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Gegenstand
der Erfindung sind neue Untereinheiten humaner spannungsabhängiger Kaliumkanäle, insbesondere
hKv4.1. Ferner werden im Rahmen der Erfindung Vektoren zur Verfügung gestellt,
die hKv4.1 bzw. .2 enthalten, sowie diese Vektoren enthaltende Wirtszellen,
die die Kaliumkanaluntereinheiten bzw. die Kaliumkanluntereinheiten
enthaltenden Kaliumkanäle
exprimieren. Gegenstand der Erfindung sind ferner gegen die Kaliumkanaluntereinheiten
gerichtete Antikörper.
Ferner wird ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen zur
Verfügung
gestellt die Kv4.1-Kaliumkanäle öffnen, schließen, aktivieren,
inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften verändern können. Das
Verfahren kann zur Spezifikation von Antiarrhytmika bzw. zum Auffinden
und Identifizieren von Therapeutika zur Behandlung neurodegenerativer
Erkrankungen, zur Verbesserung des Lernvermögens und von Gedächtnisleistungen
und zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet werden.
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Die
Membranen von Säugetierzellen
sind für
die strukturelle Integrität
und die Aktivität
von Zellen und Gewebe von großer
Bedeutung. Eine Vielzahl von Stoffwechselprozessen wird von membrandurchspannenden
Ionenkanälen
gesteuert. In der Vergangenheit konnten verschiedene Innenkanäle identifiziert
werden, durch die Kalzium, Natrium und/oder Kalium die Zellmembran
passieren können.
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Die
Aktivität
von Kaliumkanälen
kann entweder durch intrazelluläre
Signalstoffe wie cAMP oder durch Potentialdifferenzen an der Zellmembran
reguliert werden. Diese Potentialdifferenzen oder Spannungen kommen
durch unterschiedliche Innenkonzentrationen innerhalb und außerhalb
der Zelle zustande.
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Spannungsabhängige Kaliumkanäle sind
in Abhängigkeit
des über
die Zellmembran vorliegenden Potentials geöffnet oder geschlossen. Es
sind verschiedene Klassen von spannungsabhängigen Kaliumkanälen bekannt,
deren Aufbau in der Regel ähnlich
ist. Grundsätzlich
bestehen sie aus vier homologen α-Untereinheiten.
Die α-Untereinheiten
gehören
zu einer gemeinsamen Gensuperfamilie. Sie besitzen eine vergleichbare zweidimensionale
Struktur, aus der eine für
Kaliumkanäle
typische Membrantopologie hervorgeht (O. Pongs, Physiol. Rev. 72
(1992) S69–88;
L. Y. Jan et al., Nature 371 (1994) 119–122; K. G. Chandy et al.,
in Handbook of Receptors and Channels ed. R. A. North, Boca Raton
1 (1994) 1–71;
O. Pongs, FERS Lett. 452 (1999) 31–35). Jede α-Untereinheit besitzt sechs
hydrophobe Membran-durchspannende Segmente S1–S6. Zwischen S5 und S6 liegt
die sogenannte P-Region, die von der extrazellulären Seite in die Membran eintaucht. Die
P-Region hat einen entscheidenden Anteil an der Ausbildung der Kaliumkanalpore.
Das S4-Segment enthält
mehrere Aminosäuren
mit positiven Ladungen, die wahrscheinlich für die Spannungsempfindlichkeit
des Kanals einen wesentlichen Beitrag liefern. Zusätzlich können spannungsabhängige Kaliumkanäle auch β-Untereinheiten
enthalten. Die β-Untereinheiten
sind für
die Regulation der Aktivität
des Kanals von Bedeutung, während
die α-Untereinheiten
den eigentli chen funktionellen Kaliumkanal bilden (O. Pongs, Biospektrum
3 (1997) 21–26).
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Die
Familie der spannungsabhängigen
Kaliumkanaluntereinheiten läßt sich
in mehrere Unterfamilien unterteilen, von denen die Kv1- bis Kv4-Familien
gut charakterisiert sind (W. Stühmer
et al., EMBO J. 8 (1989) 3235–3244;
B. Albrecht et al., Receptor and Channel 1 (1993) 99–199; J.
Rettig et al., EMBO J. 11 (1992) 2473–2486; Serodio et al., J. Neurophysiol.
75 (1996) 2174–2179).
Innerhalb der Unterfamilien liegt die Sequenzidentität der einzelnen α-Untereinheiten
untereinander auf der Ebene der Aminosäuren bei ≥ 60%. Die bisher klonierten α-Untereinheiten
der Familien Kv1 bis Kv4 exprimieren funktionelle Kaliumkanäle in heterologen
Expressionssystemen, d. h. nach Injektion von DNA und mRNA in Xenopus
Oozyten bzw. in Gewebekulturzellen (z. B. Chinese Hamster Ovary
(CHO) Zellen, Human Epithelial Kidney (HEK) 293 Zellen) oder nach Transfektion
von Gewebekulturzellen mit für α-Untereinheiten
kodierender DNA in geeigneten Expressionsvektoren wie pcDNA3 (s.
u.).
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Dilks
et al. (The Journal of Neurophysiology 1999, 81, 1974–7) beschreibt
die Expression der menschlichen Kaliumkanalproteine "hKv4.3 long" und "hKv4.3 short" in Xenopus Oocyten.
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Die
Datenbankeinträge
AAD22053 und AAC05122 geben die Sequenzen für Kv4.2 und Kv4.3 an.
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Kong
et al. (AJP – Heart
and Circulatory Physiology 1998, 275 (6), H1963–H1970) offenbart die Heteromultimerisierung
von Kaliumkanalproteinuntereinheiten. Xu et al. (J. Biol. Chem.
1995, 270 (42) 24761–8) beschreibt,
dass Mitglieder der Kv4(Shal)-Unterfamilie Tetramere ausbilden.
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Zusätzlich zu α-Untereinheiten
von Kv1 bis Kv4 sind noch weitere potentielle Kvα-Untereinheiten bekannt (M.
A. Post et al., FEBS 399 (1996) 177–182; J. P. Hugnot et al.,
EMBO 15 (1996) 3322–3331;
A. Castellano et al., J. Neurosci. 17 (1997) 4652–4661; J.
A. Drewe et al., J. Neurosci. 12 (1992) 538–548), die zu Kv1 bis Kv4 bezogen
auf die Aminosäuren
eine Sequenzidentität
von < 60% zeigen.
Diese Kanäle
wurden als Kv5.1, Kv6.1, Kv7.1, Kv8.1 bezeichnet. Hauptmerkmal dieser α-Untereinheiten
ist, daß sie
zwar für
Kaliumkanal α-Untereinheiten
typische Sequenzmerkmale enthalten, aber als Homomultimere keine
funktionellen Kanäle
in heterologen Expressionsystem ausbilden.
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Spannungsabhängige Kaliumkanäle können vielfältige physiologische
Aufgaben übernehmen,
die von der Regulation des Membranruhepotentials bis hin zur Regulation
der Exozytose und Zellproliferation reichen. In erregbaren Zellen
haben spannungsabhängige Kaliumkanäle eine
wichtige Bedeutung für
die Repolarisation der Aktionspotentiale und die Regulation des
Schwellenwertes, von dem aus ein Aktionspotential ausgelöst werden
kann. Insofern steuert die Aktivität von Kaliumkanälen sowohl
die Dauer und Verlaufsform des Aktionspotentials als auch die Aktionspotentialauslösungsfrequenz.
Dies gilt auch für
die rhythmische Erzeugung von Aktionspotentialen im Herzmuskelgewebe,
dem Myocard (R. E. Ten Eick et al., FASEB J. 6 (1992) 2568–2580).
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Mehrere
distinkte Kaliumkanaltypen sind an der Generierung und Repolarisierung
der Aktionspotentiale im Myocard beteiligt. An der Repolarisierung
sind Kv-Kanäle
beteiligt, die insbesondere die Ströme Ito,
IKR und ISK vermitteln.
Ito ist ein schnell aktivierender transienter
Kaliumauswärtsstrom,
IKR ist ein schnell aktivierender, nicht-inaktivierender
Kaliumauswärtsstrom,
ISK ist ein langsam aktivierender Kaliumauswärtsstrom.
Diese Ströme
wurden an dissoziierten, in Kultur gehaltenen Myocardzellen gemessen
(R. C. Kass und L. C. Freeman, Trends Cardiovasc. Med. 3 (1993)
149–159;
D. M. Barry und J. M. Nerbonne, Ann. Rev. Physiol. 58 (1996) 363–394). Die
Analyse von erblichen Herzrhythmusstörungen, die zu einem langen
QT-Syndrom, d. h. einer verzögerten
Repolarisierung des kardiakalen Aktionspotentials, führen, hat
gezeigt, daß der
ISK-Strom im wesentlichen durch die Kv-Kanäle KCNQ1/KCNE1
vermittelt wird (M. C. Sanguinetti et al., Nature 384 (1996) 80–83; J.
Berhanin et al., Nature 384 (1996) 78–80; C. Chouabe et al., EMBO
J. 16 (1997) 5472–5479).
Der IKR-Strom wird durch die Kv-Kanäle KCNH2/KCNE2
Kv-Kanäle
vermittelt, die zur Nachhyperpolarisierung und damit zur Stabilisierung
des Schwellenwertes beitragen (P. L. Smith et al., Nature 379 (1996)
833–836;
1998; G. W. Abbott et al., Cell 97 (1999) 175–187).
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Pharmakologisch
ist es möglich,
KCNN1/KCNE2 Kanäle
relativ spezifisch durch Pharmaka wie E-4031 zu blockieren (P. S.
Spector et al., Circ Res. 78 (1996) 499–503).
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In
Nagern sind Kanäle
des hier beschriebenen Typus, Kv4.2, an der Ausbildung des Ito beteiligt (D. C. Johns et al., J. Biological.
Chem. 272 (1997) 31598–31603;
D. M. Barry et al., Circ. Res. 83 (1998); T. Y. Nakamura et al.,
Am. J. Physiol. 273 (1997) 1775–1786).
Für das
humane Herz wird hingegen angenommen, daß Kv-Kanäle des Typus Kv4.3 (W. Kong
et al., Am. J. Physiol. 275 (1998) H1963–H1970) zum Ito vermitteln
(Kääb et al.,
Circ. Res. 98 (1998) 1383–1393)
während
Kv4.2 keine wesentliche Rolle zu spielen scheint (J. E. Dixon et
al., Circ. Res. 79 (1996) 659–668;
diese Schrift).
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Herzrhythmusstörungen werden
gegenwärtig
häufig
mit Ionenkanalblockern behandelt. Die Wirkungsweise dieser Blocker
läßt sich
dahingehend klassifizieren, ob sie die Depolarisierungsgeschwindigkeit
(Anstieg) des kardiakalen Aktionspotentials verzögern (z. B. Flecainid, Phenytoin)
bzw. die Dauer des kardiakalen Aktionspotentials verlängern (z.
B. Sotalol, Aminodaron, Chinidin, Disopyramid) (T. J. Colatsky in
Potassium Channel Modulators (Herausgeber A. H. Weston and T. C.
Hamilton) (1992) Blackwell Scientific Publ.; Oxford; pp. 304–340).
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Bei
der Behandlung von Herzrhythmusstörungen spielen Antiarrhythmika
klinisch eine wichtige Rolle. Die Klassifizierung der Antiarrhythmika
erfolgt in vier Klassen, wobei zu Klasse I z. B. Flecainid und Chinidin gezählt werden.
Diese Substanzen blockieren zum einem den Natriumkanal und verzögern damit
den Anstieg des Aktionspotentials, zum anderen wirken sie aber auch
auf Kaliumkanäle,
insbesondere solche die an der Ausbildung des Ito beteiligt
sind.
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Die
Verabreichung von Antiarrhythmika ist häufig mit erheblichen Nachteilen
für den
Patienten verbunden, die sich bei den Patienten im Auftreten von
Kopfschmerzen, Schwindel, Augenflimmern oder Magen-Darmstörungen manifestieren
können
(J. Braun und R. Preuss. Klinikleitfaden Intensivmedizin, 2. Auflage, Jung
Johann Verlagsgesellschaft, Neckarsulm/Stuttgart (1992)). Bei älteren Patienten
kommen häufig
hypotone Kreislaufstörungen
vor. Bei stark vorgeschädigtem
Myokard könne
unerwünschte
Beeinträchtigungen
der Erregungsleitung im HIS-Purkinje-System und der Myokardkontraktilität auftreten
(P. Vigreux et al., Therapie 50 (1995) 413–418; P. J. Podrid und J. L.
Anderson, Am. J. Cardiol. 15 (-1996) 430–434; E. Aliot und I. Denjoy, Am.
J. Cardiol. 77 (1996) 66A–71A).
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Aufgrund
der Nebenwirkungen von Flecainid und anderen im Stand der Technik
bekannten Antiarrhythmika wird ständig nach neuen Wirkstoffen
gesucht. Das gezielte Screening nach neuen Antiarrhythmika erfolgt
in der Pharma-Industrie bislang in der Regel mit Hilfe relativ aufwendiger
Organ- bzw. Gewebepräparate.
Dabei wird z. B. die Funktion eines isolierten Kaninchenherzens
unter entweder einem konstanten Druck oder einem konstanten Fluß gemessen
(A. von Bethmann et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153 (1996) A529).
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein neues Testsystem (Assay)
zur Verfügung
zu stellen, das geeignet ist, Stoffe auf ihre Eignung als Antiarrhythmika
zu testen, d. h. mit dem getestet werden kann, ob Wirkstoffe spezifisch
die für
Ito-Ströme
verantwortlichen Kanäle
beeinflussen. Mit dem Testsystem sollen Pharmaka somit auf ihre
Wirkung gegenüber
Ito-Strömen überprüft werden
können.
Insbesondere soll das Testsystem geeignet sein, Wirkstoffe zu identifizieren,
die wenig oder gar nicht mit den Kanälen interagieren, die Ito-Ströme
leiten und somit die bei den bislang bekannten Antiarrhythmika beobachteten
Nebenwirkungen nicht aufweisen. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe
zugrunde, ein Assay zur Verfügung
zu stellen, der den bislang notwendigen Einsatz von Organkulturen überflüssig macht
oder zumindest stark einschränkt.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe durch Wirtszellen gelöst,
die den spannungsabhängigen
Kaliumkanal Kv4.1, Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3, oder Kv4.1/4.2/4.3
exprimieren, d. h. einen Kaliumkanal, der aus vier Untereinheiten
besteht, wobei die Untereinheiten aus der Gruppe bestehend aus Kv4.1,
Kv4.2 und Kv4.3 ausgewählt
sind.
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Gemäß der hier
gewählten
Terminologie handelt es sich bei dem mit "Kv4.1" bezeichneten Kaliumkanal somit um ein
Homotetramer bestehend aus vier Kv4.1-Kaliumkanaluntereinheiten.
Mit "Kv4.1/Kv4.2" wird beispielsweise
ein Kaliumkanal bezeichnet, der aus den Untereinheiten Kv4.1 und
Kv4.2 besteht, die ein Heterotetramer bilden, wobei alle denkbaren
stöchiometrischen
Verhältnisse
(d. h. 1:3, 2:2, 3:1; bei 0:4 oder 4:0 handelt es sich um ein Homotetramer)
eingeschlossen sind. "hKv4" bezeichnet einen
Kv4-Kanal humanen Ursprungs. Soweit im folgenden "Kv4" verwendet wird,
umfaßt
dieser Begriff alle zur Kv4-Familie zählenden Untereinheiten, wie
z. B. Kv4.1, Kv4.2, Kv4.3.
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Es
wurde überraschenderweise
festgestellt, daß die
humane Kaliumkanaluntereinheit Kv4.2 sehr spezifisch im zentralen
Nervensystem (ZNS), im Gegensatz zu Nagern (Zhn X. R. Receptor Channels
6 (1999) 387–400)
aber kaum im Myokard exprimiert wird (siehe Beispiel 3). Unerwartet
war auch der Befund, daß die bislang
nicht klonierte Untereinheit Kv4.1 in vielen Geweben und auch im
humanen Myokard exprimiert wird. Es ist daher davon auszugehen,
daß die
meisten Kv4-Kanäle
Kv4.1 als Untereinheit enthalten. In Northern blots von mRNA extrahiert
aus verschiedenen humanen Geweben wurde Kv4.2 mRNA nur im Gehirn,
Kv4.1 und Kv4.3 mRNA hingegen sowohl im Gehirn als auch in Herz,
Lunge, Placenta, Leber, Niere, Pankreas und Skelettmuskel nachgewiesen
(Beispiel 3).
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Durch
diese Erkenntnis ist somit die Entwicklung von Assays möglich, mit
deren Hilfe sich die Organspezifität (Herz oder ZNS) von Substanzen,
die auf Kaliumkanäle
der Kv4-Unterfamilie wirken, bestimmen läßt. Dies ist von großer Bedeutung,
da sich auf diese Weise z. B. Antiarrhythmika entwickeln lassen,
die die Blut-Hirn-Schranke zwar passieren können, jedoch keine Wirkung
auf den ZNS-spezifischen Kaliumkanal Kv4.2 ausüben. Es ist zu erwarten, daß derartige
Wirkstoffe die mit herkömmlichen
Antiarrhythmika assoziierten Nebenwirkungen wie Kopfschmerz, Schwindel
oder Augenflimmern nicht aufweisen sollten, so diese Nebenwirkungen
durch Interaktion mit Kv4.2-Kanälen
verursacht werden.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen (funktionellen)
Kv4.1- und Kv4.2-Kanäle
hochsensitiv gegen das Klasse I Herzantiarrhythmikum Flecainid sind,
d. h. einen hochaffinen Rezeptor für das Klasse I Antiarrhythmikum
Flecainid darstellen. Dies könnte
ein Grund für die
o. g. Nebenwirkungen von Antiarrhythmika im allgemeinen und von
Flecainid im besonderen sein.
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Kv4.1-
und Kv4.3-Untereinheiten vermitteln transiente schnell-inaktivierende Kaliumauswärtsströme, die
aufgrund ihrer Eigenschaften zu Ito-Strömen beitragen
können.
Aufgrund des Vorkommens der humanen Kv4.1-, Kv4.2- und Kv4.3-Untereinheiten
im humanen ZNS und der gefundenen Eigenschaften der vermittelten Auswärtströme können Kv4.1-,
Kv4.2- und Kv4.3-Kanäle
bzw. Kanäle,
die Kv4.1-, Kv4.2- und/oder Kv4.3-Untereinheiten (d. h. sowohl Homo- als auch Hetereotetramere)
enthalten, somatodendritische Kaliumkanäle bilden, die einen transienten
schnell-inaktivierenden, sog. A-Typ Kaliumauswärtsstrom in Dendriten und im
Soma eines Neurons vermitteln. Von diesen Strömen ist bekannt, daß sie einen
wichtigen Beitrag zur Erzeugung, Integration und Weiterleitung dendritischer
Aktionspotentiale leisten (D. A. Hoffmann und D. Johnston, J. Neurosci.
18 (1998) 3521–3528).
Diesem Prozeß wird
eine wesentliche Bedeutung bei Lern- und Gedächtnisvorgängen beigemessen, die im Zusammenhang
mit Langzeitpotenzierungen synaptischer Übertragungen stehen (D. A.
Hoffmann et al., Nature 387 (1997) 869–875). Im neuronalen Bereich
spielen Kaliumkanäle
somit eine entscheidende Rolle in der Regulation der Aktivität von Neuronen.
Modulatoren dieser Kaliumka näle
können
daher potentiell nicht nur Lern- und Gedächtnisfunktionen beeinflussen,
sondern – aufgrund
des hohen Vorkommens der Kv4.2 Kaliumkanaluntereinheit in humaner
striataler Cortex und in humaner Substantia nigra – beispielsweise
auch bei (neurodegerativen) Erkrankungen des Nervensystems (z. B.
Autismus, Epilepsien, Ischämien,
Schlaganfall, Morbus Parkinson, Morbus Huntington und Alzheimersche
Erkrankung) therapeutisch eingesetzt werden.
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Die
erfindungsgemäßen Kaliumkanäle eignen
sich somit nicht nur in besonderer Weise zur gezielten Identifizierung
und Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung von Erkrankungen
des Herzkreislaufsystems sondern auch des Nervensystems in Mensch
und Tier, insbesondere von Antineurodegenerativa. Kv4.1 und Kv4.3
homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.3 heterotetramere Kaliumkanäle werden
im Herzen exprimiert, nicht aber Kv4.2 homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.2,
Kv4.2/Kv4.3, Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3 heterotetramere Kanäle. Diese sind
besonders geeignet zur Suche nach spezifischen Wirkstoffen zur Behandlung
von Erkrankungen des Nervensystems (s. o.).
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Erfindungsgemäß werden
daher neue humane Kaliumkanaluntereinheiten Kv4.1 zur Verfügung gestellt,
die die in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen. Die
Untereinheit Kv4.3 weist die in SEQ ID NO: 29 dargestellte Sequenz
auf. [Die Angabe "SEQ
ID NO:" entspricht
der numerischen Kennzahl "<400>" im Sequenzprotokoll]. Kv4.2 weist die
in SEQ ID NO: 4 gezeigte Sequenz auf.
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Die
erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine
(Untereinheiten) sind auf verschiedenen, dem Fachmann bekannten
Wegen erhältlich.
Zum einen können
Kaliumkanalproteine derselben mittels chemischer Synthese hergestellt
werden. Desweiteren können
Antikörper
gegen Fragmente der Polypeptide nach dem Fachmann bekannten Methoden
hergestellt werden (E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory
manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY). Mittels dieser Antikörper
kann dann das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein
aus Zellen isoliert werden, die natürlicherweise das Kaliumkanalprotein
exprimieren, es ist aber ebenso denkbar, daß Zellen verwendet werden,
in die für
das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein
kodierende Nukleinsäuresequenzen
eingeführt
werden und die das Protein anschließend unter geeigneten Bedingungen
exprimieren.
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Gegenstand
der Erfindung ist ferner ein Kaliumkanal, der dadurch gekennzeichnet
ist, daß er
mindestens die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.1 enthält. Erfindungsgemäß kann der
Kaliumkanal neben der Untereinheit Kv4.1 auch andere Kaliumkanaluntereinheiten
enthalten. Dabei kommen besonders die Untereinheiten Kv4.2 und Kv4.3
in Frage sowie Homologe, Derivate (z. B. phosphorylierte Untereinheiten
und durch Mutagenese veränderte
Untereinheiten oder Fragmente derselben, die die gleiche elektrobiologische,
pharmakologische und/oder biologische Wirkung und/oder Immunogenität aufweisen.
Besonders bevorzugt enthält
er zusätzlich
die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.3. Wie bereits oben erwähnt, können diese
Kaliumkanäle
in Form von Homo- oder Heterotetrameren vorliegen, wobei die Kanäle Kv4.1,
Kv4.1/Kv4.2, und Kv4.1/Kv4.3 sind.
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Die
spezifischen Inaktivierungseigenschaften des Kaliumkanals hängen von
den Kaliumkanaluntereinheiten ab, die er neben Kv4.1 enthält. Enthält er neben
Kv4.1 eine andere Kaliumkanaluntereinheit, so handelt es sich um
einen spannungsabhängigen
Kaliumkanal, der bei Depolarisierung der Membran Auswärtsströme vermit telt,
die gleich, schneller oder langsamer inaktivieren als die vom Vergleichskanal
Kv4.1 vermittelten Ströme.
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Gegenstand
der Erfindung sind ferner Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine
bzw. Kaliumkanäle,
kodieren. Besonders bevorzugt können
diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
ausgewählt
werden aus:
- (a) der in SEQ ID NO: 1 angegebenen
Nukleotidsequenz,
- (b) allelischen Varianten und Fragmenten der unter (a) genannten
Sequenzen (soweit sie für
Protein und Polypeptide mit gleicher elektropbiologischer, pharmakologischer
und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität kodieren).
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Gegenstand
der Erfindung ist ferner ein Vektor, der dadurch gekennzeichnet
ist, daß er
eine oder mehrere der oben genannten Nukleinsäuresequenzen enthält. Geeignete
Vektoren sind pBluescript KS+ und pBluescript KS– (Stratagene, La Jolla, CA,
US), sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise ist der Vektor
ein Expressionsvektor, wie z. B. pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA,
US), wobei die Erfindung aber nicht auf diesen beschränkt ist.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
können
in diese Vektoren nach allgemeinen bekannten Methoden kloniert werden
(T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, US). Erfindungsgemäß enthalten
die Expressionsvektoren Kontrollelemente für Transkription, Transkriptionsstart,
Transkriptionsende, mRNA-Prozessierung und Translation, die in den
erfindungsgemäß verwendeten
Expressionsystemen in aktiver Form vorliegen.
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Vorzugsweise
enthalten die Vektoren Sequenzen, die die Replikation der oben genannten
Nukleinsäuremolekäle erleichtern.
Besonders bevorzugt enthalten sie ferner Sequenzen, die die Integration
der Nukleinsäuresequenzen
in das Genom einer Wirtszelle erleichtern.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung entsprechen die Vektoren den am 23.12.1999 bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder
Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, in Form transformierter
E. coli-Stämme
nach dem Budapester Vertrag hinterlegten Vektoren mit den Zugriffsnummern
DSM 13222 und DSM 13221, die eine für hKv4.1
(im Vektor pcDNA3; DSM 13222) bzw. hKv4.2
(im Vektor pGEM HE; DSM 13221) kodierende Nukleinsäuresequenz
enthalten.
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Gegenstand
der Erfindung sind ferner Wirtszellen, die mit den genannten Vektoren,
die für
eine Kaliumkanaluntereinheit kodieren (vorzugsweise Kv4.1 oder Kv4.2),
transformiert sind. Besonders bevorzugt sind diese Wirtszellen CHO-Zellen
oder Xenopus Oozyten, es kommen aber auch andere Eukaryontenzellen
aus der Gruppe bestehend aus COS, HEK 293, NIH-3T3 in Frage, die
Erfindung ist aber nicht auf diese Zellen beschränkt. Von Bedeutung ist, daß die Promotor-
und/oder Enhancersequenzen auf die mit den Vektoren transformierten
Wirtszellen abgestimmt sind. Dadurch kann eine erhöhte Expression
der erfindungsgemäßen Polypeptide
sichergestellt werden.
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Ferner
ist eine Wirtszelle Gegenstand dieser Erfindung, die zusätzlich zu
einem der oben genannten Vektoren mit mindestens einem weiteren
Vektor transformiert ist, der vorzugsweise eine abweichende Nukleinsäuresequenz
enthält,
d. h. eine Sequenz, die z. B. für
eine andere Kaliumkanaluntereinheit aus der Gruppe bestehend aus
Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 kodiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform
enthält
die Wirtszelle Vektoren, die entweder für die Kaliumkanaluntereinheiten
Kv4.1 und Kv4.2 oder für
die Untereinheiten Kv4.1 und Kv4.3 oder die für Homologe, Derivate oder Fragmente
derselben kodieren. Ferner kommen auch oligo-/multicistronische
Expressionssysteme in Frage.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine Wirtszelle, die
einen funktionellen Kaliumkanal exprimiert, der Kaliumkanaluntereinheit
Kv4.1 (entweder als Homo- oder Heterotetramer und gegebenenfalls
zusammen mit Kv4.2 und oder Kv4.3) enthält. Vorzugsweise exprimiert
die Wirtszelle den funktionellen Kaliumkanal auf ihrer Oberfläche, es
ist aber ebenso möglich,
daß der
funktionelle Kaliumkanal in intrazellulären Membranen exprimiert wird.
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Erfindungsgemäß eingeschlossen
ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen,
die geeignet sind, die von den erfindungsgemäßen Wirtszellen exprimierten
Kaliumkanäle
zu öffnen,
zu schließen,
zu aktivieren, zu inaktivieren und/oder in ihren biophysikalischen
Eigenschaften zu verändern,
bei dem man
- (a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen
den Kaliumauswärtsstrom
mißt,
- (b) die Wirtszellen mit einer zu untersuchenden Substanz in
Kontakt bringt und
- (c) an den Wirtszellen erneut den Kaliumauswärtsstrom mißt,
wobei der Unterschied
zwischen den Kaliumauswärtsstrom
vor und nach Zugabe der Substanz die Aktivität der Substanz bestimmt. Dabei
ist die Aktivität
einer Substanz im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Kaliumkanäle zu öffnen, zu
schließen,
zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften
zu verändern umso
höher,
je niedriger die hinzuzusetzende Konzentration der Substanz ist,
um eine Änderung
der Kaliumauswärtsströme zu erreichen.
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Erfindungsgemäß wird eine
Substanz als öffnende
Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz bei einem Membranpotential,
bei dem ohne Zugabe der Substanz keine Kaliumauswärtsstrom
fließen, Kaliumauswärtzsstrome
fließen.
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Erfindungsgemäß wird eine
Substanz als eine aktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der
Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom verstärkt wird.
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Erfindungsgemäß wird eine
Substanz als eine inaktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach
Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom
vermindert wird, ohne daß der
Kaliumauswärtsstrom
vollständig
zum Erliegen kommt.
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Erfindungsgemäß wird eine
Substanz als eine verändernde
Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz biophysikalische
Eigenschaften des Kaliumkanals wie Spannungsabhängigkeit, Leitfähigkeit, Aktivierungszeitkonstanten,
Inaktivierungszeitkonstanten, Schaltverhalten, Offenzeiten oder
Geschlossenzeiten verändert
werden.
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Erfindungsgemäß wird eine
Substanz auch dann als eine verändernde
Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz die Zelloberflächenexpression
des Kaliumkanals verändert
wird. Eine Veränderung
der Zelloberflächenexpression
führt zu
einer Zunahme bzw. Abnahme der zu messenden Kaliumauswärtsströme.
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Änderungen
in der Spannungsabhängigkeit
der Aktivierung führen
erwartungsgemäß bei Testpotentialen,
die Kaliumauswärtsströme hervorrufen,
zu einer Stromzunahme oder Stromabnahme. Leitfähigkeitsänderungen führen ebenfalls zu einer Zu-
oder Abnahme der Kaliumauswärtsströme. Änderungen
der Aktivierungszeitkonstanten führen
zu einer Verlangsamung oder Beschleunigung der Aktivierung von Kaliumauswärtsströmen. Änderungen
der Inaktivierungszeikonstanten sowie des Schaltverhaltens können während eines
Testpulses zu einer Zunahme oder Abnahme der Auswärtsströme führen. Das
gleiche gilt, wenn die Offenzeiten oder Geschlossenzeiten der zu
messenden Kaliumkanäle
verändert
werden (B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Ausgabe
(1993), Sinauer Associates inc., Sunderland, Massachusetts, USA).
-
Besonders
bevorzugt exprimieren die verwendeten Wirtszellen die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle auf ihrer
Oberfläche.
Auf diese Weise können
die Substanzen dadurch identifiziert bzw. getestet werden, daß man den
Ausstrom von Ionen aus den Zellen durch den erfindungsgemäßen Kaliumkanal
mißt.
Das Ausströmen
von Ionen wird bevorzugt mit der "patch-clamp"-Methode (vgl. z. B. O. P. Hamill et
al., Pflügers
Arch. (1981) 85–100)
durch Anlegen depolarisierender Testpotentiale bestimmt.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die
erfindungsgemäßen Wirtszellen nach
dem Fachmann gut bekannten Methoden mit 86Rb-Ionen
zu beladen, die durch Kaliumkanäle
so gut wie Kaliumionen permeieren können. Die beladenen Zellen
können
in Gegenwart von zu testenden Substanzen kultiviert werden. Danach
kann der Einfluß der
Substanzen auf den 86Rb-Auswärtsstrom
der mit 86Rb beladenen Zellen mit dem Fachmann
bekannten Methoden gemessen werden (R. S. Rogowski et al., Mol.
Pharmacol. 50 (1996) 1167–1177).
-
Gegenstand
der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen
von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu
aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften
zu verändern,
bei dem man
- (a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen
das Membranpotential mißt,
- (b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- (c) an den Wirtszellen erneut das Membranpotential mißt,
wobei
der Unterschied zwischen dem Membranpotential vor und nach Zugabe
der Substanz die Aktivität
der Substanz bestimmt. Dabei ist die Aktivität einer Substanz im Hinblick
auf ihre Fähigkeit,
Kaliumkanäle
zu öffnen,
zu schließen,
zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften
zu verändern umso
höher,
je niedriger die einzusetzende Konzentration der Substanz ist, um
eine Änderung
des Membranpotentials zu erreichen.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die
erfindungsgemäßen Wirtszellen (insbesondere
solche die Kv4.1, Kv4.2 oder Kv4.3 homomultimere Kaliumkanäle bzw.
heteromultimere Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3-, oder Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3-Kaliumkanäle beliebiger
Stöchiometrie
nach dem Fachmann gut bekannten Methoden mit fluoreszierenden Membranpotential-sensitiven
Farbstoffen, wie z. B. DiBAC (Bis-Barbitursäureoxonol) Farbstoff (Molecular
Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), zu beladen. Die beladenen Zellen
können
in Mikrotiterplatten übertragen
werden. Mittels eines Bioassayreadergeräts (z. B. der Firma BMG LabTechnologies
GmbH, Hanns-Martin-Schleyer-Str. 10, 77656 Offenburg), kann dann
der Einfluß der
Substanzen auf die Kaliumkanalaktivität fluoreszenzspektroskopisch
mit dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden. Das Bioassayreadergerät mißt speziell
durch den Unterschied zwischen der Membranpotential-abhängigen Fluoreszenz
vor und nach Zugabe der Substanz. Wirkt die Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle, ändert sich
das Membranpotential und somit die Membranpotential-abhängige Fluoreszenz.
Daraus kann die Aktivität
der Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle bestimmt
werden.
-
Gegenstand
der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen
von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanä le zu öffnen, zu schließen, zu
aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften
zu verändern,
bei dem man
- a) in den erfindungsgemäßen Wirtszellen
das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom mißt,
- b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- c) das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom erneut mißt,
wobei
die Unterschiede zwischen sowohl dem Membranpotential als auch dem
Kaliumauswärtsstrom
vor und nach Zugabe der Substanz die Aktivität der Substanz bestimmt. Dabei
ist die Aktivität
einer Substanz im Hinblick auf ihre Fähigkeit, Kaliumkanäle zu öffnen, zu
schließen,
zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften
zu verändern
umso höher,
je niedriger die einzusetzende Konzentration der Substanz ist, um
eine Änderung
des Membranpotentials sowie des Kaliumauswärtsstromes zu erreichen.
-
Überraschenderweise
hat sich herausgestellt, daß die
Phosphorylierung der erfindungsgemäßen Kv4-Kanäle in Gewebekulturzellen durch
Proteinkinasen zu einer drastischen Veränderung der Amplitude der durch
Kv4-Kanäle
vermittelten transienten Auswärtsströme führt. Insofern
betrifft die Erfindung einerseits Wirtszellen, die phosphorylierte
Kaliumkanäle
enthalten sowie die Messung der Aktivität dieser Testkanäle zur Ermittlung
von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren. Gegenstand der Erfindung
ist daher auch ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen,
die Proteinkinasen aktivieren, bei dem man
- (a)
in den erfindungsgemäßen Wirtszellen,
die exprimierten Kv4-Kaliumkanäle durch
Aktivierung von Proteinkinasen phosphoryliert,
- (b) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten
Auswärtsströme mißt,
- (c) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- (d) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten
Auswärtsströme erneut
mißt,
wobei
die Substanz eine Proteinkinase aktivierende Substanz ist, wenn
sich die in (b) und (d) gemessene Amplitude durch Zugabe der Substanz
verändert.
-
Die
Phosphorylierung der Kaliumkanäle
erfolgt beispielsweise durch Proteinkinase A und C.
-
Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung werden ferner Antikörper zur
Verfügung
gestellt, die an das isolierte erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden.
Ferner werden Antikörper
zur Verfügung
gestellt, die an das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden,
wobei das Kaliumkanalprotein Bestandteil eines Kaliumkanales sind
und somit eine andere dreidimensional Struktur aufweisen können als
die isolierten erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine.
Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann allgemein
bekannt (E. Harlow und D. Lane, a. a. O.). Die Antikörper sind
erhältlich,
indem man Tiere mit dem erfindungsgemäßen Kaliumkanalprotein oder
Derivaten oder Fragmenten desselben mit gleicher elektrophysiologischer,
pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität immunisiert.
Polykonale Antikörper
werden dann aus dem Serum der Tiere gewonnen, während monoklonale Antikörper aus
dem Überstand
von Hybridomzellen erhältlich
sind. Hybridomzellen sind erhältlich,
indem man Antikörper
produzie rende Zellen mit Tumorzellen fusioniert (E. Harlow and D.
Lane, a. a. O.).
-
Die
Erfindung wird im folgenden durch Beispiele, Sequenzprotokolle und
Figuren verdeutlicht.
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1
-
- A) Nukleotid-Sequenz der humanen Kv4.1 cDNA
(SEQ ID NO: 1), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde.
Fettgedruckt ist das erste Startcondon ATG, mit dem der offene Leserahmen
startet, und das Stopcodon, mit dem der offene Leserahmen aufhört.
- B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) der humanen Kv4.1α-Untereinheit.
Die sechs hydrophoben, möglicherweise
membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende
Domäne
ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich
auf die jeweils letzte Aminosäure
in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o, , ☐,
und Δ zeigen
mögliche
Phosphorylierungsstellen für
Proteinkinase C, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase
II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).
-
2
-
- A) Nucleotid-Sequenz der humanen Kv4.2 cDNA
(SEQ ID NO: 3), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde wie
im 1. Fettgedruckt ist das erste Startcondon
ATG, mit dem der offene Leserahmen startet, und das Stopcodon, mit
dem der offene Leserahmen aufhört.
- B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 4) der humanen Kv4.2 α-Untereinheit.
Die sechs hydrophoben, möglicherweise
membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende
Domäne
ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich
auf die jeweils letzte Aminosäure
in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o, , ☐,
und Δ zeigen
mögliche
Phosphorylierungsstellen für
Proteinkinase C, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase
II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).
- C) Ähnlichkeit
der humanen (h)Kv4.2 Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4) zu Proteinsequenzen
anderer Mitglieder der humanen Kv4-Kaliumkanalfamilie (Kv4.1 (SEQ ID NO:
2) und Kv4.3. Es von Kv4.3 gibt es zwei Versionen. Gezeigt ist die
lange Version (hKv4.32), die im Vergleich zur kürzeren Version ein zusätzliches Exon
enthält,
das unterstrichen ist.
-
3
-
- A) Northern-Analyse der Expression humaner
Kv4.1 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der
jeweiligen Spur vermerkt. Die humane Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) wurde
als Hybridisierungssonde verwendet. Eine ca. 5 kb große Kv4.1
mRNA wurde mehr oder weniger in allen Geweben detektiert. Die RNA-Menge
in den einzelnen Bahnen wurde durch eine Hybridisierung mit einer
markierten β-Aktin
cDNA Probe kontrolliert.
- B) Northern-Analyse der Expression humaner Kv4.2 mRNA in verschiedenen
Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt.
Die humane Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3) wurde als Hybridisierungssonde
verwendet. Nur in mRNA aus Gehirn bzw. Gehirnregionen wurde eine
6.5 kb große
Kv4.2 mRNA detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde
durch eine Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe kontrolliert.
- C) Northern Analyse der Expression der Kv4.3 mRNA in verschiedenen
Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt.
Die humanen Kv4.3 cDNA (Nukleotide 1420–2644, Acc. AF120 491) wurde
als Hybridisierungssonde verwendet. In Gehirn, Herz, Placenta, Lunge,
Leber und Skelettmuskel wurde eine 8.5 kb große Kv4.3 mRNA detektiert. Die
RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch Hybridisierung mit
einer markierten β-Aktin
cDNA Probe überprüft.
-
4
-
Lokalisation des hKv4.1 Kaliumkanal-Gens,
KCND1, in der Region des humanen Chromosoms Xp11.23.
-
Links
ist eine schematische Karte der Xp11.1. bis Xp21-Region; rechts
ist die Lage bekannter polymorpher Marker im Vergleich zu KCND1
angegeben.
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5
-
Lokalisation des hKv4.2-Kaliumkanal-Gens,
KCND2, in der Region des humanen Chromosoms 7q31-32.
-
- A) Nachweis von KCND2 DNA in einem DNA-Panel
aus Nager/Mensch-Hybridzellinien.
Die DNA Proben des Panels wurden einer Polymerasekettenreaktion
unterzogen unter Verwendung KCND2-DNA spezifischer sense- und antisense
Primer (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9). Die amplifizierten DNA-Produkte
wurden in einem 1.5% Agarose-Gel separiert und mittels Ethidium-bromid-Färbung sichtbar
gemacht. Die Nummern oberhalb der Gelbahnen beziehen sich auf die
verschiedenen eingesetzten Hybridzellinien. Auf der linken Seite
sind Größemarkierungen
in kb DNA angegeben; auf der rechten Seite zeigt der Pfeil das erwartete
KCND2-Produkt von 3 bp an.
- B) Humaner Chromosomenbesatz der in A getesteten Nager/Mensch-Hybridzellinien.
Die Spalten beziehen sich auf die DNA, die in der jeweils darüber liegenden
Gelbahn getestet wurde. Die Chromosomen sind mit X angegeben; inkomplette
Chromosomen mit einem +– Zeichen.
Die beiden Sternchen zeigen an, in welchen Bahnen ein amplifiziertes
KCND2-Produkt gefunden wurde. Daraus geht hervor, daß das KCND2-Gen
auf Chromosome 7 lokalisiert ist.
- C) Chromosomale Lokalisierung bei 7q31-32 mit einer FISH-Analyse
von Metaphase-Chromosomen. Verwendet wurde eine biotinylierte KCND2-Sonde.
-
6
-
Genomische Struktur der Gene KCND1, KCND2,
KCND3.
-
Die
schwarzen Kästchen
entsprechen Exonen der offenen Leserahmen. Exone 1 enthalten auch 5'-nichtranslierte
Sequenzen, schematisch als weiße
Kästchen
dargestellt; dgl. enthalten Exone 6 jeweils 3'-nichttranslatierte
Sequenzen. Graue Balken entsprechen Intronsequenzen.
-
7
-
Nukleotid-Sequenzen des humanen KCND1-Gens.
-
Kodierende
Bereiche sind durch Großbuchstaben,
nichtkodierende Bereiche (d. h. Introne bzw. 5' und 3' nichttranslatierte Regionen) sind durch
Kleinbuchstaben gekennzeichnet.
- A) Nukleotid-Sequenz
des Exons 1 des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 5). Das Startkodon
ist durch Fettdruck hervorgehoben.
- B) Nukleotid-Sequenz der Exone 2–5 sowie der angrenzenden Introne
des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 6).
- C) Nukleotid-Sequenz der Exone 6 des humanen KCND1-Gens (SEQ
ID NO: 7). Das Stopkodon ist durch Fettdruck hervorgehoben.
-
8
-
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.1
Kanälen,
die durch transiente Expression von hKv4.1 α-Untereinheiten in HEK293-Zellen
gebildet wurden.
-
Auswärtsströme gemessen
mit der "patch-clamp"-Methode an mit hKv4.1-cDNA (SEQ ID NO:
1) transient transfizierten HEK 293 Zellen. Das Haltepotential war
bei –100
mV, das Testpotential bei +40 mV. Die mittlere Stromdichte betrug
60 ± 20
pA/pF.
-
An
der beispielhaft gezeigten Stromkurve der hKv4.1 vermittelten Auswärtsströme wurde
bezüglich der
Inaktivierung Zeitkonstanten τ angepaßt nach
dem Fachmann gut bekannten Verfahren. Der zeitliche Verlauf der
Inaktivierung bei +40 mV ließ sich
durch zwei Zeitkonstanten (τh,1 bzw. τh,2) gut beschreiben (τh,1 =
31.9 ± 3.5; τh,2 =
354 ± 36).
Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler von in vierzehn
Experimenten durchgeführten
Messungen. Das Amplitudenverhältnis
von τh,1 und τh,2 zueinander ist 3:1 (76% zu 24%).
-
9
-
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.2-Kanälen, die
durch transiente Expression von hKv4.2 α-Untereinheiten in HEK 293-Zellen
gebildet wurden.
-
- A) Auswärtsströme gemessen
mit der "patch-clamp"-Methode an hKv4.2-cDNA
(SEQ ID NO: 3) transient transfizierten HEK 293 Zellen.
- B) Auftragung normalisierter Leitfähigkeiten (G/Gmax, Ordina te)
für human
Kv4.2-Ströme
gegen das im Test vorhandene Membranpotential (Abzisse). Jeder Punkt
stellt den Mittelwert ± Standardfehler
von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die durchgezogene
Linie stellt die Ausgleichskurve gemäß der Boltzmann-Gleichung mit
V0.5 = –3.2 ± 1.5 mV
dar.
- C) Auftragung der Aktivierungszeitkonstanten τm in
ms für
humane Kv4.2-Ströme
gemessen in Abhängigkeit
vom im Text vorhandenen Membranpotential in mV. Die Messungen wurden
wie in A durchgeführt.
Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs
Experimenten durchgeführten
Messungen dar.
- D) Auftragung der Inaktivierungszeitkonstanten τh,1 und τh,2 in
ms für
humane Kv4.2-Ströme
gemessen in Abhängigkeit
vom im Test vorhandenen Membranpotential in mV. Den wie in A gemessenen
Stromverläufe wurden
zwei Inaktivierungszeitkonstanten angepaßt. Jeder Punkt stellt den
Mittelwert ± Standardfehler
von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar.
- E) Spannungsabhängigkeit
der Inaktivierung der humanen Kv4.2-Ströme
vom Vorpulspotential. Datenpunkte entsprechen den gemessenen Stromamplituden
bei +60 mV nach einem 500 ms langen Vorpuls bei dem angegebenen
Vorpulspotential. Dieses wurde in 5 mV Schritten zwischen –90 und –15 mV variiert.
Den Datenpunkten wurde eine Boltzmann-Gleichung angepaßt. Jeder
Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler
von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die gemessenen
Peak-Amplituden (I) wurden normalisiert, bezogen auf die bei +60
mV gemessenen maximale Peak-Amplitude (Imax),
die mit einem Vorpuls von –90
mV erhalten wurde.
- F) Erholung der inaktivierten humanen Kv4.2 Ströme. Die
Erholungsphase wurde mit gepaarten 500 ms langen Test pulsen bei
+60 mV gemessen, die unterbrochen wurden durch einen Zwischenpuls
unterschiedlicher Dauer bei –100
mV. Die Dauer des Zwischenpulses variierte zwischen 10 ms und 600
ms. Io entspricht der Peak-Amplitude, die
gemessen wurde mit einem +60 mV Testpuls nach einer Erholungsphase
von 15 s bei –100
mV. Die anderen gemessenen Peakamplituden, die mit kürzeren Zwischen
Pulsen erhalten wurden, wurden darauf normalisiert (I/Io).
Die an die Datenpunkte angepaßte
Linie entspricht einer mono-exponentiellen Funktion mit einer Zeitkonstante τrec von
118.3 ± 5.3
ms und wurde von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen erhalten.
-
10
-
Inhibierung von humanen Kv4.2-Strömen nach
Applikation von Wirkstoffen.
-
Die
transienten Auswärtsströme wurden
mit der "patch-clamp"-Methode wie in 4 an
hKv4.2-cDNA (SEQ ID NO: 3) transient transfizierten HEK 293 Zellen
gemessen mit einem Haltepotential von –100 mV und 500 ms langen Testpotentialen
bei +40 mV. Nach der Registrierung eines transienten Auswärtsstroms
(Kontrolle) wurde die in der Meßkammer
befindliche Badlösung
mit dem angegebenen Kaliumkanalblocker bzw. Wirkstoff in der angegebenen
Konzentration für
15 min. perfundiert. Danach wurde eine zweite Stromregistrierung
durchgeführt.
4-AP = 4-Aminopyridin; TEA = Tetraethylammonium.
-
Beispiele
-
Die
Abkürzungen "M" und "mM" stehen
für die
Einheiten mol/l bzw. mmol/l.
-
Beispiel 1: Isolierung von Klonen aus
humanen cDNA-Bibliotheken und Polymerasekettenreaktion.
-
1·106 Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek
(Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver,
5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL,
Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die
genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV
Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung
der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma),
1% SDS, 100 μg/ml
denaturierte Heringssperm-DNA, in H2O und
mit 32P-markierter Maus Kv4.1 (M. D. Pak
et al., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 4386–4390) als Probe. Diese Hybridisierung
wurde bei 60°C
für 18
Stunden durchgeführt.
Die Filter wurden anschließend
mit 0.1 × SET/0.1%
SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl,
pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200
verdünnt)
gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen
(Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden
Plaques auf den Platten zugeordnet.
-
Es
wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2800 bp lange
hKv4.1 cDNA enthielt. Das Insert des Phagen wurde mittels der Phagen-spezifischen
Primer 5'-GACTCCTGGAGCCCG-3' (5'Insert screening amplimer,
(Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 10) und 5'-GGTAGCGACCGGCGC-3' (3'Insert
screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 11) ansequenziert
und anschließend
mittels PCR unter der Verwendung Insert(hKv4.1)-spezifischer Primer
amplifiziert. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt:
30 Reaktionszyklen mit PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla,
CA) bestehend aus 95°C – 30 sec, 55°C – 30 sec.
und 72°C – 2 min.
Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt
5'-AGCCCCCAC CATCCTGGAGA-3' (h41-1; SEQ ID NO:
12) und als "Antisense-Primer" 5'-CTGGGGGCCCAGCAGAGGAC-3' (h41-2; SEQ ID NO: 13).
Das resultierende hKv4.1 PCR cDNA-Fragment war 2711 bp lang und
enthielt den kompletten offenen Leserahmen der hKv4.1 cDNA sowie
80 bp 5' UTR und
687 bp 3' UTR. Dieses
Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch isoliert.
-
Beispiel 2: Isolierung von Klonen aus
humanen genomischen DNA-Bibliotheken
-
1·106 Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7
Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit 32P-markierter
humaner Kv4.1 cDNA als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden
durchgeführt.
Die Filter wurden anschließend
mit 0.1 × SET/0.1%
SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL, pH
7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200
verdünnt)
gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen
(Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden
Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein Phagenklon wurde durch
eine Hybridisierung, durchgeführt
wie oben, identifiziert. Durch direkte Sequenzierung der Phagen-DNA
zeigte sich, daß dieser
Phage die komplette kodierende Sequenz des KCND1-Gens enthielt.
(SEQ ID NO: 5, 6, 7).
-
Beispiel 3: DNA-Sequenzierung
-
Das
hKv4.1 PCR cDNA Fragment wurde mit Bsp120I (MBI fermentas) geschnitten
und in die in die EcoRV/Bsp120I-Schnittstellen des pcDNA3 Vektors
(Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die hKv4.1 cDNA wurde dann
unter Verwendung des BigDye terminator cycle sequencing kits (Perkin
Elmer, XY) sequenziert. Die Sequenzreaktionen wurden anschließend auf
automatischen Sequenzierern (ABI 377 or Prism 310 automated sequencer
(Perkin Elmer, XY)) analysiert. Das Plasmid-spezifische Oligonukleotid
T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14) sowie hKv4.1-spezifische
Oligonukleotide (h41-1–h41-7
(SEQ IDs NO: 12, 13, 15–19) wurden
für die Sequenzierungen
als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo
Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A+ mRNA
aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und
Pankreas. Die hKv4.1 cDNA wurde 32P-markiert
(T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde
verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll
400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20. g/l Polyvinylpyrolidon (Merck),
1:10 verdünnt),
1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H2O) bei 42°C
24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander
in Waschlösung
1 (2 × SSC
(20 × SSC:
173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma,
für 2 × SSC 1:10
verdünnt));
0.1% SDS; in H2O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200
verdünnt;
0.1% SDS; in 1120) bei 50°C gewaschen.
Nach dem Waschen erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen
(Kodak, Rochester, N. Y.) bei –70°C. Der gleiche
Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde
mit einer 32P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide
1430–2644;
GenBank Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen
hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.
-
Beispiel 4: Humane chromosomale Lokalisation
des KCND1 Gens
-
Das
Genebridge 4 Hybridzellpanel (bezogen durch Research Genetics, Huntsville,
AL) wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion unter der Verwendung
KCND1-spezifischer Oligonukleotide untersucht. Die PCR Reaktionen
wurden mit 25 ng DNA von jedem der 93 Hybridklone und mit humaner
sowie genomischer DNA vom Hamster als Kontrollen durchgeführt. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt
5'-GACTTGGAAGAATACGCTGGAC-3' (h41-3; SEQ ID NO:
15) und als "Antisense-Primer" 5'-TCATGACACTCCGCAGGAAGC-3' '(h41-8; SEQ ID NO: 20) Die PCR-Bedingungen
waren 5 min 95°C
1 Zyklus; 45 sec 95°C,
1 min 59°C,
1 min 72°C
für 30
Zyklen; 10 min 72°C
1 Zyklus; Taq Polymerase (GibcoBRL,). Die Ergebnisse der PCR wurden durch
den "Radiation Hybrid
Mapping Server" am
Whitehead Institute (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)
analysiert. Für
die Analyse wurde ein LOD-score von 15 gewählt.
-
Beispiel 5: Funktionelle Expression und
elektrophysiologische Technik
-
Das
hKv4.1 PCR-Fragment (SEQ ID NO: 1) wurde in den dem Fachmann gut
bekannten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie
oben ausgeführt
einkloniert. Insgesamt 2 μg
Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.1) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen
mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und
Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM
1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM
1-Medium mit 6.4 μl
DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei
RT für
45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde.
2·105 HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden
zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit
diesem Lipid-DNA-Komplex
auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden
bei 37°C
in einem Inkubator unter 5% CO2 wurde die
Lösung
durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere
12–24
Stunden bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurden
5·104 Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen
Messungen umgesetzt.
-
Auswärtsströme wurden
24–48
Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der
patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen.
Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments,
Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen
2–3 MΩ nach der
Füllung
mit der intrazellulären
Lösung
(95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl2,
1 mM, MgCl2, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2
mM Glutathion, 2 mM Na2ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen
Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135
mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM Glucose, 20 mM Sucrose,
pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma) bei Raumtemperatur auf einem
Haltepotential von –100
mV gehalten. Die bei positiveren Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden
mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker
(HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut
bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt,
DE) wurde für
die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.
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Beispiel 6: Isolierung von Klonen aus
humanen cDNA-Bibliotheken.
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1·106 Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek
(Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver,
5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL,
Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die
genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV
Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung
der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma),
1% SDS, 100 μg/ml
denaturierte Heringssperm-DNA, in H2O und
mit 32P-markierter Ratte Kv4.2 cDNA (T.
J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als Probe. Diese Hybridisierung
wurde bei 60°C
für 18
Stunden durchgeführt.
Die Filter wurden anschließend
mit 0.1 × SET/0.1%
SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl,
pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200
verdünnt)
gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen
(Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden
Plaques auf den Platten zugeordnet.
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Es
wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2500 bp lange
hKv4.2 cDNA enthielt. DNA des Phagen wurde mit EcoRI verdaut. Das
hKv4.2 EcoRI cDNA-Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch
isoliert.
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Beispiel 7: Isolierung von Klonen aus
humanen genomischen DNA-Bibliotheken
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1·106 Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7
Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit 32p-markierter
Ratte Kv4.2 cDNA (T. J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als
Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die
Filter wurden anschließend
mit 0.1 × SET/0.1%
SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL,
pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200
verdünnt)
gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen
(Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden
Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein DNA-Fragment wurde durch
eine Hybridisierung, durchgeführt
wie oben, identifiziert. Dies war ein 1.0 kb BamHI/XbaI Fragment.
Die Sequenzierung des Fragments zeigte, daß es nur einen Teil der kodierenden
Region enthielt, der den Aminosäuren
1 bis 218 des abgeleiteten offenen hKv4.2 Leserahmens entspricht
(SEQ ID NO: 21).
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Beispiel 8: DNA-Sequenzierung
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Das
EcoRI-hKv4.2 cDNA Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstellen des
Bluescript Vektors (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Die hKv4.2
cDNA wurde dann nach der Methode von Sanger et al., (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74 (1977) 5463–5467)
mit T7-DNA Polymerase (Sequenase, US Biochemicals, Cleveland, Ohio)
sequenziert. Plasmid-spezifische Oligonukleotide M13, Reverse, T3
und T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14, 22–24) wurden
für die
Sequenzierungen als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN)
blot (Clontech, Palo Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A+ mRNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber,
Skelettmuskel, Niere und Pankreas. Die hKv4.2 cDNA wurde 32P-markiert
(T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde
verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll
400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20 g/l Polyvinylpyroli don (Merck),
1:10 verdünnt),
1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H2O) bei 42°C
24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander
in Waschlösung
1 (2 × SSC
(20 × SSC:
173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma,
für 2 × SSC 1:10
verdünnt));
0.1% SDS; in H2O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200
verdünnt;
0.1% SDS; in H2O) bei 50°C gewaschen. Nach dem Waschen
erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester,
N. Y.) bei –70°C. Der gleiche
Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde
mit einer 32P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide
1430–2644;
EMBL Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen
hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.
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Beispiel 9: Polymerasekettenreaktion
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Der
hKv4.2 cDNA-Phagenklon wurde mit EcoRI verdaut. Das EcoRI-Fragment wurde in
die Polylinker-Region des EcoRI-linearisierten Expressionsvektor
pcDNA3 (Invitrogene, Carlsbad, CA) einkloniert, um pcDNA3-hKv4.2
zu erhalten. Dieser wurde in einer Polymerasekettenreaktion (PCR)
als Matrize verwendet, um eine Kozak-Sequenz (5'-CCACC-3', SEQ ID NO: 25) vor das Startcodon
des hKv4.2 offenen Leserahmens einzubauen und gleichzeitig den nicht-kodierenden
5'-Bereich der hKv4.2
cDNA zu verkürzen.
Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt: 20 Reaktionszyklen
mit Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA) bestehend aus
94°C – 1 min,
50°C – 30 sec.
und 72°C – 30 sec.
Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-ATTAAGCTTCCACCATGGCGGCGGGGGTGGCAGCG-3
(h42koz; SEQ ID NO: 26) und als "Antisense-Primer" 5'-ACATAGTAGAACACCAGGGCC-3' (h423; SEQ ID NO: 28). Der h42koz-Primer
enthielt eine Schnittstelle für
das Restriktionsenzym Hind III vor der Kozak-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 25). Das
PCR Reaktionsprodukt war 673 bp lang und entsprach der hKv4.2 cDNA
Sequenz von Nukleotid 340 bis 399 (SEQ ID NO: 3) und 14 zusätzliche
Basenpaare, die dem eingesetzten Primer h42koz entsprachen. Das
PCR-Produkt wurde mit HINDIII und BstXl geschnitten. Letzteres Restriktions enzym
erkennt eine Schnittstelle in der hKv4.2 cDNA Sequenz bei Nukleotiden
971–980
(SEQ ID NO: 3). Parallel wurde pcDNA3-hKv4.2 mit HindIII und BstXl
verdaut, wodurch die ersten 980 Basenpaare der einklonierten hKv4.2
cDNA eliminiert wurden. Mit der verdauten pcDNA3-hKv4.2 wurde das
HINDIII/BstXl PCR Fragment mit Hilfe von T4-DNA Ligase (MBI Fermentas,
Buffalo, NY) ligiert und der Klon pcDNA3-hKv4.2koz wurde erhalten.
Die hKv4.2koz Sequenz (SEQ ID NO: 26) wurde durch Sequenzierung
verifiziert.
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Beispiel 10: Humane chromosomale Lokalisation
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Primer
hg427 (SEQ ID NO: 8) und hg428 (SEQ ID NO: 9) wurden in PCRs eingesetzt
zur Amplifizierung der genomischen KCND2-DNA. Als Matrize wurde
ein DNA Panel aus Nager/Mensch-Hybridzellininen verwendet (Firma)
und Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA). Die Reaktionsbedingungen
waren 35 Zyklen mit 92°C – 2 min.,
50°C – 30 sec.,
72°C – 20 sec.
Ein 12 kb langer humaner genomischer λDNA-Klon, der den kodierenden
Bereich für
Aminosäuren
1–211
der hKv4.2 α-Untereinheit
enthielt, wurde mit Biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim) markiert
und dann für
eine FISH-Analyse als Sonde verwendet. Die FISH-Analyse erfolgte
nach der von P. Lichter et al., PNAS USA 85 (1988) 9664–9668 und
C. Fonatsch et al., Int. J. Cancer 26 (1980) 749–754 beschriebenen Methode.
Die Signale wurden mit Fluoreszenz-Isothiozyanat gekoppeltem Avidin-DCSR (Vector
Laboratories) detektiert und die Lokalisierung der Signale in Metaphase-Chromosomen
wurde mit Hilfe eines konfocalen Laser Scanning Mikroskops (C. Zeiss,
LSM 410, Germany) durchgeführt.
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Beispiel 11: Funktionelle Expression und
elektrophysiologische Technik
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Das
DNA-Fragment (SEQ ID NO: 3) wurde in den dem Fachmann gut bekannten
Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie oben ausgeführt einkloniert.
Insgesamt 2 μg
Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.2koz) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen
mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und
Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM
1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM
1-Medium mit 6.4 μl
DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei
RT für
45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde.
2·105 HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden
zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit
diesem Lipid-DNA-Komplex
auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden
bei 37°C
in einem Inkubator unter 5% CO2 wurde die
Lösung
durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere
12–24
Stunden bei 37°C
inkubiert. Anschließend
wurden 5·104 Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen
Messungen umgesetzt.
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Auswärtsströme wurden
24–48
Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der
patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen.
Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments,
Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen
2–3 MΩ nach der
Füllung
mit der intrazellulären
Lösung
(95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl2,
1 mM, MgCl2, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2
mM Glutathion, 2 mM Na2 ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen
Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135
mM NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2,
5 HEPES, 10 Glucose, 20 Sucrose, pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma)
bei Raumtemperatur auf einem Haltepotential von –100 mV gehalten. Die bei positiveren
Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden
mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker
(HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut
bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE)
wurde für
die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.
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