーを用いてのＰＣＲ解析を行い、２４クローンに△１−４９ＴＲｃＤＮＡがクローニングされていることを確認した。このうちの１クローン、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ０１Ｅ０１プラスミドを含有する大腸菌を培養し、精製することで約３９０μｇのプラスミドを得た。
【００８４】
［△１−４９ＴＲ改変トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作成］
△１−４９ＴＲｃＤＮＡを含有する組換えバキュロウイルスの作成は、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ０１Ｅ０１組換えトランスファーベクター２μｇを用い、完全長トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスｐＡＣ−ＴＲＦ作成と同様に行った。組換えウイルスクローンのうちＢａｃＦおよびＴＲ−Ｓ２プライマーでのＰＣＲにより、△１−４９ＴＲｃＤＮＡが組み込まれていることが確認されたクローンｐＡＣ−△１−４９ＴＲ−３を△１−４９ＴＲ改変ＴＲ発現用組換えバキュロウイルスとした。これをＳｆ９昆虫細胞にＭＯＩ＝０．２５で感染させることで、３×１０7ｐｆｕ／ｍｌの高濃度ウイルス液を取得した。
【００８５】
［組換えバキュロウイルスによるトロンビンレセプターの昆虫細胞における発現］
上記のようにして得られたトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスＡｃＴＲＦを、１５０ｃｍ2フラスコに播種した１．８×１０7のＳｆ９細胞にＭＯＩ＝０．６−１．０で感染させ、４０−４８時間、２７℃で静置培養した。培養後、感染細胞を回収し、ウエスタンブロッティングおよびカルシウム流入実験によってトロンビンレセプターの発現および機能を有することの確認を行った。
【００８６】
［ウエスタンブロッティング］
回収した感染細胞（１５０ｃｍ2フラスコ２本分、約６×１０7）をＰＢＳで２回洗浄した。これ以後の実験はすべて４℃の条件で行った。次に、５ｍｌのホモジェナイズ用緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＴＭ）（ベーリンガー社製）含有）に懸濁し、テフロンホモジェナイザーを用いて、２５００回転／分で３０ｓｔｒｏｋｅホモジェナイズを行った。このホモジェネートを１５ｍｌの遠心管にいれて２５００回転／分（約１０００ｇ）で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清を５００００回転／分（約１０００００ｇ）で１時間、超遠心を行い、粗膜画分を沈殿させた。沈殿物を１ｍｌのホモジェナイズ用緩衝液に懸濁し、５０μｌずつ分注して−８０℃で凍結保存した。Ｎａｎｏ Ｏｒａｎｇｅ（ＴＭ）（ベーリンガー社製）を用いて定量した結果、タンパク濃度は１４ｍｇ／ｍｌであった。このようにして得られた粗膜画分につき、２５μｇ−５０μｇ／ｌａｎｅで、１０％ゲルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、これをニトロセルロース膜に転写した。この膜を３％ゼラチン／ＴＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄した。その後、トロンビンレセプターの内在性リガンド領域であるＴＲＡＰをウサギに免疫して得られた抗ＴＲＡＰウサギポリクローナル抗体１０−２０μｇ／ｍｌを含む１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液中、室温で終夜反応させた。翌日、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナルＨＲＰ標識抗体（約１μｇ／ｍｌ、１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液）を室温１時間反応させた。次にＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで２回洗浄し、コニカイムノステインＨＲＰで１０分間、室温にて発色させてバンドを検出した。その結果、トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に特異的に、約４５ｋＤおよび約８５ｋＤ付近のバンドが観察され、トロンビンレセプターが昆虫細胞膜上に発現していることが確認された。
【００８７】
［カルシウム流入実験］
回収した感染細胞（約３×１０7）をＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）で１回洗浄した後、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１μｇ／ｍｌ Ｆｕｒａ２−ＡＭ含有）に懸濁してＦｕｒａ２−ＡＭを２７℃で３０分間負荷した。室温で８００回転／分で５分間遠心して細胞を回収し、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）で２回洗浄した後、２ｍｌのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）に再懸濁した。この細胞懸濁液に２μｌの１Ｍ ＣａＣｌ2を最終濃度１ｍＭになるように加え、遮光して室温で５分間インキュベートした。このように調製したＦｕｒａ２−ＡＭ負荷感染細胞を４９０μｌとってキュベットに入れ、細胞内カルシウム測定装置（日本分光ＣＡＦ−１００型）で測定した。［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］（細胞内カルシウム濃度を反映）が０．０２ぐらいに安定したらキュベットに１０μｌの１０ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンもしくは１．２５ｍＭ ＴＲＡＰを添加して刺激を与え、細胞内カルシウム濃度を経時的に測定した。カルシウムの流入は［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］の値が上昇することで検出される。その結果、トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に特異的にカルシウム流入が観察された（表１参照）。この結果から、機能を有するトロンビンレセプターが昆虫細胞に発現していることが証明された。
【００８８】
【表１】
【００８９】
表中の値は
［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］の変化量を表す（高い値ほど強い反応を表す）。４回の測定の平均値±ＳＤ。
【００９０】
実施例２：マウスの免疫および脾臓細胞からのファージミドライブラリーの作製ファージミドライブラリーの作製はリコンビナント・ファージアンチボディー・システム（ファルマシア社製）の方法に準じた。
抗体遺伝子取得のための免疫は以下のように行った。Ｓｆ９昆虫細胞２×１０7 細胞を細胞培養フラスコに播種して３０分間静置の後、前述のｐｃ△１−４９ＴＲ−３ウイルスをＭＯＩ＝２で感染させ、２７℃で４０時間培養した。この感染細胞を回収してＰＢＳ（０．９％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）で２回洗浄後、０．２Ｍアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を室温で３０分間放置したのち５０μＬを分取して等量の０．２％トレパンブルー染色液と混合し、光学顕微鏡で細胞を観察したところ、すべての細胞が青く染まったことから、回収した感染細胞が１００％死細胞となったと判断した。この死細胞化した感染昆虫細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、約３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。得られた死細胞化感染昆虫細胞は約６×１０7細胞であった。この細胞３ｍｌに不活化百日咳死菌（シグマ社）を３０μＬ添加した後、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに各１ｍｌずつ腹腔内投与した。その後２週間おきに４回、同様の方法で免疫を行った後、最後の免疫実施から４日後にマウスを屠殺して脾臓の摘出を行った。
【００９１】
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を免疫したマウスから脾臓を摘出し、ｍＲＮＡを抽出した。これを鋳型としてＨｏｎｇ Ｚｈｏｕらの報告（Nucleic Acid Reserch, 1994, vol. 22, No.5, 888-889）のＰＣＲプライマーを使用して抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子をそれぞれ別々に増幅した。得られたＤＮＡをリンカーを用いて連結し、アガロースゲル電気泳動により約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＳｆｉＩで消化し、再びアガロースゲル電気泳動により、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを抗Ｄ１−４９ＴＲ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名付けた。
【００９２】
アマーシャムファルマシアバイオテク社のｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターを制限酵素ＮｏｔＩとＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡ断片にヒスチジンＴａｇアダプター（配列番号１５）をＴＡＫＡＲＡのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＶｅｒII（ＴＭ）でライゲーションし、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。この遺伝子ベクター導入大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ−アガロース固形培地に播種し、クローンを取得した。そのうちの２０クローンについてプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ社プラスミド抽出キットによって取得し、Ｅ−ｔａｇプライマーとＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（ＴＭ） Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよび同社ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ３７３Ａ ＤＮＡシークェンサーを用いて塩基配列を解析することで、ヒスチジンＴａｇアダプターが正しい方向にクローニングされたベクターを選択し、これをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベクターと名づけた。さらにこのｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩで切断したベクターをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名づけた。
【００９３】
抗Ｄ１−４９ＴＲ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩとｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩをライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてライゲーション反応を行った。このライゲーション溶液とコンピテントセルＴＧ１−ｔｒを用いて形質転換を行った。
【００９４】
アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ（トリプトン １６ｇ、イーストエクストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）寒天プレートに形質転換した液をまき、３７℃で一晩インキュベートした。プレート上に生じたコロニーをかきとって２×ＹＴ培地に懸濁し、これをファージミドライブラリーとした（ライブラリーのサイズは約１．３×１０8ｐｆｕ）。作製したファージミドライブラリーはグリセロールを最終２５％程度になるように加えてマイナス８０℃に保存した。
【００９５】
実施例３：△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を用いるパンニング
実施例２で得られたファージミドライブラリー１００μｌをアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（２％）を含む２×ＹＴ培地５０ｍｌに加え、６００ｎｍのＯＤが０．６になるまで３７℃で培養した。ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を５５μｌ加え、１時間感染させた。
【００９６】
遠心により菌体を回収し、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に懸濁し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心後、上清を回収し、５分の１量の２０％ポリエチレングリコール、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿回収した。回収したファージは滅菌水に懸濁した。
【００９７】
次に２％スキムミルクを含む溶液中でファージとＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞を混合し、室温で３０分間反応させた。遠心により細胞に結合したファージを除き、上澄みを再度ＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞と混合した。この操作を１０回繰り返すことによりＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞に結合するファージを除去した。
【００９８】
続いてそのファージ溶液と△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を混合し、室温で１時間反応させた。遠心により結合しなかったファージ（上澄み）を除き、さらに５回の洗い操作によって非特異的な結合を排除した。その後０．１Ｍ ＨＣｌで細胞からファージをはがして回収し、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。こうして回収したファージを大腸菌ＴＧ１−ｔｒに１時間感染させ、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ寒天プレート上で一晩培養することによりコロニーを作製し、回収したものを△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞１回パンニングファージミドライブラリーとした。
【００９９】
ここまでのファージ調製、細胞に結合するファージの回収という操作を４回繰り返すことによって、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合するファージミドを濃縮した。各パンニングステップにおいて溶出されてきたファージ数は１回目から順に、８×１０7ｐｆｕ、１×１０8ｐｆｕ、１×１０9ｐｆｕ、６×１０10ｐｆｕである。
【０１００】
実施例４：精製ｓｃＦｖの調製
［標準的なｓｃＦｖ産生株培養法およびペリプラズム画分取得方法］
（１）ｓｃＦｖ産生大腸菌株を下記前培養液３０ｍｌに植菌して３０℃、１６０回転／分で終夜培養を行う。（前培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５％グルコース含有）
（２）終夜培養液３０ｍｌを本培養液３００ｍｌに加える。（本培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．４Ｍショ糖含有）
（３）３０℃、１６０回転／分で１時間培養後、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を加え、ｓｃＦｖの産生を誘導する。さらに、３０℃、１６０回転／分で６時間培養する。
（４）培養液を５００ｍｌの遠心管に移し、４℃、５５００回転／分で２０分間遠心する。
（５）沈殿物を回収し、１．８ｍｌの１０×ＨＥＰＥＳ緩衝液（１ｍＭ ＡＰＭＳＦ含有、４℃）に懸濁する。
（６）４０ｍｌの遠心管に移し、氷上で１５分間静置する。（５分おきにボルテックスで攪拌）
（７）４℃、８０００回転／分で１０分間遠心する。
（８）上清を回収し４℃に保存する。
（９）沈殿物を１６．２ｍｌ注射用水（１ｍＭ ＡＰＭＳＦ含有、４℃）に懸濁する。
（１０）氷上で２０分間静置する。（５分おきにボルテックスで攪拌）
（１１）４℃、１２０００回転／分で２０分間遠心する。
（１２）上清を回収し、（８）で保存してあった上清と合わせて「ペリプラズム画分」とする。
（１３）４℃に保存または−２０℃で凍結保存する。
【０１０１】
［標準的なｓｃＦｖ精製方法］
（１）ペリプラズム画分（３０ｍｌ）の約１／１０量の３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（アガロース担体の量として１／２０量）を測りとる。
（２）室温で６００回転／分で３分間遠心する。
（３）上清を捨て、１．５ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌する。
（４）真空ポンプで吸引し、１０−２０分間脱気を行う。
（５）３０ｍｌボリュームのカラムにＮｉ−ＮＴＡアガロースを装填する。
（６）１時間室温で静置する。
（７）１５ｍｌ緩衝液１（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）でカラムを平衡化する。
（８）３０ｍｌのペリプラズム画分を４℃で０．５ｍｉｎ／ｍｌの滴下速度で２回アプライする。以下の操作はすべて４℃で行う。
（９）１５ｍｌ緩衝液２（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、ｐＨ８）で洗浄する。
（１０）１．５ｍｌ緩衝液３（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、６５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）で２回ｓｃＦｖを溶出する。
（１１）Ｍｉｌｌｉｃｕｐ ＬＧＣ（ミリポア社製）で濃縮を行う。
（１２）１０００倍量のＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で透析を２回行う。
（１３）精製されたｓｃＦｖを回収し、４℃または−２０℃で凍結保存する。
【０１０２】
実施例５：リコンビナントＴＲ発現昆虫細胞結合性の評価
実施例１で作製した△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞で４回パンニングしたファージを大腸菌ＨＢ２１５１に感染させ、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成させた。
【０１０３】
こうして得られたファージミドがトランスフォームされた大腸菌ＨＢ２１５１株をアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（最終濃度０．５％）を含む２×ＹＴ培地中、３０℃で一晩振とう培養した。培養液を１０μｌとり、１００μｌのアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む培地に懸濁し、３０℃で１時間振とう培養した。ここで最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間振とう培養を続けた後、遠心によりペレットを回収した。これに１０×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を加えて菌体を懸濁した後、４℃で１５分静置した。最後に蒸留水を加えて１×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２９ｍＭ ＮａＣｌ、８．９ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２．８ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ2／Ｌ）の状態に戻したものをペリプラズム画分として回収した。これを結合評価用のｓｃＦｖサンプルとした。
【０１０４】
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に対する結合性の評価は以下のように行った。
まず９６ウエルマルチスクリーンプレート（ミリポア社製）を３％ウシ血清アルブミンでコーティングしたところに、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞とＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞をそれぞれ抗原として加え、調製したｓｃＦｖを混合し、１時間室温で反応させ、ｓｃＦｖのＣ末端側に存在するＥ ｔａｇ部分を認識するＨＲＰ／抗Ｅ ｔａｇ抗体コンジュゲートで検出した。こうして５４０個のコロニーを評価して△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合し、ＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖを３４個選択した。
【０１０５】
実施例６：ヒト巨核芽球系細胞を用いるＣａ流入阻害評価
実施例４において作製したｓｃＦｖのトロンビン惹起カルシウム流入阻害能を、以下に示す方法によって評価した。すなわち、巨核球細胞系の株化細胞をＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に懸濁し、最終濃度１μＭのＦｕｒａ２−ＡＭ（和光純薬社製）を３７℃で５０分間インキュベートしたのち、ＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で２回洗浄し、細胞密度が３．３３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製した。次にその細胞懸濁液３００μｌに実施例４において作製したｓｃＦｖ溶液を２００μｌ混合し、室温で３０分間インキュベートしたのち、最終濃度が１ｍＭになるようにＣａＣｌ2を添加し、さらに室温で５分間インキュベートした。そこにヒト血漿由来トロンビン（シグマ社製）を最終濃度が０．４Ｕ／ｍｌになるように添加し、添加３０秒後の細胞内カルシウム流入量をＣＡＦ−１００（日本分光社製）を用いて測定した。その例として、４種類のクローン（Ｎ０２１、Ｎ０２２、Ｎ０２３、Ｎ０２５）について、ｓｃＦｖ溶液のかわりにＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液とインキュベートした場合のカルシウム流入量を１００としたときの相対値および阻害率を算出した（表２参照）。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】
実施例７：血小板凝集阻害評価
健常人より０．３８％クエン酸加血として採血し、９００回転／分で１５分遠心することにより血小板を豊富に含む血漿を取得した。その血漿をセファロース２Ｂを用いＨＥＰＡＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液にて展開することにより血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液（＞２×１０8／ｍｌ）を調製した。得られた血小板浮遊液２１０μｌにｓｃＦｖ溶液９０μｌを混合し、２０分間静置した。そのうち２８５μｌをキュッベットに分取し、アグリゴメーターＰＡＭ８Ｃ（メバニクス株式会社）を用いて攪拌しつつ、３７℃にて２分間で安定化した。その血小板浮遊液の濁度を測定しつつ、７．５μｌのＣａＣｌ2 水溶液（最終濃度１．５ｍＭ）を添加した。さらに７．５μｌのヒトトロンビン（最終濃度０．１〜０．２Ｕ／ｍｌ）を添加して血小板の凝集を惹起し、その濁度の変化から血小板の凝集度を１１分間測定することによってｓｃＦｖによる血小板凝集阻害を評価した。トロンビンで惹起された最大凝集度を１００％としたときのｓｃＦｖの阻害活性の例を表３に示した。
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
実施例８：滑膜細胞増殖阻害評価
実施例４に示したように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにて精製したｓｃＦｖについて、さらにエンドトキシンの除去を行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラム溶出物１６０ｍｌを限外濾過膜を用いて９０ｍｌに濃縮したのち、φ０．２２μｍのフィルターで濾過した後、セファクリルＳ−１００を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ｓｃＦｖが溶出する画分を回収した。それを再度Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードして６０ｍｌの溶出画分を得、それを限外濾過膜を用いて１０ｍｌに濃縮した。それを２ＬのＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して２回透析した後、カニ外殻キトサン多孔性粒子を用いたアフィニティーカラムにロードし、フロースルー画分を回収し、φ０．２２μｍのフィルターで濾過した。各精製工程におけるエンドトキシン量、蛋白質量を表４に示した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
次に、慢性関節リウマチ患者の滑膜組織から外植片法により初代培養したのち数代継代した滑膜細胞を、９６穴のマイクロタイタープレートにて１ウェル当たり５×１０3細胞になるように播き込み、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養した。上清を除去し、無血清のＤＭＥＭ培地で洗浄した後に０．１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を添加し、さらに４８時間血清飢餓条件下で培養した。そこにエンドトキシンを除去したｓｃＦｖを添加し、３０分間インキュベートした後、ヒト血漿由来トロンビン（シグマ社製）を最終濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように添加した。添加２４時間後にチミジンのアナログであるＢｒｄＵを最終濃度１ｍＭになるように添加し、添加４８時間後に蛋白固相液により細胞核内に取り込まれたＢｒｄＵを固相化し、酵素標識された抗ＢｒｄＵ抗体を用いて検出した。トロンビンで惹起されたＢｒｄＵ取り込み量を１００％としたときのｓｃＦｖの阻害活性の例を表５に示した。
【０１１２】
【表５】
【０１１３】
実施例９：ｓｃＦｖのエピトープの決定
以下に示す９４種類の１５アミノ酸をＣ末端が固相側になるように９４本のピン上に固相合成した。該ペプチドはすべてＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含されるペプチドである。
【０１１４】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の１番目から１５番目のアミノ酸配列［配列番号１６］、同じく２番目から１６番目のアミノ酸配列［配列番号１７］、同じく３番目から１７番目のアミノ酸配列［配列番号１８］、同じく４番目から１８番目のアミノ酸配列［配列番号１９］、同じく５番目から１９番目のアミノ酸配列［配列番号２０］、同じく６番目から２０番目のアミノ酸配列［配列番号２１］、同じく７番目から２１番目のアミノ酸配列［配列番号２２］、同じく８番目から２２番目のアミノ酸配列［配列番号２３］、同じく９番目から２３番目のアミノ酸配列［配列番号２４］、同じく１０番目から２４番目のアミノ酸配列［配列番号２５］、同じく１１番目から２５番目のアミノ酸配列［配列番号２６］、同じく１２番目から２６番目のアミノ酸配列［配列番号２７］、同じく１３番目から２７番目のアミノ酸配列［配列番号２８］、同じく１４番目から２８番目のアミノ酸配列［配列番号２９］、同じく１５番目から２９番目のアミノ酸配列［配列番号３０］、同じく１６番目から３０番目のアミノ酸配列［配列番号３１］、同じく１７番目から３１番目のアミノ酸配列［配列番号３２］、同じく１８番目から３２番目のアミノ酸配列［配列番号３３］、同じく１９番目から３３番目のアミノ酸配列［配列番号３４］、同じく２０番目から３４番目のアミノ酸配列［配列番号３５］、同じく２１番目から３５番目のアミノ酸配列［配列番号３６］、同じく２２番目から３６番目のアミノ酸配列［配列番号３７］、同じく２３番目から３７番目のアミノ酸配列［配列番号３８］、同じく２４番目から３８番目のアミノ酸配列［配列番号３９］、同じく２５番目から３９番目のアミノ酸配列［配列番号４０］、同じく２６番目から４０番目のアミノ酸配列［配列番号４１］、同じく２７番目から４１番目のアミノ酸配列［配列番号４２］、同じく４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］、同じく５２番目から６６番目のアミノ酸配列［配列番号５４］、同じく５３番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号５５］、同じく５４番目から６８番目のアミノ酸配列［配列番号５６］、同じく５５番目から６９番目のアミノ酸配列［配列番号５７］、同じく５６番目から７０番目のアミノ酸配列［配列番号５８］、同じく５７番目から７１番目のアミノ酸配列［配列番号５９］、同じく５８番目から７２番目のアミノ酸配列［配列番号６０］、同じく５９番目から７３番目のアミノ酸配列［配列番号６１］、同じく６０番目から７４番目のアミノ酸配列［配列番号６２］、同じく６１番目から７５番目のアミノ酸配列［配列番号６３］、同じく６２番目から７６番目のアミノ酸配列［配列番号６４］、同じく６３番目から７７番目のアミノ酸配列［配列番号６５］、同じく６４番目から７８番目のアミノ酸配列［配列番号６６］、同じく６５番目から７９番目のアミノ酸配列［配列番号６７］、同じく６６番目から８０番目のアミノ酸配列［配列番号６８］、同じく６７番目から８１番目のアミノ酸配列［配列番号６９］、同じく６８番目から８２番目のアミノ酸配列［配列番号７０］、同じく６９番目から８３番目のアミノ酸配列［配列番号７１］、同じく７０番目から８４番目のアミノ酸配列［配列番号７２］、同じく７１番目から８５番目のアミノ酸配列［配列番号７３］、同じく７２番目から８６番目のアミノ酸配列［配列番号７４］、同じく７３番目から８７番目のアミノ酸配列［配列番号７５］、同じく７４番目から８８番目のアミノ酸配列［配列番号７６］、同じく７５番目から８９番目のアミノ酸配列［配列番号７７］、同じく７６番目から９０番目のアミノ酸配列［配列番号７８］、同じく７７番目から９１番目のアミノ酸配列［配列番号７９］、同じく７８番目から９２番目のアミノ酸配列［配列番号８０］、同じく７９番目から９３番目のアミノ酸配列［配列番号８１］、同じく８０番目から９４番目のアミノ酸配列［配列番号８２］、同じく８１番目から９５番目のアミノ酸配列［配列番号８３］、同じく８２番目から９６番目のアミノ酸配列［配列番号８４］、同じく８３番目から９７番目のアミノ酸配列［配列番号８５］、同じく８４番目から９８番目のアミノ酸配列［配列番号８６］、同じく８５番目から９９番目のアミノ酸配列［配列番号８７］、同じく８６番目から１００番目のアミノ酸配列［配列番号８８］、同じく８７番目から１０１番目のアミノ酸配列［配列番号８９］、同じく８８番目から１０２番目のアミノ酸配列［配列番号９０］、同じく８９番目から１０３番目のアミノ酸配列［配列番号９１］、同じく９０番目から１０４番目のアミノ酸配列［配列番号９２］、同じく１５９番目から１７３番目のアミノ酸配列［配列番号９３］、同じく１６０番目から１７４番目のアミノ酸配列［配列番号９４］、同じく２３５番目から２４９番目のアミノ酸配列［配列番号９５］。同じく２３６番目から２５０番目のアミノ酸配列［配列番号９６］、同じく２３７番目から２５１番目のアミノ酸配列［配列番号９７］、同じく２３８番目から２５２番目のアミノ酸配列［配列番号９８］、同じく２３９番目から２５３番目のアミノ酸配列［配列番号９９］、同じく２４０番目から２５４番目のアミノ酸配列［配列番号１００］、同じく２４１番目から２５５番目のアミノ酸配列［配列番号１０１］、同じく２４２番目から２５６番目のアミノ酸配列［配列番号１０２］、同じく２４３番目から２５７番目のアミノ酸配列［配列番号１０３］、同じく２４４番目から２５８番目のアミノ酸配列［配列番号１０４］、同じく２４５番目から２５９番目のアミノ酸配列［配列番号１０５］、同じく２４６番目から２６０番目のアミノ酸配列［配列番号１０６］、同じく２４７番目から２６１番目のアミノ酸配列［配列番号１０７］、同じく２４８番目から２６２番目のアミノ酸配列［配列番号１０８］、同じく３２９番目から３４６番目のアミノ酸配列［配列番号１０９］
【０１１５】
上記９４種類のペプチドが固相化されたピンをプレコートバッファー（２％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％アジ化ナトリウム０．０１Ｍ ＰＢＳ）に室温で６０分間浸したのちに、洗浄バッファー（０．０１Ｍ ＰＢＳ）で室温で１０分間洗浄した。次に２０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ溶液（１％ＢＳＡ、０．１％スキムミルク含有）に４℃で終夜反応させたのちに洗浄バッファーで４回洗浄した。次にｓｃＦｖのｃ−ｍｙｃタグを特異的に認識する抗体である９Ｅ１０にホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたものを１μｇ／ｍｌ（１％ ＢＳＡ、０．１％スキムミルク、０．０１Ｍ ＰＢＳ含有）の濃度で室温で６０分間反応させた後、洗浄バッファーで４回洗浄した。次に発色剤溶液（ＡＢＴＳ）にピンを１０分間浸漬し、波長４０５ｎｍにおける発色剤溶液の吸光度を測定した。その結果、滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０２２およびＮ０２５は、以下のアミノ酸配列に対して特異的に結合した。すなわち、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］である。
【０１１６】
このことから、トロンビンで惹起した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０２２およびＮ０２５のエピトープは、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列を認識することが示された。
【０１１７】
また滑膜細胞増殖を阻害しないｓｃＦｖクローンＮ０１８は、以下のアミノ酸配列に対して特異的に結合した。すなわち、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］である。
【０１１８】
このことから、トロンビンで惹起した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖのエピトープは、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５６番目のアミノ酸配列であることが示された。
【０１１９】
実施例１０：ｓｃＦｖのＫｉｎｅｔｉｃｓ解析
滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープに対するＫｉｎｅｔｉｃｓ特異性の検証を表面プライズモン共鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて行った。
【０１２０】
以下に示す２１アミノ酸を合成した（株式会社バイオロジカ）。このペプチドはＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含され、活膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープを含むペプチドである。
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１０］
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
【０１２１】
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１０］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＫＬＨ ａｎｄ ＢＳＡ」を用い、まずＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド１ｍｇをＫｉｔのＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さらにＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、ＫＬＨ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３０分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止させた。その後、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して２回透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。
【０１２２】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体ペプチドまたリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡＣＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキット」を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なった。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同社市販のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ボリソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／分で流した。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応させ、センサーチップ表面上のカルボキシメチルデキストランを活性化させた。１００μｇ／ｍｌのＫＬＨ ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄペプチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応させることによりセンサーチップ上に結合させ、さらにアミンカップリングキット中のエタノールアミンを７分間（３５μｌ）反応させて残余の活性型ＮＨＳ基をブロッキングした。
【０１２３】
上記センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結合解離曲線を測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にてｓｃＦｖを５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌに調製し、各ｓｃＦｖ溶液について、流速２０μｌ／分で３分間センサーチップに反応させた。その後、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ／分で５分間流し、センサーチップを１０ｍＭ ＨＣｌで２０μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一連の操作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定することによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの結合解離曲線を得た。得られた結合解離曲線と各ｓｃＦｖの濃度から、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．２．１を用いて同社添付のプログラムに準じ、各ｓｃＦｖの結合解離定数を算出した。その結果、各ｓｃＦｖの結合解離定数（ＫＤ値）は滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖでＫＤ値：約５×１０-7Ｍ、滑膜細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖでＫＤ値：約１×１０-7Ｍであった（表６参照）。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
実施例１１：ｓｃＦｖのエピトープのアミノ酸残基特異性の比較
滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープにおけるアミノ酸残基特異性の検証を、表面プライズモン共鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて行った。
【０１２６】
以下に示す５種類の２１アミノ酸を合成した（株式会社バイオロジカ）。４種のペプチドはヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含されるペプチドとそのアミノ酸残基置換ペプチドである。
【０１２７】
すなわち、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１２］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１３］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１４］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１５］、およびコントロールの２１アミノ酸配列［配列番号１１１］
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
である。
【０１２８】
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１２］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＫＬＨ ａｎｄ ＢＳＡ」を用い、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド１ｍｇをＫｉｔのＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、ＫＬＨ溶解液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さらにＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、ＫＬＨ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３０分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止させた。さらにＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して２回透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。
【０１２９】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体ペプチド、またリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡＣＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキット」を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なった。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同社市販のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ボリソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／分で流した。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応させ、センサーチップ表面上のカルボキシルデキストランを活性化させた。１００μｇ／ｍｌの ＫＬＨ複合体ペプチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応させることによりセンサーチップ上に結合させ、さらにアミンカップリングキット中のエタノールアミンを７分間（３５μｌ）反応させて残余のＮＨＳ基をブロッキングした。
【０１３０】
上記センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結合を確認した。ｓｃＦｖをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にて５０μｇ／ｍｌに調製し、流速１０μｌ／分で３分間反応させた。その後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ／分で５分間流し、センサーチップを１０ｍＭ ＨＣｌで２０μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一連の操作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定することによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの最大結合量を得た。滑膜細胞増殖活性を有するｓｃＦｖで最大結合量約３００ＲＵ、滑膜細胞増殖活性のないｓｃＦｖで最大結合量約６００ＲＵの結合値を得た。
【０１３１】
上記線センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスに、ペプチドに対するｓｃＦｖ５種の各ペプチドによる競合結合阻害を測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にてｓｃＦｖ（終濃度５０μｇ／ｍｌ）とペプチド（終濃度５μｇ／ｍｌ）の混合液を調製し、ｓｃＦｖ−ペプチド混合液を流速１０μｌ／分で３分間反応させた。
【０１３２】
コントロールペプチドでは滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともに結合を阻害されなかった。ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチドでは滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともに結合が阻害された。
【０１３３】
活膜細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖではヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチド、および４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは結合阻害が認められず、アミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認められた。
【０１３４】
滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖではヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドおよび４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認められ、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは結合阻害が認められなかった。
【０１３５】
滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともにエピトープとして重複したアミノ酸配列を認識しているものの、そのエピトープにおける各アミノ酸残基に対する重要度に違いがあることが確認された。
【０１３６】
トロンビン惹起滑膜細胞増殖阻害にはヒトトロンビンレセプターのアミノ酸末端から５６番目のトリプトファン残基がｓｃＦｖの重要な結合部位であることが確認された。
【０１３７】
【発明の効果】
本発明の薬剤（ポリペプチドまたは化合物）は、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を抑制し、細胞増殖阻害活性やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制する活性を有し、各種炎症性疾患や細胞増殖性疾患の治療薬として用いられる。
【０１３８】
【配列表】
【０１３９】
【発明の属する技術分野】
本発明はトロンビンによる細胞の増殖を抑制しうる薬剤に関する。さらに詳しくは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの特定の領域に結合して該レセプターの細胞増殖に関する機能を阻害する薬剤に関する。本発明はまた、新規なヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプター、ならびにそれをコードするＤＮＡ断片に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トロンビンは血液凝固カスケードの最終段階に関与し、血栓止血において極めて重要な役割を果たすセリンプロテアーゼである。一方、トロンビンは血管内皮細胞上のトロンボモジュリンと結合すると、凝固促進的な働きは全くなくなり、逆にプロテインＣの活性化能が数千倍も増強される。このようにして活性化されたプロテインＣは、第Ｖ因子や第ＶIII因子を分解して抗凝固作用を示す。したがって、トロンビンは抗凝固因子としての働きももっていることになる。トロンボモジュリンはトロンビン受容体の一種であるが、最近トロンビンのシグナルを伝達するタイプの受容体（レセプター）が発見された（Vu, T. K. H. et al. :Cell, 64, 1057-1068 (1991)）。最初にクローニングされたシグナル伝達型のトロンビンレセプター（ＰＡＲ１）のｃＤＮＡは４２５個のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードしており、７個の膜貫通領域をもつ典型的なＧ蛋白共役型レセプターの構造を有している。
【０００３】
トロンビンはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞外Ｎ末端側の部位Ａｒｇ（４１）−Ｓｅｒ（４２）を限定分解する。ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＮ末端側が遊離すると、新たに露呈してきたＮ末端部位がアゴニストとして働くという極めて特徴的な構造をしている。すなわちトロンビンはリガンドとして働くのではなく、レセプターに内在しているリガンド（ＴＲＡＰ： Thrombin Receptor Agonist Peptide）を露呈させる役目をもっているだけである。このリガンド部位のＣ末端側には隣接して酸性アミノ酸に富んだ部位がある（−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−）。この部位はトロンビンの天然インヒビターであるヒルの唾液中のヒルジンに相同性が高く、ヒルジン様ドメインとよばれており、トロンビンが結合する部位と考えられている（医学のあゆみ、167, 484-487 (1993)）。
【０００４】
トロンビンのシグナルにより、血小板や血管内皮細胞のみならず、血管平滑筋細胞やマクロファージなども活性化され、遊走し、増殖する。粥状硬化、ＰＴＣＡ後などにＰＡＲ１型トロンビンレセプターが過剰発現していることからみて、このレセプターが各種血管病変の成立に重要な役割を果たすと考えられてきた。
【０００５】
抗トロンビン剤、すなわちトロンビン阻害剤は、前述したようなトロンビンの機能を考えると、血液凝固カスケードを阻害するばかりでなく活性化プロテインＣの生成も抑制することになる。すなわち血管内皮上の凝固と抗凝固のバランスがくずれることが予想され、副作用として、例えば出血が懸念される。
【０００６】
一方、トロンビンレセプター阻害剤は、その作用機序からみて、血液凝固系には全く影響を及ぼさずに細胞表面のレセプターを調節することで、細胞増殖や細胞遊走などの細胞活性化のみを抑制することが期待できる。つまり、トロンビン阻害剤と異なり、トロンビンレセプター阻害剤は、出血という副作用の少ない薬剤となりうると考えれる。さらに、対象疾患のすみわけも可能である。例えば、トロンビン阻害剤は血栓症が対象になるのに対し、トロンビンレセプター阻害剤は細胞増殖性の疾患が対象となる。
【０００７】
次に、トロンビンと細胞上のレセプターとの反応が各種疾患といかに関連するかについて説明する。例えば、リウマチにおける滑膜細胞増殖や、動脈硬化における血小板凝集、平滑筋細胞増殖、あるいはマクロファージ遊走に細胞上のトロンビンレセプターが関与していることを示唆する報告を以下に示す。
【０００８】
リウマチ患者の滑膜組織においてＰＡＲ１型トロンビンレセプターは過剰発現している（Ann. Rheum. Dis., 55: 841-843 (1996)）。また、リウマチ患者の滑液中には活性化トロンビンが多量に存在し、さらに滑液中ではトロンビン生成量を反映するメルクマールであるＴＡＴ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ−Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ）が健常人血漿値に比べて数千倍も高値になっていることが最近明らかにされている（J. of Rheumatology, 23, 1505-1511 (1996); Clin. Exp. Rheumatol., 17, 161-170 (1999)）。
【０００９】
さらに、リウマチ患者由来の滑膜細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養液中にトロンビンあるいはＴＲＡＰを添加することによって、トリチウムチミジンの取り込みが増加すること、すなわちトロンビンレセプターの作用を介して増殖することが示唆されている（Clinical Immunology and Immunopathology, 76: 225-233 (1995)）。
【００１０】
また、慢性関節リウマチにおいては増殖した滑膜組織内に新生血管が多くみられることが特徴であるが、トロンビンは血管内皮細胞の管腔形成など血管新生の過程に関与することが示唆されている（Am. J. Physiol., 273, c239-245, 1997）。
【００１１】
さらに、慢性関節リウマチ患者の病態においてマトリックスメタロプロテアーゼの発現が亢進していることが知られている。トロンビンは血管内皮細胞に作用してマトリックスメタロプロテアーゼ−１および−３の発現を亢進するが、そのうちのマトリックスメタロプロテアーゼ−３の発現にＰＡＲ１型トロンビンレセプターが関与していることが報告されている（Atheroscler. Thromb. Vasc. Biol., 17, 1731-1738 (1997)）。このことから、トロンビンレセプターは慢性関節リウマチの滑膜増生、およびそれに引き続いて起きる骨軟骨破壊の過程に関与していると考えられる。
【００１２】
これらの報告をまとめてみると、関節局所で生成したトロンビンが滑膜組織あるいは滑膜細胞表面上のトロンビンレセプターを介してシグナル伝達を起こし、滑膜細胞増殖が惹起されていると考えられる。
【００１３】
リウマチの発症機序は、最近の研究から滑膜細胞増殖が骨軟骨破壊に到るステップであることが明らかにされている。しかしながら、現行の抗リウマチ薬の作用をみると、痛みを和らげる抗炎症薬が主流であり、滑膜細胞増殖を有効に阻害調節する薬剤は未だない。早期リウマチ治療を考えた場合、滑膜細胞増殖阻害剤は、対症療法のための薬剤ではなく根治薬となりうる。
【００１４】
また、粥状動脈硬化やＰＴＣＡ後の再狭窄などの血管病変の病態進展においては新生内膜肥厚がその大きな要因となっており、その新生内膜組織にはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの過剰発現が認められることが報告されている（Journal of Clinical Investigation, 90, 1614-1621 (1992)）。
【００１５】
一方、トロンビンはｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板の凝集、平滑筋細胞の増殖、マクロファージの遊走を惹起することから、病変部位においても浸潤したマクロファージや血小板、内膜平滑筋細胞表面上のトロンビンレセプターを介するシグナル伝達に関与し、局所炎症亢進、平滑筋細胞増殖を起こしていることが強く示唆される。
【００１６】
また、上記以外にもＰＡＲ１型トロンビンレセプターと疾患に関する報告例のひとつとして、脳神経細胞（Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）がトロンビンあるいはＴＲＡＰによってアポトーシスを起こすことが最近報告されており（The Journal of Neuroscience, 17, 5316-5326, (1997)）、トロンビンレセプターと脳神経障害との関連性が示唆されている。また、トロンビンレセプターはある種のヒト肺ガン細胞の転移にも関与しているとの報告もある（Nature Med., 4, 909-914,1998）。
【００１７】
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、その生体内における分布や機能から考えると、上述のリウマチや動脈硬化、脳神経障害に限らず、各種疾患の発症あるいは増悪に関連していると考えられる。
【００１８】
しかしながら、一部の報告ではＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位に対する抗体でラットの血管平滑筋細胞の増殖を抑制しうることが示されているものの（Circ.Res. 82, 980-987 (1998)）、ヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対する阻害剤で細胞増殖を抑制したという報告は現在のところない。また、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位による刺激は細胞の増殖には不十分である可能性も報告されている（FEBS Lett., 15, 225-228 (1993); J Surg. Res., 68, 139-144 (1997); Circulation 95, 1870-1876 (1997)）。さらに近年トロンビンに反応するといわれる複数のレセプター（ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、Ｎ−ＰＡＲ）が報告されており、それらのレセプターと細胞の増殖作用などとの関連については明らかになっていない（Nature, 386, 502-506 (1997); Nature, 394, 690-694 (1998); Biochem. J., 313, 353-368 (1996)）。
【００１９】
次にファージミド技術すなわちファージディスプレイライブラリーについて詳述する。
ファージ表面上に発現されたタンパク質をあたかもファージと融合した巨大タンパク質として扱うことが可能となり、目的の物質（例えば抗原タンパク質）に結合するファージクローンを効率的に選別できるようになった。いったん選択されたファージはたとえ少数であろうとも、大腸菌での感染、増殖過程を経ることにより大量のファージとすることができる。
【００２０】
また、ファージディスプレイベクターの最大の特長は、ファージ表面に提示されたタンパク質の性質（表現型）を指標として選択を行うことにより、そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列（遺伝子型）を同時に回収できることであり、したがって遺伝子レベルでの解析を行うことが容易な点である。
【００２１】
特異的結合能をもつファージクローンをライブラリーから選択的に分離するためには、基本的に標的タンパク質への結合、洗浄、そして溶出という操作を行う。さらに、標的タンパク質に特異的に強く結合するファージクローンを濃縮するために、溶出操作後に得られたファージを大腸菌に感染してその増殖を行い、標的タンパク質での選択操作を繰り返す必要がある。このような結合、洗浄、溶出、増殖という過程はパンニングとよばれており、通常この操作を５回程度繰り返すことにより、ライブラリーより特異的結合能をもつファージを選択的に分離することができる。
【００２２】
ファージの結合対象としては、タンパク質のみならずターゲットタンパク質を表面に発現している細胞そのもの、炭水化物、核酸、化学薬品などがある。
また、溶出過程では、酸あるいはアルカリによる処理が一般的に用いられている。
【００２３】
ファージディスプレイは、その原理上いかなるポリペプチドにも応用可能である。例えば抗体のＶＨとＶＬ領域をペプチドリンカーでつないだ一本鎖抗体すなわち単鎖型Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ； ｓｃＦｖ）断片の形で、外殻タンパク質IIIとの融合タンパク質としてファージ表面上に提示することができる。
【００２４】
抗原（標的タンパク質あるいは細胞など）を免疫したマウスのＢリンパ細胞に由来するｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法によりＶＨとＶＬ遺伝子をそれぞれ増幅すると共にクローン化することにより、さまざまな抗原結合部位を提示するファージミドライブラリーを作製することができる。そのライブラリーの大きさは、通常の分子生物学的手法によれば１０の８乗程度である。この方法を用いることで特定の抗原に対して異なる結合特性をもつ単鎖抗体を同時に多種類取得することが可能となる。
【００２５】
従来のトロンビンレセプターに対する抗体は、アミノ末端の細胞外部分のペプチドを合成し、抗原として動物に免疫して取得されている。例えば、ウサギポリクローナル抗体の調製が報告されている（Circulation., 91, 2961-2971 (1995)）。また、ラットのトロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含むペプチドＳＦＦＬＲＮＰＳＥＤＴＦＥＱＦをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体は、ラットの平滑筋細胞のトロンビンによる増殖を抑制したことが報告されている（Circ. Res., 82, 980-987 (1998)）。
【００２６】
しかしながら、本発明者らの検討では、ヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターのＴＲＡＰ部位を含むペプチドＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦを免疫して得たウサギポリクローナル抗体によっては、ヒト血管平滑筋細胞およびヒト関節滑膜細胞のトロンビンによる細胞増殖を抑制することはできなかった。
【００２７】
トロンビンレセプターはリガンドを分子中に内在し、トロンビンによってアミノ末端側が切断されて露呈したＴＲＡＰ部分が分子内の特定部分と相互作用をすることによってシグナル伝達が起こると考えられている。また、トロンビンはトロンビンレセプターを切断した後、レセプター分子から離れて次々とレセプターを活性化していくものと考えられる。こうしたことから、トロンビンレセプターはトロンビンと結合した後に、さらにはトロンビンによって切断された後に、分子内で立体構造変化を起こしていることが示唆されている（米国心臓学会、１９９６年）。
【００２８】
一方ファージミド技術によって得られたｓｃＦｖは、１回のライブラリーの作成により多数の独立したクローンが得られること、またその各クローンは単一の抗原決定基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗体を安定的に産生できるという利点をもつことから、リガンドとレセプターの機能解析、アンタゴニストあるいはアゴニスト分子デザイン、構造活性相関研究に近年利用されるようになってきた。
【００２９】
ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖シグナル伝達においては、ＴＲＡＰ部位以外の部位が関与している可能性が考えられてきたが、その部位については今までの情報では特定できていない。
【００３０】
しかしながら、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上に存在する未知の細胞増殖に関与する部位に対する抗体を作成するために、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの全配列を分割した複数の部分ペプチドを作成して免疫し、得られたそれぞれの抗体について細胞増殖抑制活性を検討する方法では効率が悪いといわざるを得ない。
【００３１】
そこで本発明者らは、トロンビン切断部位およびＴＲＡＰ部位を欠損させた組み換えＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを細胞上に発現させ、その機能および構造活性相関に関して鋭意研究を重ねた。その結果、このヒトトロンビンレセプター改変体を発現した細胞を抗原としてマウスに免疫し、構築したファージディスプレイライブラリーからヒトトロンビンレセプターに対するｓｃＦｖを作製することで、トロンビンレセプターの機能を特異的に抑制する薬剤を得ることができた。
【００３２】
本発明のｓｃＦｖは、慢性関節リウマチ患者より取得した関節滑膜細胞のトロンビン惹起増殖を特異的に抑制する活性を有する。現在まで、トロンビンレセプターに対する抗体を含むトロンビンレセプター阻害剤によってトロンビンによる細胞増殖を有意に抑制したと報告はなく、この活性は本発明の薬剤において初めて認められたものである。
【００３３】
例えば特表平６−５０８７４２号公報にはトロンビンレセプターに対する抗体を含むアンタゴニストの取得についての記載があるものの、トロンビンレセプターのアンタゴニストによる細胞増殖作用の抑制についての記載はない。
【００３４】
さらに、本発明に至る過程で、種々のＰＡＲ１型トロンビンレセプターと結合しうるｓｃＦｖおよび抗体についてトロンビンによる細胞増殖の抑制の検討を行ったところ、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上の特定の配列を認識するｓｃＦｖクローンのみが有意に抑制活性を示した。すなわち、従来ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのトロンビンとの結合に関与する部位といわれていたＹＥＰＦＷ配列を認識するｓｃＦｖのうち、一部のｓｃＦｖクローンのみが細胞増殖抑制活性を有することも明らかになった。この細胞増殖抑制活性をもつｓｃＦｖクローンは、該活性をもたないｓｃＦｖクローンと比較してトロンビンによる細胞でのＣａ流入反応、血小板凝集に対する抑制効果、およびエピトープペプチドに対するアフィニティの強さにおいて特に強い活性を示すことはなく、したがって従来の技術により細胞増殖抑制活性をもつｓｃＦｖや抗体を取得することは困難と考えられる。
【００３５】
さらに、本発明者らが鋭意検討を行ったところ、トロンビンによる細胞増殖を抑制する活性のあるｓｃＦｖクローンは、その認識エピトープであるヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターの５２番目から５６番目のアミノ酸配列のうちの５６番目のトリプトファン残基をアラニン残基に置き換えることで、該エピトープへの結合性を失った。
【００３６】
これに対し、同様のエピトープに結合しうる細胞増殖抑制活性のないｓｃＦｖクローンは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターエピトープの５６番目のトリプトファンをアラニンに置き換えてもそれへの結合性を保持していた。つまり、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞増殖に関与する部位は、従来のトロンビンに対するアニオン外部部位結合領域では規定されず、そのすぐ下流に位置するヒルジン様配列（ＥＤＥＥ）の間に位置する５６番目のトリプトファン残基を中心にした部位であることが示された。
【００３７】
以上のことから、本発明はトロンビンによる細胞の増殖を抑制しうる薬剤を効率よく取得するための技術を含んでいる。すなわち、従来のトロンビンレセプター阻害剤の取得方法であるトロンビンによる細胞でのＣａ流入反応の抑制や、血小板の凝集抑制を評価項目とする方法では、トロンビンによる細胞の増殖を有効に抑制しうる薬剤を取得することは困難であり、本明細書に示されているように、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖に関連する特定の配列の情報を得たことによってトロンビンの細胞増殖作用を有効に阻止しうる抗体や薬剤の取得が可能になったのである。
【００３８】
本発明の薬剤の一例は、マウス抗体骨格をもつｓｃＦｖであるが、該遺伝子配列をもとにＣＤＲグラフティングなどの技術を利用することによって、ヒト化抗体を作製することが可能である。またｓｃＦｖを改変してＦｃ部分を付加したり、あるいは二本鎖の完全分子型の抗体にすることも可能である。これらは血中半減期が異なると予想され、対象疾患、投与部位、投与方法によって抗体の剤型を変えることができる。
【００３９】
また、本発明のｓｃＦｖはＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖に重要な部位を認識するため、このｓｃＦｖを用いてより活性の高い抗体やＰＡＲ１型トロンビンレセプターと結合してその活性を修飾しうる化合物を選別、取得するためのツールとして用いることが可能である。
【００４０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対する多種類の抗体を取得することによってＰＡＲ１型トロンビンレセプターの細胞増殖への関与を検証するとともに、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター上の増殖に強く関与する部位を特定し、その情報をもとにトロンビンによる細胞増殖を有効に抑制しうる薬剤を取得する点にある。
【００４１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを特異的に認識するポリペプチドを見出し、本発明に到達した。
【００４２】
すなわち本発明者らは、遺伝子工学的に各種ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを昆虫細胞表面に機能を有する蛋白として発現させた。本発明者らが作製したＰＡＲ１型トロンビンレセプター改変体は次の３種類である。
（１）△１−４９ＴＲ
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端の１番目から４９番目までのアミノ酸を欠失させたレセプター：内在性リガンドであるＴＲＡＰ部分やトロンビンによって切断されて遊離するペプチド部分を欠失させたレセプター。トロンビン結合部位すなわちヒルジン様ドメインは有している。△１−４９ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（２）△１−８０ＴＲ
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端１番目から８０番目のアミノ酸を欠失したレセプター：ＴＲＡＰ部分、遊離ペプチド、ヒルジン様ドメインを含まないレセプター。△１−８０ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（３）Ｆｕｌｌ ＴＲ
天然に存在するＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプター：各機能部位を分子内に有する。Ｆｕｌｌ ＴＲのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【００４３】
本発明者らは上記（１）〜（３）の各レセプターを発現させた昆虫細胞を抗原としてマウスに免疫し、得られたマウス抗血清から抗体を調製し、それぞれの抗体のプロファイルを検討した。その結果、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を抗原として免疫し得られた抗体にアンタゴニスト的な活性プロファイルが認められた。
【００４４】
そこで本発明者らは、△１−４９ＴＲ発現細胞を抗原として免疫したマウスの脾臓細胞よりファージミドライブラリーを作製し、そのライブラリーから吸脱着すなわちパンニング法によってヒトトロンビンレセプターを特異的に認識して結合するｓｃＦｖを選別、取得した。
【００４５】
本発明者らは、さらに研究を進めた結果、取得したＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターを認識するｓｃＦｖの中に、次のような特徴を有するものがあることを見出した。すなわち、ヒト細胞表面上のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに結合し、トロンビンによるトロンビンレセプターを介したカルシウム流入を抑制する活性を有すること、さらにはヒト血小板上のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに結合して、トロンビンによるトロンビンレセプターを介した血小板凝集を阻害する活性を有すること、さらにはヒト滑膜細胞のトロンビンレセプターに結合して、トロンビンによるトロンビンレセプターを介した滑膜細胞増殖を阻害する活性を有することが明らかになった。
【００４６】
さらに本発明者らは、取得した抗体の結合部位のアミノ酸配列を決定した。該エピトープの解析手法としては、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの部分合成ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡおよび各種トロンビンレセプター発現細胞を用いるＥＬＩＳＡを行った。また、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのすべての細胞外領域を包含するように１つのピン当たり１５アミノ酸の長さのペプチドを計９４種類ピン上に固相合成したマルチピンＥＬＩＳＡを行った。
【００４７】
トロンビンレセプターの内在性リガンドであるＴＲＡＰ部分に対するポリクローナル抗体、あるいはトロンビン結合部位であるヒルジンライクドメインに対するポリクローナル抗体は、それぞれの機能部位に対して複数のエピトープで結合するため、トロンビンレセプターの機能に影響を与える可能性はある。しかしながらどのエピトープをブロックすることがアンタゴニストとして有効かはこれまで明らかではなかった。そこで、本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、ヒルジン様ドメインに包含されるＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５５番目のアミノ酸が増殖惹起を含むトロンビンレセプター機能に重要であり、その部分に由来する機能を抑えることが該レセプター阻害剤として有効であることがわかった。
【００４８】
このエピトープのアミノ酸配列は、トロンビンレセプターの活性化および機能発現において重要な部位であると考えられる。例えばこの部位に抗体が結合することによってトロンビンとトロンビンレセプターの相互作用が阻害されること、またトロンビンはレセプターに結合するが、ＴＲＡＰによるレセプターの細胞外ループ部分への相互作用を阻害していることなど種々の可能性が考えられる。
【００４９】
また、このヒトＰＡＲ１型トロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５５番目の配列の中でも増殖に関与する部位があることが判明した。すなわち本発明者らは同様の部位に結合し、かつ同様のエピトープに対する親和性を示す複数のｓｃＦｖを取得しているが、トロンビンの細胞の増殖を抑制しうるのはその一部のｓｃＦｖであった。そのトロンビンによる細胞増殖を抑制しうるｓｃＦｖは、ＰＡＲ１型トロンビンレセプターのアミノ末端側から５５番目のトリプトファン残基をアラニンに置換するとその配列に対する結合性が消失するのに対し、トロンビンによる細胞増殖を抑制しないｓｃＦｖにおいては同様な置換を行ったエピトープに対する結合性は維持されていた。すなわち、トロンビンによる細胞増殖を抑制しうるｓｃＦｖのＰＡＲ１型トロンビンレセプターへの結合には該レセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン残基が重要であり、また該レセプターの細胞増殖に対する作用にはこの該レセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン残基の周辺の配列が重要な役割をもつことが示された。
【００５０】
本発明者らは、前記のトロンビンレセプターおよび改変体を作製する研究過程で詳細な検討を進めた結果、新しい事実を見出した。それは従来知られているＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターをコードする遺伝子とは２箇所異なる塩基配列があることが判明した点である。本発明者らは、該遺伝子が細胞表面上にＰＡＲ１型トロンビンレセプターとしての機能を有する形で発現していることを確認した。つまりトロンビンおよびＴＲＡＰ（内在性リガンド部分の合成ペプチド：Ｈ2Ｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＣＯＯＨ）いずれにおいても細胞内シグナル伝達が認められた。また、ＴＲＡＰ部分に対するウサギポリクローナル抗体の結合性がフローサイトメトリーによって認められた。この点からも本発明者らが新たに見出した遺伝子配列は機能しているものであることが明らかになった。
【００５１】
既報のＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、最初に巨核球細胞株Ｄａｍｉ細胞のｃＤＮＡをアフリカツメガエルの卵母細胞にトランスフェクトし、トロンビン刺激に対する応答性からクローニングされた。これに対し、本発明者らはＰＡＲ１型トロンビンレセプターをコードする遺伝子をヒト大動脈と胎盤由来の正常組織のｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。既報のｃＤＮＡの由来がガン細胞の一種であるＤａｍｉ細胞だとすると、遺伝子変異もしくは遺伝子多型による可能性もある。
【００５２】
また、上述のことから、本発明者らが見出したＰＡＲ１型トロンビンレセプターは、アミノ酸配列が既報のものに比べて２箇所異なったものであることがわかる。したがって本発明の薬剤は、新規なレセプターを認識し、結合するものである。
【００５３】
すなわち本発明は下記の発明を包含する。
１）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうるポリペプチドまたは化合物。
２）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの構造のうち細胞増殖に関与する特定の領域に結合するポリペプチドまたは化合物。
３）ペプチド配列Ｘ1−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｘ2−Ｔｒｐ−Ｘ3に結合する前記ポリペプチドまたは化合物。ここで、Ｘ1は任意のアミノ酸またはペプチド配列であり、Ｘ2は任意のアミノ酸を、Ｘ3は任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。
４）ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列：Ｘ4−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｘ5なる部分に結合するポリペプチドまたは化合物。ここでＸ4およびＸ5は、任意のアミノ酸またはペプチド配列を表す。
５）単鎖型Ｆｖあるいはその断片であるＰＡＲ１型トロンビンレセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチド。
６）抗体あるいはその断片であるＰＡＲ１型トロンビンレセプターアンタゴニストたる前記ポリペプチド。
７）トロンビンレセプターを介した細胞増殖に関わるシグナル伝達系を阻害する、ＰＡＲ１型トロンビンレセプター阻害剤としての前記ポリペプチド。
８）前記ポリペプチドを取得するために用いることが可能な改変型ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの遺伝子またはその断片、ならびにそれを発現する細胞。
９）トロンビンによる細胞増殖を抑制しうる前記ポリペプチドまたは化合物を取得するための方法。
【００５４】
【発明の実施の形態】
本発明におけるｓｃＦｖの作製方法について詳細に説明する。
Ａ．ファージミドライブラリーの作製
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞をアジ化ナトリウムによって死細胞化し、死菌体（シグマ社製）と混合して生理食塩水に懸濁した。細胞の形態が生細胞と同程度であることを確認し、マウス腹腔に投与した。この免疫を２週間間隔で５回行い、最終免疫の４日後に心臓から採血すると同時に脾臓細胞を摘出した。
【００５５】
上記抗原の細胞を調製する際、アジ化ナトリウムを細胞と接触させることによってレセプターの細胞内へのインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を防ぐことができる。細胞表面に存在するレセプター蛋白数をインタナーナリゼーションを防いで恒常的に維持することは、免疫感作を十分に行うために必要である。
【００５６】
一般的には純化精製された抗原蛋白であれば、免疫の際の必要量は比較的少量でよいと考えられている。例えばモノクローナル抗体の例では、マウス１匹あたり１回投与量として数μｇ〜数十μｇでよい。
【００５７】
しかしながら、細胞表面上のレセプターを抗原とする場合では細胞表面上には各種蛋白が存在する。レセプターに対する免疫動物の抗体価を上げるためには、レセプターの数がこれら細胞表面上の夾雑蛋白に比べてある程度多量に必要である。本発明者らはアジ化ナトリウムによってレセプターの細胞内へのインタナライゼーションを防ぎ、該トロンビンレセプター発現昆虫細胞を抗原として動物に免疫することによってレセプターの構造を反映した機能部位を特異的に認識するファージミド抗体を取得した。
【００５８】
ファージミド抗体の作成はアマーシャムファルマシア・バイオテク社より市販されている「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ」を用いて業者添付のプロトコールにしたがって行った。キットに含まれるｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターについては、このベクターのＮｏｔＩ部位に塩基配列ｇｇｃｃｇｃａｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｇｇを挿入し、クローニングした遺伝子が発現される際にＨｉｓ６配列およびＥ−ｔａｇ配列が付加されるようにデザインした（ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥ）。上記のトロンビンレセプター発現昆虫細胞を免疫したマウスの脾臓よりｍＲＮＡを取得し、抗体ｃＤＮＡを作成した。そのｃＤＮＡよりキットに含まれるＰＣＲプライマーを用いて免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の抗原結合部位（それぞれＶＨおよびＶＬ）の遺伝子を取得した。このＶＬおよびＶＨ遺伝子断片をキットに含まれるリンカー遺伝子を用いて一本のＤＮＡとして連結させ、さらにＶＨの５’側を認識し、制限酵素ＳｆｉＩ認識部位を含むプライマーおよびＶＬの３’側を認識し、制限酵素ＮｏｔＩ認識部位を含むプライマーを用いてＰＣＲを行い、このＶＨ−ＶＬ連結遺伝子を増幅して取得した。この増幅ＤＮＡ産物を制限酵素ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで処理し、ｐＣＡＮＴＡＢ５−ＨＥベクターのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩクローニング部位に挿入し、大腸菌ＴＧ１株に導入した。この遺伝子導入大腸菌にヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を添加することで抗体蛋白質を発現し、かつ抗体遺伝子を含有するファージミドライブラリーを作成した。
【００５９】
Ｂ．パンニング
上記のように作成したファージミドライブラリーは、目的のＰＡＲ１型トロンビンレセプターに対するファージミド抗体以外のものを多数含んでいる。たとえば、ここで用いた抗体遺伝子はバキュロウイルス法でトロンビンレセプターを発現させた細胞そのものを免疫しているため、細胞自体の成分やウイルスの構成成分に対するファージミド抗体も多種類存在することが考えられる。したがって、パンニング法による目的のファージミド抗体の濃縮を行った。すなわち、このファージミド抗体を天然型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶを感染させた昆虫細胞と反応させることで目的以外のファージミド抗体を吸着除去を行った後、トロンビンレセプター（△１−４９ＴＲ）を発現させた昆虫細胞と反応させ、結合したファージミド抗体のみを取得することでトロンビンレセプターと結合するファージミド抗体を濃縮した。この濃縮ファージミドライブラリーを大腸菌ＨＢ２１５１に感染させ、アンピシリン含有寒天培地上で生育させた各コロニーを取得することで可溶型ｓｃＦｖを産生しうる大腸菌クローン（ｓｃＦｖ産生大腸菌株）を取得した。
【００６０】
Ｃ．キャラクタリゼーション
標準的な方法によりｓｃＦｖ産生株の培養およびペリプラズム画分取得を行い、標準的な方法により精製を行った。ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの機能阻害活性を評価するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法として、ヒト巨核芽球系細胞を用いたカルシウム流入阻害評価、ヒト血小板を用いた凝集阻害評価、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞を用いた増殖阻害評価を実施した。また、上記評価にてトロンビンレセプターの機能阻害活性を認めたｓｃＦｖおよび該活性を認めなかったｓｃＦｖについてＰＡＲ１型トロンビンレセプター上のエピトープを決定したうえで、さらに詳細な認識ペプチド配列の解析を行った。
【００６１】
以下に、標準的なｓｃＦｖの産生、ペリプラズム画分取得、および精製について述べる。
ｓｃＦｖ産生大腸菌株を２×ＹＴ培地にて終夜培養を行い、終夜培養液と本培養液を１：１０の割合で混合した。３０℃、１６０回転／分で１時間培養後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を最終濃度で１ｍＭ加えて６時間培養し、ｓｃＦｖ産生を誘導した。本発明者らの用いたｓｃＦｖ産生システムではｓｃＦｖは大腸菌のペリプラズム画分に産生、集積することが知られている。このため、培養液を遠心操作し、菌体沈殿物を１０倍濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁したのち、再度遠心操作により得た沈殿物を超純水に懸濁し、浸透圧ストレスを加え、再度遠心して上清を回収してペリプラズム画分を得た。
【００６２】
本発明者らの調製したｓｃＦｖは、そのアミノ酸配列内にポリＨｉｓ領域を有しており、この領域の金属イオン結合性を利用したＮｉ−ＮＴＡカラムによるアフィニティーカラムクロマトによる精製が可能である。取得したペリプラズム画分をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムにロードし、数回洗浄の後にイミダゾールを含むＨｅｐｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液により溶出した。さらに、溶出物を限外濾過膜を用いて濃縮してからＨｅｐｅｓ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して透析を行い、精製ｓｃＦｖを取得した。
【００６３】
次に、上記工程Ａ、Ｂで取得した各ｓｃＦｖ産生大腸菌株の産生するｓｃＦｖのトロンビンレセプター結合性について解析した。トロンビンレセプター発現昆虫細胞に精製ｓｃＦｖを反応させ、未反応のｓｃＦｖを洗浄除去した。次にｓｃＦｖのＣ末端に反応するホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗Ｅ−Ｔａｇ抗体を結合させ、ＨＲＰの発色基質である２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）による発色法で結合性を解析した。また、野生型バキュロウイルスＡｃＭＮＰＶを感染させた細胞においても同様に結合性を解析し、トロンビンレセプター発現昆虫細胞に結合してＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖ産生大腸菌株を選択した。この選択した大腸菌株の産生するｓｃＦｖについてトロンビンレセプターの機能阻害活性を評価した。
【００６４】
以下にトロンビンレセプターの機能阻害活性を評価する方法について述べる。ヒト巨核芽球系の株化細胞にはトロンビンレセプターの発現が認められており、またトロンビンにより細胞内カルシウム濃度が上昇することが知られている。そこで、トロンビンにより惹起された細胞内カルシウム濃度上昇を測定し、上記方法により取得したｓｃＦｖに機能阻害活性があるかどうか調べた。すなわち、ヒト巨核芽球系の株化細胞に蛍光色素（Ｆｕｒａ２−ＡＭ）を取り込ませ、室温で３０分間ｓｃＦｖとインキュベートした後にヒトトロンビンを添加し、添加３０秒後の細胞内カルシウム流入量を測定し、ｓｃＦｖのカルシウム流入阻害活性を調べた。その結果、トロンビンによる細胞内カルシウム濃度上昇を抑制する複数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６５】
上述のように、血小板上にはトロンビンレセプターが発現し、トロンビンにより凝集が惹起されることが知られている。そこで、トロンビンで惹起した血小板凝集に対するｓｃＦｖの効果について検討した。健常人ヒト血液から血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液を調製した。得られた血小板浮遊液に上記方法にて取得したｓｃＦｖを添加し、室温で２０分間静置した。さらに３７℃で２分間で安定化し、ＣａＣｌ2（最終濃度１．５ｍＭ）を添加した。次にヒトトロンビン（最終濃度０．１〜０．２ｕ／ｍｌ）を添加して血小板凝集を惹起し、その濁度の変化からｓｃＦｖによる血小板凝集阻害を評価した。その結果、血小板凝集を抑制する数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６６】
また、本発明者らにより慢性関節リウマチ患者由来滑膜細胞はＬＰＳ（リポポリサッカライド）感受性を有し、ＬＰＳにより増殖が惹起されることが判明したため、ゲルろ過法およびカニ外殻キトサン多孔性粒子を用いたアフィニティー吸着除去法を併用し、上記のように精製、取得したｓｃＦｖサンプルに含まれる大腸菌由来のエンドトキシンを除去した。
【００６７】
上述のように、滑膜細胞にはトロンビンレセプターが発現しており、トロンビン刺激により細胞増殖が惹起されることが知られている。そこで、トロンビンにより惹起した滑膜細胞増殖能に対して上記方法によりエンドトキシンを除去したｓｃＦｖに阻害活性があるかどうか調べた。すなわち、慢性関節リウマチ患者由来の滑膜細胞を血清飢餓状態にしてから３７℃で３０分間ｓｃＦｖとインキュベートした後、ヒトトロンビンで増殖を惹起した。そしてトロンビン添加２４時間から４８時間までの間のチミジンアナログ（ＢｒｄＵ）取り込みを測定することによってＤＮＡ合成能を測定し、ｓｃＦｖの細胞増殖阻害活性を調べた。その結果、滑膜細胞増殖を抑制する数種類のｓｃＦｖクローンを取得した。
【００６８】
上記の滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンのエピトープを決定するためにエピトープマッピング解析を行った。すなわち、１ペプチド当たり１５アミノ酸の長さで、ヒトトロンビンレセプターのすべての細胞外領域を包含するように、９４種類のペプチドをピン上に固相合成し、上記方法で取得した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖの結合性を調べた。その結果、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのヒルジン様ドメインに包含されるアミノ末端側の５１番目から５５番目のアミノ酸が滑膜細胞増殖阻害ｓｃＦｖのエピトープであることがわかった。同様に滑膜細胞増殖を示さなかったｓｃＦｖについても同様の解析を行ったところ、その中にＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５０番目から５５番目のアミノ酸を認識するｓｃＦｖクローンが見出された。
【００６９】
さらにこのＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクローン、およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、そのエピトープを含むＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から４７番目から６７番目のアミノ酸に相当する合成ペプチドを作成し、キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲート化した。これを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップ上に固定化し、それぞれの該ペプチドに対するアフィニティを計測した。滑膜細胞増殖抑制活性を有するｓｃＦｖクローンと増殖抑制活性を有しないｓｃＦｖクローンの間でアフィニティの差は認められなかった。
【００７０】
また、以下にＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５１番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制するｓｃＦｖクローン、およびＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側から５０番目から５５番目のアミノ酸を認識して滑膜増殖を抑制しないｓｃＦｖクローンについて、エピトープのアミノ酸配列の一部を置換したペプチドに対する結合性を解析した。前記ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から４７番目から６７番目のアミノ酸に相当する合成ペプチドをＫＬＨにコンジュゲート化したものを表面プラズモン共鳴測定装置のセンサーチップに固定化し、この滑膜細胞増殖抑制活性を有するｓｃＦｖクローンとＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファンをアラニンに置き換えた４７番目から６７番目のアミノ酸に相当するペプチドとを混合して解析を行ったところ、センサーチップに固定化したペプチドへの結合は阻害されなかった。しかしながら滑膜細胞増殖抑制活性をもたないｓｃＦｖクローンについて同様の解析を行ったところ、センサーチップに固定化されたペプチドへの結合は強く阻害された。このことはエピトープペプチドの５５番トリプトファンをアラニンに置換したことにより滑膜細胞増殖抑制活性を有するクローンのエピトープへの結合が失われたことを示しており、ひいてはこのＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端から５５番目のトリプトファン周辺がトロンビンの細胞増殖活性に関与していることを示している。
【００７１】
本発明の一態様である前記ｓｃＦｖあるいはその断片を有効成分として含有する薬剤（ポリペプチドまたは低分子化合物）は、炎症性の細胞、増殖した組織あるいは血小板を主体とする血栓に接触させることにより、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を抑制し、細胞増殖阻害やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制し、あるいは血小板凝集を阻害することにより血栓形成進展を阻害するので、各種炎症性疾患、細胞増殖性疾患、血栓性疾患の治療薬として利用できる。
【００７２】
例えば本発明のトロンビンレセプター阻害剤は、静脈用注射用製剤として使用することができる。その場合、上記ｓｃＦｖあるいはその断片は広い範囲の含有割合でよく、投与量は種々の条件によって変動する。またこれらは通常静脈注射用として使用されている水性媒体中に溶解ないしは分散して使用することができる。また、注射剤以外にも外用剤または座薬として用いられる。非経口投与のための注射剤としては無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。非経口投与のためのその他の組成物としてはひとつ、またはそれ以上の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟膏、塗布剤のような外用剤、直腸内投与のための座薬およびペッサリー等が含まれる。
【００７３】
【実施例】
実施例１：各種組換えＴＲ発現細胞の調製
［ヒトトロンビンレセプターｃＤＮＡの取得］
ヒト大動脈由来ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈより購入）１μｇからｃＤＮＡ合成キットＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡの１／１００量を用いてプライマーＴＲ１［配列番号４］およびＴＲ４［配列番号５］によりトロンビンレセプターのｃＤＮＡ部分をＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動した結果、約１．３ｋｂ付近にトロンビンレセプターのｃＤＮＡフラグメントと推定されるバンドが認められた。このＤＮＡフラグメントをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲルから抽出、精製した。精製したＤＮＡフラグメントをＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＣＲII ｐＣＲ２．１（ＴＭ）ベクターに挿入し、数クローンについてプラスミド精製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使用）を行った。これらの精製したプラスミドを用いて日立ＤＮＡ蛍光自動シーケンサーによりＤＮＡ配列を決定した。塩基配列決定に用いたプライマー６種を［配列番号６−１１］で示す。その結果、このＤＮＡフラグメントがトロンビンレセプターをコードしていることが明らかになった。決定したヒト大動脈由来のトロンビンレセプターの全塩基配列を［配列番号３］に示す。同様に、本発明者らはヒト胎盤由来のｃＤＮＡ配列も決定したが、ヒト大動脈由来のものと一致した。この得られたヒト大動脈由来およびヒト胎盤由来のトロンビンレセプターｃＤＮＡ配列と、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録されているトロンビンレセプターのｃＤＮＡ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｍ６２４２４）との比較を行ったところ、トロンビンレセプターの蛋白質をコードしている部分の５’末端より７１１番目の塩基がＣがＧに、７１２番目の塩基がＧからＣに、１０９１番目の塩基がＣからＧに、１０９２番目の塩基がＧからＣにデータベースでの表示から置き換わった形のｃＤＮＡとなっていることがわかった。また、ヒト胎盤由来のゲノムＤＮＡ中のトロンビンレセプター遺伝子についてもこの部位の塩基配列を解析したところ、本発明者らが取得した配列と同様の配列であることが確認された。このヒトトロンビンレセプターｃＤＮＡを挿入したｐＣＲIIプラスミドをｐＣＲ−ＴＲ１４と命名した。
【００７４】
［トロンビンレセプターｃＤＮＡ含有トランスファーベクターの作製］
上記ｐＣＲ−ＴＲ１４を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル電気泳動を行った。そしてトロンビンレセプターｃＤＮＡを含む約１．３ｋｂフラグメントをＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡＥＸII使用）を用いてゲルから抽出、精製した。一方、バキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）［Technique, Vol. 2, No. 4, pp.173-188, 1990]を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断し、上記ＤＮＡフラグメントとライゲーション反応を行った。この反応液で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、いくつかの形質転換体のコロニーからプラスミドを抽出して約１．３ｋｂフラグメントが挿入されたプラスミドを得た。これをｐＡｃ−ＴＲ１４と命名した。このトロンビンレセプターｃＤＮＡ含有トランスファーベクターを精製（ＱＩＡＧＥＮ社製プラスミド抽出キット使用）してトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作製に用いた。
【００７５】
［トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作製］
組換えバキュロウイルスの作製にはファーミジェン社製のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）キットを用いた。Ｓｆ９昆虫細胞１×１０6 細胞を３０ｍｍディッシュに播種し、３０分間室温にて接着させた。一方、０．２５μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＴＭ）ＤＮＡと２μｇのｐＡｃ−ＴＲ１４プラスミドＤＮＡを混ぜ、室温に５分間静置し、その後０．５ｍｌトランスフェクション緩衝液Ｂ（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１、１２５ｍＭ ＣａＣｌ2、１４０ｍＭ ＮａＣｌ）を加えてよく混ぜた。次に播種したＳｆ９細胞の培地を抜き取り、０．５ｍｌのトランスフェクション緩衝液Ａ（グレース培地、１０％牛血清含有）を加えた。ここに、トランスフェクション緩衝液ＢとＤＮＡの溶液を少しずつ滴下していくことによりコトランスフェクションを行った。２７℃でインキュベーションして４時間後に新しいグレース培地（１０％牛血清含有）に取り換えた。５日後、組換えウイルスを含む培養上清を回収し、１０倍、１００倍、１０００倍希釈液を作成し、Ｓｆ９細胞（１×１０6 細胞／ｄｉｓｈ）に室温で１時間感染させた。上清を抜き取り、１％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース含有グレース培地（４２℃）を２ｍｌ滴下して加え、アガロースが固まるまで１０分間程度室温に放置した。その後、２７℃で３日間培養を行った。３日目にニュートラルレッド／ＰＢＳ（１ｇ／ｌ）を１ｍｌ／ｄｉｓｈ加えた。４日目にウイルスプラークを観察したところ、１００培希釈液を感染したディッシュに６個のプラークを確認した。数個のシングルウイルスプラークをアガロースごとパスツールピペットで抜き取り、グレース培地と混ぜて、ウイルスを培地中に拡散させた。このシングルプラーク由来のウイルス液を単層培養したＳｆ９細胞（２５ｃｍ2フラスコ培養）に感染させた。これを２７℃で４−５日間培養してウイルス液を回収した。このウイルス液を１ｍｌとって１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れ、４℃、１５０００回転／分で３０分間遠心し、ウイルス粒子を沈殿させた。沈殿物を２００μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液に懸濁し、５０μｌのＬｙｓｉｓ緩衝液（１０％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、６０℃で２０分間インキュベートした。フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により反応液中のウイルスＤＮＡを回収した。回収したウイルスＤＮＡの１／５を使用し、プライマーＢａｃＦ［配列番号１２］およびＴＲ−Ｓ２［配列番号７］によってＰＣＲ増幅を行い、ＤＮＡ中にトロンビンレセプターｃＤＮＡが含有されていることを確認した。このトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスをＡｃＴＲＦと命名した。ウイルス液は適宜希釈してプラークアッセイを行い、タイターをチェックした。さらに、ウイルス液をＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．２５でＳｆ９細胞に感染させることで１〜５×１０7程度の高濃度のウイルス液を得た。ウイルス液は４℃および−８０℃で凍結保存した。
【００７６】
［改変型トロンビンレセプターｃＤＮＡの構築］
トロンビンレセプターの構造の内在性リガンドペプチド部分（ＴＲＡＰ）を欠損させ、トロンビン結合部位は保持させた形の改変トロンビンレセプター△１−４９ＴＲ、および内在性リガンドペプチド部位およびトロンビン結合部位の両方を欠損させた形の改変トロンビンレセプター△１−８０ＴＲのｃＤＮＡを構築し、バキュロウイル−昆虫細胞系での発現を行った。△１−４９ＴＲｃＤＮＡは完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐＣＲ−ＴＲ１４）の遺伝子配列のうち、塩基番号７９〜１４７の部位を、△１−８０ＴＲｃＤＮＡは完全長トロンビンレセプターの塩基番号７９〜２４０の部位を遺伝子工学的に欠損させて構築した。これらの遺伝子は、細胞でトロンビンレセプターが発現したときに除去されるシグナルペプチド部位（アミノ酸残基番号１〜２６）に、さらに、△１−４９ＴＲでは完全長トロンビンレセプターにおいてシグナルが除去されたときにアミノ末端となる部位から３３アミノ酸残基を、△１−８０ＴＲでは６４アミノ酸残基を欠損させた形のアミノ酸配列を付加した形のトロンビンレセプターとなるように設計されている。△１−４９ＴＲと△１−８０のｃＤＮＡの塩基配列、ならびにそれらによってコードされているアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１と配列番号２に記載する。
【００７７】
［△１−４９ＴＲｃＤＮＡの構築］
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ（ｐＣＲ−ＴＲ１４）よりその塩基番号７９〜１４７の部位を欠損させて△１−４９ｃＤＮＡを作成する手順を以下に示す。
▲１▼ｐＣＲ−ＴＲ１４より△１−４９ｃＤＮＡの塩基配列１−１８５に相当する部位を含む遺伝子断片である△１−４９−５’（１９０ｂｐ）断片を作成した。
▲１▼−１
ｐＣＲ−ＴＲ１４のｐＣＲIIベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）の部位に相同なプライマー Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー［配列番号１０］、および完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号５９〜７８に相当する部位と塩基番号１４８〜１５７に相当する部位に相補的なプライマーであるＴＲ△２７−４９Ｒプライマー［配列番号１３］を用いてＰＣＲ反応を実施した。反応液組成はｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ ２００ｎｇ／ｍｌ、Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー ３００ｎＭ、ＴＲ△２９−４９プライマー ３００ｎＭ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ｛２０ｍＭ ｄＮＴＰｓ ｍｉｘ｝（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ社）１０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社）１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈａｉｍ社）１０μｌ／ｍｌのものを用い、５０μｌの反応スケールで行った。反応条件はＧｅｎｅＡｍｐ ｓｙｓｔｅｍR ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）で９４℃２分間反応した後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分間のサイクルを１０サイクル行い、その後に７２℃７分間反応させる温度サイクルであった。反応後のサンプルは４％ ＮＵＳＩＥＶＥR ＧＴＧR ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社）−ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ ｐＨ７．６、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液ゲルを用い、１００Ｖで１時間電気泳動し、２２４ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部分のゲルを切り出した。切り出したゲルはＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡを抽出、精製して約２００ｎｇのＤＮＡを得た。
【００７８】
▲１▼−２
完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号１４８〜３６７に相当する部分の遺伝子断片を取得するため、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号６９〜７８に相当する部位と塩基番号１４８〜１６９に相当する部位よりなるＴＲ△２７−４９Ｆプライマー［配列番号１４］と、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号３５０〜３６７に相補的な配列よりなるＴＲＳ１プライマー［配列番号６］を用いたＰＣＲを行った。反応液組成は▲１▼−１に示した反応組成中のＭ１３ＲＥＶ２２プライマーおよびＴＲ△２７−４９ＲプライマーをＴＲ△２７−４９ＦプライマーとＴＲＳ１プライマーに置き換えた他は同様に実施した。反応条件も▲１▼−１と同様に行った。得られたＰＣＲ反応物は４％ ＮＵＳＵＥＶＥTM ＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを用い、１００Ｖで１時間電気泳動を行った。２２０ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部位のゲルを切り出し、Ｈｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。得られたＤＮＡ断片は約２４０ｎｇである。
【００７９】
▲１▼−３
ＴＲ△２７−４９ＲプライマーとＴＲ△２７−４９Ｆプライマーの間には２０ｂｐの相補的な部分が生じるようにデザインされているため、▲１▼−１で得られた２２４ｂｐのＤＮＡ断片と▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片をａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ法での連結を行った。まず、▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片８０ｎｇと▲１▼−２で得られた２２０ｂｐのＤＮＡ断片９６ｎｇを混合した。反応液組成は ＤＮＡ ｐｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ １０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ／ｍｌ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ７．５μｌ／ｍｌであり、４０μｌの反応スケールで実施した。反応は、ＧｅｎｅＡｍｐRＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍで９４℃２分間反応後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間のサイクルを５サイクル行い、その後７２℃で７分間反応を行う温度サイクルプログラムで行った。次にその反応によって得られた反応産物４０μｌに、Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー １５０ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＳ１プライマー １５０ｎｇ／ｍｌ、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｘ１０μｌ／ｍｌ、×１０ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ緩衝液１００μｌ／ｍｌ、３．５Ｕ ＥｘｐａｎｄTM Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ６μｌ／ｍｌになるように各試薬を加え、蒸留水で全量４００μｌになるように調整し、５０μｌづつ５本の反応チューブに分注してＰＣＲ反応を行った。反応はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００で９４℃２分間反応させた後、９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間のサイクルを１０サイクル行い、その後９４℃１５秒間→５９℃３０秒間→７２℃１分３０秒間＋各サイクルごとに２０秒間延長のサイクルを１０サイクル行い、最後に７２℃７分間で反応させる温度サイクルプログラムで行った。得られたＰＣＲ反応物からエタノール沈殿法でＤＮＡを回収した後、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ−１００ ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏカラム（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）で精製した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社）３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社）３０Ｕで切断した。制限酵素処理を行った産物を４％ ＮＵＳＩＥＶＥTM ＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ−ＴＡＥ緩衝液ゲルを用い、５０Ｖで１時間電気泳動を行った。その１９０ｂｐのＤＮＡ鎖長に相当する部位のゲルを切り出してＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法でＤＮＡの抽出、精製を行った。その結果、△１−４９−５’（１９０ｂｐ）ＤＮＡ断片に相当するＤＮＡ約４００ｎｇを得た。
【００８０】
▲２▼完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡの塩基番号２５５〜１２７８と△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１８６〜１２０９は配列が同一であるため、ｐＣＲ−ＴＲ１４に含まれる完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡ部分のうちの塩基番号１〜２４４の部分を切り出して、その部分を△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１〜１８５を含むＤＮＡ断片である△１−４９−５’（１９０ｂｐ）とおきかえることで△１−４９ｃＤＮＡの塩基番号１〜１２０９の部分を構築した。
【００８１】
▲２▼−１
ｐＣＲ−ＴＲ１４ＤＮＡ ２．３μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ ３０Ｕ、続いて制限酵素ＢｓｍＩ ３０Ｕで切断し、それを０．７５％ ＳＥＡＰＬＡＱＵＥTMＧＴＧTM ＡＧＡＲＯＳＥ（ＦＭＣ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）−ＴＡＥ緩衝液ゲルにのせて５０Ｖで１時間電気泳動を行った。その４．１ｋｂｐに相当するＤＮＡ断片を含むゲルを切り出し、そこからＨｏｔ−Ｐｈｅｎｏｌ法で抽出、精製して約６４０ｎｇのＤＮＡ断片を得た。
【００８２】
▲２▼−２
▲１▼で得られた△１−４９−５’（１９０ｂｐ）断片８０ｎｇと、▲２▼−１で得られたｐＣＲ−ＴＲ１４ ４．１ｋｂｐ断片 ６４ｎｇとを、ＵＮＩ−Ａｍｐ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）のｌｉｇａｔｉｏｎ試薬（Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ３７．５Ｕ／ｍｌ）を用い、２０μｌスケールで４℃２０時間反応させて結合させた。得られた結合ＤＮＡは大腸菌 ＤＨ−１０Ｂ株（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）に、ＢＲＬ Ｃｅｌｌ ＰｏｒａｔｏｒR Ｅ． ｃｏｌｉ ｐｕｌｓｅｒR（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社）を用いて遺伝子導入した。遺伝子を導入した大腸菌をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に播き込み、３７℃で一晩培養して可視的に見られるコロニーを組換え体クローンとした。それらについて△１−４９ＴＲｃＤＮＡの塩基番号１−２０に相当するプライマーＴＲ１プライマーとＴＲＳ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、電気泳動的に３００ｂｐの増幅産物がみられる△１−４９ｃＴＲＤＮＡを含むベクターが導入されたクローンの有無を解析したところ、組換え体クローン８４クローン中１７クローンに目的のＤＮＡが導入されていることが確認された。このうちの１クローンｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１についてＤＮＡ塩基配列解析を行った。詳細にはｐＣＲIIR ベクター部位に対するシークェンスプライマー Ｍ１３ＲＥＶ２２プライマー［配列番号１０］、およびＭ１３ＦＯＲ２４プライマー［配列番号１１］、△１−４９ＴＲｃＤＮＡのシークェンスプライマーＴＲ１、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２［配列番号４、６、および７］、ＴＲＳ３［配列番号８］、ＴＲＳ４［配列番号９］ならびに、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭTM Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑR ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＦＳ （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用い、業者添付のプロトコールに従った。解析装置としてはＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ現Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いた。その結果、ｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−１の△１−４９ＴＲｃＤＮＡに相当する部分のＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示したＤＮＡ塩基配列と完全に一致したことから、目的の△１−４９ＴＲｃＤＮＡが正しく構築されていることが確認された。このｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１を含有する大腸菌を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＣＩＲＣＬＥＧＲＯＷR培地で３７℃で一晩培養し、その含有するプラスミドをＱＩＡＧＥＮR ＰＬＡＳＭＩＤ ＭＩＤＩＫＩＴ（ＱＩＡＧＥＮ社）で抽出、精製し、３４μｇのｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１プラスミドを得た。
【００８３】
［△１−４９ＴＲｃＤＮＡ含有トランスファーベクターの作成］
△１−４９ＴＲｃＤＮＡを含有するバキュロウイルストランスファーベクターの作成は、完全長トロンビンレセプターｃＤＮＡのトランスファーベクターｐＡＣ−ＴＲ１４作成と同様の方法で行った。方法を簡単に示すと、ｐＣＲ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ−０１の△１−４９ＴＲｃＤＮＡ部分１．２ｋｂｐを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切り出し、そのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理したｐＶＬ１３９３ベクター中へサブクローニングした。得られた組換え体クローン８４クローンについてＢａｃＦプライマーとＴＲＳ２プライマーを用いてのＰＣＲ解析を行い、２４クローンに△１−４９ＴＲｃＤＮＡがクローニングされていることを確認した。このうちの１クローン、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ０１Ｅ０１プラスミドを含有する大腸菌を培養し、精製することで約３９０μｇのプラスミドを得た。
【００８４】
［△１−４９ＴＲ改変トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスの作成］
△１−４９ＴＲｃＤＮＡを含有する組換えバキュロウイルスの作成は、ｐＡｃ−△１−４９ＴＲ ｃｌｏｎｅ ｅ０１Ｅ０１組換えトランスファーベクター２μｇを用い、完全長トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスｐＡＣ−ＴＲＦ作成と同様に行った。組換えウイルスクローンのうちＢａｃＦおよびＴＲ−Ｓ２プライマーでのＰＣＲにより、△１−４９ＴＲｃＤＮＡが組み込まれていることが確認されたクローンｐＡＣ−△１−４９ＴＲ−３を△１−４９ＴＲ改変ＴＲ発現用組換えバキュロウイルスとした。これをＳｆ９昆虫細胞にＭＯＩ＝０．２５で感染させることで、３×１０7ｐｆｕ／ｍｌの高濃度ウイルス液を取得した。
【００８５】
［組換えバキュロウイルスによるトロンビンレセプターの昆虫細胞における発現］
上記のようにして得られたトロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスＡｃＴＲＦを、１５０ｃｍ2フラスコに播種した１．８×１０7のＳｆ９細胞にＭＯＩ＝０．６−１．０で感染させ、４０−４８時間、２７℃で静置培養した。培養後、感染細胞を回収し、ウエスタンブロッティングおよびカルシウム流入実験によってトロンビンレセプターの発現および機能を有することの確認を行った。
【００８６】
［ウエスタンブロッティング］
回収した感染細胞（１５０ｃｍ2フラスコ２本分、約６×１０7）をＰＢＳで２回洗浄した。これ以後の実験はすべて４℃の条件で行った。次に、５ｍｌのホモジェナイズ用緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（ＴＭ）（ベーリンガー社製）含有）に懸濁し、テフロンホモジェナイザーを用いて、２５００回転／分で３０ｓｔｒｏｋｅホモジェナイズを行った。このホモジェネートを１５ｍｌの遠心管にいれて２５００回転／分（約１０００ｇ）で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清を５００００回転／分（約１０００００ｇ）で１時間、超遠心を行い、粗膜画分を沈殿させた。沈殿物を１ｍｌのホモジェナイズ用緩衝液に懸濁し、５０μｌずつ分注して−８０℃で凍結保存した。Ｎａｎｏ Ｏｒａｎｇｅ（ＴＭ）（ベーリンガー社製）を用いて定量した結果、タンパク濃度は１４ｍｇ／ｍｌであった。このようにして得られた粗膜画分につき、２５μｇ−５０μｇ／ｌａｎｅで、１０％ゲルを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、これをニトロセルロース膜に転写した。この膜を３％ゼラチン／ＴＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄した。その後、トロンビンレセプターの内在性リガンド領域であるＴＲＡＰをウサギに免疫して得られた抗ＴＲＡＰウサギポリクローナル抗体１０−２０μｇ／ｍｌを含む１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液中、室温で終夜反応させた。翌日、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナルＨＲＰ標識抗体（約１μｇ／ｍｌ、１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液）を室温１時間反応させた。次にＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで２回洗浄し、コニカイムノステインＨＲＰで１０分間、室温にて発色させてバンドを検出した。その結果、トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に特異的に、約４５ｋＤおよび約８５ｋＤ付近のバンドが観察され、トロンビンレセプターが昆虫細胞膜上に発現していることが確認された。
【００８７】
［カルシウム流入実験］
回収した感染細胞（約３×１０7）をＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）で１回洗浄した後、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１μｇ／ｍｌ Ｆｕｒａ２−ＡＭ含有）に懸濁してＦｕｒａ２−ＡＭを２７℃で３０分間負荷した。室温で８００回転／分で５分間遠心して細胞を回収し、ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）で２回洗浄した後、２ｍｌのＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（−Ｃａ）に再懸濁した。この細胞懸濁液に２μｌの１Ｍ ＣａＣｌ2を最終濃度１ｍＭになるように加え、遮光して室温で５分間インキュベートした。このように調製したＦｕｒａ２−ＡＭ負荷感染細胞を４９０μｌとってキュベットに入れ、細胞内カルシウム測定装置（日本分光ＣＡＦ−１００型）で測定した。［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］（細胞内カルシウム濃度を反映）が０．０２ぐらいに安定したらキュベットに１０μｌの１０ｕｎｉｔ／ｍｌトロンビンもしくは１．２５ｍＭ ＴＲＡＰを添加して刺激を与え、細胞内カルシウム濃度を経時的に測定した。カルシウムの流入は［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］の値が上昇することで検出される。その結果、トロンビンレセプター発現用組換えバキュロウイルスを感染させた昆虫細胞に特異的にカルシウム流入が観察された（表１参照）。この結果から、機能を有するトロンビンレセプターが昆虫細胞に発現していることが証明された。
【００８８】
【表１】
表中の値は
［励起光３４０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］／［励起光３８０ｎｍによる５００ｎｍの蛍光強度］の変化量を表す（高い値ほど強い反応を表す）。４回の測定の平均値±ＳＤ。
【００９０】
実施例２：マウスの免疫および脾臓細胞からのファージミドライブラリーの作製ファージミドライブラリーの作製はリコンビナント・ファージアンチボディー・システム（ファルマシア社製）の方法に準じた。
抗体遺伝子取得のための免疫は以下のように行った。Ｓｆ９昆虫細胞２×１０7 細胞を細胞培養フラスコに播種して３０分間静置の後、前述のｐｃ△１−４９ＴＲ−３ウイルスをＭＯＩ＝２で感染させ、２７℃で４０時間培養した。この感染細胞を回収してＰＢＳ（０．９％ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）で２回洗浄後、０．２Ｍアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を室温で３０分間放置したのち５０μＬを分取して等量の０．２％トレパンブルー染色液と混合し、光学顕微鏡で細胞を観察したところ、すべての細胞が青く染まったことから、回収した感染細胞が１００％死細胞となったと判断した。この死細胞化した感染昆虫細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、約３ｍｌのＰＢＳに懸濁した。得られた死細胞化感染昆虫細胞は約６×１０7細胞であった。この細胞３ｍｌに不活化百日咳死菌（シグマ社）を３０μＬ添加した後、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスに各１ｍｌずつ腹腔内投与した。その後２週間おきに４回、同様の方法で免疫を行った後、最後の免疫実施から４日後にマウスを屠殺して脾臓の摘出を行った。
【００９１】
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を免疫したマウスから脾臓を摘出し、ｍＲＮＡを抽出した。これを鋳型としてＨｏｎｇ Ｚｈｏｕらの報告（Nucleic Acid Reserch, 1994, vol. 22, No.5, 888-889）のＰＣＲプライマーを使用して抗体のＨ鎖、Ｌ鎖の遺伝子をそれぞれ別々に増幅した。得られたＤＮＡをリンカーを用いて連結し、アガロースゲル電気泳動により約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＳｆｉＩで消化し、再びアガロースゲル電気泳動により、約７５０ｂｐのＤＮＡ断片を分離、回収した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを抗Ｄ１−４９ＴＲ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名付けた。
【００９２】
アマーシャムファルマシアバイオテク社のｐＣＡＮＴＡＢ５ベクターを制限酵素ＮｏｔＩとＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離、回収した。このＤＮＡ断片にヒスチジンＴａｇアダプター（配列番号１５）をＴＡＫＡＲＡのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ＶｅｒII（ＴＭ）でライゲーションし、大腸菌ＤＨ１０Ｂ株に導入した。この遺伝子ベクター導入大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ−アガロース固形培地に播種し、クローンを取得した。そのうちの２０クローンについてプラスミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ社プラスミド抽出キットによって取得し、Ｅ−ｔａｇプライマーとＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ社ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（ＴＭ） Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよび同社ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ３７３Ａ ＤＮＡシークェンサーを用いて塩基配列を解析することで、ヒスチジンＴａｇアダプターが正しい方向にクローニングされたベクターを選択し、これをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベクターと名づけた。さらにこのｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥベクターを制限酵素ＮｏｔＩおよびＳｆｉＩで切断したベクターをｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩと名づけた。
【００９３】
抗Ｄ１−４９ＴＲ発現昆虫細胞ｓｃＦｖ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩとｐＣＡＮＴＡＢ６ＨＥ／ＮｏｔＩ−ＳｆｉＩをライゲーションキット（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてライゲーション反応を行った。このライゲーション溶液とコンピテントセルＴＧ１−ｔｒを用いて形質転換を行った。
【００９４】
アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ（トリプトン １６ｇ、イーストエクストラクト１０ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）寒天プレートに形質転換した液をまき、３７℃で一晩インキュベートした。プレート上に生じたコロニーをかきとって２×ＹＴ培地に懸濁し、これをファージミドライブラリーとした（ライブラリーのサイズは約１．３×１０8ｐｆｕ）。作製したファージミドライブラリーはグリセロールを最終２５％程度になるように加えてマイナス８０℃に保存した。
【００９５】
実施例３：△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を用いるパンニング
実施例２で得られたファージミドライブラリー１００μｌをアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（２％）を含む２×ＹＴ培地５０ｍｌに加え、６００ｎｍのＯＤが０．６になるまで３７℃で培養した。ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を５５μｌ加え、１時間感染させた。
【００９６】
遠心により菌体を回収し、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ培地に懸濁し、３７℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心後、上清を回収し、５分の１量の２０％ポリエチレングリコール、２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えてファージを沈殿回収した。回収したファージは滅菌水に懸濁した。
【００９７】
次に２％スキムミルクを含む溶液中でファージとＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞を混合し、室温で３０分間反応させた。遠心により細胞に結合したファージを除き、上澄みを再度ＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞と混合した。この操作を１０回繰り返すことによりＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞に結合するファージを除去した。
【００９８】
続いてそのファージ溶液と△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞を混合し、室温で１時間反応させた。遠心により結合しなかったファージ（上澄み）を除き、さらに５回の洗い操作によって非特異的な結合を排除した。その後０．１Ｍ ＨＣｌで細胞からファージをはがして回収し、等量の１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。こうして回収したファージを大腸菌ＴＧ１−ｔｒに１時間感染させ、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む２×ＹＴ寒天プレート上で一晩培養することによりコロニーを作製し、回収したものを△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞１回パンニングファージミドライブラリーとした。
【００９９】
ここまでのファージ調製、細胞に結合するファージの回収という操作を４回繰り返すことによって、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合するファージミドを濃縮した。各パンニングステップにおいて溶出されてきたファージ数は１回目から順に、８×１０7ｐｆｕ、１×１０8ｐｆｕ、１×１０9ｐｆｕ、６×１０10ｐｆｕである。
【０１００】
実施例４：精製ｓｃＦｖの調製
［標準的なｓｃＦｖ産生株培養法およびペリプラズム画分取得方法］
（１）ｓｃＦｖ産生大腸菌株を下記前培養液３０ｍｌに植菌して３０℃、１６０回転／分で終夜培養を行う。（前培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．５％グルコース含有）
（２）終夜培養液３０ｍｌを本培養液３００ｍｌに加える。（本培養液組成：２×ＹＴ培地、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、０．４Ｍショ糖含有）
（３）３０℃、１６０回転／分で１時間培養後、最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を加え、ｓｃＦｖの産生を誘導する。さらに、３０℃、１６０回転／分で６時間培養する。
（４）培養液を５００ｍｌの遠心管に移し、４℃、５５００回転／分で２０分間遠心する。
（５）沈殿物を回収し、１．８ｍｌの１０×ＨＥＰＥＳ緩衝液（１ｍＭ ＡＰＭＳＦ含有、４℃）に懸濁する。
（６）４０ｍｌの遠心管に移し、氷上で１５分間静置する。（５分おきにボルテックスで攪拌）
（７）４℃、８０００回転／分で１０分間遠心する。
（８）上清を回収し４℃に保存する。
（９）沈殿物を１６．２ｍｌ注射用水（１ｍＭ ＡＰＭＳＦ含有、４℃）に懸濁する。
（１０）氷上で２０分間静置する。（５分おきにボルテックスで攪拌）
（１１）４℃、１２０００回転／分で２０分間遠心する。
（１２）上清を回収し、（８）で保存してあった上清と合わせて「ペリプラズム画分」とする。
（１３）４℃に保存または−２０℃で凍結保存する。
【０１０１】
［標準的なｓｃＦｖ精製方法］
（１）ペリプラズム画分（３０ｍｌ）の約１／１０量の３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（アガロース担体の量として１／２０量）を測りとる。
（２）室温で６００回転／分で３分間遠心する。
（３）上清を捨て、１．５ｍｌの脱イオン水を加え、攪拌する。
（４）真空ポンプで吸引し、１０−２０分間脱気を行う。
（５）３０ｍｌボリュームのカラムにＮｉ−ＮＴＡアガロースを装填する。
（６）１時間室温で静置する。
（７）１５ｍｌ緩衝液１（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）でカラムを平衡化する。
（８）３０ｍｌのペリプラズム画分を４℃で０．５ｍｉｎ／ｍｌの滴下速度で２回アプライする。以下の操作はすべて４℃で行う。
（９）１５ｍｌ緩衝液２（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＡＰＭＳＦ、ｐＨ８）で洗浄する。
（１０）１．５ｍｌ緩衝液３（ＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ、６５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）で２回ｓｃＦｖを溶出する。
（１１）Ｍｉｌｌｉｃｕｐ ＬＧＣ（ミリポア社製）で濃縮を行う。
（１２）１０００倍量のＨＥＰＥＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で透析を２回行う。
（１３）精製されたｓｃＦｖを回収し、４℃または−２０℃で凍結保存する。
【０１０２】
実施例５：リコンビナントＴＲ発現昆虫細胞結合性の評価
実施例１で作製した△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞で４回パンニングしたファージを大腸菌ＨＢ２１５１に感染させ、３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを形成させた。
【０１０３】
こうして得られたファージミドがトランスフォームされた大腸菌ＨＢ２１５１株をアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）、グルコース（最終濃度０．５％）を含む２×ＹＴ培地中、３０℃で一晩振とう培養した。培養液を１０μｌとり、１００μｌのアンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を含む培地に懸濁し、３０℃で１時間振とう培養した。ここで最終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間振とう培養を続けた後、遠心によりペレットを回収した。これに１０×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液を加えて菌体を懸濁した後、４℃で１５分静置した。最後に蒸留水を加えて１×Ｈｅｐｅｓ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１２９ｍＭ ＮａＣｌ、８．９ｍＭ ＮａＨＣＯ3、２．８ｍＭ ＫＣｌ、０．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ2／Ｌ）の状態に戻したものをペリプラズム画分として回収した。これを結合評価用のｓｃＦｖサンプルとした。
【０１０４】
△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に対する結合性の評価は以下のように行った。
まず９６ウエルマルチスクリーンプレート（ミリポア社製）を３％ウシ血清アルブミンでコーティングしたところに、△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞とＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞をそれぞれ抗原として加え、調製したｓｃＦｖを混合し、１時間室温で反応させ、ｓｃＦｖのＣ末端側に存在するＥ ｔａｇ部分を認識するＨＲＰ／抗Ｅ ｔａｇ抗体コンジュゲートで検出した。こうして５４０個のコロニーを評価して△１−４９ＴＲ発現昆虫細胞に結合し、ＡｃＭＮＰＶ感染昆虫細胞には結合しないｓｃＦｖを３４個選択した。
【０１０５】
実施例６：ヒト巨核芽球系細胞を用いるＣａ流入阻害評価
実施例４において作製したｓｃＦｖのトロンビン惹起カルシウム流入阻害能を、以下に示す方法によって評価した。すなわち、巨核球細胞系の株化細胞をＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に懸濁し、最終濃度１μＭのＦｕｒａ２−ＡＭ（和光純薬社製）を３７℃で５０分間インキュベートしたのち、ＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液で２回洗浄し、細胞密度が３．３３×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製した。次にその細胞懸濁液３００μｌに実施例４において作製したｓｃＦｖ溶液を２００μｌ混合し、室温で３０分間インキュベートしたのち、最終濃度が１ｍＭになるようにＣａＣｌ2を添加し、さらに室温で５分間インキュベートした。そこにヒト血漿由来トロンビン（シグマ社製）を最終濃度が０．４Ｕ／ｍｌになるように添加し、添加３０秒後の細胞内カルシウム流入量をＣＡＦ−１００（日本分光社製）を用いて測定した。その例として、４種類のクローン（Ｎ０２１、Ｎ０２２、Ｎ０２３、Ｎ０２５）について、ｓｃＦｖ溶液のかわりにＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液とインキュベートした場合のカルシウム流入量を１００としたときの相対値および阻害率を算出した（表２参照）。
【０１０６】
【表２】
実施例７：血小板凝集阻害評価
健常人より０．３８％クエン酸加血として採血し、９００回転／分で１５分遠心することにより血小板を豊富に含む血漿を取得した。その血漿をセファロース２Ｂを用いＨＥＰＡＳ−Ｔｙｒｏｄｅ緩衝液にて展開することにより血小板を精製し、洗浄血小板浮遊液（＞２×１０8／ｍｌ）を調製した。得られた血小板浮遊液２１０μｌにｓｃＦｖ溶液９０μｌを混合し、２０分間静置した。そのうち２８５μｌをキュッベットに分取し、アグリゴメーターＰＡＭ８Ｃ（メバニクス株式会社）を用いて攪拌しつつ、３７℃にて２分間で安定化した。その血小板浮遊液の濁度を測定しつつ、７．５μｌのＣａＣｌ2 水溶液（最終濃度１．５ｍＭ）を添加した。さらに７．５μｌのヒトトロンビン（最終濃度０．１〜０．２Ｕ／ｍｌ）を添加して血小板の凝集を惹起し、その濁度の変化から血小板の凝集度を１１分間測定することによってｓｃＦｖによる血小板凝集阻害を評価した。トロンビンで惹起された最大凝集度を１００％としたときのｓｃＦｖの阻害活性の例を表３に示した。
【０１０８】
【表３】
実施例８：滑膜細胞増殖阻害評価
実施例４に示したように、Ｎｉ−ＮＴＡカラムにて精製したｓｃＦｖについて、さらにエンドトキシンの除去を行った。Ｎｉ−ＮＴＡカラム溶出物１６０ｍｌを限外濾過膜を用いて９０ｍｌに濃縮したのち、φ０．２２μｍのフィルターで濾過した後、セファクリルＳ−１００を用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、ｓｃＦｖが溶出する画分を回収した。それを再度Ｎｉ−ＮＴＡカラムにロードして６０ｍｌの溶出画分を得、それを限外濾過膜を用いて１０ｍｌに濃縮した。それを２ＬのＨＥＰＥＳ−ｔｙｒｏｄｅ緩衝液に対して２回透析した後、カニ外殻キトサン多孔性粒子を用いたアフィニティーカラムにロードし、フロースルー画分を回収し、φ０．２２μｍのフィルターで濾過した。各精製工程におけるエンドトキシン量、蛋白質量を表４に示した。
【０１１０】
【表４】
次に、慢性関節リウマチ患者の滑膜組織から外植片法により初代培養したのち数代継代した滑膜細胞を、９６穴のマイクロタイタープレートにて１ウェル当たり５×１０3細胞になるように播き込み、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で３日間培養した。上清を除去し、無血清のＤＭＥＭ培地で洗浄した後に０．１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を添加し、さらに４８時間血清飢餓条件下で培養した。そこにエンドトキシンを除去したｓｃＦｖを添加し、３０分間インキュベートした後、ヒト血漿由来トロンビン（シグマ社製）を最終濃度が１０Ｕ／ｍｌになるように添加した。添加２４時間後にチミジンのアナログであるＢｒｄＵを最終濃度１ｍＭになるように添加し、添加４８時間後に蛋白固相液により細胞核内に取り込まれたＢｒｄＵを固相化し、酵素標識された抗ＢｒｄＵ抗体を用いて検出した。トロンビンで惹起されたＢｒｄＵ取り込み量を１００％としたときのｓｃＦｖの阻害活性の例を表５に示した。
【０１１２】
【表５】
実施例９：ｓｃＦｖのエピトープの決定
以下に示す９４種類の１５アミノ酸をＣ末端が固相側になるように９４本のピン上に固相合成した。該ペプチドはすべてＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含されるペプチドである。
【０１１４】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の１番目から１５番目のアミノ酸配列［配列番号１６］、同じく２番目から１６番目のアミノ酸配列［配列番号１７］、同じく３番目から１７番目のアミノ酸配列［配列番号１８］、同じく４番目から１８番目のアミノ酸配列［配列番号１９］、同じく５番目から１９番目のアミノ酸配列［配列番号２０］、同じく６番目から２０番目のアミノ酸配列［配列番号２１］、同じく７番目から２１番目のアミノ酸配列［配列番号２２］、同じく８番目から２２番目のアミノ酸配列［配列番号２３］、同じく９番目から２３番目のアミノ酸配列［配列番号２４］、同じく１０番目から２４番目のアミノ酸配列［配列番号２５］、同じく１１番目から２５番目のアミノ酸配列［配列番号２６］、同じく１２番目から２６番目のアミノ酸配列［配列番号２７］、同じく１３番目から２７番目のアミノ酸配列［配列番号２８］、同じく１４番目から２８番目のアミノ酸配列［配列番号２９］、同じく１５番目から２９番目のアミノ酸配列［配列番号３０］、同じく１６番目から３０番目のアミノ酸配列［配列番号３１］、同じく１７番目から３１番目のアミノ酸配列［配列番号３２］、同じく１８番目から３２番目のアミノ酸配列［配列番号３３］、同じく１９番目から３３番目のアミノ酸配列［配列番号３４］、同じく２０番目から３４番目のアミノ酸配列［配列番号３５］、同じく２１番目から３５番目のアミノ酸配列［配列番号３６］、同じく２２番目から３６番目のアミノ酸配列［配列番号３７］、同じく２３番目から３７番目のアミノ酸配列［配列番号３８］、同じく２４番目から３８番目のアミノ酸配列［配列番号３９］、同じく２５番目から３９番目のアミノ酸配列［配列番号４０］、同じく２６番目から４０番目のアミノ酸配列［配列番号４１］、同じく２７番目から４１番目のアミノ酸配列［配列番号４２］、同じく４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］、同じく５２番目から６６番目のアミノ酸配列［配列番号５４］、同じく５３番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号５５］、同じく５４番目から６８番目のアミノ酸配列［配列番号５６］、同じく５５番目から６９番目のアミノ酸配列［配列番号５７］、同じく５６番目から７０番目のアミノ酸配列［配列番号５８］、同じく５７番目から７１番目のアミノ酸配列［配列番号５９］、同じく５８番目から７２番目のアミノ酸配列［配列番号６０］、同じく５９番目から７３番目のアミノ酸配列［配列番号６１］、同じく６０番目から７４番目のアミノ酸配列［配列番号６２］、同じく６１番目から７５番目のアミノ酸配列［配列番号６３］、同じく６２番目から７６番目のアミノ酸配列［配列番号６４］、同じく６３番目から７７番目のアミノ酸配列［配列番号６５］、同じく６４番目から７８番目のアミノ酸配列［配列番号６６］、同じく６５番目から７９番目のアミノ酸配列［配列番号６７］、同じく６６番目から８０番目のアミノ酸配列［配列番号６８］、同じく６７番目から８１番目のアミノ酸配列［配列番号６９］、同じく６８番目から８２番目のアミノ酸配列［配列番号７０］、同じく６９番目から８３番目のアミノ酸配列［配列番号７１］、同じく７０番目から８４番目のアミノ酸配列［配列番号７２］、同じく７１番目から８５番目のアミノ酸配列［配列番号７３］、同じく７２番目から８６番目のアミノ酸配列［配列番号７４］、同じく７３番目から８７番目のアミノ酸配列［配列番号７５］、同じく７４番目から８８番目のアミノ酸配列［配列番号７６］、同じく７５番目から８９番目のアミノ酸配列［配列番号７７］、同じく７６番目から９０番目のアミノ酸配列［配列番号７８］、同じく７７番目から９１番目のアミノ酸配列［配列番号７９］、同じく７８番目から９２番目のアミノ酸配列［配列番号８０］、同じく７９番目から９３番目のアミノ酸配列［配列番号８１］、同じく８０番目から９４番目のアミノ酸配列［配列番号８２］、同じく８１番目から９５番目のアミノ酸配列［配列番号８３］、同じく８２番目から９６番目のアミノ酸配列［配列番号８４］、同じく８３番目から９７番目のアミノ酸配列［配列番号８５］、同じく８４番目から９８番目のアミノ酸配列［配列番号８６］、同じく８５番目から９９番目のアミノ酸配列［配列番号８７］、同じく８６番目から１００番目のアミノ酸配列［配列番号８８］、同じく８７番目から１０１番目のアミノ酸配列［配列番号８９］、同じく８８番目から１０２番目のアミノ酸配列［配列番号９０］、同じく８９番目から１０３番目のアミノ酸配列［配列番号９１］、同じく９０番目から１０４番目のアミノ酸配列［配列番号９２］、同じく１５９番目から１７３番目のアミノ酸配列［配列番号９３］、同じく１６０番目から１７４番目のアミノ酸配列［配列番号９４］、同じく２３５番目から２４９番目のアミノ酸配列［配列番号９５］。同じく２３６番目から２５０番目のアミノ酸配列［配列番号９６］、同じく２３７番目から２５１番目のアミノ酸配列［配列番号９７］、同じく２３８番目から２５２番目のアミノ酸配列［配列番号９８］、同じく２３９番目から２５３番目のアミノ酸配列［配列番号９９］、同じく２４０番目から２５４番目のアミノ酸配列［配列番号１００］、同じく２４１番目から２５５番目のアミノ酸配列［配列番号１０１］、同じく２４２番目から２５６番目のアミノ酸配列［配列番号１０２］、同じく２４３番目から２５７番目のアミノ酸配列［配列番号１０３］、同じく２４４番目から２５８番目のアミノ酸配列［配列番号１０４］、同じく２４５番目から２５９番目のアミノ酸配列［配列番号１０５］、同じく２４６番目から２６０番目のアミノ酸配列［配列番号１０６］、同じく２４７番目から２６１番目のアミノ酸配列［配列番号１０７］、同じく２４８番目から２６２番目のアミノ酸配列［配列番号１０８］、同じく３２９番目から３４６番目のアミノ酸配列［配列番号１０９］
【０１１５】
上記９４種類のペプチドが固相化されたピンをプレコートバッファー（２％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％アジ化ナトリウム０．０１Ｍ ＰＢＳ）に室温で６０分間浸したのちに、洗浄バッファー（０．０１Ｍ ＰＢＳ）で室温で１０分間洗浄した。次に２０μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ溶液（１％ＢＳＡ、０．１％スキムミルク含有）に４℃で終夜反応させたのちに洗浄バッファーで４回洗浄した。次にｓｃＦｖのｃ−ｍｙｃタグを特異的に認識する抗体である９Ｅ１０にホースラディッシュペルオキシダーゼをコンジュゲートしたものを１μｇ／ｍｌ（１％ ＢＳＡ、０．１％スキムミルク、０．０１Ｍ ＰＢＳ含有）の濃度で室温で６０分間反応させた後、洗浄バッファーで４回洗浄した。次に発色剤溶液（ＡＢＴＳ）にピンを１０分間浸漬し、波長４０５ｎｍにおける発色剤溶液の吸光度を測定した。その結果、滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０２２およびＮ０２５は、以下のアミノ酸配列に対して特異的に結合した。すなわち、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］である。
【０１１６】
このことから、トロンビンで惹起した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖクローンＮ０２２およびＮ０２５のエピトープは、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５２番目から５６番目のアミノ酸配列を認識することが示された。
【０１１７】
また滑膜細胞増殖を阻害しないｓｃＦｖクローンＮ０１８は、以下のアミノ酸配列に対して特異的に結合した。すなわち、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４１番目から５５番目のアミノ酸配列［配列番号４３］、同じく４２番目から５６番目のアミノ酸配列［配列番号４４］、同じく４３番目から５７番目のアミノ酸配列［配列番号４５］、同じく４４番目から５８番目のアミノ酸配列［配列番号４６］、同じく４５番目から５９番目のアミノ酸配列［配列番号４７］、同じく４６番目から６０番目のアミノ酸配列［配列番号４８］、同じく４７番目から６１番目のアミノ酸配列［配列番号４９］、同じく４８番目から６２番目のアミノ酸配列［配列番号５０］、同じく４９番目から６３番目のアミノ酸配列［配列番号５１］、同じく５０番目から６４番目のアミノ酸配列［配列番号５２］、同じく５１番目から６５番目のアミノ酸配列［配列番号５３］である。
【０１１８】
このことから、トロンビンで惹起した滑膜細胞増殖を阻害するｓｃＦｖのエピトープは、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の５１番目から５６番目のアミノ酸配列であることが示された。
【０１１９】
実施例１０：ｓｃＦｖのＫｉｎｅｔｉｃｓ解析
滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープに対するＫｉｎｅｔｉｃｓ特異性の検証を表面プライズモン共鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて行った。
【０１２０】
以下に示す２１アミノ酸を合成した（株式会社バイオロジカ）。このペプチドはＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含され、活膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープを含むペプチドである。
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１０］
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
【０１２１】
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１０］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＫＬＨ ａｎｄ ＢＳＡ」を用い、まずＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド１ｍｇをＫｉｔのＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さらにＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、ＫＬＨ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３０分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止させた。その後、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して２回透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。
【０１２２】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体ペプチドまたリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡＣＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキット」を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なった。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同社市販のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ボリソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／分で流した。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応させ、センサーチップ表面上のカルボキシメチルデキストランを活性化させた。１００μｇ／ｍｌのＫＬＨ ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄペプチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応させることによりセンサーチップ上に結合させ、さらにアミンカップリングキット中のエタノールアミンを７分間（３５μｌ）反応させて残余の活性型ＮＨＳ基をブロッキングした。
【０１２３】
上記センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結合解離曲線を測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にてｓｃＦｖを５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌに調製し、各ｓｃＦｖ溶液について、流速２０μｌ／分で３分間センサーチップに反応させた。その後、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ／分で５分間流し、センサーチップを１０ｍＭ ＨＣｌで２０μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一連の操作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定することによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの結合解離曲線を得た。得られた結合解離曲線と各ｓｃＦｖの濃度から、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．２．１を用いて同社添付のプログラムに準じ、各ｓｃＦｖの結合解離定数を算出した。その結果、各ｓｃＦｖの結合解離定数（ＫＤ値）は滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖでＫＤ値：約５×１０-7Ｍ、滑膜細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖでＫＤ値：約１×１０-7Ｍであった（表６参照）。
【０１２４】
【表６】
実施例１１：ｓｃＦｖのエピトープのアミノ酸残基特異性の比較
滑膜細胞増殖阻害能を有するｓｃＦｖのエピトープにおけるアミノ酸残基特異性の検証を、表面プライズモン共鳴センサーＢＩＡＣＯＲＥ１０００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いて行った。
【０１２６】
以下に示す５種類の２１アミノ酸を合成した（株式会社バイオロジカ）。４種のペプチドはヒトトロンビンレセプターの細胞外領域に包含されるペプチドとそのアミノ酸残基置換ペプチドである。
【０１２７】
すなわち、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１２］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１３］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１４］、同じく４７番目から６７番目のアミノ酸残基中５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸配列［配列番号１１５］、およびコントロールの２１アミノ酸配列［配列番号１１１］
Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
である。
【０１２８】
ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列［配列番号１１２］のペプチドに対してＫＬＨ複合体を作成した。ＰＩＥＲＣＥ社より市販されている「Ｉｍｊｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈ ＫＬＨ ａｎｄ ＢＳＡ」を用い、ＰＡＲ１型ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチド１ｍｇをＫｉｔのＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液０．２５ｍｌに溶解し（ペプチド４ｍｇ／ｍｌ）、ＫＬＨ溶解液（１０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを加えた。さらにＥＤＣ（１０ｍｇ／ｍｌ）２５μｌをペプチド、ＫＬＨ混合液に攪拌しながらゆっくり滴下し、引き続き３０分間室温にて攪拌した。その後、ＥＤＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ緩衝液３５０μｌを添加し、反応を停止させた。さらにＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、３Ｌに対して２回透析し、ＫＬＨ複合体ペプチドを得た。
【０１２９】
ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列のＫＬＨ複合体ペプチド、またリファレンスとしてＫＬＨをＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）に固定化した。ＢＩＡＣＯＲＥ社で市販している「アミンカップリングキット」を使用し、業者添付のプログラムに準じて行なった。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒ．１．２を用いてＣＭ５センサーチップに同社市販のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ボリソルベート２０（ｖ／ｖ））を流速５μｌ／分で流した。さらにアミンカップリングキットのＥＤＣ／ＮＨＳの１：１混合液を７分間（３５μｌ）反応させ、センサーチップ表面上のカルボキシルデキストランを活性化させた。１００μｇ／ｍｌの ＫＬＨ複合体ペプチドまたはＫＬＨを７分間（３５μｌ）反応させることによりセンサーチップ上に結合させ、さらにアミンカップリングキット中のエタノールアミンを７分間（３５μｌ）反応させて残余のＮＨＳ基をブロッキングした。
【０１３０】
上記センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスとし、ペプチドに対するｓｃＦｖの結合を確認した。ｓｃＦｖをＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にて５０μｇ／ｍｌに調製し、流速１０μｌ／分で３分間反応させた。その後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を流速２０μｌ／分で５分間流し、センサーチップを１０ｍＭ ＨＣｌで２０μｌ／分で１分間洗浄することを繰り返した。一連の操作におけるセンサーチップ表面の質量変化を測定することによってペプチドに対する各ｓｃＦｖの最大結合量を得た。滑膜細胞増殖活性を有するｓｃＦｖで最大結合量約３００ＲＵ、滑膜細胞増殖活性のないｓｃＦｖで最大結合量約６００ＲＵの結合値を得た。
【０１３１】
上記線センサーチップ上に固定化されたＫＬＨをリファレンスに、ペプチドに対するｓｃＦｖ５種の各ペプチドによる競合結合阻害を測定した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液にてｓｃＦｖ（終濃度５０μｇ／ｍｌ）とペプチド（終濃度５μｇ／ｍｌ）の混合液を調製し、ｓｃＦｖ−ペプチド混合液を流速１０μｌ／分で３分間反応させた。
【０１３２】
コントロールペプチドでは滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともに結合を阻害されなかった。ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸配列ペプチドでは滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともに結合が阻害された。
【０１３３】
活膜細胞増殖阻害活性をもたないｓｃＦｖではヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチド、および４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは結合阻害が認められず、アミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認められた。
【０１３４】
滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖではヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５１番目のリジンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドおよび４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５５番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドで結合阻害が認められ、ヒトトロンビンレセプターのアミノ末端側の４７番目から６７番目のアミノ酸残基中、５６番目のトリプトファンをアラニンに置換したアミノ酸ペプチドでは結合阻害が認められなかった。
【０１３５】
滑膜細胞増殖阻害活性をもつｓｃＦｖ、もたないｓｃＦｖともにエピトープとして重複したアミノ酸配列を認識しているものの、そのエピトープにおける各アミノ酸残基に対する重要度に違いがあることが確認された。
【０１３６】
トロンビン惹起滑膜細胞増殖阻害にはヒトトロンビンレセプターのアミノ酸末端から５６番目のトリプトファン残基がｓｃＦｖの重要な結合部位であることが確認された。
【０１３７】
【発明の効果】
本発明の薬剤（ポリペプチドまたは化合物）は、トロンビンレセプターを介したシグナル伝達を抑制し、細胞増殖阻害活性やＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１βなどの炎症性メディエーターの産生や放出を抑制する活性を有し、各種炎症性疾患や細胞増殖性疾患の治療薬として用いられる。
【０１３８】
【配列表】
【０１３９】
Claims (4)
- ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの部分配列であってＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐを含むエピトープ、または前記エピトープに含まれるＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐの中のＰｈｅをＡｌａに置換したエピトープに結合し、トロンビンによる細胞増殖を抑制する単鎖型Ｆｖもしくはその断片、または抗体もしくはその断片。
- ＰＡＲ１型トロンビンレセプターの部分配列であってＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐを含むエピトープ、または前記エピトープに含まれるＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐの中のＰｈｅをＡｌａに置換したエピトープに結合するが、前記エピトープに含まれるＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐの中のＴｒｐをＡｌａに置換したエピトープに結合せず、トロンビンによる細胞増殖を抑制する単鎖型Ｆｖもしくはその断片、または抗体もしくはその断片。
- トロンビンレセプターを介した細胞増殖に関わるシグナル伝達系を阻害する請求項１または請求項２に記載の単鎖型Ｆｖもしくはその断片、または抗体もしくはその断片。
- 配列番号１で示される改変型ＰＡＲ１型トロンビンレセプター遺伝子。
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