DE19963612B4 - New voltage-dependent potassium channels from the Kv4 family and their use for the development of therapeutics - Google Patents
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Abstract
Kaliumkanalprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es Kv4.1 ist, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.Potassium channel protein, characterized in that it is Kv4.1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
Description
Gegenstand der Erfindung sind neue Untereinheiten humaner spannungsabhängiger Kaliumkanäle, insbesondere hKv4.1. Ferner werden im Rahmen der Erfindung Vektoren zur Verfügung gestellt, die hKv4.1 bzw. .2 enthalten, sowie diese Vektoren enthaltende Wirtszellen, die die Kaliumkanaluntereinheiten bzw. die Kaliumkanluntereinheiten enthaltenden Kaliumkanäle exprimieren. Gegenstand der Erfindung sind ferner gegen die Kaliumkanaluntereinheiten gerichtete Antikörper. Ferner wird ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen zur Verfügung gestellt die Kv4.1-Kaliumkanäle öffnen, schließen, aktivieren, inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften verändern können. Das Verfahren kann zur Spezifikation von Antiarrhytmika bzw. zum Auffinden und Identifizieren von Therapeutika zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, zur Verbesserung des Lernvermögens und von Gedächtnisleistungen und zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen verwendet werden.object The invention relates to new subunits of human voltage-dependent potassium channels, in particular hKv4.1. Furthermore, vectors are provided within the scope of the invention, containing hKv4.1 or .2, as well as host cells containing these vectors, the potassium channel subunits or potassium channel subunits containing potassium channels express. The invention also relates to the potassium channel subunits directed antibodies. Furthermore, a method for identifying substances for disposal open the Kv4.1 potassium channels open, close, activate, inactivate or change in their biophysical properties. The Method can be used for the specification of Antiarrhytmika or to find and identifying therapeutics for the treatment of neurodegenerative Diseases, to improve learning and memory and used to treat neurodegenerative diseases.
Die Membranen von Säugetierzellen sind für die strukturelle Integrität und die Aktivität von Zellen und Gewebe von großer Bedeutung. Eine Vielzahl von Stoffwechselprozessen wird von membrandurchspannenden Ionenkanälen gesteuert. In der Vergangenheit konnten verschiedene Innenkanäle identifiziert werden, durch die Kalzium, Natrium und/oder Kalium die Zellmembran passieren können.The Membranes of mammalian cells are for the structural integrity and the activity of cells and tissues of great size Importance. A variety of metabolic processes is spiked by membrane ion channels controlled. In the past, various internal channels could be identified through the calcium, sodium and / or potassium, the cell membrane can happen.
Die Aktivität von Kaliumkanälen kann entweder durch intrazelluläre Signalstoffe wie cAMP oder durch Potentialdifferenzen an der Zellmembran reguliert werden. Diese Potentialdifferenzen oder Spannungen kommen durch unterschiedliche Innenkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Zelle zustande.The activity of potassium channels can be either by intracellular Signal substances such as cAMP or by potential differences on the cell membrane be regulated. These potential differences or tensions come due to different indoor concentrations inside and outside of the cell.
Spannungsabhängige Kaliumkanäle sind in Abhängigkeit des über die Zellmembran vorliegenden Potentials geöffnet oder geschlossen. Es sind verschiedene Klassen von spannungsabhängigen Kaliumkanälen bekannt, deren Aufbau in der Regel ähnlich ist. Grundsätzlich bestehen sie aus vier homologen α-Untereinheiten. Die α-Untereinheiten gehören zu einer gemeinsamen Gensuperfamilie. Sie besitzen eine vergleichbare zweidimensionale Struktur, aus der eine für Kaliumkanäle typische Membrantopologie hervorgeht (O. Pongs, Physiol. Rev. 72 (1992) S69–88; L. Y. Jan et al., Nature 371 (1994) 119–122; K. G. Chandy et al., in Handbook of Receptors and Channels ed. R. A. North, Boca Raton 1 (1994) 1–71; O. Pongs, FERS Lett. 452 (1999) 31–35). Jede α-Untereinheit besitzt sechs hydrophobe Membran-durchspannende Segmente S1–S6. Zwischen S5 und S6 liegt die sogenannte P-Region, die von der extrazellulären Seite in die Membran eintaucht. Die P-Region hat einen entscheidenden Anteil an der Ausbildung der Kaliumkanalpore. Das S4-Segment enthält mehrere Aminosäuren mit positiven Ladungen, die wahrscheinlich für die Spannungsempfindlichkeit des Kanals einen wesentlichen Beitrag liefern. Zusätzlich können spannungsabhängige Kaliumkanäle auch β-Untereinheiten enthalten. Die β-Untereinheiten sind für die Regulation der Aktivität des Kanals von Bedeutung, während die α-Untereinheiten den eigentli chen funktionellen Kaliumkanal bilden (O. Pongs, Biospektrum 3 (1997) 21–26).Voltage-dependent potassium channels are dependent on of the over the cell membrane of existing potential opened or closed. It different classes of voltage-dependent potassium channels are known their structure is usually similar is. in principle they consist of four homologous α-subunits. The α subunits belong to a common gene superfamily. They have a comparable two-dimensional Structure, from the one for potassium channels typical membrane topology (O. Pongs, Physiol. Rev. 72 (1992) S69-88; L.Y. Jan et al., Nature 371 (1994) 119-122; K.G. Chandy et al. in Handbook of Receptors and Channels ed. R.A. North, Boca Raton 1 (1994) 1-71; O. Pongs, FERS Lett. 452 (1999) 31-35). Each α subunit has six hydrophobic membrane-spanning segments S1-S6. Between S5 and S6 lies the so-called P region, which dips from the extracellular side into the membrane. The P region plays a crucial role in the formation of the potassium channel pore. The S4 segment contains several amino acids with positive charges, probably for the voltage sensitivity the channel make a significant contribution. In addition, voltage-gated potassium channels can also be β-subunits contain. The β-subunits are for the regulation of activity the channel of importance while the α subunits form the actual functional potassium channel (O. Pongs, Biospektrum 3 (1997) 21-26).
Die Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanaluntereinheiten läßt sich in mehrere Unterfamilien unterteilen, von denen die Kv1- bis Kv4-Familien gut charakterisiert sind (W. Stühmer et al., EMBO J. 8 (1989) 3235–3244; B. Albrecht et al., Receptor and Channel 1 (1993) 99–199; J. Rettig et al., EMBO J. 11 (1992) 2473–2486; Serodio et al., J. Neurophysiol. 75 (1996) 2174–2179). Innerhalb der Unterfamilien liegt die Sequenzidentität der einzelnen α-Untereinheiten untereinander auf der Ebene der Aminosäuren bei ≥ 60%. Die bisher klonierten α-Untereinheiten der Familien Kv1 bis Kv4 exprimieren funktionelle Kaliumkanäle in heterologen Expressionssystemen, d. h. nach Injektion von DNA und mRNA in Xenopus Oozyten bzw. in Gewebekulturzellen (z. B. Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen, Human Epithelial Kidney (HEK) 293 Zellen) oder nach Transfektion von Gewebekulturzellen mit für α-Untereinheiten kodierender DNA in geeigneten Expressionsvektoren wie pcDNA3 (s. u.).The Family of voltage-dependent Potassium channel subunits can be into several subfamilies, of which the Kv1 to Kv4 families are well characterized (W. Stühmer et al., EMBO J. 8 (1989) 3235-3244; Albrecht et al., Receptor and Channel 1 (1993) 99-199; J. Rettig et al., EMBO J. 11 (1992) 2473-2486; Serodio et al., J. Neurophysiol. 75 (1996) 2174-2179). Within the subfamilies lies the sequence identity of the individual α subunits among themselves at the level of amino acids at ≥ 60%. The previously cloned α-subunits of families Kv1 to Kv4 express functional potassium channels in heterologous Expression systems, d. H. after injection of DNA and mRNA into Xenopus Oocytes or in tissue culture cells (eg Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, human epithelial kidney (HEK) 293 cells) or after transfection of tissue culture cells with for α-subunits encoding DNA in suitable expression vectors such as pcDNA3 (s. u.).
Dilks et al. (The Journal of Neurophysiology 1999, 81, 1974–7) beschreibt die Expression der menschlichen Kaliumkanalproteine "hKv4.3 long" und "hKv4.3 short" in Xenopus Oocyten.Dilks et al. (The Journal of Neurophysiology 1999, 81, 1974-7) the expression of the human potassium channel proteins "hKv4.3 long" and "hKv4.3 short" in Xenopus oocytes.
Die Datenbankeinträge AAD22053 und AAC05122 geben die Sequenzen für Kv4.2 und Kv4.3 an.The Records AAD22053 and AAC05122 indicate the sequences for Kv4.2 and Kv4.3.
Kong et al. (AJP – Heart and Circulatory Physiology 1998, 275 (6), H1963–H1970) offenbart die Heteromultimerisierung von Kaliumkanalproteinuntereinheiten. Xu et al. (J. Biol. Chem. 1995, 270 (42) 24761–8) beschreibt, dass Mitglieder der Kv4(Shal)-Unterfamilie Tetramere ausbilden.Kong et al. (AJP - Heart and Circulatory Physiology 1998, 275 (6), H1963-H1970) discloses heteromultimerization of potassium channel protein subunits. Xu et al. (J. Biol. Chem. 1995, 270 (42) 24761-8), members of the Kv4 (Shal) subfamily train tetramers.
Zusätzlich zu α-Untereinheiten von Kv1 bis Kv4 sind noch weitere potentielle Kvα-Untereinheiten bekannt (M. A. Post et al., FEBS 399 (1996) 177–182; J. P. Hugnot et al., EMBO 15 (1996) 3322–3331; A. Castellano et al., J. Neurosci. 17 (1997) 4652–4661; J. A. Drewe et al., J. Neurosci. 12 (1992) 538–548), die zu Kv1 bis Kv4 bezogen auf die Aminosäuren eine Sequenzidentität von < 60% zeigen. Diese Kanäle wurden als Kv5.1, Kv6.1, Kv7.1, Kv8.1 bezeichnet. Hauptmerkmal dieser α-Untereinheiten ist, daß sie zwar für Kaliumkanal α-Untereinheiten typische Sequenzmerkmale enthalten, aber als Homomultimere keine funktionellen Kanäle in heterologen Expressionsystem ausbilden.In addition to α subunits of Kv1 to Kv4, other potential Kvα subunits are known (MA Post et al., FEBS 399 (1996) 177-182; JP Hugnot et al., EMBO 15 (1996) 3322-3331; Cas tellano et al., J. Neurosci. 17 (1997) 4652-4661; JA Drewe et al., J. Neurosci. 12 (1992) 538-548), which show a sequence identity of <60% to Kv1 to Kv4 relative to the amino acids. These channels were named Kv5.1, Kv6.1, Kv7.1, Kv8.1. The main feature of these α-subunits is that they contain typical sequence characteristics for potassium channel α subunits but, as homomultimers, do not form functional channels in heterologous expression systems.
Spannungsabhängige Kaliumkanäle können vielfältige physiologische Aufgaben übernehmen, die von der Regulation des Membranruhepotentials bis hin zur Regulation der Exozytose und Zellproliferation reichen. In erregbaren Zellen haben spannungsabhängige Kaliumkanäle eine wichtige Bedeutung für die Repolarisation der Aktionspotentiale und die Regulation des Schwellenwertes, von dem aus ein Aktionspotential ausgelöst werden kann. Insofern steuert die Aktivität von Kaliumkanälen sowohl die Dauer und Verlaufsform des Aktionspotentials als auch die Aktionspotentialauslösungsfrequenz. Dies gilt auch für die rhythmische Erzeugung von Aktionspotentialen im Herzmuskelgewebe, dem Myocard (R. E. Ten Eick et al., FASEB J. 6 (1992) 2568–2580).Voltage-dependent potassium channels can be diverse physiological Take over tasks, from regulation of the resting potential of the membrane to regulation of exocytosis and cell proliferation. In excitable cells have voltage-dependent potassium channels one important for the repolarization of the action potentials and the regulation of the Threshold from which an action potential is triggered can. In that sense, the activity of potassium channels controls both the duration and history of the action potential as well as the action potential trigger frequency. This also applies to the rhythmic generation of action potentials in the heart muscle tissue, the myocardium (R.E. Ten Eick et al., FASEB J. 6 (1992) 2568-2580).
Mehrere distinkte Kaliumkanaltypen sind an der Generierung und Repolarisierung der Aktionspotentiale im Myocard beteiligt. An der Repolarisierung sind Kv-Kanäle beteiligt, die insbesondere die Ströme Ito, IKR und ISK vermitteln. Ito ist ein schnell aktivierender transienter Kaliumauswärtsstrom, IKR ist ein schnell aktivierender, nicht-inaktivierender Kaliumauswärtsstrom, ISK ist ein langsam aktivierender Kaliumauswärtsstrom. Diese Ströme wurden an dissoziierten, in Kultur gehaltenen Myocardzellen gemessen (R. C. Kass und L. C. Freeman, Trends Cardiovasc. Med. 3 (1993) 149–159; D. M. Barry und J. M. Nerbonne, Ann. Rev. Physiol. 58 (1996) 363–394). Die Analyse von erblichen Herzrhythmusstörungen, die zu einem langen QT-Syndrom, d. h. einer verzögerten Repolarisierung des kardiakalen Aktionspotentials, führen, hat gezeigt, daß der ISK-Strom im wesentlichen durch die Kv-Kanäle KCNQ1/KCNE1 vermittelt wird (M. C. Sanguinetti et al., Nature 384 (1996) 80–83; J. Berhanin et al., Nature 384 (1996) 78–80; C. Chouabe et al., EMBO J. 16 (1997) 5472–5479). Der IKR-Strom wird durch die Kv-Kanäle KCNH2/KCNE2 Kv-Kanäle vermittelt, die zur Nachhyperpolarisierung und damit zur Stabilisierung des Schwellenwertes beitragen (P. L. Smith et al., Nature 379 (1996) 833–836; 1998; G. W. Abbott et al., Cell 97 (1999) 175–187).Several distinct potassium channel types are involved in the generation and repolarization of the action potentials in the myocardium. The repolarization involves Kv channels, which in particular mediate the currents I to , I KR and I SK . I to is a fast-acting transient potassium outward current, I KR is a fast-acting, non-inactivating potassium outward current, I SK is a slowly-activating potassium outward current. These currents were measured on dissociated cultured myocardial cells (RC Kass and LC Freeman, Trends Cardiovasc Med 3 (1993) 149-159, DM Barry and JM Nerbonne, Ann Rev. Physiol 58 (1996) 363-394 ). The analysis of hereditary cardiac arrhythmias leading to a long QT syndrome, that is, a delayed repolarization of cardiac action potential, has shown that the I SK current is mediated essentially by the Kv channels KCNQ1 / KCNE1 (MC Sanguinetti et al , Nature 384 (1996) 80-83, J. Berhanin et al., Nature 384 (1996) 78-80, C. Chouabe et al., EMBO J. 16 (1997) 5472-5479). The I KR current is mediated by the Kv channels KCNH2 / KCNE2 Kv channels, which contribute to posthypert Polarization and thus to threshold stabilization (PL Smith et al., Nature 379 (1996) 833-836, 1998, GW Abbott et al., Cell 97 (1999) 175-187).
Pharmakologisch ist es möglich, KCNN1/KCNE2 Kanäle relativ spezifisch durch Pharmaka wie E-4031 zu blockieren (P. S. Spector et al., Circ Res. 78 (1996) 499–503).pharmacological Is it possible, KCNN1 / KCNE2 channels relatively specifically blocked by drugs such as E-4031 (P.S. Spector et al., Circ. Res. 78 (1996) 499-503).
In Nagern sind Kanäle des hier beschriebenen Typus, Kv4.2, an der Ausbildung des Ito beteiligt (D. C. Johns et al., J. Biological. Chem. 272 (1997) 31598–31603; D. M. Barry et al., Circ. Res. 83 (1998); T. Y. Nakamura et al., Am. J. Physiol. 273 (1997) 1775–1786). Für das humane Herz wird hingegen angenommen, daß Kv-Kanäle des Typus Kv4.3 (W. Kong et al., Am. J. Physiol. 275 (1998) H1963–H1970) zum Ito vermitteln (Kääb et al., Circ. Res. 98 (1998) 1383–1393) während Kv4.2 keine wesentliche Rolle zu spielen scheint (J. E. Dixon et al., Circ. Res. 79 (1996) 659–668; diese Schrift).In rodents, channels of the type described here, Kv4.2, are involved in the formation of I to (Johns DC et al., J. Biological Chem 272 (1997) 31598-31603, Barry, DM, et al., Circ 83 (1998); TY Nakamura et al., Am. J. Physiol. 273 (1997) 1775-1786). For the human heart, however, it is assumed that Kv channels of the Kv4.3 type (W.Kong et al., Am. J. Physiol 275 (1998) H1963-H1970) mediate to I to (Kääb et al., Circ Res. 98 (1998) 1383-1393) while Kv4.2 does not appear to play a significant role (JE Dixon et al., Circ. Res. 79 (1996) 659-668, this document).
Herzrhythmusstörungen werden gegenwärtig häufig mit Ionenkanalblockern behandelt. Die Wirkungsweise dieser Blocker läßt sich dahingehend klassifizieren, ob sie die Depolarisierungsgeschwindigkeit (Anstieg) des kardiakalen Aktionspotentials verzögern (z. B. Flecainid, Phenytoin) bzw. die Dauer des kardiakalen Aktionspotentials verlängern (z. B. Sotalol, Aminodaron, Chinidin, Disopyramid) (T. J. Colatsky in Potassium Channel Modulators (Herausgeber A. H. Weston and T. C. Hamilton) (1992) Blackwell Scientific Publ.; Oxford; pp. 304–340).Become cardiac arrhythmias currently often treated with ion channel blockers. The mode of action of this blocker let yourself classify whether they are the rate of depolarization (Increase) of the cardiac action potential (eg flecainide, phenytoin) or extend the duration of the cardiac action potential (z. Sotalol, aminodarone, quinidine, disopyramide) (T.J. Colatsky in Potassium Channel Modulators (Editors A.H. Weston and T.C. Hamilton) (1992) Blackwell Scientific Publ .; Oxford; pp. 304-340).
Bei der Behandlung von Herzrhythmusstörungen spielen Antiarrhythmika klinisch eine wichtige Rolle. Die Klassifizierung der Antiarrhythmika erfolgt in vier Klassen, wobei zu Klasse I z. B. Flecainid und Chinidin gezählt werden. Diese Substanzen blockieren zum einem den Natriumkanal und verzögern damit den Anstieg des Aktionspotentials, zum anderen wirken sie aber auch auf Kaliumkanäle, insbesondere solche die an der Ausbildung des Ito beteiligt sind.Antiarrhythmics are clinically important in the treatment of cardiac arrhythmias. Classification of antiarrhythmic drugs is in four classes, with class I z. Flecainide and quinidine are counted. On the one hand these substances block the sodium channel and thus delay the increase of the action potential, on the other hand they also act on potassium channels, especially those involved in the formation of the I to .
Die Verabreichung von Antiarrhythmika ist häufig mit erheblichen Nachteilen für den Patienten verbunden, die sich bei den Patienten im Auftreten von Kopfschmerzen, Schwindel, Augenflimmern oder Magen-Darmstörungen manifestieren können (J. Braun und R. Preuss. Klinikleitfaden Intensivmedizin, 2. Auflage, Jung Johann Verlagsgesellschaft, Neckarsulm/Stuttgart (1992)). Bei älteren Patienten kommen häufig hypotone Kreislaufstörungen vor. Bei stark vorgeschädigtem Myokard könne unerwünschte Beeinträchtigungen der Erregungsleitung im HIS-Purkinje-System und der Myokardkontraktilität auftreten (P. Vigreux et al., Therapie 50 (1995) 413–418; P. J. Podrid und J. L. Anderson, Am. J. Cardiol. 15 (-1996) 430–434; E. Aliot und I. Denjoy, Am. J. Cardiol. 77 (1996) 66A–71A).The Administration of antiarrhythmic drugs is often with significant disadvantages for the Patients associated with the onset of patients Headache, dizziness, eye fibrillation or gastrointestinal disorders manifest can (J. Braun and R. Preuss, Clinical Guide Intensive Care Medicine, 2nd edition, Jung Johann Verlagsgesellschaft, Neckarsulm / Stuttgart (1992)). In elderly patients come often hypotonic circulatory disorders in front. For heavily damaged Myocardium could undesirable impairments of excitation conduction in the HIS-Purkinje system and myocardial contractility (P. Vigreux et al., Therapy 50 (1995) 413-418; P.J. Podrid and J.L. Anderson, Am. J. Cardiol. 15 (-1996) 430-434; E. Aliot and I. Denjoy, Am. J. Cardiol. 77 (1996) 66A-71A).
Aufgrund der Nebenwirkungen von Flecainid und anderen im Stand der Technik bekannten Antiarrhythmika wird ständig nach neuen Wirkstoffen gesucht. Das gezielte Screening nach neuen Antiarrhythmika erfolgt in der Pharma-Industrie bislang in der Regel mit Hilfe relativ aufwendiger Organ- bzw. Gewebepräparate. Dabei wird z. B. die Funktion eines isolierten Kaninchenherzens unter entweder einem konstanten Druck oder einem konstanten Fluß gemessen (A. von Bethmann et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153 (1996) A529).by virtue of the side effects of Flecainide and others in the art known antiarrhythmics is constantly looking for new drugs searched. Targeted screening for new antiarrhythmic drugs takes place In the pharmaceutical industry so far with the help of relatively expensive Organ or tissue preparations. This z. B. the function of an isolated rabbit heart measured under either a constant pressure or a constant flow (A. of Bethmann et al., Am J. Respir, Crit. Care Med. 153 (1996) A529).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein neues Testsystem (Assay) zur Verfügung zu stellen, das geeignet ist, Stoffe auf ihre Eignung als Antiarrhythmika zu testen, d. h. mit dem getestet werden kann, ob Wirkstoffe spezifisch die für Ito-Ströme verantwortlichen Kanäle beeinflussen. Mit dem Testsystem sollen Pharmaka somit auf ihre Wirkung gegenüber Ito-Strömen überprüft werden können. Insbesondere soll das Testsystem geeignet sein, Wirkstoffe zu identifizieren, die wenig oder gar nicht mit den Kanälen interagieren, die Ito-Ströme leiten und somit die bei den bislang bekannten Antiarrhythmika beobachteten Nebenwirkungen nicht aufweisen. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Assay zur Verfügung zu stellen, der den bislang notwendigen Einsatz von Organkulturen überflüssig macht oder zumindest stark einschränkt.It is therefore an object of the present invention to provide a novel test system (assay) which is suitable for testing substances for their suitability as antiarrhythmics, ie for testing whether active substances specifically regulate the channels responsible for I to currents influence. With the test system, pharmaceuticals should be able to be checked for their effect on I to currents. In particular, the test system should be suitable for identifying active ingredients which interact little or not with the channels which conduct I to currents and thus do not have the side effects observed with the antiarrhythmics known hitherto. It is a further object of the present invention to provide an assay which obviates or at least severely restricts the hitherto necessary use of organ cultures.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch Wirtszellen gelöst, die den spannungsabhängigen Kaliumkanal Kv4.1, Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3, oder Kv4.1/4.2/4.3 exprimieren, d. h. einen Kaliumkanal, der aus vier Untereinheiten besteht, wobei die Untereinheiten aus der Gruppe bestehend aus Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 ausgewählt sind.According to the invention Task solved by host cells, the voltage-dependent Potassium channel Kv4.1, Kv4.1 / Kv4.2, Kv4.1 / Kv4.3, or Kv4.1 / 4.2 / 4.3 express, d. H. a potassium channel that consists of four subunits where the subunits are selected from the group consisting of Kv4.1, Kv4.2 and Kv4.3 selected are.
Gemäß der hier gewählten Terminologie handelt es sich bei dem mit "Kv4.1" bezeichneten Kaliumkanal somit um ein Homotetramer bestehend aus vier Kv4.1-Kaliumkanaluntereinheiten. Mit "Kv4.1/Kv4.2" wird beispielsweise ein Kaliumkanal bezeichnet, der aus den Untereinheiten Kv4.1 und Kv4.2 besteht, die ein Heterotetramer bilden, wobei alle denkbaren stöchiometrischen Verhältnisse (d. h. 1:3, 2:2, 3:1; bei 0:4 oder 4:0 handelt es sich um ein Homotetramer) eingeschlossen sind. "hKv4" bezeichnet einen Kv4-Kanal humanen Ursprungs. Soweit im folgenden "Kv4" verwendet wird, umfaßt dieser Begriff alle zur Kv4-Familie zählenden Untereinheiten, wie z. B. Kv4.1, Kv4.2, Kv4.3.According to the here selected Terminology is the "Kv4.1" designated potassium channel thus a Homotetramer consisting of four Kv4.1 potassium channel subunits. For example, "Kv4.1 / Kv4.2" a potassium channel, consisting of the subunits Kv4.1 and Kv4.2 exists, which form a heterotetramer, with all conceivable stoichiometric conditions (i.e., 1: 3, 2: 2, 3: 1; 0: 4 or 4: 0 is a homotetramer) are included. "hKv4" denotes one Kv4 channel of human origin. As far as "Kv4" is used in the following, comprises this term includes all Kv4 family subunits, such as z. Kv4.1, Kv4.2, Kv4.3.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die humane Kaliumkanaluntereinheit Kv4.2 sehr spezifisch im zentralen Nervensystem (ZNS), im Gegensatz zu Nagern (Zhn X. R. Receptor Channels 6 (1999) 387–400) aber kaum im Myokard exprimiert wird (siehe Beispiel 3). Unerwartet war auch der Befund, daß die bislang nicht klonierte Untereinheit Kv4.1 in vielen Geweben und auch im humanen Myokard exprimiert wird. Es ist daher davon auszugehen, daß die meisten Kv4-Kanäle Kv4.1 als Untereinheit enthalten. In Northern blots von mRNA extrahiert aus verschiedenen humanen Geweben wurde Kv4.2 mRNA nur im Gehirn, Kv4.1 und Kv4.3 mRNA hingegen sowohl im Gehirn als auch in Herz, Lunge, Placenta, Leber, Niere, Pankreas und Skelettmuskel nachgewiesen (Beispiel 3).It was surprisingly found that the human potassium channel subunit Kv4.2 very specific in central Nervous system (CNS), in contrast to rodents (Zhn X. R. Receptor Channels 6 (1999) 387-400) but hardly expressed in the myocardium (see Example 3). Unexpectedly was also the finding that so far not cloned subunit Kv4.1 in many tissues and also in the human myocardium is expressed. It is therefore to be assumed that the Most Kv4 channels Kv4.1 as subunit included. In Northern blots extracted from mRNA from various human tissues, Kv4.2 mRNA was found only in the brain, Kv4.1 and Kv4.3 mRNA, however, both in the brain and in the heart, Lung, placenta, liver, kidney, pancreas and skeletal muscle detected (Example 3).
Durch diese Erkenntnis ist somit die Entwicklung von Assays möglich, mit deren Hilfe sich die Organspezifität (Herz oder ZNS) von Substanzen, die auf Kaliumkanäle der Kv4-Unterfamilie wirken, bestimmen läßt. Dies ist von großer Bedeutung, da sich auf diese Weise z. B. Antiarrhythmika entwickeln lassen, die die Blut-Hirn-Schranke zwar passieren können, jedoch keine Wirkung auf den ZNS-spezifischen Kaliumkanal Kv4.2 ausüben. Es ist zu erwarten, daß derartige Wirkstoffe die mit herkömmlichen Antiarrhythmika assoziierten Nebenwirkungen wie Kopfschmerz, Schwindel oder Augenflimmern nicht aufweisen sollten, so diese Nebenwirkungen durch Interaktion mit Kv4.2-Kanälen verursacht werden.By This realization is thus possible with the development of assays whose help is the organ specificity (heart or CNS) of substances, on potassium channels the Kv4 subfamily act, let determine. This is very important because in this way z. B. develop antiarrhythmic drugs, Although the blood-brain barrier can happen, but no effect on the CNS specific potassium channel Kv4.2. It is expected that such Active ingredients with conventional Antiarrhythmic associated side effects such as headache, dizziness or eye flicker should have, so these side effects through interaction with Kv4.2 channels caused.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen (funktionellen) Kv4.1- und Kv4.2-Kanäle hochsensitiv gegen das Klasse I Herzantiarrhythmikum Flecainid sind, d. h. einen hochaffinen Rezeptor für das Klasse I Antiarrhythmikum Flecainid darstellen. Dies könnte ein Grund für die o. g. Nebenwirkungen von Antiarrhythmika im allgemeinen und von Flecainid im besonderen sein.in the Within the scope of the present invention, it has been possible to show that the (functional) Kv4.1 and Kv4.2 channels are highly sensitive to the Class I cardiac antiarrhythmic Flecainid, d. H. a high-affinity receptor for the class I antiarrhythmic drug Represent Flecainid. this could a reason for the o. g. Side effects of antiarrhythmic drugs in general and of Flecainid in particular.
Kv4.1- und Kv4.3-Untereinheiten vermitteln transiente schnell-inaktivierende Kaliumauswärtsströme, die aufgrund ihrer Eigenschaften zu Ito-Strömen beitragen können. Aufgrund des Vorkommens der humanen Kv4.1-, Kv4.2- und Kv4.3-Untereinheiten im humanen ZNS und der gefundenen Eigenschaften der vermittelten Auswärtströme können Kv4.1-, Kv4.2- und Kv4.3-Kanäle bzw. Kanäle, die Kv4.1-, Kv4.2- und/oder Kv4.3-Untereinheiten (d. h. sowohl Homo- als auch Hetereotetramere) enthalten, somatodendritische Kaliumkanäle bilden, die einen transienten schnell-inaktivierenden, sog. A-Typ Kaliumauswärtsstrom in Dendriten und im Soma eines Neurons vermitteln. Von diesen Strömen ist bekannt, daß sie einen wichtigen Beitrag zur Erzeugung, Integration und Weiterleitung dendritischer Aktionspotentiale leisten (D. A. Hoffmann und D. Johnston, J. Neurosci. 18 (1998) 3521–3528). Diesem Prozeß wird eine wesentliche Bedeutung bei Lern- und Gedächtnisvorgängen beigemessen, die im Zusammenhang mit Langzeitpotenzierungen synaptischer Übertragungen stehen (D. A. Hoffmann et al., Nature 387 (1997) 869–875). Im neuronalen Bereich spielen Kaliumkanäle somit eine entscheidende Rolle in der Regulation der Aktivität von Neuronen. Modulatoren dieser Kaliumka näle können daher potentiell nicht nur Lern- und Gedächtnisfunktionen beeinflussen, sondern – aufgrund des hohen Vorkommens der Kv4.2 Kaliumkanaluntereinheit in humaner striataler Cortex und in humaner Substantia nigra – beispielsweise auch bei (neurodegerativen) Erkrankungen des Nervensystems (z. B. Autismus, Epilepsien, Ischämien, Schlaganfall, Morbus Parkinson, Morbus Huntington und Alzheimersche Erkrankung) therapeutisch eingesetzt werden.Kv4.1 and Kv4.3 subunits mediate transient fast-inactivating potassium outward currents, which by their properties can contribute to I to currents. Due to the presence of the human Kv4.1, Kv4.2 and Kv4.3 subunits in the human CNS and the found properties of the mediated outward currents, Kv4.1, Kv4.2 and Kv4.3 channels or channels, contain the Kv4.1, Kv4.2 and / or Kv4.3 subunits (ie both homo- and hetereotetramers) that form somatodendritic potassium channels that have a transient fast-inactivating, so-called A-type potassium outward current in dendrites and in the Mediate soma of a neuron. These currents are known to make an important contribution to the generation, integration and transmission of dendritic action potentials (DA Hoffmann and D. Johnston, J. Neurosci 18 (1998) 3521-3528). This process becomes essential in learning and memory attributed to long-term potentiation of synaptic transmissions (DA Hoffmann et al., Nature 387 (1997) 869-875). In the neuronal domain, potassium channels play a crucial role in the regulation of the activity of neurons. Modulators of these potassium channels can therefore potentially influence not only learning and memory functions, but - due to the high occurrence of the Kv4.2 potassium channel subunit in human striatal cortex and in human substantia nigra - for example also in (neurodeconomic) diseases of the nervous system (eg. Autism, epilepsy, ischaemia, stroke, Parkinson's disease, Huntington's disease and Alzheimer's disease) can be used therapeutically.
Die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle eignen sich somit nicht nur in besonderer Weise zur gezielten Identifizierung und Entwicklung von Wirkstoffen zur Behandlung von Erkrankungen des Herzkreislaufsystems sondern auch des Nervensystems in Mensch und Tier, insbesondere von Antineurodegenerativa. Kv4.1 und Kv4.3 homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.3 heterotetramere Kaliumkanäle werden im Herzen exprimiert, nicht aber Kv4.2 homotetramere bzw. Kv4.1/Kv4.2, Kv4.2/Kv4.3, Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3 heterotetramere Kanäle. Diese sind besonders geeignet zur Suche nach spezifischen Wirkstoffen zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems (s. o.).The Potassium channels according to the invention are suitable thus not only in a special way for targeted identification and development of drugs for the treatment of diseases of the cardiovascular system but also of the nervous system in humans and animal, in particular antineurodegenerativa. Kv4.1 and Kv4.3 homotetramer or Kv4.1 / Kv4.3 heterotetramer potassium channels expressed in the heart, but not Kv4.2 homotetramers or Kv4.1 / Kv4.2, Kv4.2 / Kv4.3, Kv4.1 / Kv4.2 / Kv4.3 heterotetrameric channels. These are especially suitable for the search for specific active ingredients for treatment of diseases of the nervous system (see above).
Erfindungsgemäß werden daher neue humane Kaliumkanaluntereinheiten Kv4.1 zur Verfügung gestellt, die die in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen. Die Untereinheit Kv4.3 weist die in SEQ ID NO: 29 dargestellte Sequenz auf. [Die Angabe "SEQ ID NO:" entspricht der numerischen Kennzahl "<400>" im Sequenzprotokoll]. Kv4.2 weist die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Sequenz auf.According to the invention therefore provided new human potassium channel subunits Kv4.1, which have the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2. The Subunit Kv4.3 has the sequence shown in SEQ ID NO: 29 on. [The indication "SEQ ID NO: "corresponds the numerical code "<400>" in the sequence listing]. Kv4.2 has the in SEQ ID NO: 4 shown sequence.
Die erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine (Untereinheiten) sind auf verschiedenen, dem Fachmann bekannten Wegen erhältlich. Zum einen können Kaliumkanalproteine derselben mittels chemischer Synthese hergestellt werden. Desweiteren können Antikörper gegen Fragmente der Polypeptide nach dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden (E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Mittels dieser Antikörper kann dann das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein aus Zellen isoliert werden, die natürlicherweise das Kaliumkanalprotein exprimieren, es ist aber ebenso denkbar, daß Zellen verwendet werden, in die für das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein kodierende Nukleinsäuresequenzen eingeführt werden und die das Protein anschließend unter geeigneten Bedingungen exprimieren.The potassium channel proteins according to the invention (Subunits) are at various, known in the art Because available. For one thing Potassium channel proteins of the same produced by chemical synthesis become. Furthermore you can antibody against fragments of the polypeptides according to methods known to those skilled in the art E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). By means of these antibodies can then the potassium channel protein according to the invention isolated from cells that are naturally the potassium channel protein but it is also conceivable that cells are used in the for the potassium channel protein according to the invention coding nucleic acid sequences introduced and then the protein under appropriate conditions express.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kaliumkanal, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er mindestens die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.1 enthält. Erfindungsgemäß kann der Kaliumkanal neben der Untereinheit Kv4.1 auch andere Kaliumkanaluntereinheiten enthalten. Dabei kommen besonders die Untereinheiten Kv4.2 und Kv4.3 in Frage sowie Homologe, Derivate (z. B. phosphorylierte Untereinheiten und durch Mutagenese veränderte Untereinheiten oder Fragmente derselben, die die gleiche elektrobiologische, pharmakologische und/oder biologische Wirkung und/oder Immunogenität aufweisen. Besonders bevorzugt enthält er zusätzlich die Kaliumkanaluntereinheit Kv4.3. Wie bereits oben erwähnt, können diese Kaliumkanäle in Form von Homo- oder Heterotetrameren vorliegen, wobei die Kanäle Kv4.1, Kv4.1/Kv4.2, und Kv4.1/Kv4.3 sind.object The invention further provides a potassium channel characterized is that he contains at least the potassium channel subunit Kv4.1. According to the invention of Potassium channel in addition to the subunit Kv4.1 also other potassium channel subunits contain. In particular, the subunits Kv4.2 and Kv4.3 come and homologs, derivatives (eg phosphorylated subunits and altered by mutagenesis Subunits or fragments thereof, which have the same electrobiological, have pharmacological and / or biological activity and / or immunogenicity. Particularly preferably contains he additionally potassium channel subunit Kv4.3. As mentioned above, these can potassium channels in the form of homo- or heterotetramers, with the channels Kv4.1, Kv4.1 / Kv4.2, and Kv4.1 / Kv4.3.
Die spezifischen Inaktivierungseigenschaften des Kaliumkanals hängen von den Kaliumkanaluntereinheiten ab, die er neben Kv4.1 enthält. Enthält er neben Kv4.1 eine andere Kaliumkanaluntereinheit, so handelt es sich um einen spannungsabhängigen Kaliumkanal, der bei Depolarisierung der Membran Auswärtsströme vermit telt, die gleich, schneller oder langsamer inaktivieren als die vom Vergleichskanal Kv4.1 vermittelten Ströme.The specific inactivation properties of the potassium channel depend on potassium channel subunits that it contains next to Kv4.1. Does he contain beside Kv4.1 another potassium channel subunit, so it is a voltage-dependent Potassium channel, which mediates outflows when the membrane is depolarized, which inactivate the same, faster or slower than those from the comparison channel Kv4.1 mediated currents.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Nukleinsäuresequenzen, die für die erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine bzw. Kaliumkanäle, kodieren. Besonders bevorzugt können diese erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden aus:
- (a) der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleotidsequenz,
- (b) allelischen Varianten und Fragmenten der unter (a) genannten Sequenzen (soweit sie für Protein und Polypeptide mit gleicher elektropbiologischer, pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität kodieren).
- (a) the nucleotide sequence given in SEQ ID NO: 1,
- (b) allelic variants and fragments of the sequences mentioned under (a) (insofar as they code for protein and polypeptides having the same electropiological, pharmacological and / or biological activity and / or immunogenicity).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er eine oder mehrere der oben genannten Nukleinsäuresequenzen enthält. Geeignete Vektoren sind pBluescript KS+ und pBluescript KS– (Stratagene, La Jolla, CA, US), sind aber nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor, wie z. B. pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US), wobei die Erfindung aber nicht auf diesen beschränkt ist.object The invention further provides a vector characterized is that he contains one or more of the above-mentioned nucleic acid sequences. suitable Vectors are pBluescript KS + and pBluescript KS- (Stratagene, La Jolla, CA, US), but are not limited to these. Preferably, the vector is an expression vector, such as. PcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, US), but the invention is not limited to these.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können in diese Vektoren nach allgemeinen bekannten Methoden kloniert werden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, US). Erfindungsgemäß enthalten die Expressionsvektoren Kontrollelemente für Transkription, Transkriptionsstart, Transkriptionsende, mRNA-Prozessierung und Translation, die in den erfindungsgemäß verwendeten Expressionsystemen in aktiver Form vorliegen.The Nucleic acid sequences of the invention can be cloned into these vectors according to generally known methods (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, US). Included in the invention the expression vectors control elements for transcription, transcription start, Transcriptional end, mRNA processing and translation, which are described in the used according to the invention Expression systems in active form.
Vorzugsweise enthalten die Vektoren Sequenzen, die die Replikation der oben genannten Nukleinsäuremolekäle erleichtern. Besonders bevorzugt enthalten sie ferner Sequenzen, die die Integration der Nukleinsäuresequenzen in das Genom einer Wirtszelle erleichtern.Preferably the vectors contain sequences that replicate the above Facilitate nucleic acid molecules. More preferably, they also contain sequences that integrate the nucleic acid sequences into the genome of a host cell.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung entsprechen die Vektoren den am 23.12.1999 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland, in Form transformierter E. coli-Stämme nach dem Budapester Vertrag hinterlegten Vektoren mit den Zugriffsnummern DSM 13222 und DSM 13221, die eine für hKv4.1 (im Vektor pcDNA3; DSM 13222) bzw. hKv4.2 (im Vektor pGEM HE; DSM 13221) kodierende Nukleinsäuresequenz enthalten.According to one embodiment of the invention, the vectors correspond to the vectors deposited on December 23, 1999 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany, in the form of transformed E. coli strains according to the Budapest Treaty Accession numbers DSM 13222 and DSM 13221, which contain a nucleic acid sequence coding for hK v 4.1 (in vector pcDNA3; DSM 13222) or hK v 4.2 (in vector pGEM HE; DSM 13221).
Gegenstand der Erfindung sind ferner Wirtszellen, die mit den genannten Vektoren, die für eine Kaliumkanaluntereinheit kodieren (vorzugsweise Kv4.1 oder Kv4.2), transformiert sind. Besonders bevorzugt sind diese Wirtszellen CHO-Zellen oder Xenopus Oozyten, es kommen aber auch andere Eukaryontenzellen aus der Gruppe bestehend aus COS, HEK 293, NIH-3T3 in Frage, die Erfindung ist aber nicht auf diese Zellen beschränkt. Von Bedeutung ist, daß die Promotor- und/oder Enhancersequenzen auf die mit den Vektoren transformierten Wirtszellen abgestimmt sind. Dadurch kann eine erhöhte Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide sichergestellt werden.object The invention furthermore relates to host cells which are compatible with the said vectors, the for encode a potassium channel subunit (preferably Kv4.1 or Kv4.2), are transformed. Most preferably, these host cells are CHO cells or Xenopus oocytes, but there are also other eukaryotic cells from the group consisting of COS, HEK 293, NIH-3T3 in question, the However, the invention is not limited to these cells. It is important that the promoter and / or enhancer sequences to those transformed with the vectors Host cells are matched. This can increase expression the polypeptides of the invention be ensured.
Ferner ist eine Wirtszelle Gegenstand dieser Erfindung, die zusätzlich zu einem der oben genannten Vektoren mit mindestens einem weiteren Vektor transformiert ist, der vorzugsweise eine abweichende Nukleinsäuresequenz enthält, d. h. eine Sequenz, die z. B. für eine andere Kaliumkanaluntereinheit aus der Gruppe bestehend aus Kv4.1, Kv4.2 und Kv4.3 kodiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält die Wirtszelle Vektoren, die entweder für die Kaliumkanaluntereinheiten Kv4.1 und Kv4.2 oder für die Untereinheiten Kv4.1 und Kv4.3 oder die für Homologe, Derivate oder Fragmente derselben kodieren. Ferner kommen auch oligo-/multicistronische Expressionssysteme in Frage.Further is a host cell subject of this invention, in addition to one of the above vectors with at least one other Vector, preferably a different nucleic acid sequence contains d. H. a sequence z. For example another potassium channel subunit from the group consisting of Kv4.1, Kv4.2 and Kv4.3. According to a particular embodiment contains the host cell vectors responsible for either the potassium channel subunits Kv4.1 and Kv4.2 or for the subunits Kv4.1 and Kv4.3 or those for homologs, derivatives or fragments encode it. There are also oligo- / multicistronic Expression systems in question.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere eine Wirtszelle, die einen funktionellen Kaliumkanal exprimiert, der Kaliumkanaluntereinheit Kv4.1 (entweder als Homo- oder Heterotetramer und gegebenenfalls zusammen mit Kv4.2 und oder Kv4.3) enthält. Vorzugsweise exprimiert die Wirtszelle den funktionellen Kaliumkanal auf ihrer Oberfläche, es ist aber ebenso möglich, daß der funktionelle Kaliumkanal in intrazellulären Membranen exprimiert wird.object In particular, the present invention is a host cell which expresses a functional potassium channel, the potassium channel subunit Kv4.1 (either as a homo- or heterotetramer and optionally together with Kv4.2 and or Kv4.3). Preferably expressed the host cell the functional potassium channel on its surface, it but it is also possible that the functional potassium channel is expressed in intracellular membranes.
Erfindungsgemäß eingeschlossen ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, die von den erfindungsgemäßen Wirtszellen exprimierten Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren und/oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man
- (a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen den Kaliumauswärtsstrom mißt,
- (b) die Wirtszellen mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt bringt und
- (c) an den Wirtszellen erneut den Kaliumauswärtsstrom mißt,
- (a) measures the potassium outward current of the host cells according to the invention,
- (b) bringing the host cells into contact with a substance to be examined, and
- (c) again measuring the potassium outflow current at the host cells,
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als öffnende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz bei einem Membranpotential, bei dem ohne Zugabe der Substanz keine Kaliumauswärtsstrom fließen, Kaliumauswärtzsstrome fließen.According to the invention is a Substance as opening Substance, if, after addition of the substance at a membrane potential, in which without the addition of the substance no potassium outward flow, potassium outflow flow.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine aktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom verstärkt wird.According to the invention is a Substance is referred to as an activating substance, if after adding the Substance an already existing potassium upward current is amplified.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine inaktivierende Substanz bezeichnet, wenn nach Zugabe der Substanz ein bereits vorhandener Kaliumauwärtsstrom vermindert wird, ohne daß der Kaliumauswärtsstrom vollständig zum Erliegen kommt.According to the invention, a substance is referred to as an inactivating substance when after Zuga An already existing potassium upflow is reduced in the substance without the potassium outflow completely coming to a standstill.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz als eine verändernde Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz biophysikalische Eigenschaften des Kaliumkanals wie Spannungsabhängigkeit, Leitfähigkeit, Aktivierungszeitkonstanten, Inaktivierungszeitkonstanten, Schaltverhalten, Offenzeiten oder Geschlossenzeiten verändert werden.According to the invention is a Substance as a transformative Substance refers to when adding the substance biophysical Properties of the potassium channel such as voltage dependence, conductivity, activation time constants, Inaktivierungszeitkonstanten, switching behavior, open times or Closed times changed become.
Erfindungsgemäß wird eine Substanz auch dann als eine verändernde Substanz bezeichnet, wenn durch Zugabe der Substanz die Zelloberflächenexpression des Kaliumkanals verändert wird. Eine Veränderung der Zelloberflächenexpression führt zu einer Zunahme bzw. Abnahme der zu messenden Kaliumauswärtsströme.According to the invention is a Substance then as a changing Substance refers to cell surface expression upon addition of the substance the potassium channel changed becomes. A change cell surface expression leads to an increase or decrease in the measured potassium outward currents.
Änderungen in der Spannungsabhängigkeit der Aktivierung führen erwartungsgemäß bei Testpotentialen, die Kaliumauswärtsströme hervorrufen, zu einer Stromzunahme oder Stromabnahme. Leitfähigkeitsänderungen führen ebenfalls zu einer Zu- oder Abnahme der Kaliumauswärtsströme. Änderungen der Aktivierungszeitkonstanten führen zu einer Verlangsamung oder Beschleunigung der Aktivierung von Kaliumauswärtsströmen. Änderungen der Inaktivierungszeikonstanten sowie des Schaltverhaltens können während eines Testpulses zu einer Zunahme oder Abnahme der Auswärtsströme führen. Das gleiche gilt, wenn die Offenzeiten oder Geschlossenzeiten der zu messenden Kaliumkanäle verändert werden (B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Ausgabe (1993), Sinauer Associates inc., Sunderland, Massachusetts, USA).amendments in the voltage dependence lead the activation as expected at test potentials, cause the potassium outward currents, to a power increase or current decrease. Conductivity changes also lead to an increase in or decrease in potassium outward currents. amendments lead the activation time constant to slow or accelerate the activation of potassium outflows. amendments Inaktivierungszeikonstanten and the switching behavior can during a Test pulses lead to an increase or decrease in the outward currents. The same applies if the open times or closed times to measuring potassium channels changed (B.Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd Edition (1993), Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusetts, USA).
Besonders bevorzugt exprimieren die verwendeten Wirtszellen die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle auf ihrer Oberfläche. Auf diese Weise können die Substanzen dadurch identifiziert bzw. getestet werden, daß man den Ausstrom von Ionen aus den Zellen durch den erfindungsgemäßen Kaliumkanal mißt. Das Ausströmen von Ionen wird bevorzugt mit der "patch-clamp"-Methode (vgl. z. B. O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) durch Anlegen depolarisierender Testpotentiale bestimmt.Especially Preferably, the host cells used express the potassium channels of the invention on their Surface. That way you can The substances are identified or tested by the Outflow of ions from the cells through the potassium channel according to the invention measures. The outflow of ions is preferred by the patch-clamp method (see, for example, O.P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85-100) determined by applying depolarizing test potentials.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die erfindungsgemäßen Wirtszellen nach dem Fachmann gut bekannten Methoden mit 86Rb-Ionen zu beladen, die durch Kaliumkanäle so gut wie Kaliumionen permeieren können. Die beladenen Zellen können in Gegenwart von zu testenden Substanzen kultiviert werden. Danach kann der Einfluß der Substanzen auf den 86Rb-Auswärtsstrom der mit 86Rb beladenen Zellen mit dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden (R. S. Rogowski et al., Mol. Pharmacol. 50 (1996) 1167–1177).In the context of the present invention it is further included to load the host cells according to the invention by methods which are well known to those skilled in the art with 86 Rb ions which can permeate potassium ions as well as potassium ions. The loaded cells can be cultured in the presence of substances to be tested. Thereafter, the influence of the substances on the 86 Rb outward flow of the loaded with 86 Rb cells known in the art methods can be measured (RS Rogowski et al., Mol. Pharmacol. 50 (1996) 1167-1177).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanäle zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man
- (a) an den erfindungsgemäßen Wirtszellen das Membranpotential mißt,
- (b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- (c) an den Wirtszellen erneut das Membranpotential mißt,
- (a) measures the membrane potential at the host cells according to the invention,
- (b) contacting the host cells with a substance and
- (c) again measuring the membrane potential at the host cells,
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ferner eingeschlossen, die erfindungsgemäßen Wirtszellen (insbesondere solche die Kv4.1, Kv4.2 oder Kv4.3 homomultimere Kaliumkanäle bzw. heteromultimere Kv4.1/Kv4.2, Kv4.1/Kv4.3-, oder Kv4.1/Kv4.2/Kv4.3-Kaliumkanäle beliebiger Stöchiometrie nach dem Fachmann gut bekannten Methoden mit fluoreszierenden Membranpotential-sensitiven Farbstoffen, wie z. B. DiBAC (Bis-Barbitursäureoxonol) Farbstoff (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA), zu beladen. Die beladenen Zellen können in Mikrotiterplatten übertragen werden. Mittels eines Bioassayreadergeräts (z. B. der Firma BMG LabTechnologies GmbH, Hanns-Martin-Schleyer-Str. 10, 77656 Offenburg), kann dann der Einfluß der Substanzen auf die Kaliumkanalaktivität fluoreszenzspektroskopisch mit dem Fachmann bekannten Methoden gemessen werden. Das Bioassayreadergerät mißt speziell durch den Unterschied zwischen der Membranpotential-abhängigen Fluoreszenz vor und nach Zugabe der Substanz. Wirkt die Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle, ändert sich das Membranpotential und somit die Membranpotential-abhängige Fluoreszenz. Daraus kann die Aktivität der Substanz auf die erfindungsgemäßen Kaliumkanäle bestimmt werden.In the context of the present invention is further included, the host cells according to the invention (especially those Kv4.1, Kv4.2 or Kv4.3 homomultimeric potassium channels or heteromultimer Kv4.1 / Kv4.2, Kv4.1 / Kv4.3-, or Kv4.1 / Kv4.2 / Kv4.3 potassium channels of any stoichiometry according to methods well known to those skilled in the art with fluorescent membrane potential-sensitive dyes, such as DiBAC (bis-barbituric acid oxonol) dye (Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, The loaded cells can be transferred into microtiter plates, and the influence of the substances can then be determined by means of a bioassay reader (for example from BMG LabTechnologies GmbH, Hanns-Martin-Schleyer-Strasse 10, 77656 Offenburg) The potassium channel activity can be measured by fluorescence spectroscopy using methods known to the person skilled in the art.The bioassay reader measures in particular by the difference between the membrane potential-dependent fluorescence before and after the addition of the substance If the substance binds to the potassium channels according to the invention, the membrane potential and thus the membrane potential-dependent fluorescence changes. From this the activity of the substance on the potassium channels according to the invention can be determined the.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die geeignet sind, Kaliumkanä le zu öffnen, zu schließen, zu aktivieren, zu inaktivieren oder in ihren biophysikalischen Eigenschaften zu verändern, bei dem man
- a) in den erfindungsgemäßen Wirtszellen das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom mißt,
- b) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- c) das Membranpotential und den Kaliumauswärtsstrom erneut mißt,
- a) measures the membrane potential and the potassium outward current in the host cells according to the invention,
- b) bringing the host cells into contact with a substance and
- c) again measuring the membrane potential and the potassium outflow,
Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die Phosphorylierung der erfindungsgemäßen Kv4-Kanäle in Gewebekulturzellen durch Proteinkinasen zu einer drastischen Veränderung der Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme führt. Insofern betrifft die Erfindung einerseits Wirtszellen, die phosphorylierte Kaliumkanäle enthalten sowie die Messung der Aktivität dieser Testkanäle zur Ermittlung von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zum Identifizieren und Testen von Substanzen, die Proteinkinasen aktivieren, bei dem man
- (a) in den erfindungsgemäßen Wirtszellen, die exprimierten Kv4-Kaliumkanäle durch Aktivierung von Proteinkinasen phosphoryliert,
- (b) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme mißt,
- (c) die Wirtszellen mit einer Substanz in Kontakt bringt und
- (d) die Amplitude der durch Kv4-Kanäle vermittelten transienten Auswärtsströme erneut mißt,
- (a) in the host cells according to the invention, which phosphorylates expressed Kv4 potassium channels by activating protein kinases,
- (b) measures the amplitude of the Kv4-channel-mediated transient outward currents;
- (c) contacting the host cells with a substance and
- (d) again measuring the amplitude of the outbound Kv4-channel-mediated currents,
Die Phosphorylierung der Kaliumkanäle erfolgt beispielsweise durch Proteinkinase A und C.The Phosphorylation of potassium channels for example, by protein kinase A and C.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden ferner Antikörper zur Verfügung gestellt, die an das isolierte erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden. Ferner werden Antikörper zur Verfügung gestellt, die an das erfindungsgemäße Kaliumkanalprotein binden, wobei das Kaliumkanalprotein Bestandteil eines Kaliumkanales sind und somit eine andere dreidimensional Struktur aufweisen können als die isolierten erfindungsgemäßen Kaliumkanalproteine. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann allgemein bekannt (E. Harlow und D. Lane, a. a. O.). Die Antikörper sind erhältlich, indem man Tiere mit dem erfindungsgemäßen Kaliumkanalprotein oder Derivaten oder Fragmenten desselben mit gleicher elektrophysiologischer, pharmakologischer und/oder biologischer Wirksamkeit und/oder Immunogenität immunisiert. Polykonale Antikörper werden dann aus dem Serum der Tiere gewonnen, während monoklonale Antikörper aus dem Überstand von Hybridomzellen erhältlich sind. Hybridomzellen sind erhältlich, indem man Antikörper produzie rende Zellen mit Tumorzellen fusioniert (E. Harlow and D. Lane, a. a. O.).in the The present invention further provides antibodies for disposal placed, which bind to the isolated potassium channel protein according to the invention. Furthermore, antibodies to disposal which bind to the potassium channel protein according to the invention, wherein the potassium channel protein is part of a potassium channel and thus may have a different three-dimensional structure than the isolated potassium channel proteins of the invention. Methods of producing antibodies are well known to those skilled in the art known (E. Harlow and D. Lane, supra). The antibodies are available, by animals with the potassium channel protein according to the invention or Derivatives or fragments thereof with the same electrophysiological, immunized pharmacological and / or biological activity and / or immunogenicity. Polyconical antibodies are then recovered from the serum of the animals while monoclonal antibodies the supernatant available from hybridoma cells are. Hybridoma cells are available by giving antibodies producing cells fused with tumor cells (E. Harlow and D. Lane, a. a. O.).
Die Erfindung wird im folgenden durch Beispiele, Sequenzprotokolle und Figuren verdeutlicht.The Invention will be described in the following by examples, sequence protocols and Figures clarified.
- A) Nukleotid-Sequenz der humanen Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde. Fettgedruckt ist das erste Startcondon ATG, mit dem der offene Leserahmen startet, und das Stopcodon, mit dem der offene Leserahmen aufhört.A) Nucleotide sequence of the human Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) from which the open reading frame was derived. Bold is the first starting London ATG with which the open reading frame starts, and the stop codon with which the open reading frame stops.
-
B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) der humanen Kv4.1α-Untereinheit.
Die sechs hydrophoben, möglicherweise
membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende
Domäne
ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich
auf die jeweils letzte Aminosäure
in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o, , ☐, und Δ zeigen mögliche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).B) An open reading frame of the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the human Kv4.1α subunit. The six hydrophobic, possibly membrane-spanning segments are labeled S1 through S6. The pore-forming domain is labeled with P. The numbers on the right side refer to the last amino acid in each row. The marks o,
, □, and Δ show possible phosphorylation sites for protein kinase C, Ca 2+ calmodulin-dependent protein kinase II and mitogen-activated protein kinase (MAP kinase).
-
A) Nucleotid-Sequenz der humanen Kv4.2 cDNA
(SEQ ID NO: 3), aus der der offene Leserahmen abgeleitet wurde wie
im
1 . Fettgedruckt ist das erste Startcondon ATG, mit dem der offene Leserahmen startet, und das Stopcodon, mit dem der offene Leserahmen aufhört.A) Nucleotide sequence of the human Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3), from which the open reading frame was derived as in1 , Bold is the first startcondon ATG that starts the open reading frame and the stop codon that stops the open reading frame. -
B) Offener Leserahmen der abgeleiteten Aminosäuresequenz
SEQ ID NO: 4) der humanen Kv4.2 α-Untereinheit.
Die sechs hydrophoben, möglicherweise
membranspannenden Segmente sind mit S1 bis S6 markiert. Die Porenbildende
Domäne
ist mit P markiert. Die Zahlen an der rechten Seite beziehen sich
auf die jeweils letzte Aminosäure
in der betreffenden Zeile. Die Markierungen o, , ☐, und Δ zeigen mögliche Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C, Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinase II beziehungsweise Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAP-Kinase).B) An open reading frame of the deduced amino acid sequence SEQ ID NO: 4) of the human Kv4.2 α subunit. The six hydrophobic, possibly membrane-spanning segments are labeled S1 through S6. The pore-forming domain is labeled with P. The numbers on the right side refer to the last amino acid in each row. The marks o,
, □, and Δ show possible phosphorylation sites for protein kinase C, Ca 2+ calmodulin-dependent protein kinase II and mitogen-activated protein kinase (MAP kinase). - C) Ähnlichkeit der humanen (h)Kv4.2 Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4) zu Proteinsequenzen anderer Mitglieder der humanen Kv4-Kaliumkanalfamilie (Kv4.1 (SEQ ID NO: 2) und Kv4.3. Es von Kv4.3 gibt es zwei Versionen. Gezeigt ist die lange Version (hKv4.32), die im Vergleich zur kürzeren Version ein zusätzliches Exon enthält, das unterstrichen ist.C) similarity the human (h) Kv4.2 protein sequence (SEQ ID NO: 4) to protein sequences of other members of the human Kv4 potassium channel family (Kv4.1 (SEQ ID NO: 2) and Kv4.3. There are two versions of Kv4.3. Shown is the long version (hKv4.32), which in comparison to the shorter version an additional exon contains that is underlined.
- A) Northern-Analyse der Expression humaner Kv4.1 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humane Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Eine ca. 5 kb große Kv4.1 mRNA wurde mehr oder weniger in allen Geweben detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch eine Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe kontrolliert.A) Northern analysis of expression of human Kv4.1 mRNA in different tissues. The applied mRNA is above the noted each track. The human Kv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) was used as a hybridization probe. An approx. 5 kb Kv4.1 mRNA was detected more or less in all tissues. The amount of RNA in each lane was hybridized with a labeled β-actin controlled cDNA sample.
- B) Northern-Analyse der Expression humaner Kv4.2 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humane Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. Nur in mRNA aus Gehirn bzw. Gehirnregionen wurde eine 6.5 kb große Kv4.2 mRNA detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch eine Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe kontrolliert.B) Northern analysis of the expression of human Kv4.2 mRNA in different Tissues. The applied mRNA is noted above the respective lane. The human Kv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3) was used as a hybridization probe used. Only in mRNA from brain or brain regions was a 6.5 kb in size Kv4.2 mRNA detected. The amount of RNA in each lane was controlled by hybridization with a labeled β-actin cDNA sample.
- C) Northern Analyse der Expression der Kv4.3 mRNA in verschiedenen Geweben. Die aufgetragene mRNA ist über der jeweiligen Spur vermerkt. Die humanen Kv4.3 cDNA (Nukleotide 1420–2644, Acc. AF120 491) wurde als Hybridisierungssonde verwendet. In Gehirn, Herz, Placenta, Lunge, Leber und Skelettmuskel wurde eine 8.5 kb große Kv4.3 mRNA detektiert. Die RNA-Menge in den einzelnen Bahnen wurde durch Hybridisierung mit einer markierten β-Aktin cDNA Probe überprüft.C) Northern analysis of the expression of Kv4.3 mRNA in different Tissues. The applied mRNA is noted above the respective lane. The human Kv4.3 cDNA (nucleotides 1420-2644, Acc. AF120 491) was used as a hybridization probe. In brain, heart, placenta, lungs, Liver and skeletal muscle, a 8.5 kb Kv4.3 mRNA was detected. The RNA level in the individual lanes was determined by hybridization with a labeled β-actin cDNA sample checked.
Lokalisation des hKv4.1 Kaliumkanal-Gens, KCND1, in der Region des humanen Chromosoms Xp11.23.Localization of the hKv4.1 potassium channel gene, KCND1, in the region of the human chromosome Xp11.23.
Links ist eine schematische Karte der Xp11.1. bis Xp21-Region; rechts ist die Lage bekannter polymorpher Marker im Vergleich zu KCND1 angegeben.Left is a schematic map of Xp11.1. to Xp21 region; right is the location of known polymorphic markers compared to KCND1 specified.
Lokalisation des hKv4.2-Kaliumkanal-Gens, KCND2, in der Region des humanen Chromosoms 7q31-32.Localization of the hKv4.2 potassium channel gene, KCND2, in the region of human chromosome 7q31-32.
- A) Nachweis von KCND2 DNA in einem DNA-Panel aus Nager/Mensch-Hybridzellinien. Die DNA Proben des Panels wurden einer Polymerasekettenreaktion unterzogen unter Verwendung KCND2-DNA spezifischer sense- und antisense Primer (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9). Die amplifizierten DNA-Produkte wurden in einem 1.5% Agarose-Gel separiert und mittels Ethidium-bromid-Färbung sichtbar gemacht. Die Nummern oberhalb der Gelbahnen beziehen sich auf die verschiedenen eingesetzten Hybridzellinien. Auf der linken Seite sind Größemarkierungen in kb DNA angegeben; auf der rechten Seite zeigt der Pfeil das erwartete KCND2-Produkt von 3 bp an.A) Detection of KCND2 DNA in a DNA panel from rodent / human hybrid cell lines. The DNA samples of the panel became a polymerase chain reaction subjected to KCND2 DNA specific sense and antisense Primer (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9). The amplified DNA products were separated in a 1.5% agarose gel and visualized by ethidium bromide staining made. The numbers above the yellow lines refer to the various hybrid cell lines used. On the left are size marks in kb DNA indicated; on the right side the arrow shows the expected one KCND2 product of 3 bp.
- B) Humaner Chromosomenbesatz der in A getesteten Nager/Mensch-Hybridzellinien. Die Spalten beziehen sich auf die DNA, die in der jeweils darüber liegenden Gelbahn getestet wurde. Die Chromosomen sind mit X angegeben; inkomplette Chromosomen mit einem +– Zeichen. Die beiden Sternchen zeigen an, in welchen Bahnen ein amplifiziertes KCND2-Produkt gefunden wurde. Daraus geht hervor, daß das KCND2-Gen auf Chromosome 7 lokalisiert ist.B) Human chromosome population of the rodent / human hybrid cell lines tested in A. The columns refer to the DNA in each of the above Gelbahn was tested. The chromosomes are indicated by X; incomplete Chromosomes with a + sign. The two asterisks indicate in which lanes an amplified KCND2 product was found. It can be seen that the KCND2 gene is located on chromosomes 7.
- C) Chromosomale Lokalisierung bei 7q31-32 mit einer FISH-Analyse von Metaphase-Chromosomen. Verwendet wurde eine biotinylierte KCND2-Sonde.C) Chromosomal localization at 7q31-32 with FISH analysis of metaphase chromosomes. A biotinylated KCND2 probe was used.
Genomische Struktur der Gene KCND1, KCND2, KCND3.Genomic structure of genes KCND1, KCND2, KCND3.
Die schwarzen Kästchen entsprechen Exonen der offenen Leserahmen. Exone 1 enthalten auch 5'-nichtranslierte Sequenzen, schematisch als weiße Kästchen dargestellt; dgl. enthalten Exone 6 jeweils 3'-nichttranslatierte Sequenzen. Graue Balken entsprechen Intronsequenzen.The black box correspond to exons of the open reading frame. Exons 1 also contain 5'-untranslated ones Sequences, schematically as white casket shown; Likewise, exons 6 each contain 3'-untranslated Sequences. Gray bars correspond to intron sequences.
Nukleotid-Sequenzen des humanen KCND1-Gens.Nucleotide sequences of the human KCND1 gene.
Kodierende Bereiche sind durch Großbuchstaben, nichtkodierende Bereiche (d. h. Introne bzw. 5' und 3' nichttranslatierte Regionen) sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.
- A) Nukleotid-Sequenz des Exons 1 des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 5). Das Startkodon ist durch Fettdruck hervorgehoben.
- B) Nukleotid-Sequenz der Exone 2–5 sowie der angrenzenden Introne des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 6).
- C) Nukleotid-Sequenz der Exone 6 des humanen KCND1-Gens (SEQ ID NO: 7). Das Stopkodon ist durch Fettdruck hervorgehoben.
- A) Nucleotide sequence of exon 1 of the human KCND1 gene (SEQ ID NO: 5). The start codon is highlighted in bold.
- B) Nucleotide sequence of the exons 2-5 and the adjacent introns of the human KCND1 gene (SEQ ID NO: 6).
- C) Nucleotide sequence of exone 6 of the human KCND1 gene (SEQ ID NO: 7). The stop codon is highlighted in bold.
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.1 Kanälen, die durch transiente Expression von hKv4.1 α-Untereinheiten in HEK293-Zellen gebildet wurden.Functional properties of hKv4.1 channels, by transient expression of hKv4.1 α subunits in HEK293 cells were formed.
Auswärtsströme gemessen mit der "patch-clamp"-Methode an mit hKv4.1-cDNA (SEQ ID NO: 1) transient transfizierten HEK 293 Zellen. Das Haltepotential war bei –100 mV, das Testpotential bei +40 mV. Die mittlere Stromdichte betrug 60 ± 20 pA/pF.Outward currents measured with the "patch-clamp" method on with hKv4.1 cDNA (SEQ ID NO: 1) transiently transfected HEK 293 cells. The holding potential was at -100 mV, the test potential at +40 mV. The average current density was 60 ± 20 pA / pF.
An der beispielhaft gezeigten Stromkurve der hKv4.1 vermittelten Auswärtsströme wurde bezüglich der Inaktivierung Zeitkonstanten τ angepaßt nach dem Fachmann gut bekannten Verfahren. Der zeitliche Verlauf der Inaktivierung bei +40 mV ließ sich durch zwei Zeitkonstanten (τh,1 bzw. τh,2) gut beschreiben (τh,1 = 31.9 ± 3.5; τh,2 = 354 ± 36). Angegeben sind die Mittelwerte ± Standardfehler von in vierzehn Experimenten durchgeführten Messungen. Das Amplitudenverhältnis von τh,1 und τh,2 zueinander ist 3:1 (76% zu 24%).With respect to the inactivation time constant τ, the current flow of the hKv4.1 mediated outward currents was matched to methods well known to the person skilled in the art. The time course of inactivation at +40 mV was well described by two time constants (τ h, 1 or τ h, 2 ) (τ h, 1 = 31.9 ± 3.5, τ h, 2 = 354 ± 36). Indicated are the mean ± standard errors of measurements made in fourteen experiments. The amplitude ratio of τ h, 1 and τ h, 2 to each other is 3: 1 (76% to 24%).
Funktionelle Eigenschaften von hKv4.2-Kanälen, die durch transiente Expression von hKv4.2 α-Untereinheiten in HEK 293-Zellen gebildet wurden.Functional properties of hKv4.2 channels that by transient expression of hKv4.2 α subunits in HEK 293 cells were formed.
- A) Auswärtsströme gemessen mit der "patch-clamp"-Methode an hKv4.2-cDNA (SEQ ID NO: 3) transient transfizierten HEK 293 Zellen.A) Outward currents measured with the "patch-clamp" method on hKv4.2 cDNA (SEQ ID NO: 3) transiently transfected HEK 293 cells.
- B) Auftragung normalisierter Leitfähigkeiten (G/Gmax, Ordina te) für human Kv4.2-Ströme gegen das im Test vorhandene Membranpotential (Abzisse). Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die durchgezogene Linie stellt die Ausgleichskurve gemäß der Boltzmann-Gleichung mit V0.5 = –3.2 ± 1.5 mV dar.B) Plotting normalized conductivities (G / Gmax, Ordina te) for human Kv4.2 currents against the membrane potential present in the test (abscissa). Each point represents the mean ± standard error of measurements made in six experiments. The solid line represents the compensation curve according to the Boltzmann equation with V 0.5 = -3.2 ± 1.5 mV.
- C) Auftragung der Aktivierungszeitkonstanten τm in ms für humane Kv4.2-Ströme gemessen in Abhängigkeit vom im Text vorhandenen Membranpotential in mV. Die Messungen wurden wie in A durchgeführt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar.C) Plot of the activation time constant τ m in ms for human Kv4.2 currents measured as a function of the membrane potential in mV present in the text. The measurements were carried out as in A. Each point represents the mean ± standard error of measurements made in six experiments.
- D) Auftragung der Inaktivierungszeitkonstanten τh,1 und τh,2 in ms für humane Kv4.2-Ströme gemessen in Abhängigkeit vom im Test vorhandenen Membranpotential in mV. Den wie in A gemessenen Stromverläufe wurden zwei Inaktivierungszeitkonstanten angepaßt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar.D) plots the inactivation time constants τ h, 1 and τ h, 2 in ms for human Kv4.2 currents measured as a function of the membrane potential in mV present in the test. The current waveforms measured as in A were adjusted for two inactivation time constants. Each point represents the mean ± standard error of measurements made in six experiments.
- E) Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung der humanen Kv4.2-Ströme vom Vorpulspotential. Datenpunkte entsprechen den gemessenen Stromamplituden bei +60 mV nach einem 500 ms langen Vorpuls bei dem angegebenen Vorpulspotential. Dieses wurde in 5 mV Schritten zwischen –90 und –15 mV variiert. Den Datenpunkten wurde eine Boltzmann-Gleichung angepaßt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert ± Standardfehler von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen dar. Die gemessenen Peak-Amplituden (I) wurden normalisiert, bezogen auf die bei +60 mV gemessenen maximale Peak-Amplitude (Imax), die mit einem Vorpuls von –90 mV erhalten wurde.E) Voltage dependence of inactivation of human Kv4.2 currents from pre-pulse potential. Data points correspond to the measured current amplitudes at +60 mV after a 500 ms long pre-pulse at the specified pre-pulse potential. This was varied in steps of 5 mV between -90 and -15 mV. The data points were fitted with a Boltzmann equation. Each point represents the mean ± standard error of measurements made in six experiments. The measured peak amplitudes (I) were normalized based on the maximum peak amplitude (I max ) measured at +60 mV Pre-pulse of -90 mV was obtained.
- F) Erholung der inaktivierten humanen Kv4.2 Ströme. Die Erholungsphase wurde mit gepaarten 500 ms langen Test pulsen bei +60 mV gemessen, die unterbrochen wurden durch einen Zwischenpuls unterschiedlicher Dauer bei –100 mV. Die Dauer des Zwischenpulses variierte zwischen 10 ms und 600 ms. Io entspricht der Peak-Amplitude, die gemessen wurde mit einem +60 mV Testpuls nach einer Erholungsphase von 15 s bei –100 mV. Die anderen gemessenen Peakamplituden, die mit kürzeren Zwischen Pulsen erhalten wurden, wurden darauf normalisiert (I/Io). Die an die Datenpunkte angepaßte Linie entspricht einer mono-exponentiellen Funktion mit einer Zeitkonstante τrec von 118.3 ± 5.3 ms und wurde von in sechs Experimenten durchgeführten Messungen erhalten.F) Recovery of inactivated human Kv4.2 currents. The recovery period was measured with paired 500 ms test pulses at +60 mV, which were interrupted by an intermediate pulse of different duration at -100 mV. The duration of the intermediate pulse varied between 10 ms and 600 ms. I o corresponds to the peak amplitude measured with a +60 mV test pulse after a recovery period of 15 s at -100 mV. The other measured peak amplitudes obtained with shorter intermediate pulses were normalized to this (I / I o ). The line fitted to the data points corresponds to a mono-exponential function with a time constant τ rec of 118.3 ± 5.3 ms and was obtained from measurements made in six experiments.
Inhibierung von humanen Kv4.2-Strömen nach Applikation von Wirkstoffen.Inhibition of human Kv4.2 currents after Application of active ingredients.
Die
transienten Auswärtsströme wurden
mit der "patch-clamp"-Methode wie in
BeispieleExamples
Die Abkürzungen "M" und "mM" stehen für die Einheiten mol/l bzw. mmol/l.The Abbreviations "M" and "mM" stand for the Units mol / l or mmol / l.
Beispiel 1: Isolierung von Klonen aus humanen cDNA-Bibliotheken und Polymerasekettenreaktion.Example 1: Isolation of clones human cDNA libraries and polymerase chain reaction.
1·106 Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver, 5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL, Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma), 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Heringssperm-DNA, in H2O und mit 32P-markierter Maus Kv4.1 (M. D. Pak et al., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 4386–4390) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet.1 x 10 6 plaques of a human cortex λgt 10 cDNA library (Clontech, Palo Alto, CA) were plated in 20 NZ plates (NZ: 16 g / l NZ powder, 5 g / l yeast extract, 15 g / l Bacto agar Chemicals from Gibco BRL, Eggenstein, DE) with a diameter of 150 mm. The genomic phage DNA was then transferred to 20 membrane filters (Duralon UV membrane, Stratagene). Hybridization of the filters in 50% formamide, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (piperazine-N, N'-bis [2-ethanesulfonic acid], Sigma), 1% SDS, 100 μg / ml denatured herring sperm DNA, followed H 2 O and with 32 P-labeled mouse Kv4.1 (MD Pak et al., Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991) 4386-4390) as a sample. This hybridization was carried out at 60 ° C for 18 hours. The filters were then mixed with 0.1X SET / 0.1% SDS in H 2 O (20x SET: 3M NaCl, 400mM Tris / HCl, pH 7.4, 200mM EDTA, chemicals from Sigma, for 0.1x SET becomes 20x SET 1: 200 diluted). After autoradiography at -70 ° C, the signals visible on the X-ray films (Kodak, Rochester, NY) were assigned to the corresponding plaques on the plates.
Es wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2800 bp lange hKv4.1 cDNA enthielt. Das Insert des Phagen wurde mittels der Phagen-spezifischen Primer 5'-GACTCCTGGAGCCCG-3' (5'Insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 10) und 5'-GGTAGCGACCGGCGC-3' (3'Insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 11) ansequenziert und anschließend mittels PCR unter der Verwendung Insert(hKv4.1)-spezifischer Primer amplifiziert. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt: 30 Reaktionszyklen mit PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) bestehend aus 95°C – 30 sec, 55°C – 30 sec. und 72°C – 2 min. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-AGCCCCCAC CATCCTGGAGA-3' (h41-1; SEQ ID NO: 12) und als "Antisense-Primer" 5'-CTGGGGGCCCAGCAGAGGAC-3' (h41-2; SEQ ID NO: 13). Das resultierende hKv4.1 PCR cDNA-Fragment war 2711 bp lang und enthielt den kompletten offenen Leserahmen der hKv4.1 cDNA sowie 80 bp 5' UTR und 687 bp 3' UTR. Dieses Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch isoliert.It a positive phage clone was obtained which was a 2800 bp long hKv4.1 cDNA. The phage insert was amplified by the phage-specific Primer 5'-GACTCCTGGAGCCCG-3 '(5'insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 10) and 5'-GGTAGCGACCGGCGC-3 '(3' insert screening amplimer, (Clontech, Palo Alto, CA), SEQ ID NO: 11) and subsequently by PCR using Insert (hKv4.1) -specific primer amplified. The conditions of the PCR reaction were as follows: 30 reaction cycles with PfuTurbo polymerase (Stratagene, La Jolla, CA) consisting of 95 ° C - 30 sec, 55 ° C - 30 sec. and 72 ° C - 2 min. As a "sense primer" was used 5'-AGCCCCCAC CATCCTGGAGA-3 '(h41-1, SEQ ID NO: 12) and as "antisense primer" 5'-CTGGGGGCCCAGCAGAGGAC-3 '(h41-2, SEQ ID NO: 13). The resulting hKv4.1 PCR cDNA fragment was 2711 bp long and contained the complete open reading frame of the hKv4.1 cDNA as well 80 bp 5 'UTR and 687 bp 3 'UTR. This Fragment was electrophoretically isolated in an agarose gel.
Beispiel 2: Isolierung von Klonen aus humanen genomischen DNA-BibliothekenExample 2: Isolation of clones human genomic DNA libraries
1·106 Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7 Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit 32P-markierter humaner Kv4.1 cDNA als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein Phagenklon wurde durch eine Hybridisierung, durchgeführt wie oben, identifiziert. Durch direkte Sequenzierung der Phagen-DNA zeigte sich, daß dieser Phage die komplette kodierende Sequenz des KCND1-Gens enthielt. (SEQ ID NO: 5, 6, 7).1 × 10 6 plaques of a λEMBL3 SP6 / T7 human genomic library (Clontech, Palo Alto, CA) with 32 P-labeled human Kv4.1 cDNA as a sample. This hybridization was carried out at 60 ° C for 18 hours. The filters were then mixed with 0.1X SET / 0.1% SDS in H 2 O (20x SET: 3M NaCl, 400mM Tris / HCl, pH 7.4, 200mM EDTA, chemicals from Sigma, for 0.1x SET becomes 20x SET 1: 200 diluted). After autoradiography at -70 ° C, the signals visible on the X-ray films (Kodak, Rochester, NY) were assigned to the corresponding plaques on the plates). A phage clone was identified by hybridization performed as above. Direct sequencing of the phage DNA revealed that this phage contained the complete coding sequence of the KCND1 gene. (SEQ ID NO: 5, 6, 7).
Beispiel 3: DNA-SequenzierungExample 3: DNA sequencing
Das hKv4.1 PCR cDNA Fragment wurde mit Bsp120I (MBI fermentas) geschnitten und in die in die EcoRV/Bsp120I-Schnittstellen des pcDNA3 Vektors (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die hKv4.1 cDNA wurde dann unter Verwendung des BigDye terminator cycle sequencing kits (Perkin Elmer, XY) sequenziert. Die Sequenzreaktionen wurden anschließend auf automatischen Sequenzierern (ABI 377 or Prism 310 automated sequencer (Perkin Elmer, XY)) analysiert. Das Plasmid-spezifische Oligonukleotid T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14) sowie hKv4.1-spezifische Oligonukleotide (h41-1–h41-7 (SEQ IDs NO: 12, 13, 15–19) wurden für die Sequenzierungen als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A+ mRNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas. Die hKv4.1 cDNA wurde 32P-markiert (T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll 400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20. g/l Polyvinylpyrolidon (Merck), 1:10 verdünnt), 1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H2O) bei 42°C 24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander in Waschlösung 1 (2 × SSC (20 × SSC: 173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma, für 2 × SSC 1:10 verdünnt)); 0.1% SDS; in H2O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200 verdünnt; 0.1% SDS; in 1120) bei 50°C gewaschen. Nach dem Waschen erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) bei –70°C. Der gleiche Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit einer 32P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide 1430–2644; GenBank Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.The hKv4.1 PCR cDNA fragment was cut with Bsp120I (MBI fermentas) and cloned into the EcoRV / Bsp120I sites of the pcDNA3 vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). The hKv4.1 cDNA was then sequenced using the BigDye terminator cycle sequencing kits (Perkin Elmer, XY). Sequence reactions were then analyzed on automatic sequencers (ABI 377 or Prism 310 automated sequencer (Perkin Elmer, XY)). The plasmid-specific oligonucleotide T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14) and hKv4.1-specific oligonucleotides (h41-1-h41-7 (SEQ ID NOs: 12, 13, 15-19) were used for The Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, Calif.) each contained 2 mg poly-A + mRNA from the heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney, and pancreas CDNA was 32 P-labeled (T. Maniatis et al., Supra) and then used as a hybridization probe The probe was placed in hybridization solution (50% formamide, 5x SET, 10x Denhardt's (100x Denhardt's: 20g / l Ficoll 400 (Sigma), 20 g / l BSA (Sigma), 20 g / l polyvinylpyrrolidone (Merck), diluted 1:10), 1% SDS (Biorad), 100 mb / ml herring sperm DNA (Sigma) in H 2 O) was hybridized to the mRNA for 24 hours at 42 ° C. The blot was then washed successively in wash solution 1 (2 × SSC (20 × SSC: 173 g / l NaCl, 88.2 g / l Na citrate, pH 7.0 , all chemicals from Sigma, for 2 × SSC 1:10 dil NNT)); 0.1% SDS; (in H 2 O) at RT and in washing solution 2 0.1 × SSC (20 × SSC diluted 1: 200; 0.1% SDS; in 11 2 0) at 50 ° C. After washing, autoradiography was performed on the X-ray films (Kodak, Rochester, NY) at -70 ° C. The same Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) was treated with a 32 P-labeled hKv4.3 cDNA (nucleotides 1430 to 2644;. GenBank Access NO AF120491) hybridized as a probe under the above running conditions after the hybridization and autoradiographed.
Beispiel 4: Humane chromosomale Lokalisation des KCND1 GensExample 4: Human Chromosomal Localization of the KCND1 gene
Das Genebridge 4 Hybridzellpanel (bezogen durch Research Genetics, Huntsville, AL) wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion unter der Verwendung KCND1-spezifischer Oligonukleotide untersucht. Die PCR Reaktionen wurden mit 25 ng DNA von jedem der 93 Hybridklone und mit humaner sowie genomischer DNA vom Hamster als Kontrollen durchgeführt. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-GACTTGGAAGAATACGCTGGAC-3' (h41-3; SEQ ID NO: 15) und als "Antisense-Primer" 5'-TCATGACACTCCGCAGGAAGC-3' '(h41-8; SEQ ID NO: 20) Die PCR-Bedingungen waren 5 min 95°C 1 Zyklus; 45 sec 95°C, 1 min 59°C, 1 min 72°C für 30 Zyklen; 10 min 72°C 1 Zyklus; Taq Polymerase (GibcoBRL,). Die Ergebnisse der PCR wurden durch den "Radiation Hybrid Mapping Server" am Whitehead Institute (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) analysiert. Für die Analyse wurde ein LOD-score von 15 gewählt.The Genebridge 4 hybrid cell panel (purchased from Research Genetics, Huntsville, AL) was synthesized using the polymerase chain reaction KCND1-specific oligonucleotides examined. The PCR reactions with 25 ng DNA from each of the 93 hybrid clones and with human and hamster genomic DNA as controls. As a "sense primer" was used 5'-GACTTGGAAGAATACGCTGGAC-3 '(h41-3; SEQ ID NO: 15) and as "antisense primer" 5'-TCATGACACTCCGCAGGAAGC-3 "(h41-8, SEQ ID NO: 20) PCR conditions were 5 min 95 ° C 1 cycle; 45 sec. 95 ° C, 1 min 59 ° C, 1 min 72 ° C for 30 cycles; 10 min 72 ° C 1 cycle; Taq polymerase (GibcoBRL,). The results of the PCR were reviewed the "Radiation Hybrid Mapping Server "on Whitehead Institute (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) analyzed. For the analysis was chosen a LOD score of 15.
Beispiel 5: Funktionelle Expression und elektrophysiologische TechnikExample 5 Functional Expression and electrophysiological technique
Das hKv4.1 PCR-Fragment (SEQ ID NO: 1) wurde in den dem Fachmann gut bekannten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie oben ausgeführt einkloniert. Insgesamt 2 μg Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.1) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM 1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM 1-Medium mit 6.4 μl DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei RT für 45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde. 2·105 HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit diesem Lipid-DNA-Komplex auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden bei 37°C in einem Inkubator unter 5% CO2 wurde die Lösung durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 12–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 5·104 Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen Messungen umgesetzt.The hKv4.1 PCR fragment (SEQ ID NO: 1) was cloned into the expression vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) well known to those skilled in the art as outlined above. A total of 2 μg of plasmid DNA (pcDNA3-hKv4.1) was used to transfect HEK293 cells with DMRIE-C reagent (a 1: 1 mixture of cation-lipid DMRIE and cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies). 500 ml of Opti-MEM 1 medium (Gibco-BRL, Life Technology) containing 2 μg of plasmid DNA and 500 ml of Opti-MEM 1 medium containing 6.4 μl of DMRIE-C reagent were mixed together and then incubated at RT for 45 minutes in which a liposome-DNA complex was formed. 2 x 10 5 HEK293 cells in a 35 mm dish were first washed with Opti-MEM 1 medium, then the solution was plated onto the cell layer with this lipid-DNA complex. After incubation for 5-6 hours at 37 ° C in an incubator under 5% CO 2 , the solution was replaced with normal medium and the cells were incubated for an additional 12-24 hours at 37 ° C. Subsequently, 5 × 10 4 cells were transferred to a new dish (35 mm) for the electrophysiological measurements.
Auswärtsströme wurden 24–48 Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen. Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen 2–3 MΩ nach der Füllung mit der intrazellulären Lösung (95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM, MgCl2, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM Glutathion, 2 mM Na2ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 10 mM Glucose, 20 mM Sucrose, pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma) bei Raumtemperatur auf einem Haltepotential von –100 mV gehalten. Die bei positiveren Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) wurde für die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.Outward currents were measured 24-48 hours after transfection using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique (OP Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85-100). The micropipettes were pulled with a DMZ Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) and had a resistance between 2-3 MΩ after filling with the intracellular solution (95 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1mM, MgCl 2 , 11mM EGTA, 10mM HEPES, 2mM glutathione, 2mM Na 2 ATP, pH 7.2). For electrophysiological measurements, the HEK 293 cells were incubated in an extracellular solution (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2 , 2 mM MgCl 2 , 5 mM HEPES, 10 mM glucose, 20 mM sucrose, pH 7.4, all chemicals of Sigma) at room temperature to a holding potential of -100 mV. The outward currents produced at more positive potentials were measured with an EPC9 patch-clamp amplifier (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE). The well-known PULSE + PULSEFIT software program (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) was used for data acquisition and data analysis.
Beispiel 6: Isolierung von Klonen aus humanen cDNA-Bibliotheken.Example 6: Isolation of clones human cDNA libraries.
1·106 Plaques einer humanen cortex λgt 10 cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) wurden in 20 NZ Platten (NZ: 16 g/l NZ-Pulver, 5 g/l Hefeextrakt, 15 g/l Bacto-Agar; Chemikalien von Gibco BRL, Eggenstein, DE) mit einem Durchmesser von 150 mm ausplattiert. Die genomische Phagen-DNA wurde dann auf 20 Membranfilter (Duralon-UV Membran, Stratagene) transferiert. Es folgte eine Hybridisierung der Filter in 50% Formamid, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (Piperazin-N,N'-bis[2-ethansulfonsäure], Sigma), 1% SDS, 100 μg/ml denaturierte Heringssperm-DNA, in H2O und mit 32P-markierter Ratte Kv4.2 cDNA (T. J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCl, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet.1 x 10 6 plaques of a human cortex λgt 10 cDNA library (Clontech, Palo Alto, CA) were plated in 20 NZ plates (NZ: 16 g / l NZ powder, 5 g / l yeast extract, 15 g / l Bacto agar Chemicals from Gibco BRL, Eggenstein, DE) with a diameter of 150 mm. The genomic phage DNA was then transferred to 20 membrane filters (Duralon UV membrane, Stratagene). Hybridization of the filters in 50% formamide, 0.8 M NaCl, 20 mM Pipes (piperazine-N, N'-bis [2-ethanesulfonic acid], Sigma), 1% SDS, 100 μg / ml denatured herring sperm DNA, followed H 2 O and 32 P-labeled rat Kv4.2 cDNA (TJ Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471-483) as a sample. This hybridization was carried out at 60 ° C for 18 hours. The filters were then mixed with 0.1X SET / 0.1% SDS in H 2 O (20x SET: 3M NaCl, 400mM Tris / HCl, pH 7.4, 200mM EDTA, chemicals from Sigma, for 0.1x SET becomes 20x SET 1: 200 diluted). After autoradiography at -70 ° C, the signals visible on the X-ray films (Kodak, Rochester, NY) were assigned to the corresponding plaques on the plates.
Es wurde ein positiver Phagenklon erhalten, der eine 2500 bp lange hKv4.2 cDNA enthielt. DNA des Phagen wurde mit EcoRI verdaut. Das hKv4.2 EcoRI cDNA-Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch isoliert.It a positive phage clone was obtained which was a 2500 bp long hKv4.2 cDNA. DNA from the phage was digested with EcoRI. The hKv4.2 EcoRI cDNA fragment was electrophoresed in an agarose gel isolated.
Beispiel 7: Isolierung von Klonen aus humanen genomischen DNA-BibliothekenExample 7: Isolation of clones human genomic DNA libraries
1·106 Plaques einer humanen genomischen λEMBL3 SP6/T7 Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) mit 32p-markierter Ratte Kv4.2 cDNA (T. J. Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471–483) als Probe. Diese Hybridisierung wurde bei 60°C für 18 Stunden durchgeführt. Die Filter wurden anschließend mit 0.1 × SET/0.1% SDS in H2O (20 × SET: 3 M NaCl, 400 mM Tris/HCL, pH 7.4, 200 mM EDTA; Chemikalien von Sigma, für 0.1 × SET wird 20 × SET 1:200 verdünnt) gewaschen. Nach erfolgter Autoradiographie bei –70°C wurden die auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) sichtbaren Signale den entsprechenden Plaques auf den Platten zugeordnet). Ein DNA-Fragment wurde durch eine Hybridisierung, durchgeführt wie oben, identifiziert. Dies war ein 1.0 kb BamHI/XbaI Fragment. Die Sequenzierung des Fragments zeigte, daß es nur einen Teil der kodierenden Region enthielt, der den Aminosäuren 1 bis 218 des abgeleiteten offenen hKv4.2 Leserahmens entspricht (SEQ ID NO: 21).1 x 10 6 plaques of a human genomic λEMBL3 SP6 / T7 library (Clontech, Palo Alto, CA) with 32 P-labeled rat Kv4.2 cDNA (TJ Baldwin et al, Neuron 7 (1991) 471-483) as a sample. This hybridization was carried out at 60 ° C for 18 hours. The filters were then mixed with 0.1X SET / 0.1% SDS in H 2 O (20x SET: 3M NaCl, 400mM Tris / HCl, pH 7.4, 200mM EDTA, chemicals from Sigma, for 0.1x SET becomes 20x SET 1: 200 diluted). After autoradiography at -70 ° C, the signals visible on the X-ray films (Kodak, Rochester, NY) were assigned to the corresponding plaques on the plates). A DNA fragment was identified by hybridization performed as above. This was a 1.0 kb BamHI / XbaI fragment. Sequencing of the fragment indicated that it contained only a portion of the coding region corresponding to amino acids 1 to 218 of the deduced hKv4.2 open reading frame (SEQ ID NO: 21).
Beispiel 8: DNA-SequenzierungExample 8: DNA sequencing
Das EcoRI-hKv4.2 cDNA Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstellen des Bluescript Vektors (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Die hKv4.2 cDNA wurde dann nach der Methode von Sanger et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463–5467) mit T7-DNA Polymerase (Sequenase, US Biochemicals, Cleveland, Ohio) sequenziert. Plasmid-spezifische Oligonukleotide M13, Reverse, T3 und T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14, 22–24) wurden für die Sequenzierungen als Primer verwendet. Der Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) enthielt jeweils 2 mg poly-A+ mRNA aus Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas. Die hKv4.2 cDNA wurde 32P-markiert (T. Maniatis et al., a. a. O.) und dann als Hybridisierungssonde verwendet. Die Sonde wurde in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 × SET, 10 × Denhardt's (100 × Denhardt's: 20 g/l Ficoll 400 (Sigma), 20 g/l BSA (Sigma), 20 g/l Polyvinylpyroli don (Merck), 1:10 verdünnt), 1% SDS (Biorad), 100 mb/ml Heringssperm DNA (Sigma) in H2O) bei 42°C 24 Stunden an die mRNA hybridisiert. Der Blot wurde anschließend nacheinander in Waschlösung 1 (2 × SSC (20 × SSC: 173 g/l NaCl, 88,2 g/l NaCitrat, pH 7,0, alle Chemikalien von Sigma, für 2 × SSC 1:10 verdünnt)); 0.1% SDS; in H2O) bei RT und in Waschlösung 2 (0.1 × SSC (20 × SSC 1:200 verdünnt; 0.1% SDS; in H2O) bei 50°C gewaschen. Nach dem Waschen erfolgte eine Autoradiographie auf den Röntgenfilmen (Kodak, Rochester, N. Y.) bei –70°C. Der gleiche Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) wurde mit einer 32P-markierten hKv4.3 cDNA (Nukleotide 1430–2644; EMBL Access NO. AF120491) als Probe unter den ober ausgeführten Bedingungen hybridisiert, nach der Hybridisierung gewaschen und autoradiographiert.The EcoRI-hKv4.2 cDNA fragment was cloned into the EcoRI sites of the Bluescript vector (Stratagene, La Jolla, CA). The hKv4.2 cDNA was then sequenced by the method of Sanger et al., (Proc. Natl. Acad Sci., USA 74 (1977) 5463-5467) with T7 DNA polymerase (Sequenase, US Biochemicals, Cleveland, Ohio) , Plasmid-specific oligonucleotides M13, Reverse, T3 and T7 (Stratagene, La Jolla, CA, SEQ ID NO: 14, 22-24) were used as primers for sequencing. The Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) each contained 2 mg poly-A + mRNA from the heart, brain, placenta, lung, liver, skeletal muscle, kidney and pancreas. The hKv4.2 cDNA was 32 P-labeled (T. Maniatis et al., Supra) and then used as a hybridization probe. The probe was incubated in hybridization solution (50% formamide, 5x SET, 10x Denhardt's (100x Denhardt's: 20 g / l Ficoll 400 (Sigma), 20 g / l BSA (Sigma), 20 g / l polyvinylpyroli don (Merck). , Diluted 1:10), 1% SDS (Biorad), 100 mb / ml herring sperm DNA (Sigma) in H 2 O) at 42 ° C for 24 hours hybridized to the mRNA. The blot was then sequentially washed in Wash Solution 1 (2X SSC (20X SSC: 173 g / L NaCl, 88.2 g / L NaCitrate, pH 7.0, all Sigma chemicals, diluted 1:10 for 2X SSC) ); 0.1% SDS; in H 2 O) at RT and in Wash Solution 2 (0.1 × SSC (20 × SSC diluted 1: 200, 0.1% SDS, in H 2 O) at 50 ° C. After washing, autoradiography was performed on the X-ray films (Kodak , Rochester, NY) at -70 ° C. The same Multiple Tissue Northern (MTN) blot (Clontech, Palo Alto, CA) was probed with a 32 P-labeled hKv4.3 cDNA (nucleotides 1430-2644; EMBL Access NO. AF120491 ) was hybridized as a sample under the above conditions, washed after hybridization and autoradiographed.
Beispiel 9: PolymerasekettenreaktionExample 9: Polymerase Chain Reaction
Der hKv4.2 cDNA-Phagenklon wurde mit EcoRI verdaut. Das EcoRI-Fragment wurde in die Polylinker-Region des EcoRI-linearisierten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogene, Carlsbad, CA) einkloniert, um pcDNA3-hKv4.2 zu erhalten. Dieser wurde in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) als Matrize verwendet, um eine Kozak-Sequenz (5'-CCACC-3', SEQ ID NO: 25) vor das Startcodon des hKv4.2 offenen Leserahmens einzubauen und gleichzeitig den nicht-kodierenden 5'-Bereich der hKv4.2 cDNA zu verkürzen. Die Bedingungen der PCR-Reaktion waren wie folgt: 20 Reaktionszyklen mit Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA) bestehend aus 94°C – 1 min, 50°C – 30 sec. und 72°C – 30 sec. Als "Sense-Primer" wurde eingesetzt 5'-ATTAAGCTTCCACCATGGCGGCGGGGGTGGCAGCG-3 (h42koz; SEQ ID NO: 26) und als "Antisense-Primer" 5'-ACATAGTAGAACACCAGGGCC-3' (h423; SEQ ID NO: 28). Der h42koz-Primer enthielt eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Hind III vor der Kozak-Konsensussequenz (SEQ ID NO: 25). Das PCR Reaktionsprodukt war 673 bp lang und entsprach der hKv4.2 cDNA Sequenz von Nukleotid 340 bis 399 (SEQ ID NO: 3) und 14 zusätzliche Basenpaare, die dem eingesetzten Primer h42koz entsprachen. Das PCR-Produkt wurde mit HINDIII und BstXl geschnitten. Letzteres Restriktions enzym erkennt eine Schnittstelle in der hKv4.2 cDNA Sequenz bei Nukleotiden 971–980 (SEQ ID NO: 3). Parallel wurde pcDNA3-hKv4.2 mit HindIII und BstXl verdaut, wodurch die ersten 980 Basenpaare der einklonierten hKv4.2 cDNA eliminiert wurden. Mit der verdauten pcDNA3-hKv4.2 wurde das HINDIII/BstXl PCR Fragment mit Hilfe von T4-DNA Ligase (MBI Fermentas, Buffalo, NY) ligiert und der Klon pcDNA3-hKv4.2koz wurde erhalten. Die hKv4.2koz Sequenz (SEQ ID NO: 26) wurde durch Sequenzierung verifiziert.The hKv4.2 cDNA phage clone was digested with EcoRI. The EcoRI fragment was cloned into the polylinker region of the EcoRI linearized expression vector pcDNA3 (Invitrogene, Carlsbad, CA) to obtain pcDNA3-hKv4.2. This was used as a template in a polymerase chain reaction (PCR) to prepare a Kozak sequence (5'-CCACC-3 ', SEQ ID NO: 25) before the start codon of the hKv4.2 open reading frame while shortening the noncoding 5 'region of the hKv4.2 cDNA. The conditions of the PCR reaction were as follows: 20 reaction cycles with Klen Taq polymerase (Clontech, Palo Alto, Calif.) Consisting of 94 ° C-1 min, 50 ° C-30 sec. And 72 ° C-30 sec. Sense primer "was used 5'-ATTAAGCTTCCACCATGGCGGCGGGGGTGGCAGCG-3 (h42koz; SEQ ID NO: 26) and as" antisense primer "5'-ACATAGTAGAACACCAGGGCC-3 '(h423; SEQ ID NO: 28). The h42koz primer contained an restriction enzyme Hind III site before the Kozak consensus sequence (SEQ ID NO: 25). The PCR reaction product was 673 bp in length and corresponded to the hKv4.2 cDNA sequence from nucleotide 340 to 399 (SEQ ID NO: 3) and 14 additional base pairs that corresponded to the h42koz primer used. The PCR product was cut with HINDIII and BstXI. The latter restriction enzyme recognizes an interface in the hKv4.2 cDNA sequence at nucleotides 971-980 (SEQ ID NO: 3). In parallel, pcDNA3-hKv4.2 was digested with HindIII and BstXI, eliminating the first 980 base pairs of the cloned hKv4.2 cDNA. With the digested pcDNA3-hKv4.2, the HINDIII / BstXI PCR fragment was ligated using T4 DNA ligase (MBI Fermentas, Buffalo, NY) and the clone pcDNA3-hKv4.2koz was obtained. The hKv4.2koz sequence (SEQ ID NO: 26) was verified by sequencing.
Beispiel 10: Humane chromosomale LokalisationExample 10: Human chromosomal localization
Primer hg427 (SEQ ID NO: 8) und hg428 (SEQ ID NO: 9) wurden in PCRs eingesetzt zur Amplifizierung der genomischen KCND2-DNA. Als Matrize wurde ein DNA Panel aus Nager/Mensch-Hybridzellininen verwendet (Firma) und Klen Taq Polymerase (Clontech, Palo Alto, CA). Die Reaktionsbedingungen waren 35 Zyklen mit 92°C – 2 min., 50°C – 30 sec., 72°C – 20 sec. Ein 12 kb langer humaner genomischer λDNA-Klon, der den kodierenden Bereich für Aminosäuren 1–211 der hKv4.2 α-Untereinheit enthielt, wurde mit Biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim) markiert und dann für eine FISH-Analyse als Sonde verwendet. Die FISH-Analyse erfolgte nach der von P. Lichter et al., PNAS USA 85 (1988) 9664–9668 und C. Fonatsch et al., Int. J. Cancer 26 (1980) 749–754 beschriebenen Methode. Die Signale wurden mit Fluoreszenz-Isothiozyanat gekoppeltem Avidin-DCSR (Vector Laboratories) detektiert und die Lokalisierung der Signale in Metaphase-Chromosomen wurde mit Hilfe eines konfocalen Laser Scanning Mikroskops (C. Zeiss, LSM 410, Germany) durchgeführt.Primer hg427 (SEQ ID NO: 8) and hg428 (SEQ ID NO: 9) were used in PCRs to amplify genomic KCND2 DNA. The template used was a rodent / human hybrid cell line DNA panel (company) and Klen Taq polymerase (Clontech, Palo Alto, CA). The reaction conditions were 35 cycles at 92 ° C - 2 min., 50 ° C - 30 sec., 72 ° C - 20 sec. A 12 kb human genomic λDNA clone encoding the coding region for amino acids 1-211 of hKv4 .2 α-subunit was labeled with biotin-16-dUTP (Boehringer, Mannheim) and then used as a probe for FISH analysis. FISH analysis was performed according to the method described by P. Lichter et al., PNAS USA 85 (1988) 9664-9668 and C. Fonatsch et al., Int. J. Cancer 26 (1980) 749-754. The signals were detected with fluorescence isothiocyanate-coupled avidin-DCS R (Vector Laboratories) and the localization of the signals in metaphase chromosomes was performed using a confocal laser scanning microscope (C. Zeiss, LSM 410, Germany).
Beispiel 11: Funktionelle Expression und elektrophysiologische TechnikExample 11: Functional Expression and electrophysiological technique
Das DNA-Fragment (SEQ ID NO: 3) wurde in den dem Fachmann gut bekannten Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA) wie oben ausgeführt einkloniert. Insgesamt 2 μg Plasmid-DNA (pcDNA3-hKv4.2koz) wurde zur Transfektion von HEK293-Zellen mit DMRIE-C-Reagens (eine 1:1 Mischung aus Kation-Lipd DMRIE und Cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies) eingesetzt. 500 ml Opti-MEM 1-Medium (Gibco-BRL, Life Technologie) mit 2 μg Plasmid-DNA und 500 ml Opti-MEM 1-Medium mit 6.4 μl DMRIE-C-Reagens wurden zusammengemischt, und anschließend bei RT für 45 Minuten inkubiert, wobei ein Liposom-DNA-Komplex gebildet wurde. 2·105 HEK293 Zellen in einer 35-mm Schale wurden zuerst mit Opti-MEM 1-Medium gewaschen, danach wurde die Lösung mit diesem Lipid-DNA-Komplex auf die Zellschicht ausplattiert. Nach einer Inkubation für 5–6 Stunden bei 37°C in einem Inkubator unter 5% CO2 wurde die Lösung durch normales Medium ersetzt, und die Zellen wurden für weitere 12–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 5·104 Zellen in eine neue Schale (35 mm) für die elektrophysiologischen Messungen umgesetzt.The DNA fragment (SEQ ID NO: 3) was cloned into the expression vector pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA), well known to those skilled in the art, as outlined above. A total of 2 μg of plasmid DNA (pcDNA3-hKv4.2koz) was used to transfect HEK293 cells with DMRIE-C reagent (a 1: 1 mixture of cation-lipid DMRIE and cholesterol, Gibco-BRL, Life Technologies). 500 ml of Opti-MEM 1 medium (Gibco-BRL, Life Technology) containing 2 μg of plasmid DNA and 500 ml of Opti-MEM 1 medium containing 6.4 μl of DMRIE-C reagent were mixed together and then incubated at RT for 45 minutes in which a liposome-DNA complex was formed. 2 x 10 5 HEK293 cells in a 35 mm dish were first washed with Opti-MEM 1 medium, then the solution was plated onto the cell layer with this lipid-DNA complex. After incubation for 5-6 hours at 37 ° C in an incubator under 5% CO 2 , the solution was replaced with normal medium and the cells were incubated for an additional 12-24 hours at 37 ° C. Subsequently, 5 × 10 4 cells were transferred to a new dish (35 mm) for the electrophysiological measurements.
Auswärtsströme wurden 24–48 Stunden nach der Transfektion mit Hilfe der whole-cell Konfiguration der patch-clamp Technik (O. P. Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85–100) gemessen. Die Mikropipetten wurden mit einem DMZ-Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) gezogen und hatten einen Widerstand zwischen 2–3 MΩ nach der Füllung mit der intrazellulären Lösung (95 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM, MgCl2, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, 2 mM Glutathion, 2 mM Na2 ATP, pH 7.2). Für die elektrophysiologischen Messungen wurden die HEK 293 Zellen in einer extrazellulären Lösung (135 mM NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 2 MgCl2, 5 HEPES, 10 Glucose, 20 Sucrose, pH 7.4, alle Chemikalien von Sigma) bei Raumtemperatur auf einem Haltepotential von –100 mV gehalten. Die bei positiveren Potentialen hervorgerufenen Auswärtsströme wurden mit einem EPC9 Patch-clamp Verstärker (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) gemessen. Das dem Fachmann gut bekannte Softwareprogramm PULSE + PULSEFIT (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) wurde für die Datenaufnahme und Datenanalyse verwendet.Outward currents were measured 24-48 hours after transfection using the whole-cell configuration of the patch-clamp technique (OP Hamill et al., Pflügers Arch. (1981) 85-100). The micropipettes were pulled with a DMZ Universal Puller (Zeitz Instruments, Augsburg, Germany) and had a resistance between 2-3 MΩ after filling with the intracellular solution (95 mM K-gluconate, 20 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 1mM, MgCl 2 , 11mM EGTA, 10mM HEPES, 2mM glutathione, 2mM Na 2 ATP, pH 7.2). For electrophysiological measurements, the HEK 293 cells were incubated in an extracellular solution (135 mM NaCl, 5 KCl, 2 CaCl 2 , 2 MgCl 2 , 5 HEPES, 10 glucose, 20% sucrose, pH 7.4, all Sigma chemicals) at room temperature Holding potential of -100 mV held. The outward currents produced at more positive potentials were measured with an EPC9 patch-clamp amplifier (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE). The well-known PULSE + PULSEFIT software program (HEKA Elektronik, Darmstadt, DE) was used for data acquisition and data analysis.
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Non-Patent Citations (10)
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| Datenbank GenBank, Eintragung M64226 zu mShal aus Maus vom 27.04.1993 [recherchiert am 26.02.2007] * |
| Dilks, D., Ling, H., Cockett, M., [u.a.]: Cloning and expression of the human Kv4.3 potassium channel. In: The Journal of Neurophysiology. 1999, Vol. 81, No. 4, S. 1974-1977 * |
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| Internet site: accession number AAD22053 * |
| Kong, W., Po, S., Yamagishi, T., [u.a.]: Isolation and characterization of the human gene encoding Ito: further diversity by alternative mRNA splicing. In: AJP-Heart and Circulatory Physiology. 1998, Vol. 275, Issue 6, H1963-H1970 * |
| Kong, W., Po, S., Yamagishi, T., [u.a.]: Isolation and characterization of the human gene encoding Ito: further diversity by alternative mRNA splicing. In: AJP-Heart and Circulatory Physiology. 1998, Vol. 275, Issue 6, H1963-H1970 Dilks, D., Ling, H., Cockett, M., [u.a.]: Cloning and expression of the human Kv4.3 potassium channel. In: The Journal of Neurophysiology. 1999, Vol. 81, No. 4, S. 1974-1977 Internet site: accession number 3AA96454 Internet site: accession number AAD22053 Internet site: accession number AAC05122 PAK, M.D. u.a.: mShal, a subfamily of A-type K+ channel cloned from mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)88(10)4386-90 Datenbank GenBank, Eintragung M64226 zu mShal aus Maus vom 27.04.1993 [recherchiert am 26.02.2007] Sequenzvergleich der Proteine Kv4.1 aus Mensch (SEQ ID NO. 2) und Kv4.1 aus Maus (M64226) [recherchiert am 26.02.2007] XU, J. u.a.: Assembly of voltage-gated potassium channels, Conserved hydrophilic motifs determime subfamily-specific inter |
| PAK, M.D. u.a.: mShal, a subfamily of A-type K+ channel cloned from mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)88(10)4386-90 * |
| Sequenzvergleich der Proteine Kv4.1 aus Mensch (SEQ ID NO. 2) und Kv4.1 aus Maus (M64226) [recherchiert am 26.02.2007] * |
| XU, J. u.a.: Assembly of voltage-gated potassium channels, Conserved hydrophilic motifs determime subfamily-specific interactions between the alphasubunits, J. Biol. Chem. (1995)270(42)24761-8 * |
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