DE19963612B4

DE19963612B4 - Neue spannungsabhängige Kaliumkanäle aus der Kv4-Familie sowie deren Verwendung zur Entwicklung von Therapeutika

Info

Publication number: DE19963612B4
Application number: DE19963612A
Authority: DE
Inventors: Olaf Prof. Dr. Pongs
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 1999-12-29
Filing date: 1999-12-29
Publication date: 2009-07-02
Anticipated expiration: 2019-12-30
Also published as: DE19963612A1

Abstract

Kaliumkanalprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es Kv4.1 ist, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue Untereinheiten humaner spannungsabhängiger Kaliumkanäle, insbesondere hKv4.1. Ferner werden im Rahmen der Erfindung Vektoren zur Verfügung gestellt, die hKv4.1 bzw. .2 enthalten, sowie diese Vektoren enthaltende Wirtszellen, die die Kaliumkanaluntereinheiten bzw. die Kaliumkanluntereinheiten enthaltenden Kaliumkanäle exprimieren. Gegenstand der Erfindung sind ferner gegen die Kaliumkanaluntereinheiten gerichtete Antikörper. Ferner wird ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen zur Verfügung gestellt die Kv4.1-Kaliumkanäle öffnen, schließen, aktivieren, inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften verändern können. Das Verfahren kann zur Spezifikation von Antiarrhytmika bzw. zum Auffinden und Identifizieren von Therapeutika zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, zur Verbesserung des Lernvermögens und von Gedächtnisleistungen und zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet werden.
Die Membranen von Säugetierzellen sind für die strukturelle Integrität und die Aktivität von Zellen und Gewebe von großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Stoffwechselprozessen wird von membrandurchspannenden Ionenkanälen gesteuert. In der Vergangenheit konnten verschiedene Innenkanäle identifiziert werden, durch die Kalzium, Natrium und/oder Kalium die Zellmembran passieren können.
Die Aktivität von Kaliumkanälen kann entweder durch intrazelluläre Signalstoffe wie cAMP oder durch Potentialdifferenzen an der Zellmembran reguliert werden. Diese Potentialdifferenzen oder Spannungen kommen durch unterschiedliche Innenkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle zustande.
Spannungsabhängige Kaliumkanäle sind in Abhängigkeit des über die Zellmembran vorliegenden Potentials geöffnet oder geschlossen. Es sind verschiedene Klassen von spannungsabhängigen Kaliumkanälen bekannt, deren Aufbau in der Regel ähnlich ist. Grundsätzlich bestehen sie aus vier homologen α-Untereinheiten. Die α-Untereinheiten gehören zu einer gemeinsamen Gensuperfamilie. Sie besitzen eine vergleichbare zweidimensionale Struktur, aus der eine für Kaliumkanäle typische Membrantopologie hervorgeht (O. Pongs, Physiol. Rev. 72 (1992) S69–88; L. Y. Jan et al., Nature 371 (1994) 119–122; K. G. Chandy et al., in Handbook of Receptors and Channels ed. R. A. North, Boca Raton 1 (1994) 1–71; O. Pongs, FERS Lett. 452 (1999) 31–35). Jede α-Untereinheit besitzt sechs hydrophobe Membran-durchspannende Segmente S1–S6. Zwischen S5 und S6 liegt die sogenannte P-Region, die von der extrazellulären Seite in die Membran eintaucht. Die P-Region hat einen entscheidenden Anteil an der Ausbildung der Kaliumkanalpore. Das S4-Segment enthält mehrere Aminosäuren mit positiven Ladungen, die wahrscheinlich für die Spannungsempfindlichkeit des Kanals einen wesentlichen Beitrag liefern. Zusätzlich können spannungsabhängige Kaliumkanäle auch β-Untereinheiten enthalten. Die β-Untereinheiten sind für die Regulation der Aktivität des Kanals von Bedeutung, während die α-Untereinheiten den eigentli chen funktionellen Kaliumkanal bilden (O. Pongs, Biospektrum 3 (1997) 21–26).
Die Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanaluntereinheiten läßt sich in mehrere Unterfamilien unterteilen, von denen die Kv1- bis Kv4-Familien gut charakterisiert sind (W. Stühmer et al., EMBO J. 8 (1989) 3235–3244; B. Albrecht et al., Receptor and Channel 1 (1993) 99–199; J. Rettig et al., EMBO J. 11 (1992) 2473–2486; Serodio et al., J. Neurophysiol. 75 (1996) 2174–2179). Innerhalb der Unterfamilien liegt die Sequenzidentität der einzelnen α-Untereinheiten untereinander auf der Ebene der Aminosäuren bei ≥ 60%. Die bisher klonierten α-Untereinheiten der Familien Kv1 bis Kv4 exprimieren funktionelle Kaliumkanäle in heterologen Expressionssystemen, d. h. nach Injektion von DNA und mRNA in Xenopus Oozyten bzw. in Gewebekulturzellen (z. B. Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen, Human Epithelial Kidney (HEK) 293 Zellen) oder nach Transfektion von Gewebekulturzellen mit für α-Untereinheiten kodierender DNA in geeigneten Expressionsvektoren wie pcDNA3 (s. u.).
Dilks et al. (The Journal of Neurophysiology 1999, 81, 1974–7) beschreibt die Expression der menschlichen Kaliumkanalproteine "hKv4.3 long" und "hKv4.3 short" in Xenopus Oocyten.
Die Datenbankeinträge AAD22053 und AAC05122 geben die Sequenzen für Kv4.2 und Kv4.3 an.
Kong et al. (AJP – Heart and Circulatory Physiology 1998, 275 (6), H1963–H1970) offenbart die Heteromultimerisierung von Kaliumkanalproteinuntereinheiten. Xu et al. (J. Biol. Chem. 1995, 270 (42) 24761–8) beschreibt, dass Mitglieder der Kv4(Shal)-Unterfamilie Tetramere ausbilden.
Zusätzlich zu α-Untereinheiten von Kv1 bis Kv4 sind noch weitere potentielle Kvα-Untereinheiten bekannt (M. A. Post et al., FEBS 399 (1996) 177–182; J. P. Hugnot et al., EMBO 15 (1996) 3322–3331; A. Castellano et al., J. Neurosci. 17 (1997) 4652–4661; J. A. Drewe et al., J. Neurosci. 12 (1992) 538–548), die zu Kv1 bis Kv4 bezogen auf die Aminosäuren eine Sequenzidentität von < 60% zeigen. Diese Kanäle wurden als Kv5.1, Kv6.1, Kv7.1, Kv8.1 bezeichnet. Hauptmerkmal dieser α-Untereinheiten ist, daß sie zwar für Kaliumkanal α-Untereinheiten typische Sequenzmerkmale enthalten, aber als Homomultimere keine funktionellen Kanäle in heterologen Expressionsystem ausbilden.
Spannungsabhängige Kaliumkanäle können vielfältige physiologische Aufgaben übernehmen, die von der Regulation des Membranruhepotentials bis hin zur Regulation der Exozytose und Zellproliferation reichen. In erregbaren Zellen haben spannungsabhängige Kaliumkanäle eine wichtige Bedeutung für die Repolarisation der Aktionspotentiale und die Regulation des Schwellenwertes, von dem aus ein Aktionspotential ausgelöst werden kann. Insofern steuert die Aktivität von Kaliumkanälen sowohl die Dauer und Verlaufsform des Aktionspotentials als auch die Aktionspotentialauslösungsfrequenz. Dies gilt auch für die rhythmische Erzeugung von Aktionspotentialen im Herzmuskelgewebe, dem Myocard (R. E. Ten Eick et al., FASEB J. 6 (1992) 2568–2580).
Mehrere distinkte Kaliumkanaltypen sind an der Generierung und Repolarisierung der Aktionspotentiale im Myocard beteiligt. An der Repolarisierung sind Kv-Kanäle beteiligt, die insbesondere die Ströme I_to, I_KR und I_SK vermitteln. I_to ist ein schnell aktivierender transienter Kaliumauswärtsstrom, I_KR ist ein schnell aktivierender, nicht-inaktivierender Kaliumauswärtsstrom, I_SK ist ein langsam aktivierender Kaliumauswärtsstrom. Diese Ströme wurden an dissoziierten, in Kultur gehaltenen Myocardzellen gemessen (R. C. Kass und L. C. Freeman, Trends Cardiovasc. Med. 3 (1993) 149–159; D. M. Barry und J. M. Nerbonne, Ann. Rev. Physiol. 58 (1996) 363–394). Die Analyse von erblichen Herzrhythmusstörungen, die zu einem langen QT-Syndrom, d. h. einer verzögerten Repolarisierung des kardiakalen Aktionspotentials, führen, hat gezeigt, daß der I_SK-Strom im wesentlichen durch die Kv-Kanäle KCNQ1/KCNE1 vermittelt wird (M. C. Sanguinetti et al., Nature 384 (1996) 80–83; J. Berhanin et al., Nature 384 (1996) 78–80; C. Chouabe et al., EMBO J. 16 (1997) 5472–5479). Der I_KR-Strom wird durch die Kv-Kanäle KCNH2/KCNE2 Kv-Kanäle vermittelt, die zur Nachhyperpolarisierung und damit zur Stabilisierung des Schwellenwertes beitragen (P. L. Smith et al., Nature 379 (1996) 833–836; 1998; G. W. Abbott et al., Cell 97 (1999) 175–187).
Pharmakologisch ist es möglich, KCNN1/KCNE2 Kanäle relativ spezifisch durch Pharmaka wie E-4031 zu blockieren (P. S. Spector et al., Circ Res. 78 (1996) 499–503).
In Nagern sind Kanäle des hier beschriebenen Typus, Kv4.2, an der Ausbildung des I_to beteiligt (D. C. Johns et al., J. Biological. Chem. 272 (1997) 31598–31603; D. M. Barry et al., Circ. Res. 83 (1998); T. Y. Nakamura et al., Am. J. Physiol. 273 (1997) 1775–1786). Für das humane Herz wird hingegen angenommen, daß Kv-Kanäle des Typus Kv4.3 (W. Kong et al., Am. J. Physiol. 275 (1998) H1963–H1970) zum I_to vermitteln (Kääb et al., Circ. Res. 98 (1998) 1383–1393) während Kv4.2 keine wesentliche Rolle zu spielen scheint (J. E. Dixon et al., Circ. Res. 79 (1996) 659–668; diese Schrift).
Herzrhythmusstörungen werden gegenwärtig häufig mit Ionenkanalblockern behandelt. Die Wirkungsweise dieser Blocker läßt sich dahingehend klassifizieren, ob sie die Depolarisierungsgeschwindigkeit (Anstieg) des kardiakalen Aktionspotentials verzögern (z. B. Flecainid, Phenytoin) bzw. die Dauer des kardiakalen Aktionspotentials verlängern (z. B. Sotalol, Aminodaron, Chinidin, Disopyramid) (T. J. Colatsky in Potassium Channel Modulators (Herausgeber A. H. Weston and T. C. Hamilton) (1992) Blackwell Scientific Publ.; Oxford; pp. 304–340).
Bei der Behandlung von Herzrhythmusstörungen spielen Antiarrhythmika klinisch eine wichtige Rolle. Die Klassifizierung der Antiarrhythmika erfolgt in vier Klassen, wobei zu Klasse I z. B. Flecainid und Chinidin gezählt werden. Diese Substanzen blockieren zum einem den Natriumkanal und verzögern damit den Anstieg des Aktionspotentials, zum anderen wirken sie aber auch auf Kaliumkanäle, insbesondere solche die an der Ausbildung des I_to beteiligt sind.
Die Verabreichung von Antiarrhythmika ist häufig mit erheblichen Nachteilen für den Patienten verbunden, die sich bei den Patienten im Auftreten von Kopfschmerzen, Schwindel, Augenflimmern oder Magen-Darmstörungen manifestieren können (J. Braun und R. Preuss. Klinikleitfaden Intensivmedizin, 2. Auflage, Jung Johann Verlagsgesellschaft, Neckarsulm/Stuttgart (1992)). Bei älteren Patienten kommen häufig hypotone Kreislaufstörungen vor. Bei stark vorgeschädigtem Myokard könne unerwünschte Beeinträchtigungen der Erregungsleitung im HIS-Purkinje-System und der Myokardkontraktilität auftreten (P. Vigreux et al., Therapie 50 (1995) 413–418; P. J. Podrid und J. L. Anderson, Am. J. Cardiol. 15 (-1996) 430–434; E. Aliot und I. Denjoy, Am. J. Cardiol. 77 (1996) 66A–71A).
Aufgrund der Nebenwirkungen von Flecainid und anderen im Stand der Technik bekannten Antiarrhythmika wird ständig nach neuen Wirkstoffen gesucht. Das gezielte Screening nach neuen Antiarrhythmika erfolgt in der Pharma-Industrie bislang in der Regel mit Hilfe relativ aufwendiger Organ- bzw. Gewebepräparate. Dabei wird z. B. die Funktion eines isolierten Kaninchenherzens unter entweder einem konstanten Druck oder einem konstanten Fluß gemessen (A. von Bethmann et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153 (1996) A529).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein neues Testsystem (Assay) zur Verfügung zu stellen, das geeignet ist, Stoffe auf ihre Eignung als Antiarrhythmika zu testen, d. h. mit dem getestet werden kann, ob Wirkstoffe spezifisch die für I_to-Ströme verantwortlichen Kanäle beeinflussen. Mit dem Testsystem sollen Pharmaka somit auf ihre Wirkung gegenüber I_to-Strömen überprüft werden können. Insbesondere soll das Testsystem geeignet sein, Wirkstoffe zu identifizieren, die wenig oder gar nicht mit den Kanälen interagieren, die I_to-Ströme leiten und somit die bei den bislang bekannten Antiarrhythmika beobachteten Nebenwirkungen nicht aufweisen. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Assay zur Verfügung zu stellen, der den bislang notwendigen Einsatz von Organkulturen überflüssig macht oder zumindest stark einschränkt.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Wirtszellen gelöst, die den spannungsabhängigen Kaliumkanal Kv4.1, Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3, oder Kv4.1/4.2/4.3 exprimieren, d. h. einen Kaliumkanal, der aus vier Untereinheiten besteht, wobei die Untereinheiten aus der Gruppe bestehend aus Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 ausgewählt sind.
Gemäß der hier gewählten Terminologie handelt es sich bei dem mit "Kv4.1" bezeichneten Kaliumkanal somit um ein Homotetramer bestehend aus vier Kv4.1-Kaliumkanaluntereinheiten. Mit "Kv4.1/Kv4.2" wird beispielsweise ein Kaliumkanal bezeichnet, der aus den Untereinheiten Kv4.1 und Kv4.2 besteht, die ein Heterotetramer bilden, wobei alle denkbaren stöchiometrischen Verhältnisse (d. h. 1:3, 2:2, 3:1; bei 0:4 oder 4:0 handelt es sich um ein Homotetramer) eingeschlossen sind. "hKv4" bezeichnet einen Kv4-Kanal humanen Ursprungs. Soweit im folgenden "Kv4" verwendet wird, umfaßt dieser Begriff alle zur Kv4-Familie zählenden Untereinheiten, wie z. B. Kv4.1, Kv4.2, Kv4.3.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die humane Kaliumkanaluntereinheit Kv4.2 sehr spezifisch im zentralen Nervensystem (ZNS), im Gegensatz zu Nagern (Zhn X. R. Receptor Channels 6 (1999) 387–400) aber kaum im Myokard exprimiert wird (siehe Beispiel 3). Unerwartet war auch der Befund, daß die bislang nicht klonierte Untereinheit Kv4.1 in vielen Geweben und auch im humanen Myokard exprimiert wird. Es ist daher davon auszugehen, daß die meisten Kv4-Kanäle Kv4.1 als Untereinheit enthalten. In Northern blots von mRNA extrahiert aus verschiedenen humanen Geweben wurde Kv4.2 mRNA nur im Gehirn, Kv4.1 und Kv4.3 mRNA hingegen sowohl im Gehirn als auch in Herz, Lunge, Placenta, Leber, Niere, Pankreas und Skelettmuskel nachgewiesen (Beispiel 3).
Durch diese Erkenntnis ist somit die Entwicklung von Assays möglich, mit deren Hilfe sich die Organspezifität (Herz oder ZNS) von Substanzen, die auf Kaliumkanäle der Kv4-Unterfamilie wirken, bestimmen läßt. Dies ist von großer Bedeutung, da sich auf diese Weise z. B. Antiarrhythmika entwickeln lassen, die die Blut-Hirn-Schranke zwar passieren können, jedoch keine Wirkung auf den ZNS-spezifischen Kaliumkanal Kv4.2 ausüben. Es ist zu erwarten, daß derartige Wirkstoffe die mit herkömmlichen Antiarrhythmika assoziierten Nebenwirkungen wie Kopfschmerz, Schwindel oder Augenflimmern nicht aufweisen sollten, so diese Nebenwirkungen durch Interaktion mit Kv4.2-Kanälen verursacht werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen (funktionellen) Kv4.1- und Kv4.2-Kanäle hochsensitiv gegen das Klasse I Herzantiarrhythmikum Flecainid sind, d. h. einen hochaffinen Rezeptor für das Klasse I Antiarrhythmikum Flecainid darstellen. Dies könnte ein Grund für die o. g. Nebenwirkungen von Antiarrhythmika im allgemeinen und von Flecainid im besonderen sein.
Kv4.1- und Kv4.3-Untereinheiten vermitteln transiente schnell-inaktivierende Kaliumauswärtsströme, die aufgrund ihrer Eigenschaften zu I_to-Strömen beitragen können. Aufgrund des Vorkommens der humanen Kv4.1-, Kv4.2- und Kv4.3-Untereinheiten im humanen ZNS und der gefundenen Eigenschaften der vermittelten Auswärtströme können Kv4.1-, Kv4.2- und Kv4.3-Kanäle bzw. Kanäle, die Kv4.1-, Kv4.2- und/oder Kv4.3-Untereinheiten (d. h. sowohl Homo- als auch Hetereotetramere) enthalten, somatodendritische Kaliumkanäle bilden, die einen transienten schnell-inaktivierenden, sog. A-Typ Kaliumauswärtsstrom in Dendriten und im Soma eines Neurons vermitteln. Von diesen Strömen ist bekannt, daß sie einen wichtigen Beitrag zur Erzeugung, Integration und Weiterleitung dendritischer Aktionspotentiale leisten (D. A. Hoffmann und D. Johnston, J. Neurosci. 18 (1998) 3521–3528). Diesem Prozeß wird eine wesentliche Bedeutung bei Lern- und Gedächtnisvorgängen beigemessen, die im Zusammenhang mit Langzeitpotenzierungen synaptischer Übertragungen stehen (D. A. Hoffmann et al., Nature 387 (1997) 869–875). Im neuronalen Bereich spielen Kaliumkanäle somit eine entscheidende Rolle in der Regulation der Aktivität von Neuronen. Modulatoren dieser Kaliumka näle können daher potentiell nicht nur Lern- und Gedächtnisfunktionen beeinflussen, sondern – aufgrund des hohen Vorkommens der Kv4.2 Kaliumkanaluntereinheit in humaner striataler Cortex und in humaner Substantia nigra – beispielsweise auch bei (neurodegerativen) Erkrankungen des Nervensystems (z. B. Autismus, Epilepsien, Ischämien, Schlaganfall, Morbus Parkinson, Morbus Huntington und Alzheimersche Erkrankung) therapeutisch eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle eignen sich somit nicht nur in besonderer Weise zur gezielten Identifizierung und Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung von Erkrankungen des Herzkreislaufsystems sondern auch des Nervensystems in Mensch und Tier, insbesondere von Antineurodegenerativa. Kv4.1 und Kv4.3 homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.3 heterotetramere Kaliumkanäle werden im Herzen exprimiert, nicht aber Kv4.2 homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.2, Kv4.2/Kv4.3, Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3 heterotetramere Kanäle. Diese sind besonders geeignet zur Suche nach spezifischen Wirkstoffen zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems (s. o.).
Erfindungsgemäß werden daher neue humane Kaliumkanaluntereinheiten Kv4.1 zur Verfügung gestellt, die die in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen. Die Untereinheit Kv4.3 weist die in SEQ ID NO: 29 dargestellte Sequenz auf. [Die Angabe "SEQ ID NO:" entspricht der numerischen Kennzahl "<400>" im Sequenzprotokoll]. Kv4.2 weist die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Sequenz auf.
Die erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine (Untereinheiten) sind auf verschiedenen, dem Fachmann bekannten Wegen erhältlich. Zum einen können Kaliumkanalproteine derselben mittels chemischer Synthese hergestellt werden. Desweiteren können Antikörper gegen Fragmente der Polypeptide nach dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden (E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Mittels dieser Antikörper kann dann das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein aus Zellen isoliert werden, die natürlicherweise das Kaliumkanalprotein exprimieren, es ist aber ebenso denkbar, daß Zellen verwendet werden, in die für das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein kodierende Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden und die das Protein anschließend unter geeigneten Bedingungen exprimieren.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kaliumkanal, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.1 enthält. Erfindungsgemäß kann der Kaliumkanal neben der Untereinheit Kv4.1 auch andere Kaliumkanaluntereinheiten enthalten. Dabei kommen besonders die Untereinheiten Kv4.2 und Kv4.3 in Frage sowie Homologe, Derivate (z. B. phosphorylierte Untereinheiten und durch Mutagenese veränderte Untereinheiten oder Fragmente derselben, die die gleiche elektrobiologische, pharmakologische und/oder biologische Wirkung und/oder Immunogenität aufweisen. Besonders bevorzugt enthält er zusätzlich die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.3. Wie bereits oben erwähnt, können diese Kaliumkanäle in Form von Homo- oder Heterotetrameren vorliegen, wobei die Kanäle Kv4.1, Kv4.1/Kv4.2, und Kv4.1/Kv4.3 sind.
Die spezifischen Inaktivierungseigenschaften des Kaliumkanals hängen von den Kaliumkanaluntereinheiten ab, die er neben Kv4.1 enthält. Enthält er neben Kv4.1 eine andere Kaliumkanaluntereinheit, so handelt es sich um einen spannungsabhängigen Kaliumkanal, der bei Depolarisierung der Membran Auswärtsströme vermit telt, die gleich, schneller oder langsamer inaktivieren als die vom Vergleichskanal Kv4.1 vermittelten Ströme.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine bzw. Kaliumkanäle, kodieren. Besonders bevorzugt können diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden aus:

(a) der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz,
(b) allelischen Varianten und Fragmenten der unter (a) genannten Sequenzen (soweit sie für Protein und Polypeptide mit gleicher elektropbiologischer, pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität kodieren).

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine oder mehrere der oben genannten Nukleinsäuresequenzen enthält. Geeignete Vektoren sind pBluescript KS+ und pBluescript KS– (Stratagene, La Jolla, CA, US), sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor, wie z. B. pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US), wobei die Erfindung aber nicht auf diesen beschränkt ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können in diese Vektoren nach allgemeinen bekannten Methoden kloniert werden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, US). Erfindungsgemäß enthalten die Expressionsvektoren Kontrollelemente für Transkription, Transkriptionsstart, Transkriptionsende, mRNA-Prozessierung und Translation, die in den erfindungsgemäß verwendeten Expressionsystemen in aktiver Form vorliegen.
Vorzugsweise enthalten die Vektoren Sequenzen, die die Replikation der oben genannten Nukleinsäuremolekäle erleichtern. Besonders bevorzugt enthalten sie ferner Sequenzen, die die Integration der Nukleinsäuresequenzen in das Genom einer Wirtszelle erleichtern.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung entsprechen die Vektoren den am 23.12.1999 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, in Form transformierter E. coli-Stämme nach dem Budapester Vertrag hinterlegten Vektoren mit den Zugriffsnummern DSM 13222 und DSM 13221, die eine für hK_v4.1 (im Vektor pcDNA3; DSM 13222) bzw. hK_v4.2 (im Vektor pGEM HE; DSM 13221) kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Wirtszellen, die mit den genannten Vektoren, die für eine Kaliumkanaluntereinheit kodieren (vorzugsweise Kv4.1 oder Kv4.2), transformiert sind. Besonders bevorzugt sind diese Wirtszellen CHO-Zellen oder Xenopus Oozyten, es kommen aber auch andere Eukaryontenzellen aus der Gruppe bestehend aus COS, HEK 293, NIH-3T3 in Frage, die Erfindung ist aber nicht auf diese Zellen beschränkt. Von Bedeutung ist, daß die Promotor- und/oder Enhancersequenzen auf die mit den Vektoren transformierten Wirtszellen abgestimmt sind. Dadurch kann eine erhöhte Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide sichergestellt werden.
Ferner ist eine Wirtszelle Gegenstand dieser Erfindung, die zusätzlich zu einem der oben genannten Vektoren mit mindestens einem weiteren Vektor transformiert ist, der vorzugsweise eine abweichende Nukleinsäuresequenz enthält, d. h. eine Sequenz, die z. B. für eine andere Kaliumkanaluntereinheit aus der Gruppe bestehend aus Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 kodiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält die Wirtszelle Vektoren, die entweder für die Kaliumkanaluntereinheiten Kv4.1 und Kv4.2 oder für die Untereinheiten Kv4.1 und Kv4.3 oder die für Homologe, Derivate oder Fragmente derselben kodieren. Ferner kommen auch oligo-/multicistronische Expressionssysteme in Frage.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine Wirtszelle, die einen funktionellen Kaliumkanal exprimiert, der Kaliumkanaluntereinheit Kv4.1 (entweder als Homo- oder Heterotetramer und gegebenenfalls zusammen mit Kv4.2 und oder Kv4.3) enthält. Vorzugsweise exprimiert die Wirtszelle den funktionellen Kaliumkanal auf ihrer Oberfläche, es ist aber ebenso möglich, daß der funktionelle Kaliumkanal in intrazellulären Membranen exprimiert wird.
Erfindungsgemäß eingeschlossen ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, die von den erfindungsgemäßen Wirtszellen exprimierten Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren und/oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man

(a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen den Kaliumauswärtsstrom mißt,
(b) die Wirtszellen mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und
(c) an den Wirtszellen erneut den Kaliumauswärtsstrom mißt,

Erfindungsgemäß wird eine Substanz als öffnende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz bei einem Membranpotential, bei dem ohne Zugabe der Substanz keine Kaliumauswärtsstrom fließen, Kaliumauswärtzsstrome fließen.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine aktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom verstärkt wird.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine inaktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom vermindert wird, ohne daß der Kaliumauswärtsstrom vollständig zum Erliegen kommt.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine verändernde Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz biophysikalische Eigenschaften des Kaliumkanals wie Spannungsabhängigkeit, Leitfähigkeit, Aktivierungszeitkonstanten, Inaktivierungszeitkonstanten, Schaltverhalten, Offenzeiten oder Geschlossenzeiten verändert werden.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz auch dann als eine verändernde Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz die Zelloberflächenexpression des Kaliumkanals verändert wird. Eine Veränderung der Zelloberflächenexpression führt zu einer Zunahme bzw. Abnahme der zu messenden Kaliumauswärtsströme.
Änderungen in der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung führen erwartungsgemäß bei Testpotentialen, die Kaliumauswärtsströme hervorrufen, zu einer Stromzunahme oder Stromabnahme. Leitfähigkeitsänderungen führen ebenfalls zu einer Zu- oder Abnahme der Kaliumauswärtsströme. Änderungen der Aktivierungszeitkonstanten führen zu einer Verlangsamung oder Beschleunigung der Aktivierung von Kaliumauswärtsströmen. Änderungen der Inaktivierungszeikonstanten sowie des Schaltverhaltens können während eines Testpulses zu einer Zunahme oder Abnahme der Auswärtsströme führen. Das gleiche gilt, wenn die Offenzeiten oder Geschlossenzeiten der zu messenden Kaliumkanäle verändert werden (B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Ausgabe (1993), Sinauer Associates inc., Sunderland, Massachusetts, USA).
Besonders bevorzugt exprimieren die verwendeten Wirtszellen die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle auf ihrer Oberfläche. Auf diese Weise können die Substanzen dadurch identifiziert bzw. getestet werden, daß man den Ausstrom von Ionen aus den Zellen durch den erfindungsgemäßen Kaliumkanal mißt. Das Ausströmen von Ionen wird bevorzugt mit der "patch-clamp"-Methode (vgl. z. B. O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) durch Anlegen depolarisierender Testpotentiale bestimmt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die erfindungsgemäßen Wirtszellen nach dem Fachmann gut bekannten Methoden mit ⁸⁶Rb-Ionen zu beladen, die durch Kaliumkanäle so gut wie Kaliumionen permeieren können. Die beladenen Zellen können in Gegenwart von zu testenden Substanzen kultiviert werden. Danach kann der Einfluß der Substanzen auf den ⁸⁶Rb-Auswärtsstrom der mit ⁸⁶Rb beladenen Zellen mit dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden (R. S. Rogowski et al., Mol. Pharmacol. 50 (1996) 1167–1177).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man

(a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen das Membranpotential mißt,
(b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
(c) an den Wirtszellen erneut das Membranpotential mißt,

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die erfindungsgemäßen Wirtszellen (insbesondere solche die Kv4.1, Kv4.2 oder Kv4.3 homomultimere Kaliumkanäle bzw. heteromultimere Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3-, oder Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3-Kaliumkanäle beliebiger Stöchiometrie nach dem Fachmann gut bekannten Methoden mit fluoreszierenden Membranpotential-sensitiven Farbstoffen, wie z. B. DiBAC (Bis-Barbitursäureoxonol) Farbstoff (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), zu beladen. Die beladenen Zellen können in Mikrotiterplatten übertragen werden. Mittels eines Bioassayreadergeräts (z. B. der Firma BMG LabTechnologies GmbH, Hanns-Martin-Schleyer-Str. 10, 77656 Offenburg), kann dann der Einfluß der Substanzen auf die Kaliumkanalaktivität fluoreszenzspektroskopisch mit dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden. Das Bioassayreadergerät mißt speziell durch den Unterschied zwischen der Membranpotential-abhängigen Fluoreszenz vor und nach Zugabe der Substanz. Wirkt die Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle, ändert sich das Membranpotential und somit die Membranpotential-abhängige Fluoreszenz. Daraus kann die Aktivität der Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle bestimmt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanä le zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man

a) in den erfindungsgemäßen Wirtszellen das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom mißt,
b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
c) das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom erneut mißt,

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die Phosphorylierung der erfindungsgemäßen Kv4-Kanäle in Gewebekulturzellen durch Proteinkinasen zu einer drastischen Veränderung der Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme führt. Insofern betrifft die Erfindung einerseits Wirtszellen, die phosphorylierte Kaliumkanäle enthalten sowie die Messung der Aktivität dieser Testkanäle zur Ermittlung von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren, bei dem man

(a) in den erfindungsgemäßen Wirtszellen, die exprimierten Kv4-Kaliumkanäle durch Aktivierung von Proteinkinasen phosphoryliert,
(b) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme mißt,
(c) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
(d) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme erneut mißt,

Die Phosphorylierung der Kaliumkanäle erfolgt beispielsweise durch Proteinkinase A und C.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden ferner Antikörper zur Verfügung gestellt, die an das isolierte erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden. Ferner werden Antikörper zur Verfügung gestellt, die an das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden, wobei das Kaliumkanalprotein Bestandteil eines Kaliumkanales sind und somit eine andere dreidimensional Struktur aufweisen können als die isolierten erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann allgemein bekannt (E. Harlow und D. Lane, a. a. O.). Die Antikörper sind erhältlich, indem man Tiere mit dem erfindungsgemäßen Kaliumkanalprotein oder Derivaten oder Fragmenten desselben mit gleicher elektrophysiologischer, pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität immunisiert. Polykonale Antikörper werden dann aus dem Serum der Tiere gewonnen, während monoklonale Antikörper aus dem Überstand von Hybridomzellen erhältlich sind. Hybridomzellen sind erhältlich, indem man Antikörper produzie rende Zellen mit Tumorzellen fusioniert (E. Harlow and D. Lane, a. a. O.).
Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele, Sequenzprotokolle und Figuren verdeutlicht.
1

A) Nukleotid-Sequenz der humanen Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde. Fettgedruckt ist das erste Startcondon ATG, mit dem der offene Leserahmen startet, und das Stopcodon, mit dem der offene Leserahmen aufhört.
B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) der humanen Kv4.1α-Untereinheit. Die sechs hydrophoben, möglicherweise membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende Domäne ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich auf die jeweils letzte Aminosäure in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o,
, ☐, und Δ zeigen mögliche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C, Ca²⁺-Calmodulin abhängige Proteinkinase II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).

2

A) Nucleotid-Sequenz der humanen Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde wie im 1. Fettgedruckt ist das erste Startcondon ATG, mit dem der offene Leserahmen startet, und das Stopcodon, mit dem der offene Leserahmen aufhört.
B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4) der humanen Kv4.2 α-Untereinheit. Die sechs hydrophoben, möglicherweise membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende Domäne ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich auf die jeweils letzte Aminosäure in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o,
, ☐, und Δ zeigen mögliche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C, Ca²⁺-Calmodulin abhängige Proteinkinase II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).
C) Ähnlichkeit der humanen (h)Kv4.2 Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4) zu Proteinsequenzen anderer Mitglieder der humanen Kv4-Kaliumkanalfamilie (Kv4.1 (SEQ ID NO: 2) und Kv4.3. Es von Kv4.3 gibt es zwei Versionen. Gezeigt ist die lange Version (hKv4.32), die im Vergleich zur kürzeren Version ein zusätzliches Exon enthält, das unterstrichen ist.

3

A) Northern-Analyse der Expression humaner Kv4.1 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humane Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Eine ca. 5 kb große Kv4.1 mRNA wurde mehr oder weniger in allen Geweben detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch eine Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe kontrolliert.
B) Northern-Analyse der Expression humaner Kv4.2 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humane Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Nur in mRNA aus Gehirn bzw. Gehirnregionen wurde eine 6.5 kb große Kv4.2 mRNA detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch eine Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe kontrolliert.
C) Northern Analyse der Expression der Kv4.3 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humanen Kv4.3 cDNA (Nukleotide 1420–2644, Acc. AF120 491) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. In Gehirn, Herz, Placenta, Lunge, Leber und Skelettmuskel wurde eine 8.5 kb große Kv4.3 mRNA detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe überprüft.

4
Lokalisation des hKv4.1 Kaliumkanal-Gens, KCND1, in der Region des humanen Chromosoms Xp11.23.
Links ist eine schematische Karte der Xp11.1. bis Xp21-Region; rechts ist die Lage bekannter polymorpher Marker im Vergleich zu KCND1 angegeben.
5
Lokalisation des hKv4.2-Kaliumkanal-Gens, KCND2, in der Region des humanen Chromosoms 7q31-32.

A) Nachweis von KCND2 DNA in einem DNA-Panel aus Nager/Mensch-Hybridzellinien. Die DNA Proben des Panels wurden einer Polymerasekettenreaktion unterzogen unter Verwendung KCND2-DNA spezifischer sense- und antisense Primer (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9). Die amplifizierten DNA-Produkte wurden in einem 1.5% Agarose-Gel separiert und mittels Ethidium-bromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Nummern oberhalb der Gelbahnen beziehen sich auf die verschiedenen eingesetzten Hybridzellinien. Auf der linken Seite sind Größemarkierungen in kb DNA angegeben; auf der rechten Seite zeigt der Pfeil das erwartete KCND2-Produkt von 3 bp an.
B) Humaner Chromosomenbesatz der in A getesteten Nager/Mensch-Hybridzellinien. Die Spalten beziehen sich auf die DNA, die in der jeweils darüber liegenden Gelbahn getestet wurde. Die Chromosomen sind mit X angegeben; inkomplette Chromosomen mit einem +– Zeichen. Die beiden Sternchen zeigen an, in welchen Bahnen ein amplifiziertes KCND2-Produkt gefunden wurde. Daraus geht hervor, daß das KCND2-Gen auf Chromosome 7 lokalisiert ist.
C) Chromosomale Lokalisierung bei 7q31-32 mit einer FISH-Analyse von Metaphase-Chromosomen. Verwendet wurde eine biotinylierte KCND2-Sonde.

6
Genomische Struktur der Gene KCND1, KCND2, KCND3.
Die schwarzen Kästchen entsprechen Exonen der offenen Leserahmen. Exone 1 enthalten auch 5'-nichtranslierte Sequenzen, schematisch als weiße Kästchen dargestellt; dgl. enthalten Exone 6 jeweils 3'-nichttranslatierte Sequenzen. Graue Balken entsprechen Intronsequenzen.
7
Nukleotid-Sequenzen des humanen KCND1-Gens.
Kodierende Bereiche sind durch Großbuchstaben, nichtkodierende Bereiche (d. h. Introne bzw. 5' und 3' nichttranslatierte Regionen) sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.

A) Nukleotid-Sequenz des Exons 1 des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 5). Das Startkodon ist durch Fettdruck hervorgehoben.
B) Nukleotid-Sequenz der Exone 2–5 sowie der angrenzenden Introne des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 6).
C) Nukleotid-Sequenz der Exone 6 des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 7). Das Stopkodon ist durch Fettdruck hervorgehoben.

8
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.1 Kanälen, die durch transiente Expression von hKv4.1 α-Untereinheiten in HEK293-Zellen gebildet wurden.
Auswärtsströme gemessen mit der "patch-clamp"-Methode an mit hKv4.1-cDNA (SEQ ID NO: 1) transient transfizierten HEK 293 Zellen. Das Haltepotential war bei –100 mV, das Testpotential bei +40 mV. Die mittlere Stromdichte betrug 60 ± 20 pA/pF.
An der beispielhaft gezeigten Stromkurve der hKv4.1 vermittelten Auswärtsströme wurde bezüglich der Inaktivierung Zeitkonstanten τ angepaßt nach dem Fachmann gut bekannten Verfahren. Der zeitliche Verlauf der Inaktivierung bei +40 mV ließ sich durch zwei Zeitkonstanten (τ_h,1 bzw. τ_h,2) gut beschreiben (τ_h,1 = 31.9 ± 3.5; τ_h,2 = 354 ± 36). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler von in vierzehn Experimenten durchgeführten Messungen. Das Amplitudenverhältnis von τ_h,1 und τ_h,2 zueinander ist 3:1 (76% zu 24%).
9
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.2-Kanälen, die durch transiente Expression von hKv4.2 α-Untereinheiten in HEK 293-Zellen gebildet wurden.

A) Auswärtsströme gemessen mit der "patch-clamp"-Methode an hKv4.2-cDNA (SEQ ID NO: 3) transient transfizierten HEK 293 Zellen.
B) Auftragung normalisierter Leitfähigkeiten (G/Gmax, Ordina te) für human Kv4.2-Ströme gegen das im Test vorhandene Membranpotential (Abzisse). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die durchgezogene Linie stellt die Ausgleichskurve gemäß der Boltzmann-Gleichung mit V_0.5 = –3.2 ± 1.5 mV dar.
C) Auftragung der Aktivierungszeitkonstanten τ_m in ms für humane Kv4.2-Ströme gemessen in Abhängigkeit vom im Text vorhandenen Membranpotential in mV. Die Messungen wurden wie in A durchgeführt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar.
D) Auftragung der Inaktivierungszeitkonstanten τ_h,1 und τ_h,2 in ms für humane Kv4.2-Ströme gemessen in Abhängigkeit vom im Test vorhandenen Membranpotential in mV. Den wie in A gemessenen Stromverläufe wurden zwei Inaktivierungszeitkonstanten angepaßt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar.
E) Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung der humanen Kv4.2-Ströme vom Vorpulspotential. Datenpunkte entsprechen den gemessenen Stromamplituden bei +60 mV nach einem 500 ms langen Vorpuls bei dem angegebenen Vorpulspotential. Dieses wurde in 5 mV Schritten zwischen –90 und –15 mV variiert. Den Datenpunkten wurde eine Boltzmann-Gleichung angepaßt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die gemessenen Peak-Amplituden (I) wurden normalisiert, bezogen auf die bei +60 mV gemessenen maximale Peak-Amplitude (I_max), die mit einem Vorpuls von –90 mV erhalten wurde.
F) Erholung der inaktivierten humanen Kv4.2 Ströme. Die Erholungsphase wurde mit gepaarten 500 ms langen Test pulsen bei +60 mV gemessen, die unterbrochen wurden durch einen Zwischenpuls unterschiedlicher Dauer bei –100 mV. Die Dauer des Zwischenpulses variierte zwischen 10 ms und 600 ms. I_o entspricht der Peak-Amplitude, die gemessen wurde mit einem +60 mV Testpuls nach einer Erholungsphase von 15 s bei –100 mV. Die anderen gemessenen Peakamplituden, die mit kürzeren Zwischen Pulsen erhalten wurden, wurden darauf normalisiert (I/I_o). Die an die Datenpunkte angepaßte Linie entspricht einer mono-exponentiellen Funktion mit einer Zeitkonstante τ_rec von 118.3 ± 5.3 ms und wurde von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen erhalten.

10
Inhibierung von humanen Kv4.2-Strömen nach Applikation von Wirkstoffen.
Die transienten Auswärtsströme wurden mit der "patch-clamp"-Methode wie in 4 an hKv4.2-cDNA (SEQ ID NO: 3) transient transfizierten HEK 293 Zellen gemessen mit einem Haltepotential von –100 mV und 500 ms langen Testpotentialen bei +40 mV. Nach der Registrierung eines transienten Auswärtsstroms (Kontrolle) wurde die in der Meßkammer befindliche Badlösung mit dem angegebenen Kaliumkanalblocker bzw. Wirkstoff in der angegebenen Konzentration für 15 min. perfundiert. Danach wurde eine zweite Stromregistrierung durchgeführt. 4-AP = 4-Aminopyridin; TEA = Tetraethylammonium.
Beispiele
Die Abkürzungen "M" und "mM" stehen für die Einheiten mol/l bzw. mmol/l.
Beispiel 1: Isolierung von Klonen aus humanen cDNA-Bibliotheken und Polymerasekettenreaktion.
1·10⁶ Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver, 5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL, Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma), 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Heringssperm-DNA, in H₂O und mit ³²P-markierter Maus Kv4.1 (M. D. Pak et al., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 4386–4390) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H₂O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet.
Es wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2800 bp lange hKv4.1 cDNA enthielt. Das Insert des Phagen wurde mittels der Phagen-spezifischen Primer 5'-GACTCCTGGAGCCCG-3' (5'Insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 10) und 5'-GGTAGCGACCGGCGC-3' (3'Insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 11) ansequenziert und anschließend mittels PCR unter der Verwendung Insert(hKv4.1)-spezifischer Primer amplifiziert. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt: 30 Reaktionszyklen mit PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) bestehend aus 95°C – 30 sec, 55°C – 30 sec. und 72°C – 2 min. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-AGCCCCCAC CATCCTGGAGA-3' (h41-1; SEQ ID NO: 12) und als "Antisense-Primer" 5'-CTGGGGGCCCAGCAGAGGAC-3' (h41-2; SEQ ID NO: 13). Das resultierende hKv4.1 PCR cDNA-Fragment war 2711 bp lang und enthielt den kompletten offenen Leserahmen der hKv4.1 cDNA sowie 80 bp 5' UTR und 687 bp 3' UTR. Dieses Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch isoliert.
Beispiel 2: Isolierung von Klonen aus humanen genomischen DNA-Bibliotheken
1·10⁶ Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7 Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit ³²P-markierter humaner Kv4.1 cDNA als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H₂O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein Phagenklon wurde durch eine Hybridisierung, durchgeführt wie oben, identifiziert. Durch direkte Sequenzierung der Phagen-DNA zeigte sich, daß dieser Phage die komplette kodierende Sequenz des KCND1-Gens enthielt. (SEQ ID NO: 5, 6, 7).
Beispiel 3: DNA-Sequenzierung
Das hKv4.1 PCR cDNA Fragment wurde mit Bsp120I (MBI fermentas) geschnitten und in die in die EcoRV/Bsp120I-Schnittstellen des pcDNA3 Vektors (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die hKv4.1 cDNA wurde dann unter Verwendung des BigDye terminator cycle sequencing kits (Perkin Elmer, XY) sequenziert. Die Sequenzreaktionen wurden anschließend auf automatischen Sequenzierern (ABI 377 or Prism 310 automated sequencer (Perkin Elmer, XY)) analysiert. Das Plasmid-spezifische Oligonukleotid T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14) sowie hKv4.1-spezifische Oligonukleotide (h41-1–h41-7 (SEQ IDs NO: 12, 13, 15–19) wurden für die Sequenzierungen als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A⁺ mRNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas. Die hKv4.1 cDNA wurde ³²P-markiert (T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll 400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20. g/l Polyvinylpyrolidon (Merck), 1:10 verdünnt), 1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H₂O) bei 42°C 24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander in Waschlösung 1 (2 × SSC (20 × SSC: 173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma, für 2 × SSC 1:10 verdünnt)); 0.1% SDS; in H₂O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200 verdünnt; 0.1% SDS; in 11₂0) bei 50°C gewaschen. Nach dem Waschen erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) bei –70°C. Der gleiche Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit einer ³²P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide 1430–2644; GenBank Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.
Beispiel 4: Humane chromosomale Lokalisation des KCND1 Gens
Das Genebridge 4 Hybridzellpanel (bezogen durch Research Genetics, Huntsville, AL) wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion unter der Verwendung KCND1-spezifischer Oligonukleotide untersucht. Die PCR Reaktionen wurden mit 25 ng DNA von jedem der 93 Hybridklone und mit humaner sowie genomischer DNA vom Hamster als Kontrollen durchgeführt. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-GACTTGGAAGAATACGCTGGAC-3' (h41-3; SEQ ID NO: 15) und als "Antisense-Primer" 5'-TCATGACACTCCGCAGGAAGC-3' '(h41-8; SEQ ID NO: 20) Die PCR-Bedingungen waren 5 min 95°C 1 Zyklus; 45 sec 95°C, 1 min 59°C, 1 min 72°C für 30 Zyklen; 10 min 72°C 1 Zyklus; Taq Polymerase (GibcoBRL,). Die Ergebnisse der PCR wurden durch den "Radiation Hybrid Mapping Server" am Whitehead Institute (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) analysiert. Für die Analyse wurde ein LOD-score von 15 gewählt.
Beispiel 5: Funktionelle Expression und elektrophysiologische Technik
Das hKv4.1 PCR-Fragment (SEQ ID NO: 1) wurde in den dem Fachmann gut bekannten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie oben ausgeführt einkloniert. Insgesamt 2 μg Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.1) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM 1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM 1-Medium mit 6.4 μl DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei RT für 45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde. 2·10⁵ HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit diesem Lipid-DNA-Komplex auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden bei 37°C in einem Inkubator unter 5% CO₂ wurde die Lösung durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 12–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 5·10⁴ Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen Messungen umgesetzt.
Auswärtsströme wurden 24–48 Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen. Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen 2–3 MΩ nach der Füllung mit der intrazellulären Lösung (95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM, MgCl₂, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM Glutathion, 2 mM Na₂ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 10 mM Glucose, 20 mM Sucrose, pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma) bei Raumtemperatur auf einem Haltepotential von –100 mV gehalten. Die bei positiveren Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) wurde für die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.
Beispiel 6: Isolierung von Klonen aus humanen cDNA-Bibliotheken.
1·10⁶ Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver, 5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL, Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma), 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Heringssperm-DNA, in H₂O und mit ³²P-markierter Ratte Kv4.2 cDNA (T. J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H₂O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet.
Es wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2500 bp lange hKv4.2 cDNA enthielt. DNA des Phagen wurde mit EcoRI verdaut. Das hKv4.2 EcoRI cDNA-Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch isoliert.
Beispiel 7: Isolierung von Klonen aus humanen genomischen DNA-Bibliotheken
1·10⁶ Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7 Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit ³²p-markierter Ratte Kv4.2 cDNA (T. J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H₂O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein DNA-Fragment wurde durch eine Hybridisierung, durchgeführt wie oben, identifiziert. Dies war ein 1.0 kb BamHI/XbaI Fragment. Die Sequenzierung des Fragments zeigte, daß es nur einen Teil der kodierenden Region enthielt, der den Aminosäuren 1 bis 218 des abgeleiteten offenen hKv4.2 Leserahmens entspricht (SEQ ID NO: 21).
Beispiel 8: DNA-Sequenzierung
Das EcoRI-hKv4.2 cDNA Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstellen des Bluescript Vektors (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Die hKv4.2 cDNA wurde dann nach der Methode von Sanger et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463–5467) mit T7-DNA Polymerase (Sequenase, US Biochemicals, Cleveland, Ohio) sequenziert. Plasmid-spezifische Oligonukleotide M13, Reverse, T3 und T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14, 22–24) wurden für die Sequenzierungen als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A⁺ mRNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas. Die hKv4.2 cDNA wurde ³²P-markiert (T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll 400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20 g/l Polyvinylpyroli don (Merck), 1:10 verdünnt), 1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H₂O) bei 42°C 24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander in Waschlösung 1 (2 × SSC (20 × SSC: 173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma, für 2 × SSC 1:10 verdünnt)); 0.1% SDS; in H₂O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200 verdünnt; 0.1% SDS; in H₂O) bei 50°C gewaschen. Nach dem Waschen erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) bei –70°C. Der gleiche Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit einer ³²P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide 1430–2644; EMBL Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.
Beispiel 9: Polymerasekettenreaktion
Der hKv4.2 cDNA-Phagenklon wurde mit EcoRI verdaut. Das EcoRI-Fragment wurde in die Polylinker-Region des EcoRI-linearisierten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogene, Carlsbad, CA) einkloniert, um pcDNA3-hKv4.2 zu erhalten. Dieser wurde in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) als Matrize verwendet, um eine Kozak-Sequenz (5'-CCACC-3', SEQ ID NO: 25) vor das Startcodon des hKv4.2 offenen Leserahmens einzubauen und gleichzeitig den nicht-kodierenden 5'-Bereich der hKv4.2 cDNA zu verkürzen. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt: 20 Reaktionszyklen mit Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA) bestehend aus 94°C – 1 min, 50°C – 30 sec. und 72°C – 30 sec. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-ATTAAGCTTCCACCATGGCGGCGGGGGTGGCAGCG-3 (h42koz; SEQ ID NO: 26) und als "Antisense-Primer" 5'-ACATAGTAGAACACCAGGGCC-3' (h423; SEQ ID NO: 28). Der h42koz-Primer enthielt eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Hind III vor der Kozak-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 25). Das PCR Reaktionsprodukt war 673 bp lang und entsprach der hKv4.2 cDNA Sequenz von Nukleotid 340 bis 399 (SEQ ID NO: 3) und 14 zusätzliche Basenpaare, die dem eingesetzten Primer h42koz entsprachen. Das PCR-Produkt wurde mit HINDIII und BstXl geschnitten. Letzteres Restriktions enzym erkennt eine Schnittstelle in der hKv4.2 cDNA Sequenz bei Nukleotiden 971–980 (SEQ ID NO: 3). Parallel wurde pcDNA3-hKv4.2 mit HindIII und BstXl verdaut, wodurch die ersten 980 Basenpaare der einklonierten hKv4.2 cDNA eliminiert wurden. Mit der verdauten pcDNA3-hKv4.2 wurde das HINDIII/BstXl PCR Fragment mit Hilfe von T4-DNA Ligase (MBI Fermentas, Buffalo, NY) ligiert und der Klon pcDNA3-hKv4.2koz wurde erhalten. Die hKv4.2koz Sequenz (SEQ ID NO: 26) wurde durch Sequenzierung verifiziert.
Beispiel 10: Humane chromosomale Lokalisation
Primer hg427 (SEQ ID NO: 8) und hg428 (SEQ ID NO: 9) wurden in PCRs eingesetzt zur Amplifizierung der genomischen KCND2-DNA. Als Matrize wurde ein DNA Panel aus Nager/Mensch-Hybridzellininen verwendet (Firma) und Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA). Die Reaktionsbedingungen waren 35 Zyklen mit 92°C – 2 min., 50°C – 30 sec., 72°C – 20 sec. Ein 12 kb langer humaner genomischer λDNA-Klon, der den kodierenden Bereich für Aminosäuren 1–211 der hKv4.2 α-Untereinheit enthielt, wurde mit Biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim) markiert und dann für eine FISH-Analyse als Sonde verwendet. Die FISH-Analyse erfolgte nach der von P. Lichter et al., PNAS USA 85 (1988) 9664–9668 und C. Fonatsch et al., Int. J. Cancer 26 (1980) 749–754 beschriebenen Methode. Die Signale wurden mit Fluoreszenz-Isothiozyanat gekoppeltem Avidin-DCS^R (Vector Laboratories) detektiert und die Lokalisierung der Signale in Metaphase-Chromosomen wurde mit Hilfe eines konfocalen Laser Scanning Mikroskops (C. Zeiss, LSM 410, Germany) durchgeführt.
Beispiel 11: Funktionelle Expression und elektrophysiologische Technik
Das DNA-Fragment (SEQ ID NO: 3) wurde in den dem Fachmann gut bekannten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie oben ausgeführt einkloniert. Insgesamt 2 μg Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.2koz) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM 1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM 1-Medium mit 6.4 μl DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei RT für 45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde. 2·10⁵ HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit diesem Lipid-DNA-Komplex auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden bei 37°C in einem Inkubator unter 5% CO₂ wurde die Lösung durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 12–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 5·10⁴ Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen Messungen umgesetzt.
Auswärtsströme wurden 24–48 Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen. Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen 2–3 MΩ nach der Füllung mit der intrazellulären Lösung (95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM, MgCl₂, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM Glutathion, 2 mM Na₂ ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135 mM NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 2 MgCl₂, 5 HEPES, 10 Glucose, 20 Sucrose, pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma) bei Raumtemperatur auf einem Haltepotential von –100 mV gehalten. Die bei positiveren Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) wurde für die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Kaliumkanalprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es Kv4.1 ist, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Kaliumkanal, dadurch gekennzeichnet, daß er aus vier Untereinheiten besteht, die aus der Gruppe bestehend aus den Kaliumkanalproteinen nach Anspruch 1 oder mindestens einem dieser Kaliumkanalproteine in Kombination mit Kv4.2 (SEQ ID NO: 4) oder Kv4.3 (SEQ ID NO: 29) ausgewählt sind.
Kaliumkanal nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er die Kaliumkanalproteine nach Anspruch 1 einerseits und Kv4.2 andererseits in einem stöchiometrischen Verhältnis von 4:0, 3:1, 2:2 oder 1:3 enthält.
Kaliumkanal nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er die Kaliumkanalproteine nach Anspruch 1 einerseits und Kv4.3 andererseits in einem stöchiometrischen Verhältnis von 3:1, 2:2 oder 1:3 enthält.
Kaliumkanal nach den Ansprüchen 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er ein spannungsabhängiger Kaliumkanal ist.
Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Kaliumkanalprotein nach Anspruch 1 kodiert, verwendbar zur Expression eines Kaliumkanalproteins.
Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie für einen Kaliumkanal nach den Ansprüchen 2 bis 4 kodiert, verwendbar zur Expression eines Kaliumkanals.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe bestehend aus (a) der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz, (b) allelischen Varianten und Fragmenten der Sequenz gemäß (a), soweit sie für ein Protein mit gleicher elektropysiologischer, pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit kodieren, ausgewählt ist.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 6 bis 8 enthält.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mehrere Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 6 bis 8 enthält.
Vektor nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 11 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13222, der eine für Kv4.1 (SEQ ID NO: 1) kodierende Nukleinsäuresequenz enthält.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach den Ansprüchen 11 oder 12 transformiert ist.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit mehreren Vektoren nach den Ansprüchen 11 oder 12 transformiert ist, wobei die Vektoren voneinander abweichende Nukleinsäuresequenzen enthalten.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie Vektoren enthält, die für die Kaliumkanaluntereinheiten nach Anspruch 1 einerseits und Kv4.2 (SEQ ID NO: 4) oder Homologe, Derivate oder Fragmente desselben andererseits kodieren.
Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie Vektoren enthält, die für die Kaliumkanaluntereinheiten nach Anspruch 1 einerseits und Kv4.3 (SEQ ID NO: 29) oder Homologe, Derivate oder Fragmente desselben andererseits kodieren.
Wirtszelle nach den Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine CHO-Zelle ist.
Wirtszelle nach den Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Xenopus Oozyt ist.
Wirtszelle nach den Ansprüchen 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie den durch die Vektoren kodierten Kaliumkanal funktionell exprimiert.
Wirtszelle nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie den durch die Vektoren kodierten Kaliumkanal auf ihrer Oberfläche exprimiert.
Verfahren zur Expression eines Kaliumkanals, dadurch gekennzeichnet, daß man eine eukaryontische Wirtszelle nach den Ansprüchen 13 bis 20 unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des Kaliumkanals geeignet sind.
Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biopysikalischen Eigenschaften zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) an Wirtszellen nach den Ansprüchen 13 bis 20 den Kaliumauswärtsstrom mißt, (b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und (c) an Wirtszellen erneut den Kaliumauswärtsstrom mißt, wobei der Unterschied zwischen dem Kaliumauswärtsstrom vor und nach Zugabe der Substanz die Aktivität der Substanz bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kaliumauswärtsstrom mit Hilfe der 'patch-clamp'-Methode bestimmt.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine öffnende Substanz ist, wenn nach Zugabe der Substanz bei einem Membranpotential, bei dem ohne Zugabe der Substanz keine Kaliumauswärtsströme fließen, Kaliumauswärtsstöme fließen.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine aktivierende Substanz ist, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauswärtsstrom verstärkt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine schließende Substanz ist, wenn nach Zugabe der Substanz bei einem Membranpotential, bei dem ohne Zugabe der Substanz Kaliumauswärtsströme fließen, keine Kaliumauswärtsströme fließen.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine inaktivierende Substanz ist, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauswärtsstrom vermindert wird, ohne daß der Kaliumauswärtsstrom vollständig zum Erliegen kommt.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine verändernde Substanz ist, wenn durch Zugabe der Substanz biophysikalische Eigenschaften des Kaliumkanals wie Spannungsabhängigkeit, Leitfähigkeit, Aktivierungszeitkonstanten, Inaktivierungszeitkonstanten, Schaltverhalten, Offenzeiten oder Geschlossenzeiten verändert werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Substanz eine verändernde Substanz ist, wenn durch Zugabe der Substanz die Zelloberflächenexpression des Kaliumkanals verändert wird.
Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biopysikalischen Eigenschaften zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) an Wirtszellen nach den Ansprüchen 13 bis 20 das Membranpotential mißt, (b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und (c) an Wirtszellen erneut das Membranpotential mißt, wobei der Unterschied zwischen dem Membranpotential vor und nach Zugabe der Substanz die Aktivität der Substanz bestimmt.
Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biopysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man (a) an den Wirtszellen nach den Ansprüchen 13 bis 20 das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom mißt, (b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und (c) das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom erneut mißt, wobei die Unterschiede zwischen dem Membranpotential und dem Kaliumauswärtsstrom vor und nach Zugabe der Substanz die Aktivität der Substanz bestimmen.
Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren, bei dem man (a) in den Wirtszellen nach den Ansprüchen 13 bis 20 die exprimierten Kv4-Kaliumkanäle phosphoryliert, (b) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme mißt, (c) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und (d) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme erneut mißt, wobei die Substanz eine Proteinkinase aktivierende Substanz ist, wenn sich die in (b) und (d) gemessene Amplitude durch Zugabe der Substanz verändert.
Antikörper, der an das isolierte Kaliumkanalprotein nach Anspruch 1 bindet.
Antikörper, der an das Kaliumkanalprotein nach Anspruch 1 bindet, wobei das Kaliumkanalprotein Bestandteil eines Kaliumkanales nach den Ansprüchen 2 bis 5 ist.
Antikörper nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß er ein polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß er ein monoklonaler Antikörper ist.