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Die
vorliegende Erfindung betrifft mpl-Ligandenanaloga mit mindestens
einer veränderten
O- oder N-verknüpften Glykosylierungsstelle.
Die Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen, welche diese mpl-Ligandenanaloga
kodieren und rekombinante Plasmide und Wirtszellen zur Expression
der Analoga.
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Hintergrund
der Erfindung
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MGDF
oder Megakaryozytenwachstums- und Entwicklungsfaktor (megacaryocyte
growth and development factor) ist ein kürzlich kloniertes Zytokin,
das der wichtigste Regulator der Konzentrationen an Blutplättchen in
der Zirkulation zu sein scheint. Siehe Bartley, T.D. et al., Cell
77: 1117–1124
(1994); Lok, S. et al., Nature 369: 565–568 (1994); de Sauvage, F.J.
et al., Nature 369: 533–538
(1994); Miyazake, H. et al., Exp. Hematol. 22: 838 (1994); und Kutter,
D.J. et al., PNAS USA, 91: 11104–11108 (1994). MGDF wird, wie
in Bartley, T.D. et al., Cell 77: 1117–1124 (1994) beschrieben, auch
als Thrombopoetin (TPO), mpl-Ligand oder Megapoetin bezeichnet.
Hier wird die Bezeichnung „mpl-Ligand" allgemein verwendet
werden, um alle Polypeptide zu bezeichnen, welche den mpl-Rezeptor
aktivieren, einschließlich
TPO und MGDF. Der mpl-Rezepor ist ein Zelloberflächenprotein, das als Folge
einer Aktivierung zur Produktion und/oder Entwicklung von Megakaryozyten
und Blutplättchen
führt.
Siehe WO 92/07074.
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„mpl-Ligandenanaloga" sind Polypeptide,
die sich von nativen Sequenzen auf eine Weise unterscheiden, welche
die Anzahl, die Lage oder die Art von Kohlenhydratbindungsstellen
betrifft. Derartige Polypeptide sind ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung. Der reife native menschliche mpl-Ligand ist ein Protein
mit insgesamt 332 Aminosäuren.
Die Sequenz diese Proteins (angefügt an eine Führersequenz
aus 21-Aminosäuren) und
die korrespondierende cDNA werden hier in 1 gezeigt
(SEQ. ID Nr. 1 und 2).
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Für einen
rekombinanten mpl-Liganden, der sowohl in Ovarialzellen vom chinesischen
Hamster (Chinese hamster ovary, CHO) als auch in E. coli produziert
wurde, ist gezeigt worden, dass er eine biologische Aktivität aufweist,
Megakaryozyten und/oder Blutplättchen
in vivo in Mäusen,
Ratten und Affen spezifisch zu stimulieren oder ihre Zahl zu erhöhen. Siehe
z.B. Hunt, P. et al., Blood 84 (10): 390A (1994). Menschliche mpl-Ligandenmoleküle, die
trunkiert worden sind (im Vergleich zu dem Protein mit 332 Aminosäuren, welches durch
die cDNA im Menschen kodiert wird), so dass sie sich über mindestens
151 Aminosäuren
erstrecken, beginnend in der Aminosäureposition 22 in 1, behalten ihre biologische Aktivität in vivo
bei. 2 (SEQ. ID Nr. 3 und 4) zeigt
ein Beispiel eines trunkierten mpl-Ligandenmoleküls, welches in der reifen Form
174 Aminosäuren
und biologische Aktivität
aufweist. In 2 wird gezeigt, dass
das Protein mit 174 Aminosäuren
an eine N-terminale Führersequenz
mit 21 Aminosäuren
angefügt
ist. Diese Molekül
wurde verwendet, um einige der unten im Abschnitt „Beispiele" dargestellten mpl-Ligandenanaloga
zu erzeugen. Andere Analoga beruhen auf den Aminosäuren 1-199,
1-191 und 1-183 in 1. Es ist auch
möglich,
bis zu sechs der ersten Aminosäuren
am N-Terminus des reifen mpl-Ligandenproteins mit der menschlichen
Sequenz zu entfernen und die biologische Aktivität zu erhalten. Deshalb scheint
es, dass die biologische Aktivität
innerhalb der Aminosäuren 7-151
(einschließlich)
der reifen Aminosäuresequenz
des in 1 gezeigten menschlichen mpl-Liganden
bewahrt wird.
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Im
Allgemeinen sind viele Zelloberflächen- und sekretorische Proteine,
die durch eukaryotische Zellen produziert werden, durch eine oder
mehrere Oligosaccharidgruppen modifiziert. Diese Modifikation, die
als Glykosylierung bezeichnet wird, kann die physikalischen Eigenschaften
von Proteinen erheblich beeinflussen und kann auch für die Proteinstabilität, Sekretion
und subzelluläre
Lokalisierung wichtig sein. Eine ordnungsgemäße Glykosylierung kann für die biologische
Aktivität
wesentlich sein. Tatsächlich
liefern einige Gene von eukaryotischen Organismen Proteine, die
aufgrund ihrer fehlenden Glykosylierung mit wenig oder ohne Aktivität gewonnen
werden, wenn sie in Bakterien (z.B. E. coli.) exprimiert werden,
denen die zelluläre
Ausrüstung zum
Glykosylieren von Proteinen fehlt.
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Eine
Glykosylierung findet an speziellen Orten oder Stellen entlang des
Polypeptid-Rückgrats
statt und ist üblicherweise
von zweierlei Art: O-verknüpfte
Oligosaccharide werden an Serin-(Ser)
oder Threonin-(Thr) Reste angefügt,
während
N-verknüpfte
Oligosaccharide (Ketten) an Asparagin-(Asn) Reste angefügt werden, wenn
sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X jede Aminosäure sein
kann mit Ausnahme von Prolin. X ist vorzugsweise eine der 19 natürlich vorkommenden
Amionsäuren,
Prolin nicht gezählt.
Die Strukturen von N-verknüpften und
O-verknüpften
Oligosacchariden und der Zuckerreste, die bei jeder Art gefunden
werden, sind verschieden. Eine Art von Zucker, der gewöhnlich bei
beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (hier im Folgenden als
Sialinsäure
bezeichnet). Sialinsäure
ist gewöhnlich
der terminale Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden
und aufgrund ihrer negativen Ladung kann sie dem Glykoprotein saure
Eigenschaften verleihen.
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Wie
hier verwendet, sind „Glykosylierungsstellen" Aminosäurereste,
die strukturell zu einer Verknüpfung
mit Glykosylresten in der Lage sind, auch wenn derartige Stellen
tatsächlich
mit einem Glykosylrest verknüpft
sein können
oder auch nicht. Wie oben erwähnt,
sind O-verknüpfte Stellen
entweder Ser- oder Thr-Reste, wobei N-verknüpfte Stellen entweder Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr
sind, wobei X als jede Aminosäure
mit Ausnahme von Pro definiert ist (vorzugsweise eine der 19 natürlich vorkommenden
Aminosäuren
mit Ausnahme von Pro). Ob eine vorgegebene Stelle mit einer Glykosylkette
glykosyliert ist, wird durch die Wirtszelle, in der das Molekül exprimiert
wird, die Aminosäuren,
die dieser Stelle benachbart sind und anderen Faktoren bestimmt.
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Wie
hier verwendet, wird die Anzahl an „Ketten", die an ein vorgegebenes mpl-Ligandenanalogon
angefügt
sind, der durchschnittlichen Anzahl an Kohlenhydrat (d.h. Glykosyl-)
Ketten, die an ein vorgegebenes mpl-Ligandenmolekül, das durch
eine bestimmte Wirtszelle exprimiert wird, entsprechen. Vor allem
werden die Glykosylierungsstellen bei natürlichem und entsprechendem,
rekombinantem mpl-Liganden im Allgemeinen dieselben sein, während die
Anzahl an Ketten möglicherweise
variieren wird, was davon abhängt,
ob die bestimmte Wirtszelle, die zur rekombinanten Expression verwendet
wird, Glykosylketten an dieselben Stellen wie die natürliche Quelle
anfügt
oder nicht. Wann immer hier ein Vergleich zwischen rekombinanten
und natürlichen
mpl-Ligandenanaloga vorgenommen wird, wird dieselbe Aminosäurenzahl
verglichen werden, ohne Rücksicht
darauf, ob die natürliche
Quelle tatsächlich
ein mpl-Ligandenmolekül
mit dieser Länge
produziert. Folglich bezieht sich der Begriff „natürlich" auf die Sequenz, die in einer bestimmten
Spezies (wie etwa dem Menschen) eingesetzt wird, anstatt auf die
Länge des
Moleküls,
das tatsächlich
in einer solchen natürlichen Quelle
exprimiert wird.
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Der
natürlich
vorkommende mpl-Ligand ist ein glykosyliertes Molekül. Das Glykosylierungsmuster
von natürlichem
mpl-Liganden weist einen Bezug zu zwei Schlüsseldomänen auf, die in dem mpl-Liganden
gefunden worden sind. Die Sequenz der ersten ungefähr 151 Aminosäuren von
reifem menschlichen mpl-Liganden, die einem aktiven Teilbereich
des Mo leküls
entspricht, trägt
eine bemerkenswerte Homologie zu Erythropoetin (EPO), einem Zytokin,
das in der Lage ist, die Produktion von Erythrozyten zu stimulieren,
und wird als die „EPO-artige" Domäne von menschlichem
mpl-Liganden bezeichnet. Die verbleibenden Aminosäuren des
reifen Proteins machen eine sogenannte „N-verknüpfte Kohlenhydrat"-Domäne aus,
da sie die meisten, wenn nicht alle der natürlichen Stellen für eine N-verknüpfte Glykosylierung
einschließen.
In menschlichem mpl-Liganden gibt es sechs N-verknüpfte Glykosylierungsstellen,
die alle in der N-verknüpften
Glykosylierungsdomäne
enthalten sind. Beide Domänen
enthalten O-verknüpfte
Glykosylierungsstellen. Es gibt schätzungsweise 12-14 O-verknüpfte Glykosylierungsketten
in dem Molekül.
Experimentelle Nachweise mit menschlicher mpl-Liganden-DNA, die
rekombinant in CHO-Zellen exprimiert wurde, zeigen, dass in der
EPO-artigen Domäne
mindestens zwei O-verknüpfte
Stellen in den Positionen 1 (Ser) und 37 (Thr) glykosyliert sind.
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Glykoproteine,
wie etwa der mpl-Ligand, können
in zwei verschieden geladenen Formen unter Verwendung von Techniken,
wie etwa der isoelektrischen Fokusierung (IEF), aufgetrennt werden.
Beispielsweise haben verschiedene Gruppen über IEF-Studien an rohen und
teilweise gereinigten Erythopoetin-Präparationen berichtet (Lukowsky
et al., J. Biochem. 50: 909 (1972); Shelton et al., Biochem. Med.
12: 45 (1975); Fuhr et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 98: 930
(1981).
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Trotz
der oben dargestellten Information zu der Glykosylierung von mpl-Ligandenmolekülen, bleibt
ein Bedarf bestehen, mpl-Ligandenmoleküle mit einem anderen Glykosylierungsmuster
zu erhalten, die biologische Aktivität beibehalten oder bei denen
die biologische Aktivität
verbessert ist.
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Demgemäß ist eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue glykosylierte mpl-Ligandenmoleküle verfügbar zu
machen, die als mpl-Ligandenanaloga bezeichnet werden. Eine weitere
Aufgabe dieser Erfindung ist es, pharmazeutischen Zusammensetzungen,
welche derartige Moleküle
enthalten, und Verfahren zum Behandeln von Zuständen, die durch mpl-Ligand behandelbar
sind, mit den mpl-Ligandenanaloga dieser Erfindung verfügbar zu
machen.
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Kurzfassung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Analogon des Megakaryozytenwachstums- und Entwicklungsfaktors
(MGDF) verfügbar
gemacht, wobei
- (a) das MGDF-Analogon eine Aminosäuresequenz
umfasst, die ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus in SEQ. ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen
7-151 bis einschließlich
1-332.
- (b) das MGDF-Analogon mindestens eine hinzugefügte N-verknüpfte Glykosylierungsstelle
in der Sequenz von Aminosäuren
aufweist,
- (c) das MGDF-Analogon mindestens eine hinzugefügte Kohlenhydratkette
aufweist, die an die hinzugefügte
N-verknüpfte
Glykosylierungsstelle angefügt
ist, und
- (d) das MGDF-Analogon eine biologische Aktivität aufweist,
welche die Megakaryozyten oder Blutplättchen spezifisch stimuliert
oder ihre Anzahl erhöht,
- (e) das MGFD-Analogon ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus
[Asn30,
Thr32]-mpl-Ligand;
[Asn82,
Ala83]-mpl-Ligand;
[Asn120,
Thr122]-mpl-Ligand;
[Asn53,
Thr55]-mpl-Ligand;
[Asn58,
Thr60]-mpl-Ligand;
[Asn30,
Thr32, Asn120, Thr122]-mpl-Ligand;
[Asn54,
Ser56]-mpl-Ligand;
[Asn52,
Thr54]-mpl-Ligand;
[Asn55'(i), Thr57]-mpl-Ligand;
[Asn30,
Ser32, Asn120, Ser122]-mpl-Ligand;
[Thr163,
Asn164]-mpl-Ligand;
[Asn30,
Thr32, Asn120, Thr122, Asn5(i), Thr57]-mpl-Ligand;
[Asn30,
Thr32, Asn55(i),
Thr57, Thr163, Asn164]-mpl-Ligand;
[Asn56]-mpl-Ligand;
[Thr163, Asn164, Thr166]-mpl-Ligand; und
[Asm30,
Thr32, Asn120, Thr122, Asn55, Thr57, Thr163, Asn164, Thr166]-mpl-Ligand,
und
- (f) das MGDF-Analogon eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist
aus folgenden:
mpl-Ligand 1-332 Aminosäuren 1-332 aus 1
mpl-Ligand
1-199 Aminosäuren
1-199 aus 1
mpl-Ligand 1-191
Aminosäuren
1-191 aus 1
mpl-Ligand 1-183
Aminosäuren
1-183 aus 1
mpl-Ligand 1-174
Aminosäuren
1-174 aus 1
mpl-Ligand 1-163
Aminosäuren
1-163 aus 1
mpl-Ligand 1-153
Aminosäuren
1-153 aus 1
mpl-Ligand 1-152
Aminosäuren
1-152 aus 1
mpl-Ligand 1-151
Aminosäuren
1-151 aus 1
mpl-Ligand 7-332
Aminosäuren
7-332 aus 1
mpl-Ligand 7-191
Aminosäuren
7-191 aus 1
mpl-Ligand 7-199
Aminosäuren
7-199 aus 1
mpl-Ligand 7-183
Aminosäuren
7-183 aus 1
mpl-Ligand 7-174
Aminosäuren
7-174 aus 1
mpl-Ligand 7-163
Aminosäuren
7-163 aus 1
mpl-Ligand 7-153
Aminosäuren
7-153 aus 1
mpl-Ligand 7-152
Aminosäuren
7-152 aus 1
mpl-Ligand 7-151
Aminosäuren
7-151 aus 1
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Die
Erfindung umfasst weiterhin DNA-Sequenzen, welche derartige mpl-Ligandenanaloga
kodieren, und rekombinante Plasmide und Wirtszellen zur Expression
der Analoga.
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In
allen der oben beschriebenen Fälle
führt die Änderung
an einer Glykosylierungsstelle zu einer Änderung der Anzahl, Menge,
Lage oder Art (N- versus O-) der Glykosylketten in dem sich ergebenden
mpl-Ligandenanalogon und dieses behält die biologische Aktivität des mpl-Liganden bei, d.h.
das Analogon kann den mpl-Rezeptor noch aktivieren. Die Aktivierung
des mpl-Rezeptors bedeutet, dass die Megakaryozytopoese verstärkt ist,
wodurch es zu einer Zunahme der Blutplättchen in vivo kommt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz
von nativem menschlichem mpl-Liganden, einschließlich einem Signalpeptid (Amionsäuren-21
bis -1) und der reifen Aminosäuresequenz
(1-332).
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2 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz
des mpl-Liganden, die mit den Aminosäuren 1-174 der Sequenz des
menschlichen reifen mpl-Liganden entspricht, die an ein Signalpeptid
mit 21 Aminosäuren
angefügt
ist. Bei den Sequenzen, welche die kodierende Regionen flankieren,
sind XbaI- und SalI-Klonierungsstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden eingefügt.
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3 zeigt
einen Western blot von durch E. coli und CHO-Zellen exprimiertem
mpl-Liganden. MK steht
für Met-Lys,
das an den N-Terminus vom mpl-Liganden zur Expression in E. coli
angefügt
ist und unter Verwendung einer Dipeptidase, wie Cathepsin C, abgespaltet
werden kann. Ein Molekül,
bei dem MK entfernt worden ist, wird als des MK bezeichnet. Eine
Behandlung mit den Glykosidasen Neuraminidase und O-Glykanase wird
angegeben.
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4 zeigt
die Aktivität
in vivo von durch E. coli und CHO-Zellen exprimiertem mpl-Liganden in normalen
Mäusen,
bezogen auf die Zahl der Blutplättchen.
Diese Daten zeigen, dass der glykosylierte mpl-Ligand (CHO-Material)
eine Aktivität
aufweist, die der des nicht-glykosylierten
(E. coli) Materials überlegen
ist. Dies kann ein Ergebnis der erhöhten Halbwertszeit des glykosylierten
Materials sein. Beispielsweise steht CHO 332 für die Aminosäuren 1-332
des in CHO-Zellen exprimierten menschlichen mpl-Liganden (1).
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5 zeigt
eine Western blot-Analyse von COS-Zellüberständen von rekombinantem menschlichem mpl-Liganden
und den Analoga 4, 6, 7, 9, 10 und 11. Die Konstruktion dieser Analoga
wird im Beispiel 4 beschrieben. Die Analoga 4, 7, 10 weisen mindestens
eine zusätzliche
Kohlenhydratkette auf, wie durch eine geringere Gelmobilität nachgewiesen
wird. Die Analogonnummern entsprechen den Analogonnummern, die in Tabelle
1 verfügbar
gemacht werden (z.B. entspricht die Nummer 11 dem Analogon N11).
In Tabelle 1 ist N1 die Kontrolle.
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6 zeigt
eine Western blot-Analyse von COS-Zellüberständen von rekombinantem menschlichem mpl-Liganden
und den Analoga 4, 5, 13, 14 und 15. Die Konstruktion der Analoga
wird im Beispiel 4 beschrieben. Die Analoga 4, 13, 14 und 15 wiesen
mindestens eine zusätzliche
Kohlenhydratkette auf, wie durch eine geringere Gelmobilität nachgewiesen
wird.
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7 zeigt
eine Western blot-Analyse von COS-Zellüberständen von menschlichem mpl-Liganden und angegebenen
mpl-Ligandenanaloga nach Behandlung mit N-Glykanase. Die Ergebnisse
zeigen, dass die Analoga verschiedene Glykosylierungsmuster aufweisen.
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8 zeigt die Ergebnisse eines Biotests
zum Wachstum menschlicher Megakaryozyten mit mpl-Ligandenanaloga.
Die Tafeln A und D sind die positiven bzw. negativen Kontrollen.
Das in Tafel A abgebildete Well erhielt 37, 5 pg Wildtyp (d.h. natürliche Sequenz)
mpl-Ligand 1-174
COS-1-konditioniertes Medium und zeigt ein wesentliches Megakaryozytenwachstum.
Das Well in Tafel D erhielt 1,5 μl
COS-1-konditioniertes Medium ohne Liganden (Mock) und zeigte kein
Wachstum. In dem Tafeln B und C werden die mpl-Liganden 1-174-Analoga
7 bzw. 10 gezeigt. Das Well in Tafel B erhielt 9,0 pg mpl-Ligand
COS-1-konditioniertes Medium, während
das Well in Tafel C 27 pg erhielt, und beide zeigten ein ausgezeichnetes
Megakaryozytenwachstum.
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9 zeigt
eine Western blot-Analyse von CHO-mpl-Ligand 1-174 und den Analoga
N4 und N15 (siehe Tabelle 1). Eine geringere Gelmobilität zeigte,
dass das Analogon N4 (4B) ein zusätzliches Oligosaccharid aufweist,
während
das Analogon N15 (15-8) zwei zusätzliche
Oligosaccharide aufweist.
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10 zeigt
einen Western blot von durch CHO-Zellen produzierten mpl-Ligandenanaloga
mit und ohne Behandlung mit N-Glykanase, wie angegeben. Ein geringere
Gelmobilität
nach Behandlung mit N-Glykanase zeigte das Vorhandensein von N-verknüpftem Oligosaccharid.
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11 zeigt
die Blutplättchenzählungen
von Mäusen,
die mit verschiedenen Formen des mpl-Liganden in verschiedenen Dosen behandelt
wurden. Die Daten zeigen, dass zunehmende Mengen an N- und/oder O-verknüpftem Kohlenhydrat
zu einer gesteigerten Aktivität
in vivo führen.
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12 zeigt
eine Western blot-Analyse von durch COS-Zellen produziertem mpl-Liganden
1-174 zusammen mit den Analoga N10, N15, N33, N39, N31 und N40.
Die Anzahl an hinzu gefügten
N-verknüpften
Glykosylstellen wird ebenfalls angegeben. Die Figur zeigt, dass
ein Zunehmen der Anzahl an N-verknüpften Stellen die Mobilität des mpl-Liganden
aufgrund zunehmender Mengen an N-verknüpftem Kohlenhydrat reduziert.
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13 zeigt
eine Western blot-Analyse von in COS-Zellen produziertem mpl-Liganden
1-174 zusammen mit
den Analoga N15, N29, N30 und N38. Die Anzahl der N-verknüpften Glykosylketten
ist ebenfalls angegeben.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Der
Gegenstand der Erfindung macht mpl-Liganden mit Glykosylierungsstellen
verfügbar,
die sich von denen eines natürlichen
mpl-Liganden mit einer entsprechenden Sequenz unterscheiden. Vorzugsweise
sind die resultierenden Moleküle
solche, die zusätzliche
Glykosylierungsstellen aufweisen, die durch Glykosylketten nach
Expression in einer Säugetierzelle
(wie etwa COS; CHO und menschliche Zellen) besetzt sind.
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In
einer ersten Ausführung
bezieht sich der Gegenstand der Erfindung auf mpl-Ligandenanaloga,
die eine Aminosäuresequenz
umfassen, welche mindestens eine hinzugefügte, mindestens eine deletierte und/oder
mindestens eine hinzugefügte
und deletierte Stelle zur Glykosylierung im Vergleich zu dem entsprechenden
mpl-Liganden mit natürlicher
Sequenz aufweisen. Die hinzugefügte
oder deletierte Stelle bzw. die hinzugefügte(n) oder deletierte(n) Stelle(n)
zur Glykosylierung können
zu einer größeren oder
geringern Anzahl an Kohlenhydratketten und höherem oder geringerem Sialinsäuregehalt
im Vergleich zu dem entsprechenden mpl-Liganden mit natürlicher
Sequenz, insbesondere eines menschlichen mpl-Liganden, führen. Eine
Kombination aus einer Deletion an einer Stelle und einer Hinzufügung einer
anderen Stelle würde
zu keiner Netto-Änderung
der Anzahl an Stellen führen,
jedoch zu einer Änderung
des Orts und/oder der Art der Stelle. Derartige kombinierte Austauschanaloga
sind ebenfalls von dieser Erfindung umfasst.
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Unter
einem anderen Aspekt der oben beschriebenen Ausführung bezieht sich der Gegenstand
der Erfindung auf mpl-Ligandenanaloga, welche Aminosäuresequenzen
umfassen, welche einen Austausch von einer oder mehreren N- oder
O-verknüpften
Glykosylierungsstellen durch eine oder mehrere nicht natürlich vorkommende
Stellen einschließt.
Folglich kann eine N-verknüpfte
Stelle durch eine davon verschiedene N-verknüpfte Stelle ersetzt sein; eine
N- verknüpfte Stelle
kann durch eine O-verknüpfte
Stelle ersetzt sein; eine O-verknüpfte Stelle kann durch eine
davon verschiedene O-verknüpfte
Stelle ersetzt sein; und/oder eine O-verknüpfte Stelle kann durch eine
N-verknüpfte
Stelle ersetzt sein. Der Austausch von einer Stelle durch eine andere
Stelle an im Wesentlichen demselben Ort kann zum Ergebnis haben,
dass die Glykosylierungseffizienz an dieser Stelle zunimmt oder
sie kann andere Wirkungen haben. Beispielsweise wird hier der Nachweis
geführt,
dass ein Thr-Rest anstelle eines Ser-Restes die Glykosylierungseffizienz
an O-verknüpften
Stellen erhöht.
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Der
Begriff „mpl-Ligand", wie hier verwendet,
schließt
den natürlich
vorkommenden mpl-Liganden, Trunkierungen
vom natürlich
vorkommenden mpl-Liganden ebenso wie nicht natürlich vorkommende Polypeptide
mit einer Aminosäuresequenz
und einer Glykosylierung ein, welche die des natürlich vorkommenden mpl-Liganden
ausreichend kopiert, um den Besitz einer biologischen Aktivität zum spezifischen
Stimulieren des Wachstums, der Entwicklung und/oder Produktion von
Megakaryozyten und/oder Blutplättchen
zu erlauben. mpl-Ligandenanaloga,
die auf mindestens den Aminosäuren
7-151 bis zu den Aminosäuren
1-332 in 1 beruhen, werden bevorzugt.
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In
einer bevorzugten Ausführung
ist der mpl-Ligand das Produkt der Expression einer exogenen DNA-Sequenz,
die in eine eukaryotische Wirtszelle transfiziert worden ist; d.h.,
in einer bervorzugten Ausführung
ist der mpl-Ligand ein „rekombinatneter
mpl-Ligand". Die
bevorzugte eukaryotische Wirtszelle ist eine Säugetierzelle, besonders zu
bevorzugen sind CHO-Zellen.
Der rekombinante mpl-Ligand wird vorteilhafterweise gemäß den hier
beschriebenen Vorgehensweisen und den hier zitierten Publikationen
im Hinblick auf das Klonieren und die Expression des mpl-Liganden
hergestellt.
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mpl-Ligandenmoleküle weisen
auf der Grundlage der hier dargestellten
1 die
folgenden Aminosäuresequenzen
auf:
mpl-Ligand
1-332 | Aminosäuren 1-332
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-199 | Aminosäuren 1-199
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-191 | Aminosäuren 1-191
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-183 | Aminosäuren 1-183
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-174 | Aminosäuren 1-174
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-163 | Aminosäuren 1-163
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-153 | Aminosäuren 1-153
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-152 | Aminosäuren 1-152
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
1-151 | Aminosäuren 1-151
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-332 | Aminosäuren 7-332
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-191 | Aminosäuren 7-191
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-199 | Aminosäuren 7-199
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-183 | Aminosäuren 7-183
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-174 | Aminosäuren 7-174
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-163 | Aminosäuren 7-163
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-153 | Aminosäuren 7-153
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-152 | Aminosäuren 7-152
aus FIG. 1 |
mpl-Ligand
7-151 | Aminosäuren 7-151
aus FIG. 1 |
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Es
sollte beispielsweise beachtet werden, dass die mpl-Liganden 1-183,
1-191, 7-183 und 7-191
eine oder zwei zusätzliche
natürlich
vorkommende Glykosylierungsstellen an deren C-Terminus im Vergleich zu kürzeren Sequenzen
aufweisen. In jedem der oben genannten Fälle kann weiterhin Met-Lys
in den N-Terminus eingeschlossen sein.
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Die
spezifischen in vitro-Aktivitäten,
auf die hier Bezug genommen wird, sind Messungen von relativen spezifischen
in vitro-Aktivitäten,
und sie sind keine Messungen von absoluten spezifischen in vitro-Aktivitäten. Zum
Zweck dieser Anmeldung werden die spezifischen Aktivitäten nur
verwendet, um die relativen Aktivitäten von mpl-Ligandenanaloga
zu vergleichen, die unter Verwendung desselben Tests und unter Verwendung
derselben Bedingungen, einschließlich demselben internen Standard,
getestet worden sind, und welche dieselbe Analyse der Daten aufweisen,
die verwendet wurden, um die spezifische Aktivität zu berechnen, etc.
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Wie
hier verwendet, beziehen sich die Ausdrücke „Analogon vom mpl-Liganden" oder „mpl-Ligandenanalogon" auf einen mpl-Liganden
mit einer oder mehreren Änderungen
in der Aminosäuresequenz
vom mpl-Liganden, die zu einer Änderung
in der Art (N- oder O-verknüpft, was
die Menge an angefügtem
Kohlenhydrat beeinflussen kann), Anzahl oder dem Ort von Stellen
für das
Anfügen
von Kohlenhydraten führt.
In einer bevorzugten Ausführung
führt die Änderung
der Glykosylierungsstelle(n) zu einer Änderung der Anzahl der Glykosylketten,
die an das mpl-Ligandenmolekül
angefügt
sind. In einer besonders bevorzugten Aus führung fügt die Änderung in der Glykosylierungsstelle
bzw. den Glykosylierungsstellen mindestens eine (im Allgemeinen 1-6,
vorzugsweise 1-5, besonders bevorzugt 2-4) Glykosylketten hinzu,
und am stärksten
bevorzugt wird die Kette bzw. werden die Ketten durch eine N-Bindung
hinzugefügt.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführung behält das mpl-Ligandenanalogon mindestens äquivalente
biologische Aktivität
in vivo im Vergleich zu dem mpl-Liganden mit natürlicher Sequenz (z.B. menschlicher
mpl-Ligand) bei und kann eine wesentlich höhere Aktivität in vivo
besitzen, wie in Tests zur biologischen Aktivität gemessen wurde. Derartige Tests
schließen
solche ein, die eine Produktion von Megakaryozyten oder Blutplättchen detektieren.
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Um
derartige Analoga vom mpl-Liganden herzustellen, werden sie vorzugsweise
durch ortsgerichtete Mutagenese, die zu Additionen, Deletionen oder
Substitutionen von Aminosäureresten
führen,
die Stellen, die für
eine Glykosylierung verfügbar
sind, hinzufügen,
eliminieren oder verändern,
erzeugt. „Verändert" bedeutet, dass eine
Stelle deletiert worden ist, während
eine andere an demselben oder einem anderen Ort wie die deletierte
Stelle hinzugefügt
worden ist. Allerdings wird durch diejenigen, die auf dem Fachgebiet
sachkundig sind, anerkannt werden, dass andere Verfahren zu einem
Gen führen
könnten,
welches dieselbe Aminosäuresequenz
kodiert, und derartige Verfahren sind hier umfasst. Die sich ergebenden
Analoga können
weniger oder mehr (vorzugsweise mehr) angefügte Kohlenhydratketten als
der natürliche
menschliche oder rekombinante mpl-Ligand aufweisen.
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Eine
Addition von einer oder mehreren Kohlenhydrat-(d.h. Glykosyl-) Ketten
an dem mpl-Liganden
ist ein wichtiger Gegenstand dieser Erfindung. mpl-Ligandenanaloga
mit mehr Kohlenhydratketten als denen, die in der entsprechenden
natürlich
vorkommenden Aminosäuresequenz
(z.B. 1-332 oder 1-174 etc.) gefunden werden, werden durch Hinzufügen von
Glykosylierungsstellen, welche die sekundäre oder tertiäre Konformation
nicht auf eine Weise stören,
welche die biologische Aktivität
wesentlich reduziert, erzeugt. Wie hier verwendet, bezieht sich
der Begriff „natürlich vorkommender" mpl-Ligand auf eine
Aminosäuresequenz,
welche die entsprechende Anzahl an Aminosäuren wie das relevante Analogon
aufweist, selbst wenn die jeweilige Länge der mpl-Ligandenspezies
in der nativen Spezies nicht tatsächlich exprimiert wird. Vorteilhafterweise weist
das Analogon des mpl-Liganden bis zu sechs zusätzliche Stellen für eine N-Glykosylierung
oder O-Glykosylierung auf, was zu einer Addition von 1 bis zu 6
zusätzlichen
N-verknüpften
oder O-verknüpften
Kohlenhydratketten (oder eine Kombination davon) führt.
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Beispielsweise
wird ein Pro in Position 30 durch ein Asn ersetzt, und ein Val in
Position 32 wird durch ein Thr ersetzt, um die Sequenz Asn-Glu-Thr
zu ergeben, welche als eine neue Stelle zur N-Glykosylierung (Analogon
N4 unten; siehe Tabelle 1) dient.
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Es
können
auch Analoga konstruiert werden, die zwei oder mehrere zusätzliche
N-verknüpfte
Ketten durch Kombinieren von Mutationen aufweisen; beispielsweise
können
die Analoga N4 und N10, die in Tabelle 1 beschrieben werden, kombiniert
werden, um ein Analogon mit zwei zusätzlichen Stellen zur Kohlenhydrat-Addition
zu liefern (d.h. Analogon N15 in Tabelle 1). Auf eine ähnliche
Weise können
Analoga mit 3 oder mehr hinzugefügten
Ketten konstruiert werden. Wie durch diejenigen, die auf dem Fachgebiet
sachkundig sind, anerkannt werden wird, schließt der Gegenstand der Erfindung
viele andere Analoga vom mpl-Liganden mit verschiedenen Stellen
zur Glykosylierung (in Bezug auf Anzahl, Art oder Ort der Stelle)
ein. Die mpl-Ligandenanaloga dieser Erfindung sind in jedem Fall
besonders zu bevorzugen auf der Grundlage eines mpl-Liganden mit
einer menschlichen Aminosäuresequenz
(siehe 1 und 2);
allerdings werden Analoga, die auf mpl-Ligandensequenzen von anderen
Spezies, (z.B. Hund, Schwein, Affe, Maus oder Ratte) beruhen, hier ebenfalls
in Betracht gezogen.
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Insertionen
von Aminosäuren,
um Glykosylierungsstellen zu erzeugen, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Beispielsweise wird ein Glu in Position 57 durch ein Thr ersetzt,
und Asn wird unmittelbar nach Met in Position 55 eingefügt, wie
folgt:
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Dies
fügt eine
neue Glykosylierungsstelle (Aminosäuren 55', 56 und 57) hinzu. Siehe Analogon N23 unten.
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Ebenfalls
von den Analoga dieser Erfindung umfasst sind Analoga, die eine
oder mehrere Aminosäuren
aufweisen, die sich vom carboxylterminalen Ende des mpl-Liganden
erstrecken, wobei die carboxylterminale Extension mindestens eine
zusätzliche
Kohlenhydratstelle ver fügbar
macht. Der Carboxylterminus des mpl-Liganden wird in Abhängigkeit
von der spezifischen Form des verwendeten mpl-Liganden (z.B. mpl-Ligand
1-332 Aminosäuren
oder mpl-Ligand
1-163 Aminosäuren)
variieren. Eine zusätzliche
Kohlenhydratstelle kann zum Carboxylterminus einer mpl-Ligandenspezies
hinzugefügt
werden, indem man Aminosäuren
an den Carboxylterminus anfügt,
wobei solche Aminosäuren
eine oder mehrere N- oder O-verknüpfte Glykosylierungsstellen
enthalten.
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Die
Tabellen 1 und 6 listen einige beispielhafte mpl-Ligandenanaloga
auf, welche zusätzliche
Stellen für
N-verknüpfte
Kohlenhydratketten aufweisen. Die Analoga haben die Sequenz Asn-X-Ser
oder Asn-X-Thr an verschiedenen Positionen in der menschlichen mpl-Liganden-Polypeptidkette,
die auf den menschlichen Aminosäuresequenzen
beruht, um N-verknüpfte
Stellen zu erzeugen, eingeschlossen. Die Tabellen 4 und 7 listen
diejenigen Analoga auf, die mindestens eine zusätzliche N-verknüpfte Kohlenhydratkette
hinzufügen, was
durch die Wanderung des Glykoproteins in SDS-Gel nachgewiesen wird
(siehe Beispiel 6 und 3, 5, 6, 7, 9, 10, 12 und 13).
Man beachte, dass diese Tabellen auch einige trunkierte Spezies
einschließen,
die keine „Analoga", wie hier definiert,
sind (d.h. N1, N16, N17 und N31). Diese werden in den Tabellen aufgelistet,
um zu zeigen, wie verschiedene trunkierte Spezies hergestellt wurden.
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Ebenso
umfasst von der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die die
mpl-Ligandenanaloga, die
hier offenbart werden, kodieren, vorzugsweise diejenigen Sequenzen,
die Analoga kodieren, die zusätzliche
Stellen für
N-verknüpfte
Ketten aufweisen. Verfahren, die verwendet werden, um Änderungen
in der mpl-Liganden-DNA-Sequenz herbeizuführen mit dem Ziel, Anfügungsstellen
für Kohlenhydrate
zu erzeugen, zu deletieren und/oder zu ändern, werden in den Beispielen
4 und 14 offenbart.
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Diese
mpl-Ligandenanaloga können
das Produkt einer Expression einer exogenen DNA-Sequenz sein, d.h. sie können durch
rekombinante DNA-Technologie hergestellt worden sein, sie können chemisch
synthetisierte Produkte sein oder sie können durch eine Kombination
aus verschiedenen Verfahren hergestellt worden sein. Eine exogene
DNA-Sequenz umfasst cDNA, genomische DNA oder chemisch synthetisierte DNA,
die ein mpl-Ligandenanalogon kodiert. Es werden auch rekombinante
DNA-Plasmide und eukaryotische Wirtszellen, die für die Expression
solcher Analoga nützlich
sind, verfügbar
gemacht.
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Expressionsvektoren
schließen
jeden Vektor ein, der in der Lage ist, klonierte DNA-Sequenzen in einer
eukaryotischen Wirtszelle zu exprimieren, insbesondere schließen sie
jene Vektoren ein, die für
die Expression in COS- und CHO-Zellen verwendet werden. Beispiele
für solche
Vektoren schließen
die Plasmide pDSRα und
pDSRα2 ein,
siehe Mol. Cell. Biol. 8: 466–472
(1988); WO 91/13160 (1991); und WO 90/14363 (1990). Die Kultivierung
von COS- und CHO-Wirtszellen, die mpl-Ligandenanaloga exprimieren,
wurde unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die
denjenigen die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, bekannt sind.
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Das Ändern der
Anzahl, der Art, des Ortes oder der Menge an Kohlenhydratketten,
die an den mpl-Liganden angefügt
sind, kann vorteilhafte Eigenschaften verleihen, wie z.B. eine erhöhte Löslichkeit,
höhere
Resistenz gegenüber
Proteolyse, geringere Immunogenität, erhöhte Halbwertszeit im Serum
und erhöhte
oder geänderte
biologischen Aktivität.
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Konditionierte
Medien von COS-Zellen, welche die mpl-Ligandenanaloga N2–N15 exprimieren
(N1 ist der menschliche mpl-Ligand 1-174; siehe 2)
wurden auf ihre biologische Aktivität in vitro hin untersucht und
die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.
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Konditionierte
Medien von COS-Zellen, welche die mpl-Ligandenanaloga/Trunkierungen
N15–N40
exprimieren, wurden auf ihre biologische Aktivität in vitro hin untersucht und
die Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt.
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Die
Ergebnisse der biologischen Aktivität in vivo für verschiedene Formen werden
in 11 gezeigt (siehe Beispiel 13).
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Eine
andere Ausführung
der Erfindung bezieht sich auf Wirtszellen von Säugetieren (z.B. vom Ovar des
chinesischen Hamsters, CHO), die vorzugsweise mpl-Liganden oder
Analoga von mpl-Liganden synthetisieren, die mehr als eine spezifischen
Anzahl von Sialinsäuren
pro Molekül
aufweisen, z.B. mehr als die, die in den mpl-Liganden 1-332, 1-199,
1-191, 1-183, 1-174,
1-163, 1-153, 1-152 oder 1-151 gefunden werden, die natürlich oder
rekombinant in einer eukaryotischen Zelle hergestellt werden. Die
in vitro-Aktivitäten
der Analoga N4 und N15, zusammen mit Volllänge- und trunkierten Spezies,
die in CHO-Zellen exprimiert werden, werden in Tabelle 5 gezeigt.
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Der
Sialinsäuregehalt
der mpl-Ligandenmoleküle
kann einen Einfluss auf seine biologische Aktivität in vivo
haben. Beispielsweise machen tetraantennäre (vierfach verzweigte) N-verknüpfte Oligosaccharide
gewöhnlich
vier mögliche
Stellen für
eine Anfügung
von Sialinsäure
verfügbar,
während
bi- und triantennäre
Oligosaccharide, welche die tetraantennäre Form bei Asparagin-verknüpften Stellen
substituieren können,
gewöhnlich
bestenfalls nur zwei oder drei Sialinsäuren anfügen. O-verknüpfte Oligosaccharide
machen gewöhnlich
zwei Stellen zur Anfügung
von Sialinsäure
verfügbar.
Deshalb können
mpl-Ligandenmoleküle,
bei denen N-verknüpftes
Kohlenhydrat durch O-verknüpftes
Kohlenhydrat substituiert ist, zwei zusätzliche Sialinsäuren pro
Kette aufnehmen, vorausgesetzt, die N-verknüpften Oligosaccharide sind
tetraantennär.
Säugetierzellkulturen
werden auf solche Zellen hin überprüft, die
vorzugsweise tetraantennäre
Ketten an rekombinante mpl-Liganden anzufügen, wodurch die Anzahl der
Stellen zur Anheftung von Sialinsäure maximiert wird.
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Dihydrofolatreduktase
(DHFR)-defiziente chinesische Hamsterovarzellen (CHO) werden gewöhnlich als
Wirtszellen für
die Herstellung von rekombinanten Glykoproteinen, einschließlich rekombinantem
mpl-Liganden, verwendet.
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Zusammensetzungen,
die eine therapeutisch wirksame Menge eines mpl-Ligandenanalogon
in Übereinstimmung
damit zusammen mit einem geeigneten Verdünnungsmittel, einem Adjuvanz
und/oder einem Träger
umfassen, die bei der mpl-Ligandentherapie nützlich sind, sind von dieser
Erfindung weiter umfasst. Eine „therapeutisch wirksame Menge", wie hier verwendet,
bezieht sich auf diejenige Menge, die eine therapeutische Wirkung
für einen
vorgegebenen Zustand und ein Verabreichungsschema verfügbar macht.
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Die
vorliegende Zusammensetzung kann systemisch parenteral verabreicht
werden. Alternativ dazu können
die Zusammensetzungen intravenös
oder subkutan verabreicht werden. Wenn sie systemisch verabreicht
werden, können
die therapeutischen Zusammensetzungen für die Verwendung in dieser
Erfindung in Form einer pyrogenfreien, parenteral akzeptablen wässrigen
Lösung
vorliegen. Die Zubereitung von solchen pharmazeutisch akzeptablen
Proteinlösungen
bei genauer Beachtung des pH-Werts, der Isotonie, der Stabilität und dergleichem,
liegt im Bereich des Könnens
des Fachmanns. Der spezifische Weg, der eingeschlagen wird, wird
von dem zu behandelnden Zustand abhängen. Die Verabreichung eines
mpl-Liganden oder von mpl-Ligandenanaloga wird vorzugsweise als
Teil einer Formulierung vorgenommen, die einen geeigneten Träger, wie
z.B. menschliches Serumalbumin, ein geeignetes Ver dünnungsmittel,
wie z.B. gepufferte Salzlösung und/oder
ein geeignetes Adjuvanz enthält.
Die erforderliche Dosierung wird in Mengen vorhanden sein, die ausreichen,
um den Blutplättchenspiegel
von Patienten anzuheben und sie wird unterschiedlich sein, je nach der
Schwere des Zustands, der behandelt wird, der Methode der Verabreichung,
die verwendet wird und dergleichen.
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Die
Zustände,
die durch die Verfahren und durch die Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung behandelt werden sollen, sind im Allgemeinen diejenigen,
die einen existierenden Mangel an Megakaryozyten/Blutplättchen oder
einen in der Zukunft zu erwartenden Mangel an Megakaryozyten/Blutplättchen umfassen
(z.B. wegen einer geplanten Operation). Solche Zustände werden
gewöhnlich
das Ergebnis eines Mangels (zeitlich begrenzt oder andauernd) von
aktivem mpl-Liganden in vivo sein. Der Oberbegriff für einen
Mangel an Blutplättchen
ist Thrombozytopenie und deshalb sind die Verfahren und Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen für die Behandlung von Thrombozytopenie
verfügbar.
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Eine
Thrombozytopenie (Mangel an Blutplättchen) kann aus verschiedenen
Gründen,
einschließlich Chemotherapie,
Knochenmarkstransplantationen und anderer Therapien mit einer Vielzahl
an Medikamenten, Strahlentherapie, Operationen, eines durch einen
Unfall verursachten Blutverlusts und anderer spezifischer Krankheitszustände vorliegen.
Beispiele für
spezifische Krankheitszustände,
die eine Thrombozytopenie umfassen und die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung
behandelt werden können,
sind: aplastische Anämie, idiopathische
Thrombozytopenie, metastasierende Tumoren, die zu einer Thrombozytopenie
führen,
systemischer Lupus erythematosus, Splenomegalie, Franconi-Syndrom,
Vitamin-B12-Mangel,
Folsäuremangel, May-Hegglin-Anomalie,
Wiskott-Aldrich-Syndrom und anfallsartige nächtliche Hämoglobinurie. Ebenso führen einige
Behandlungen von AIDS zu Thrombozytopenie (z.B. AZT). Einige Störungen bei
der Wundheilung könnten
ebenso von einem Anstieg der Zahl der Blutplättchen profitieren.
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Im
Hinblick auf erwartete Mängel
an Blutplättchen,
z.B. wegen einer bevorstehenden Operation oder wegen einer bevorstehenden
Therapie, die zu einer Thrombozytopenie führt, könnte ein mpl-Ligandenanalogon
der vorliegenden Erfindung einige Tage bis einige Stunden vor dem
Bedarf an Blutplättchen
verabreicht werden. Im Hinblick auf akute Situationen, z.B. ein
durch einen Unfall verursachter oder ein massiver Blutverlust, könnte ein
mpl-Ligandenanalogon
zusammen mit Blut oder gereinigten Blutplättchen verabreicht werden.
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Das
Dosierungsschema, das ein Verfahren zur Behandlung der oben beschriebenen
Zustände
umfasst, wird vom behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren
in Betracht zieht, die die Wirkung von Arzneimitteln beeinflussen,
wie z.B. Alter, Zustand, Körpergewicht,
Geschlecht und Ernährung
des Patienten, die Schwere von irgendeiner Infektion, die Zeit der
Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im Allgemeinen sollte
die tägliche
Medikation in einem Bereich von 0,01–1000 μg mpl-Ligandenanalogon pro Kilogramm Körpergewicht,
vorzugsweise 0,1–10 μg pro Kilogramm
Körpergewicht
liegen.
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Die
therapeutischen Verfahren, Zusammensetzungen und Polypeptide der
vorliegenden Erfindung können
alleine oder in Kombination mit anderen Zytokinen, löslichem
mpl (z.B. mpl-Ligand)-Rezeptor,
hämatopoetischen
Faktoren, Interleukinen, Wachstumsfaktoren und Antikörpern auch
bei der Behandlung von Krankheitszuständen, die durch andere Symptome,
ebenso wie durch einen Mangel an Blutplättchen charakterisiert sind,
verwendet werden. Es wird erwartet, dass ein mpl-Ligandanalogonmolekül sich bei
der Behandlung einiger Formen von Thrombozytopenie in Kombination
mit allgemeinen Stimulatoren der Hämatopoese, wie z.B. IL-3 oder
GM-CSF, als nützlich
erweisen wird. Andere stimulatorische Faktoren für Megakaryozyten, d.h. meg-CSF,
Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF), Leukämie-Hemmfaktor (leukemia inhibitory factor,
LIF), Oncostatin M (OSM) oder andere Moleküle mit stimulierender Aktivität für Megakaryozyten
können
ebenso mit mpl-Liganden eingesetzt werden. Zusätzliche Beispiele für Zytokine
oder hämatopoetische
Faktoren für
solch eine gemeinsame Verabreichung schließen IL-1 alpha, IL-1 beta,
IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11,
koloniestimulierender Faktor-1 (colony stimulating factor-1, CSF-1),
GM-CSF, granulozytenkoloniestimulierender Faktor (granulocyte colony
stimulating factor, G-CSF), EPO, Interpheron-alpha (IFN-alpha),
IFN-beta oder IFN-gamma ein. Es könnte weiter nützlich sein,
eine wirksame Menge eines löslichen
Säugetier-mpl-Rezeptors
entweder gleichzeitig oder in Folge zu verabreichen, was zu bewirken
scheint, dass Megakaryozyten veranlasst werden, sich in Blutplättchen zu
fragmentieren, sobald die Megakaryozyten ihre reife Form erreicht
haben. Deshalb erwartet man, dass die Verabreichung eines mpl-Ligandenanalogons
(um die Anzahl der reifen Megakaryozyten zu erhöhen), gefolgt von der Verabreichung
eines löslichen
mpl-Rezeptors (um das Analogon zu inaktivieren und es dem reifen
Megakaryozyten zu ermöglichen,
Blutplättchen
zu erzeugen), ein besonders wirksames Mittel ist, die Produktion
von Blutplättchen
zu stimulieren. Die Dosierung, die oben genannt wurde, würde angepasst
werden, um solche zusätzlichen
Bestandteile in der therapeutischen Zusammensetzung zu kompensieren.
Ein Fortschritt des behandelten Patienten kann mit herkömmlichen
Verfahren überwacht
werden.
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Zusätzliche
Modifikationen der Analoga dieser Erfindung können auch ausgeführt werden,
um z.B. die Aktivität,
die Stabilität,
die Halbwertszeit etc. zu erhöhen.
Es könnte
z.B. eine Pegylierung (poly- oder mono-) an das mpl-Ligandenanalogon über Aminogruppen
an dem Protein oder über
Kohlenhydratgruppen angefügt werden.
Es könnten
ebenso Fettsäuren
oder andere Polymere an das Protein oder die Kohlenhydratgruppe angefügt werden.
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Die
folgenden Beispiele sollen die Erfindung besser veranschaulichen,
sollen sie jedoch nicht in ihrem Umfang einschränken. Der mpl-Liganden-Standard,
der in den Biotest in den Beispielen verwendet wurde, ist ein rekombinanter
mpl-Liganden-Standard, der in E. coli exprimiert, in eine aktive
Konformation gefaltet und gereinigt worden war. Deshalb werden nur
relative spezifische Aktivitäten
gemessen.
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BEISPIEL 1
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Konstruktion vom mpl-Liganden
1-174
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Ein
menschliches mpl-Liganden-Gen, das die Aminosäuren 1-174 (beginnend mit S-P-A-P-P-A...) aus 2 kodiert, wurde aus einer menschlichen
fötalen
Leber-cDNA-Bibliothek (Barley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994)
durch PCR (polymerase chain reaction) gewonnen. Der 5'-PCR-Primer kodierte
den Aminoterminus des menschlichen mpl-Liganden, eine XbaI-Stelle und eine optimierte
Kozak-Sequenz. Der 3'-Primer
enthielt ein Stoppkodon und eine SalI-Restriktionsstelle. Das amplifizierte
DNA-Fragment wurde mit XbaI und SalI verdaut, dann in mit XbaI und
SalI verdautes pDSRα2
ligiert. Das sich ergebende Plasmid, pDSRα2-mpl-Ligand 1-174, wurde zur Expression
in Säugetierzellen
verwendet. Die Sequenz des daraus hervorgehenden Gens (einschließlich des
Signalpeptids) wird in 2 gezeigt.
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Plasmid-DNA,
die mpl-Ligand 1-174 enthielt, wurde mit den Restriktionsenzymen
XbaI und SalI verdaut, die sich ergebenden DNA-Fragmente wurden
einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und das 605 nt mpl-Liganden
1-174-DNA-Fragment wurde unter Verwendung eines GeneCleanTM-Kits und von Verfahren, die durch den
Hersteller (BIO 101, Inc.) bereit gestellt wurden, aus dem Gel isoliert.
Das Plasmid pDSRα2,
wie in WO 90/14363 (1990) be schrieben, wurde auch mit den Restriktionsenzymen
XbaI und SalI verdaut und das Vektorfragment wurde zurückgewonnen.
Die Ligation der beiden Fragmente führt zu pDSRα2 (mpl-Ligand 1-174).
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BEISPIEL 2
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Expression von mpl-Liganden
1-174 in CHO-Zellen und Reinigung
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Dihydrofolatreduktase-defiziente
(DHFR–)
Zellen aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (CHO) wurden mit pDSRα2-mpl-Ligand
1-174 transfiziert. Eine 100 mm-Gewebekulturschale
wurde mit 1 × 106 CHO-DHFR–-Zellen
in CHO-D–-Medium
(DMEM, 10% fötales
Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin/Glutamin, 1% nicht essentielle
Aminosäuren
(Gibco) und 1% HT-Ersatz (Gibco)) am Tag vor der Transfektion ausplattiert.
Vier Transfektionen wurden durchgeführt. Bei jeder Transfektion
wurde Plasmid-DNA (50 μg)
durch Verdauung mit Pvu I und Puffer H (Boehringer Mannheim) linearisiert.
Dann wurde ein DNA-Präzipitat
gebildet und tröpfchenweise
mit dem Säugetier-Zell-Transfektionskit
(„Mammalian
Cell Transfection Kit")
(Speciality Media) zu den Platten hinzugegeben. Nach 24 Stunden
in einem Gewebekulturinkubator wurde das Medium durch ein frisches
CHO-D–-Medium ersetzt. 24
Stunden später
wurden die Zellen in 96-Well-Gewebekulturplatten mit 100 μl CHO-Selektionsmedium
(D-MEM, 5% dialysiertes fötales
Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin/Glutamin, 1 % nicht essentielle
Aminosäuren
(Gibco)) pro Well aufgeteilt, und es wurden Transformanten ausgewählt. Das
Medium wurde wöchentlich
gewechselt bis Kolonien zu sehen waren. Nach zwei Wochen wurde die
mpl-Liganden-Expression durchgemustert, um die Transformanten in
dem 32D-Zell-Proliferations-Test, wie unten beschrieben (siehe Beispiel
9), zu verwenden. Diese Klone, die im Übermaß 1 × 105 Units/ml
exprimierten, wurden expandiert und zur kryogenen Lagerung eingefroren.
Ein Klon wurde zur Rollflaschen-Produktion expandiert, und es wurden
ungefähr
acht Liter eines konditionierten Mediums produziert.
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Plasmid
pDSRα2,
welches mpl-Liganden-1-174-cDNA enthielt, wurde in DHFR-defiziente
CHO-Zellen wie oben beschrieben transfiziert. Zwei Liter eines serumfreien
CHO-konditionierten Mediums (50% D-MEM, 50% HAMS-F12, 1% Penicillin/Streptomycin/Glutamin,
1% nicht essentielle Aminosäuren
(Gibco)) aus Rollflaschen, in dem CHO-Zellen ausgesät worden
waren, die mpl-Liganden 1-174 exprimieren, wurden unter Verwendung
einer 21- Rührzelle
von Amicon, Model 2000 und einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluss
von 10000 Dalton (YM10, Amicon) 15-fach konzentriert. 45 ml des
konzentrierten konditionierten Mediums wurden dann direkt auf eine
4 ml-hu-MPL-X-Affinitätssäule mit
einer Flussrate von 0,4 ml/min unter Verwendung eines Pharmacia
FPLC-Geräts
geladen. Die Affinitätssäule wurde
hergestellt, indem 1,5–2,5
mg Mpl-X (die lösliche
extrazelluläre
Domaine des mpl-Rezeptors) pro ml CNBr-aktiviertes Sepharoseharz
von Pharmacia, wie vom Hersteller empfohlen, gekoppelt wurden. Nach
dem Beladen wurde die Säule
mit 16 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 10 mM NaPO4 pH 6,8/150 mM NaCl) und dann mit 24 ml
10mM Tris, pH 8,0/1M NaCl gewaschen. Der mpl-Ligand (1-174) wurde
mit 40 ml 20mM CAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure) pH
10,5/1M NaCl/SmM CHAPS (3-[3-Cholamidoopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat)
in Fraktionen von 6 ml eluiert. Die zweite Fraktion ergab eine einzelne
Bande auf einem 14%igen SDS-Gel. Dieses Material wurde konzentriert,
der Puffer wurde durch eine Salzlösung aus 0,9% NaCl ausgetauscht,
und das Material war in vitro und in vivo biologisch aktiv. Andere
Arten von mpl-Liganden, die durch CHO-Zellen exprimiert wurden,
wurden auf ähnliche
Weise gereinigt.
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BEISPIEL 3
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Biologische
Aktivität
in vivo von rekombinanten menschlichen mpl-Liganden
-
Die
Blutplättchenzahlen
von Mäusen,
die mit verschiedenen Arten von mpl-Liganden behandelt worden waren,
wurden gemessen. Aus CHO-Zellen stammende mpl-Liganden 1-332, 1-174, 1-163 und 1-153 wurden
hergestellt und durch mpl-Rezeptor-Affinitätschromatographie gereinigt.
Aus E. coli stammender Met-Lys-mpl-Ligand 1-332, Met-Lys-mpl-Ligand
1-174, Met-Lys-mpl-Ligand 1-163 und Met-Lys-mpl-Ligand 1-153 wurde
hergestellt und durch herkömmliche
Chromatographie gereinigt.
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4 zeigt
Blutplättchenzahlen
von Mäusen,
die mit verschiedenen Arten von aus CHO-Zellen stammendem (durchgezogene Linie)
oder aus E. coli stammendem (gestrichelte Linie) rekombinantem menschlichem
mpl-Liganden behandelt wurden. Normalen weiblichen Balb/c-Mäusen wurde
die angegebene Konzentration von mpl-Ligand an fünf aufeinanderfolgenden Tagen
subkutan injiziert. Blutproben von einem kleinen seitlichen Schnitt
in eine Schwanzvene wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion
gesammelt. Analysen der Blutzellen wurden mit einem elektronischen
Sysmex-Blutzellenanalysator (Baxter Diagnostics, Inc. Irvine, CA)
durchgeführt.
Die Daten werden als Mittelwert von Bestimmungen von vier Tieren
dargestellt, +/– Standardfehler
des Mittelwerts. Andere Blutzellenparameter, wie z.B. die Gesamtzahl
der weißen
oder roten Blutzellen, waren von diesen Behandlungen nicht betroffen
(Daten werden nicht gezeigt).
-
Die
Ergebnisse zeigen, dass durch CHO-Zellen exprimierte Formen vom
mpl-Liganden im Vergleich zu denselben Formen vom mpl-Liganden,
die in E. coli hergestellt wurden, eine höhere in vivo-Aktivität besitzen.
Wie in Beispiel 6 beschrieben, enthalten die durch CHO-Zellen exprimierten
Formen von mpl-Liganden alle N- und/oder O-verknüpfte Kohlenhydrate, und die
durch E. coli exprimierten Formen vom mpl-Liganden enthalten diese
nicht. Dies zeigt, dass das Kohlenhydrat die in vivo-Aktiviät vom mpl-Liganden
erhöht.
Der Anstieg in der in vivo-Aktivität, der vom Kohlenhydrat verursacht
wird, kann ein Ergebnis einer erhöhten zirkulatorischen Halbwertszeit,
einer erhöhten
Stabilität
oder einer Kombination aus beidem sein.
-
BEISPIEL 4
-
Herstellung eines mpl-Ligandenanalogons
N2–N15
-
Verfahren
zum Erzeugen zusätzlicher
Glykosylierungsstellen beim mpl-Liganden werden unten beschrieben.
-
Die
folgenden Oligonukleotidprimer wurden zur Verwendung in einer in
vitro-Mutagenese synthetisiert, um die Analoga N2–N14 herzustellen
(siehe Tabelle 1 bezüglich
der Strukturen dieser Analoga):
N2- CCCATGTCAATCACAGCAGACT
SEQ ID Nr.: 5
N3- CTTCACAGCAACCTGAGCCAGT SEQ ID Nr.: 6
N4-
CAGTGCAACGAGACCCACCCTTTG SEQ ID Nr.: 7
N5- GCCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT
SEQ ID Nr.: 8
N6- CCCACTTGTAACTCATCCCTC SEQ ID Nr.: 9
N7-
CAACTGAACGCCACTTGTCTCTCA SEQ ID Nr.: 10
N8- ACTTGTCTCAACTCCACCCTGGGGGA
SEQ ID Nr.: 11
N9- CTCCTGGGGAACCTTTCTGGA SEQ ID Nr.: 12
N10-
GACCACAAATCACACCGATCCCAAT SEQ ID Nr.: 13
N11- ACCCTTTGTCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT
SEQ ID Nr.: 14
N12- TCTCTCAAACCTCACGGGGGAGCTT SEQ ID Nr.: 15
N13-
TGGAAAAATCAGACGGAGGAGAC SEQ ID Nr.: 16
N14- TGGAGGAGAACAAGACACAGGACAT
SEQ ID Nr.: 17
-
Um
den m13mp18-mpl-Liganden 1-174 zu konstruieren, wurde das Gen aus 2 in mit den Restriktionsenzymen XbaI
und SalI verdaute m13mp18-DNA eingeführt. Einzelsträngige DNA
wurde aus Überständen vom
E. coli-Stamm RZ1032, der durch m13mp18 (mpl-Ligand 1-174) infiziert
worden war, wiedergewonnen, wie bei Kunkel et al., Methods in Enzymol.
154:367 (1987) und Messing, Methods in Enzymol. 101:20 (1983) beschrieben.
Für die
in vitro-Mutagenese wurden ungefähr
0,5 μg einzelsträngige DNA
und 0,125 pMol von einem der synthetischen Primer, die oben beschrieben
wurden, mit 6 μl
Puffer (250 mM Tris pH 7,8, 50 mM MgCl2,
50 mM Dithiothreitol und 1% Rinderserumalbumin (BSA-Pharmacia))
gemischt. Die Primer wurden mit ATP und T4-Polynukleotidkinase vor
der Zugabe behandelt. Zum Annealing der Primer an die Matrize wurde
das Reaktionsvolumen auf 10 μl
mit Wasser eingestellt, die Mischung wurde auf 65°C 5 Minuten
lang erhitzt und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Für die Verlängerungsreaktion
(Elongation) wurden jeweils 2,5 μl
dTTP, dATP, dGTP und dCTP und 1 ml ATP (alle in einer Konzentration
von 10 μM)
hinzugegeben, gefolgt von 1 μl
(1 Unit) E. coli DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) und 1 μl (1 Unit)
T4-DNA-Ligase. Die Mischung wurde dann über Nacht bei 14°C inkubiert
und verwendet, um E. coli JM 109 (Yanisch-Perron et al. Gene 33,
103 (1985)) wie beschrieben (Messing, supra) zu transformieren.
-
Um
Mutantenklone durch differentielle Hybridisierung zu identifizieren,
wurden Plaques auf Nähragar auf
Gene-Screen-Filter (New England Nuclear) übertragen. Die DNA wurde an
den Filtern quervernetzt, indem sie mit einem „UV Stratalinker" Modell 1800 unter
Verwendung des Modus „auto
cross-link" (Stratagene)
bestrahlt wurde. Sie wurden dann eine Stunde in 6 × SSC (0,9
M NaCl/0,09 M Na-Zitrat), das 1% SDS enthielt, bei 60°C inkubiert.
Für die
Hybridisierung wurde der oben genannte Oligonukleotidprimer (8 pMole)
mit T4-Polynukleotidkinase
und γ-32P-markiertem ATP am Ende markiert und mit
den Filtern über
Nacht in 6 × SSC,
0,5% SDS und 125 μg/ml
Heringssperma-DNA inkubiert. Die Hybridisierungstemperaturen wurden
nach Schätzungen
von Oligonukleotidschmelzpunkten ausgewählt. Im Allgemeinen war die
Hybridisierungstemperatur ungefähr
10°C geringer
als der Schmelzpunkt. Am nächsten
Tag wurden die Filter zweimal mit 6 × SSC/1% SDS bei Hybridisierungstemperatur
gewaschen, gefolgt durch zwei Waschschritte mit 6 × SSC bei
Hybridisierungstemperatur, und einer Autoradiographie unterzogen.
Falls notwendig, wurden die Filter dann mit 6 × SSC bei zunehmenden Temperaturen
gewaschen, bis wenig oder keine Hybridisierung bei Plaques mit der
Wildtyp-mpl-Liganden-cDNA-Sequenz nachgewiesen wurde. Klone, die
unter diesen Bedingungen positive Hybridisierungssignale ergaben,
wurden identifiziert und wieder in JM 109 überführt, um einen reinen Klon zu
isolieren. Die Sequenzanalyse durch die Didesoxykettenabbruchmethode
gab an, dass die Mutationen vorhanden waren.
-
Doppelsträngige m13mpl-Liganden
1-174 DNAs, welche die gewünschten Änderungen
trugen, wurden aus transfizierten JM109-Zellen mit QIAGEN Kits (Chatsworth
CA.) unter Verwendung von Verfahren, die durch den Hersteller bereitgestellt
wurden, wiedergewonnen. Die DNAs wurden mit XbaI und SalI verdaut,
und die 605 bp großen
mpl-Liganden-DNA-Fragmente
wurden isoliert. pDSRα2
wurde mit XbaI und SalI verdaut. Das Vektorfragment wurde isoliert
und mit den oben genannten mpl-Ligandenfragmenten ligiert. Rekombinante
Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Die daraus
hervorgehenden Plasmide (bezeichnet als mpl-Ligand 1-174-NX, wobei
NX die Nr. des Analogons ist) enthalten DNA, welche mpl-Ligandenanaloga mit
veränderten
Aminosäureresten
in den angegebenen Positionen enthält. Die sich daraus ergebenden
Plasmide wurden dann wieder sequenziert, um das Vorhandensein der
gewünschten
Mutationen zu bestätigen.
-
Das
Analogon N15 wurde derart konstruiert, dass es zwei zusätzliche
N-verknüpfte
Glykosylierungsstellen in den Positionen 30 und 120 aufwies. Der
pDSRα2-mpl-Ligand
174-N4, der Mutationen in Asn30 und Thr32 enthielt, wurde mit den
Restriktionsenzymen XbaI und PstI verdaut, und es wurde das ungefähr 385 nt DNA-Fragment
isoliert. Der PDSRα2-mpl-Ligand
174-N10, der Mutationen in Asn120 und Thr122 enthielt, wurde mit
den Restriktionsenzymen PstI und SalI verdaut, und das ungefähr 220 nt
DNA-Fragment wurde isoliert. pDSRα2
wurde mit XbaI und SalI verdaut. Das Vektorfragment wurde isoliert
und in die oben genannten mpl-Ligandenfragmente ligiert. Dies führte zum
PDSRα2-mpl-Liganden
174-N15, der Substitutionen in Asn30, Thr32, Asn120 und Thr122 enthält.
-
Diese
allgemeinen Vorgehensweisen wurden verwendet, um die in Tabelle
1 gezeigten mpl-Ligandenanaloga
zu konstruieren. Die DNA-Sequenzänderungen
werden für
jedes der Analo ga gezeigt; ansonsten wiesen die zur Mutagenese verwendeten
Oligonukleotid-Primer Sequenzen auf, die zu denen des menschlichen
mpl-Liganden komplementär
waren.
-
-
Anmerkung:
Die Analoga N2–N15
werden hier synonym als Analoga 2–15 bezeichnet. Wie hier verwendet,
bedeutet weiterhin beispielsweise [Asn22]-mpl-Ligand,
dass ein Asparagin durch die Aminosäure in Position 22 in der besonderen
mpl-Ligandenspezies, die berücksichtigt
worden ist, substituiert wurde, die vorzugsweise eine menschliche
Sequenz mit mindestens den Aminosäuren 7-151 in 1 darstellt
(einschließlich
der bevorzugten menschlichen mpl-Ligandensequenzen, die hier oben
dargestellt wurden). Folglich ergibt eine Substitution eines Asparaginrests
durch einen Lysinrest in Position 22 vom mpl-Liganden 1-174 (menschliche
Sequenz) ein mpl-Ligandenanalogon, das durch den [Asn22]-mpl-Liganden
1-174 dargestellt werden kann.
-
Plasmide,
die als pDSRα2
1-174-NX (wobei NX die Nr. des Analogons ist) bezeichnet werden,
wurden konstruiert, indem eine mpl-Liganden-DNA in pDSRα2 eingeführt wurde.
Der Expressionsvektor pDSRα2
wird allgemein in WO 90/14363 (1990) beschrieben. pDSRα2-mpl-Liganden 1-174-NX-Plasmide
wurden durch Verdau von pDSRα2
mit XbaI und SalI hergestellt. Das Vektorfragment wurde isoliert
und mit den ungefähr
605 bp großen
Fragmenten, welche die gewünschten
Sequenzen enthielten, ligiert.
-
BEISPIEL 5
-
Expression vom mpl-Liganden
und vom mpl-Liganden N1–N15
in COS-Zellen
-
cDNA-Klone
vom menschlichen mpl-Liganden und von mpl-Ligandenanaloga, beschrieben
in Tabelle 1, wurden in COS-1-Zellen (ATCC Nr. CRL-1650) durch Elektroporation
transferiert. COS-1-Zellen wurden aus halbkonfluenten Petrischalen
geerntet, mit Medium (Dulbecco's
modifiziertes essentielles Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1 % L-Glutamin/Penicillin/Streptomycin,
(Irvine Scientific)) resuspendiert und auf 6 × 106 Zellen/ml
eingestellt. Ein halber ml der Zellen wurde in eine 0,2 cm-Elektroporationsküvette (Bio-Rad) übertragen
und mit einem „BTX
Elektroporation System Electrocell Manipulator 600" bei 650 μF und 130
Volt bei Einstellung einer Niedrigspannung mit 50 μg Plasmid-DNA,
welche das mpl-Ligandenanalogon kodierte, elektroporiert. Die elektroporierten
Zellen wurden auf 100 mm-Gewebekulturplatten in 10 ml Medium ausplattiert. 12
bis 24 Stunden nach dem Ausplattieren wurde das Medium durch 10
ml frisches Medium ersetzt. Das konditionierte Medium wurde drei
bis fünf
Tage nach Elektroporation gesammelt.
-
BEISPIEL 6
-
Charakterisierung vom
mpl-Liganden und von mpl-Liganden N1–N15
-
A. Bestimmung von Kohlenhydrat-Additionen
-
Ein
Volumenüberstand,
der ungefähr
30 bis 60 ng mpl-Ligand oder mpl-Ligandenanalogon aus COS-Zellen,
die mit mpl-Ligandenanalogon-cDNAs wie in Beispiel 5 beschrieben
transfiziert waren, wurden über
Nacht bei Raumtemperatur mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-mpl-Liganden-Antikörper immunpräzipitiert.
In einigen Fällen,
in denen die Expression gering war, wurde ein maximales Volumen
von ungefähr
8 bis 9 ml zur Immunpräzipitation
verwendet. Der Antikörper
wurde gegen mpl-Ligand 1-163 erzeugt, der in E. coli exprimiert
und gereinigt wurde. 30 μl
von 1:1 Protein A-Sepharose in phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate
bufferd saline, PBS), die 0,1% Natriumazid enthielt, wurde zu dem
Immunpräzipitat
gegeben, und der Ansatz wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Proben wurden zentrifugiert, mit PBS gewaschen und in SDS-Probenpuffer
(0,12 M Tris-HCl, pH 6,8/4% SDS/20% Glyzerin/10% β-Mercaptoethanol/0,001%
Bromphenolblau) resuspendiert). Die Proben wurden durch 12% SDS-Polyacrylamidgelelekrophorese
analysiert, auf Nitrocellulose übertragen
und einer Analyse durch Western blot wie beschrieben (Burnette et
al., Anal. Biochem. 112: 195–203
(1981); Elliott et al., Gene 79: 167–180 (1989)) unter Verwendung
eines monoklonalen Maus-anti-mpl-Liganden-Antikörpers, der gegen ein synthetisches
mpl-Ligandenpeptid (z.B. eines, das den Aminosäureresten 47 bis 62 in 1 entspricht) gerichtet war, unterzogen.
Die den mpl-Liganden enthaltende Banden wurden unter Verwendung
eines ECL-Kits (Amersham) sichtbar gemacht.
-
5 zeigt,
dass COS-Zellüberstände von
Zellen, die mit DNA der Analoga N4, N7 und N10 transfiziert waren,
eine Größenzunahme
im Vergleich zum mpl-Liganden 174 (N1) mit menschlicher Sequenz
ergeben. 6 zeigt, dass COS-Zellüberstände von
Zellen, die mit N13-, N14- und N4-DNA transfiziert waren, ebenfalls
eine Größenzunahme
im Vergleich zum mpl-Liganden mit menschlicher Sequenz aufwiesen.
Diese Zunahme der Größe zeigt
eine zusätzliche
N-verknüpfte
Kohlenhydratkette an. N15 enthält
zwei zusätzliche N-verknüpfte Glykosylierungsstellen. 6 zeigt,
dass dieses Analogon Material mit einer Größe aufweist, die größer ist
als die von Analoga, die nur eine zusätzliche N-verknüpfte Glykosylierung
enthalten. Die Größen der Proteine
wurden aufgrund ihrer Mobilität
in der SDS-PAGE im Verhältnis
zu Proteinstandards von bekanntem Molekulargewicht abgeschätzt. Die
abgeschätzten
Größen der
stärkeren
Banden, die aus 6 berechnet wurden, werden in
Tabelle 2 gezeigt. Dieses Ergebnis zeigt, dass N15 zwei zusätzliche
N-verknüpfte
Ketten enthält.
Western blot-Analysen von anderen ausgewählten Analoga werden ebenfalls
in 6 gezeigt.
-
TABELLE
2 Abschätzung von
N-verknüpftem
Kohlenhydrat
-
Ein
Experiment wurde durchgeführt,
um zu zeigen, dass die Zunahme der Größe von mpl-Ligandenanaloga auf N-verknüpftes Kohlenhydrat
zurückzuführen ist.
COS- konditioniertes Zellmedium, das mpl-Ligand enthielt, wurde
immunpräzipitiert
und mit PBS wie oben beschrieben gewaschen. Jedem Röhrchen wurden dann
10 μl 0,5%
SDS zugesetzt und jede Probe wurde 3 Minuten gekocht. Dann wurden
die folgenden Bestandteile zugegeben: 10,8 μl 0,5 M NaPO4,
pH 8,6, 5 ml 7,5% Nonidet P40 und 3 μl 250 Units/ml N-Glykanase (Genzyme).
Die N-Glykanase-Behandlung entfernt N-verknüpftes Kohlenhydrat. Die Proben
wurden 6 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von SDS-PAGE-Probenpuffer
abgestoppt, und dann wurden die Proben einer SDS-PAGE (12% Acrylamid)
und Westernblot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen anti-mpl-Liganden-Antikörpers und
eines anti-Maus „ECL
Western Detection Kit" (Amersham)
wie oben beschrieben unterzogen. Eine Analyse von N-verknüpften Ketten
unter Verwendung dieses Verfahrens wird in 7 für menschlichen
mpl-Liganden und mpl-Ligandenanaloga gezeigt. Nach der Behandlung
mit N-Glykanase war die Mobilität
im Western blot bei N4, N7 und N10 reduziert auf die von N1. Wie
erwartet, hatte eine Behandlung von N1 mit N-Glykanase keine Auswirkung
auf die Mobiliät,
da N1 keine N-verknüpften
Glykosylierungstellen aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
beobachtete Zunahme der Größe auf die
Addition von N-verknüpftem
Kohlenhydrat zurückzuführen ist.
-
B. Analyse von O-verknüpftem Kohlenhydrat
am mpl-Liganden
-
Um
den Beitrag von O-verknüpftem
Kohlenhydrat auf menschlichen mpl-Liganden zu analysieren, wurden
verschiedene Formen des Proteins aus CHO-konditioniertem Zellmedium
wie oben beschrieben gereinigt. Jede Form erhielt +/–-Behandlung
mit O-Glykanase (Glykopeptid-alpha-N-acetylgalaktosaminidase, Oxford
G1ycoSystems). Die O-Glykanase entfernt O-verknüpftes Kohlenhydrat aus Glykoproteinen.
Die in E. coli exprimierte Version von jeder Form wurde als eine
unglykosylierte Kontrolle verwendet. Um den Unterschied im Molekulargewicht,
zu dem O-verknüpftes
Kohlenhydrat beiträgt,
aufzulösen,
war es notwendig, zunächst
jedes N-verknüpfte
Kohlenhydrat zu entfernen. Da die Volllänge-Version, der mpl-Ligand 1-332, N-verknüpftes Kohlenhydrat
enthält,
erhielten die in CHO-Zellen exprimierten Volllänge-Proben eine N-Glykanase (Peptid-N4-(N-Acetyl-beta-glukosaminyl)asparaginamidase)-Behandlung,
wie oben für
in COS-Zellen exprimierten mpl-Ligandenanaloga beschrieben, abgesehen
davon, dass die N-Glykanase-Behandlung mit einer Inkubation über Nacht
verbunden war.
-
Bevor
mit der O-Glykanase-Behandlung vom Volllänge (1-332)-mpl-Liganden fortgefahren
wurde, wurde der pH-Bereich der Probe auf pH 6,0 bis pH 7,0 mit
1/15 Volumen 100 mM Essigsäure,
pH 2,2 eingestellt. 1 μg
Protein wurde durch 3 Minuten Kochen in SDS denaturiert und bei
37°C 60
Minuten mit 1 U/ml Neuraminidase (Sialidase, aus Arthrobacter urefaciens,
Boehringer Mannheim) in 1 mM Calciumacetat, pH 6,8 und 20 mM Natriumphosphat,
pH 6,8 inkubiert.
-
Eine
anschließende
Behandlung mit O-Glykanase wurde durchgeführt, indem 5 mU Enzym in einem Endvolumen
von 100 μl
zugesetzt wurden, gefolgt durch eine Inkubation über Nacht bei 37°C. Die Proteine (0,2 μg/Spur) wurden
durch SDS-PAGE (15 % Acrylamid) aufgetrennt. Nach dem Transfer auf
0,2 μm Nitrocellulose
und Inkubation über
Nacht mit polyklo nalem anti-mpl-Liganden-Antikörper wurden die mpl-Ligandenproteine
unter Verwendung eines anti-Kaninchen „ECL Western Detection Kit" (Amersham) sichtbar
gemacht.
-
3 zeigt
einen Western blot von vier verschiedenen Formen von menschlichem
mpl-Liganden. Der Volllänge-mpl-Ligand
1-332 wird in den Spuren 1 bis 3 dargestellt, mpl-Ligand 1-174 in den
Spuren 4 bis 6, mpl-Ligand 1-163 in den Spuren 7 bis 9 und mpl-Ligand
1-153 in den Spuren 10 bis 12. Eine Behandlung mit Neuraminidase
und O-Glykanase, gezeigt in den Spuren 2, 5, 8 und 11, reduzierte
das Molekulargewicht auf das von unglykosyliertem Material, gezeigt
in den Spuren 3, 6, 9 und 12. In jedem Fall nahm die Mobilität zu und
erreichte diejenige der in E. coli exprimierten unglykosylierten
Version. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Banden von höherem Molekulargewicht
in den Spuren 1, 4, 7 und 10 auf O-verknüpftes Kohlenhydrat zurückzuführen sind.
Das Molekulargewicht, das jede der Banden repräsentierte, wurde abgeschätzt, indem
die Mobilitäten
der Proteine mit denen von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht
verglichen wurden.
-
Wie
Tabelle 3, die abgeschätzte
Molekulargewichte von verschiedenen Proteinen zeigt, zu entnehmen ist,
könnte
die apparente Verschiebung der Mobilität für nicht weniger als 14 O-verknüpfte Kohlenhydratketten (unter
der Annahme von 950 Da/Kette) beim mpl-Liganden 1-332, 9 Ketten beim
mpl-Liganden 1-174, 4 Ketten beim mpl-Liganden 1-163 und 2 Ketten
beim mpl-Liganden 1-153 verantwortlich sein. Die Probe, die in Spur 2
gelaufen ist, ist der Volllänge-mpl-Ligand
1-332. Es scheint so als ob dieses Protein abgebaut worden wäre, möglicherweise
aufgrund einer ausgedehnten Inkubation in Glykoenzymen bei 37°C. Deshalb
wurde die in E. coli exprimierte unglykosylierte Version in Spur
3 verwendet, um das ungefähre
Molekulargewicht von O-verknüpftem
Kohlenhydrat, das an den in CHO-Zellen exprimierten mpl-Liganden
1-332 angefügt
war, zu berechnen.
-
Diese
Ergebnisse stimmen mit dem Vorhandensein von Kohlenhydrat an allen
in CHO-Zellen exprimierten Formen von getestetem mpl-Liganden überein.
Das Vorhandensein von O-verknüpftem Kohlenhydrat wurde
für die
in CHO-Zellen exprimierten mpl-Liganden 1-332, 1-174 und 1-163 durch
direkte Analyse der Monosaccharidzusammensetzung bestätigt. Durch
Säurehydrolyse
wurden Sialinsäure,
GalNAC und Gal aus Glykoproteinen freigesetzt. Die Monosaccharide
wurden durch Hochdruck-Anionenaustauschchromatographie und durch
gepulste amperometrische Detektion nachgewiesen. Alle drei Zucker
wurden in jeder der mpl-Liganden-Formen nachgewiesen. Dieses Ergebnis
zeigt das Vorhandensein von O- verknüpftem Kohlenhydrat,
das Sialinsäure
enthält.
Diese Daten korrelieren mit den in vivo-Daten, die 4 zu entnehmen
sind, bei denen die in CHO-Zellen exprimierten Formen von mpl-Liganden
alle in vivo aktiver waren als die entsprechenden in E. coli exprimierten
Formen. Folglich verstärkt
das Vorhandensein von Kohlenhydrat die in vivo-Aktivität vom mpl-Liganden.
-
TABELLE
3 Berechnungen
von O-verknüpftem
Kohlenhydrat
-
BEISPIEL 7
-
mpl-Liganden-ELISA-Test
-
Herstellung
von polyklonalen Antikörpern:
Weiße
Kaninchen der Rasse „Neuseeländer" wurden über einen
Zeitraum von drei Monaten mit in E. coli produziertem rekombinantem
menschlichem mpl-Liganden 1-163 hyperimmunisiert. Antiseren von
sechs Kaninchen, die hohe Antikörpertiter
aufwiesen, wurden vereinigt („gepoolt") und spezifische
anti-mpl-Liganden-Antikörper wurden
affinitätsgereinigt.
-
Affinitätsreinigung:
Rekombinanter menschlicher mpl-Ligand 1-163 wurde kovalent an „Actigel-ALD" (Sterogene Bioseparations,
Inc.) nach den Anleitungen des Herstellers angefügt.
-
Ein
Aliquot der vereinigten Kaninchenantiseren wurde zu dem mpl-Liganden-Affinitätsgel gegeben
und der Schlamm wurde vorsichtig auf einer Wippe über Nacht
bei 4–8°C bewegt.
Nicht gebundene Serumproteine wurden mit PBS aus den Gelbett gewaschen,
und spezifisch gebundene anti-mpl-Liganden-Antikörper wurden dann mit „ImmunoPure
Gentle Ag/Ab Elution Buffer" (Pierce
Chemical Co.) eluiert. Die gewonnenen Antikörper wurden gegen PBS dialysiert,
wobei der Puffer mehrfach gewechselt wurde, dann wurde die Antikörperlösung in
einer Ultrafiltrationseinheit (Rührzelle
von Amicon) konzentriert, und das sich ergebende Antikörperkonzentrat
war die Quelle für
spezifische anti-mpl-Liganden-Antikörper, die anschließend für die Beschichtung
von Wells und Enzymkonjugatpräparationen
verwendet wurden.
-
ELISA-Reagenzien:
Streifen von „Immulon
4 Removawell" (Dynatech
Laboratories, Inc.) wurden mit affinitätsgereinigten Kaninchen-anti-mpl-Liganden-Antikörpern beschichtet.
Die affinitätsgereinigten
Antikörper
wurden in 0,1 M Natriumbicarbonat (frisch zubereitet mit einem pH-Wert
um 8,2) verdünnt,
um eine Konzentration von 2,5 μg/ml
zu ergeben. Jedes Well erhielt 100 μl Antikörper, und die Platten wurden
24 Stunden bei Raumtemperatur in einer abgeschlossenen und befeuchteten
Kammer inkubiert. Dann wurden 200 μl einer Blocking-Lösung, die
aus 1% fötalem
Rinderserum, 5% Succrose in TEN (50 mM Tris 7,4/10 mM EDTA/150 mM
NaCl) bestand, zu jedem Well gegeben, und die Platten wurden weitere
24 Stunden bei Raumtemperatur in einer abgeschlossenen und befeuchteten
Kammer inkubiert. Die zusammengemischten Beschichtungs- und Blocking-Lösungen wurden
aus den Wells entfernt. Es wurde ein zusätzlicher Überschichtungs-Blocking-Schritt
einbezogen: 300 μl „Superblock
Blocking"-Puffer
in PBS (Pierce Chemical Co.) wurden zu jedem Well gegeben. Nachdem
die Wells bei Raumtemperatur 5 Minuten stehen gelassen wurden, wurde
diese Lösung
entfernt und die Wells wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden lufttrocknen
gelassen. Die beschichteten Wells wurden in verschlossenen Kunststofftaschen
bei 4–8°C gelagert,
bis sie in dem mpl-Liganden-ELISA verwendet wurden.
-
Affinitätsgereinigte
anti-mpl-Liganden-Antikörper
aus einem Pool von Kaninchenantiseren wurden kovalent an Meerrettichperoxidase
(horseradish peroxidase, HRPO) zur Verwendung als signalerzeugender
Antikörper
gekoppelt. Die affinitätsgereinigten
Antikörper
wurden mit Iminothiolan-HCl (Fluka Chemical Corp.) derivatisiert.
Davon getrennt wurde die HRPO mit N-Succinimidyl-6-maleimidocaproat
(Fluka Chemical Corp.) derivatisiert. Die zwei aktivierten Proteine
wurden kombiniert, um eine kovalente Kopplung zu erlauben. Die Reaktionsmi schung
wurde dann an einer FPLC-Superose 6 (Pharmacia)-Säule chromatographiert,
um das Antikörper:HRPO-Konjugat
mit dem gewünschten
Molekulargewicht (d.h. um 200 kDa) zu isolieren. Fraktionen, welche
das gewünschte
Konjugat enthielten, wurden vereinigt und in einem Centricon 30
(Amicon Division, W.R. Grace & Co.)
konzentriert und als eine 50 %ige Glyzerinlösung bei –20°C gelagert. Dieses anti-mpl-Liganden-Antikörper:HRPO-Konzentrat
wurde in 2% fötalem
Rinderserum in PBS zur Verwendung in dem ELISA verdünnt. Die
Endkonzentration von im ELISA verwendeten Konjugat betrug 250–500 ng/ml.
-
Rekombinanter
menschlicher mpl-Ligand 1-163, hergestellt in E. coli-Zellen, wurde
für die
Herstellung von Standards verwendet. Dieser mpl-Ligand wurde in
2% fötalem
Rinderserum (Sigma Chemical Co.) in TEN-Puffer, der 0,05% Thimerosal
als Konservierungsmittel enthielt, verdünnt. Die hergestellten Standards enthielten
0,10, 0,05, 0,25, 0,125 und 0,026 ng/ml mpl-Ligand.
-
Test:
100 μl von
mpl-Liganden-Standards oder -Proben wurden in Wells gegeben, dann
wurde 18–24 Stunden
bei Raumtemperatur in einer abgeschlossenen und befeuchteten Kammer
inkubiert. Der Inhalt der Wells und restliche Lösung wurden dann entfernt,
und die Wells wurden einmal mit Waschlösung (0,05% Tween 20 in TEN-Puffer)
gewaschen. Es wurden jedem Well anti-mpl-Liganden-Antikörper:HRPO-Konjugat-Lösung (100 μl) zugegeben,
und es wurde dann zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer abgeschossenen
und befeuchteten Kammer inkubiert. Der Inhalt der Wells wurde dann
viermal mit 0,05% Tween 20 in TEN-Puffer gewaschen.
-
Zur
Farbentwicklung wurden 100 μl
TMB/Peroxid-Substratlösung
(Lösungen
A und B, 1:1 gemischt, Kirkegaard & Perry) hinzugefügt, und es wurde 20 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
100 μl Stopplösung (0,5
N Schwefelsäure)
abgestoppt, und die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikrotiterplattenlesegerät abgelesen.
Die Konzentrationen an mpl-Ligand in den Proben wurden aus einer
Standardkurve, die unter Verwendung eines Curvefit-Programms erzeugt
wurde, berechnet.
-
BEISPIEL 8
-
Biologische Aktivität von mpl-Liganden
1-174-Analoga in einem Test an Megakaryozyten in kurzzeitiger Flüssigkultur
-
Analoga
vom mpl-Liganden 1-174 wurden wie oben beschrieben hergestellt und
auf ihre Fähigkeit
getestet, das Wachstum von Megakaryozyten in einer Flüssigkultur
zu stimulieren. CD34-selektionierte Zellen, die aus menschlichen
Leukapherese-Einheiten (Nichol et al., Stem Cells 12: 494–505, 1994)
isoliert wurden, wurden mit einer Dichte von 200 × 105/ml in Kulturmedium (IMDM/1% Pen-Strep-Glutamin/1%
nicht essentielle Aminosäuren/1%
MEM Na-Pyruvat/1% MEM Vitamine/10% entionisiertes BSA/10% normales
menschliches Antikörperplasma/10 μM α-Thiazylglyzerin/20 μg/ml L-Asparagin)
ausplattiert. Zusätzlich
wurden 1,5 μl COS-1-konditioniertes
Medium, das mpl-Liganden (1-174) oder mpl-Liganden 1-174-Analogon enthielt,
zu jedem Well gegeben. Das Endvolumen betrug 15 μl in Terasaki-Mikrotiter-Gewebekulturplatten
(Vangard International). Die Zellen wurden bei 37°C 8 Tage
in befeuchteten Kästen
in 5% CO2 inkubiert, mit 1% Glutaraldehyd
direkt an die Kultur-Wells fixiert und dann mit einem Cocktail aus
monoklonalen Antikörpern,
der aus anti-GPIb, anti-GPIIb
(Biodesign) und anti-GPIb (Dako, Carpinteria, CA) bestand, inkubiert.
Die Immunreaktion wurde mit einem Streptavidin-β-Galactosidase-Detektionssystem
(HistoMark, Kirkegaard und Perry) entwickelt. Megakaryozyten, identifizert
durch die dunklere Farbe (in den echten Photographien blau), erscheinen in 8.
-
Die
Tafeln A und D in 8 sind die positiven
bzw. negativen Kontrollen. Das Well, das in Tafel A abgebildet ist,
erhielt 37,5 pg Wildtyp-mpl-Ligand 1-174 COS-1-konditioniertes Medium
und zeigt ein wesentliches Megakaryozytenwachstun. Das Well in Tafel
D erhielt 1,5 μl
COS-1-konditioniertes Medium ohne Ligand („Mock") und zeigt kein Wachstum. Die Tafeln
B und C in 8 sind die mpl-Liganden
1-174-Analoga N7 bzw. N10. Das Well in Tafel B erthielt 9,0 pg mpl-Ligand
COS-1-konditioniertes Medium, während
das Well in Tafel C 27 pg erhielt, und beide zeigten ein ausgezeichnetes
Megakaryozytenwachstum.
-
Diese
Experiment zeigt, dass die getesteten Analoga des mpl-Liganden in
der Lage sind, das Wachstum von menschlichen Megakaryozyten in vitro
zu stimulieren.
-
BEISPIEL 9
-
Biologische Aktivität von mpl-Liganden
1-174-Analoga in einem in vitro-Zellproliferationstest
-
Analoga
vom mpl-Liganden 1-174 wurden wie oben beschrieben hergestellt und
auf ihre Fähigkeit
getestet, die Proliferation von 32 D-mpl-Zellen zu stimulieren.
Um 32 D-mpl-Zellen zu konstruieren, wurde die Volllängesequenz
des menschlichen mpl-Rezeptors (Vigon, I. et al., PNAS 89: 5640–5644, 1992)
in einen Expressionsvektor subkloniert, welcher den Transkriptiospromotor
des Moloney Murine Sarcoma-Virus enthielt. Es wurden 6 μg dieses
Konstrukts und 6 μg
eines amphotrophen retroviralen Verpackungskonstrukts (Landau, N.R.,
Littaman, D.R., Journal of Virology 66: 5110–5113 (1992)) in 293-Zellen
in einer Dichte von 3 × 106 unter Verwendung eines CaPO4-Säugetiertransfektionskits
(Stratagene) transfiziert. Dieselben Zellen wurden nach zwei Tagen
und wieder nach vier Tagen erneut transfiziert. An dem Tag nach
der letzten Transfektion wurden die 293-Zellen mit der IL-3-abhängigen Mäusezelllinie
(32 D, Klon 23; Greenberger et al., PNAS 80: 2931–2936, 1983)
kokultiviert. Nach 24 Stunden wurden die 32 D-Zellen geerntet und
in einem BSA-Gradienten (Path-o-cyte; Miles Inc.) zu Banden geformt.
Die Zellen wurden in 1 ng/ml Maus-IL-3 expandiert und dann zum Wachstum
in 20% APK9-Serum (Bartley et al., Cell 77: 1117–1124, 1994) selektioniert.
Die Zellen wurden nach Zelloberflächenexpression des Rezeptors
durch FACS unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-anti-Peptid
(MPL)-Serums sortiert. Die Zytokinabhängigen 32 D-mpl-Mäusezellen
waren in der Lage, auf den mpl-Liganden zu antworten. Die 32 D-mpl-Zellen
wurden in MEM-Medium, das 10% Kälber-Klon
II-Serum (Hyclone Laboratories) und 1,0 ng/ml muIL3 enthielt, bis
zu einer Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml wachsen gelassen. Die Zellen
wurden durch Zentrifugation (ungefähr 500 × g) gesammelt und zweimal
in Wachstumsmedium ohne muIL3 gewaschen, resuspendiert und auf eine
Zellzahl von 1 × 105/ml eingestellt.
-
Eine
erweiterte mpl-Liganden-Standardkurve mit 12 Punkten wurde unter
Verwendung des mpl-Liganden 1-163 und Bereichen von 5000 bis 1 pg/ml
hergestellt. Ein Volumen von 100 μl
von jeder Verdünnung
von mpl-Liganden-Standard- oder -Testprobe wurde zu geeigneten Wells
einer 96-Well-Mikrotiter-Gewebekulturplatte gegeben, die 100 μl resuspendierte
Zellen (10000 Zellen/Well) enthielt, und in einem befeuchteten Inkubator
bei 37°C
und 10% CO2 inkubiert. Nach 48 Stunden wurden
40 μl MTS-Reagenz
(„Aqueous
Non-Radioactive Cell Proliferation Kit", Promega) zu jedem Well gegeben, und
14–18
Stunden später
wurden die Platten mit einem Plattenlesegerät bei 490 nm abgelesen. Die
in vitro-Aktivität
in Proben wurde aus einer Dosis-Antwort-Kurve für jede Probe berechnet. Eine
Einheit war definiert als die Menge an mpl-Ligand in jeder Probe, die
erforderlich war, um 50% der maximalen Stimulation zu ergeben. Die
spezifische Aktivität
wurde berechnet, indem die biologische Aktivität in Units/ml durch die mpl-Liganden-Konzentration
in ng/ml, wie durch den mpl-Liganden-ELISA bestimmt, dividiert wurde.
-
Die
spezifische biologische Aktivität
von mpl-Liganden-Analoga, die in COS-Zellen transfiziert und exprimiert
wurden, wird in Tabelle 4 gezeigt. Die Wirkung der Aminosäuresubstitutionen
auf eine Kohlenhydrat-Addition wird ebenfalls zusammengefasst. Gereinigter
mpl-Ligand mit menschlicher
Sequenz weist eine in vitro-Aktivität auf, die 200–300 Units/ng
betrug, wie durch die oben beschriebenen Tests bestimmt wurde. Aus Tabelle
4 ist ersichtlich, dass mpl-Liganden-Analoga, welche zusätzliches
N-verknüpftes
Kohlenhydrat enthalten, ebenso exprimiert werden, wie ein mpl-Ligand
mit der nativen Sequenz, selbst wenn sie zusätzliche Kohlenhydratketten
(wie in Beispiel 6, Abschnitt A bestimmt), z.B. N4 und N10, enthalten.
Beide Analoga behalten auch die volle biologische Aktivität in vitro
bei. Deshalb können
die mpl-Liganden-Analoga, welche N-verknüpftes Kohlenhydrat enthalten,
in Säugetierzellen
normal exprimiert werden, und sie können eine normale oder verstärkte biologische
Aktivität
in vitro aufweisen.
-
-
Anmerkungen:
-
- (a) Die Anzahl an zusätzlichen N-verknüpften Ketten
wurde auf der Grundlage der Mobilität der Polypeptid-Analoga in
SDS-Gelen abgeschätzt,
wie in Beispiel 6 beschrieben.
- (b) Die Mengen an mpl-Ligandenanaloga in CHO-Zellüberständen wurden
durch einen ELISA-Test bestimmt, wie in den Beispielen beschrieben.
- (c) Die in vitro-Aktivität
wurde gemessen, indem die Stimulation der Tymidin-Aufnahme in 32
D-Zellen in Abhängigkeit
vom mpl-Liganden zum Wachstum gemessen wurde.
- (d) Verhältnis
der in vitro-Aktivität
vom mpl-Ligandenanalogon, wie durch Proliferationstests gemessen,
zu der Menge an mpl-Ligandenanalogon, gemessen durch mpl-Liganden-ELISA
-
- N.A. = not available = nicht verfügbar
-
BEISPIEL 10
-
Expression in CHO-Zellen
und Reinigung der mpl-Liganden 1-174, N4 und N15
-
pDSRα2, das cDNA
der mpl-Liganden 1-174, N4 und N15 enthielt, wurde in DHFR-defiziente CHO-Zellen
unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Protokolls mit
den folgenden Modifikationen transfiziert.
-
Für jedes
Analogon wurde eine Transfektion durchgeführt. Drei Wochen nach der Transfektion
wurde die mpl-Liganden-Expression durch mpl-Liganden-ELISA durchgemustert.
Drei exprimierende Klone wurden unter cryogenen Lagerungsbedingungen
eingefroren. Der Klon, der bei jedem Analogon die höchste Expression
zeigte, wurde zur Produktion in Rollflaschen expandiert. Für N4 wurden
4,71 konditioniertes Medium (50% DMEM, 50% HAMS-F12, 1% Penicillin/Streptomycin/Glutamin,
1% nicht essentielle Aminosäuren
(Gibco) produziert und für
N15 wurden 4,61 konditioniertes Medium produziert.
-
Serumfreies
konditioniertes CHO-Zellmedium aus Rollflaschen, worin die CHO-Zellen
ausgesät
worden waren, welche die mpl-Liganden 1-174 (2,9 l) N4 (7,4 l),
N15 (4,4 l) exprimierten, wurden 12-, 19- bzw. 12-fach unter Verwendung
einer S1Y10 (10000 Da Molekulargewichtsausschluss) Spriralultrafiltrationskartusche
von Amicon konzentriert. 150 ml konzentriertes konditioniertes Medium
wurde dann direkt auf eine 3,3 ml-hu-MPL-X (Rezeptor)-Affinitätssäule bei
einer Flussrate von 0,3 ml/min. geladen. Die Affinitätssäule wurde konstruiert,
indem 1,0–1,5
mg MPL-X (die lösliche
extrazelluläre
Domäne
des mpl-Rezeptors) pro ml CNBr-aktiviertes Sepharoseharz von Pharmacia
wie durch den Hersteller empfohlen gekoppelt wurden. Nach dem Beladen
wurde die Säule
mit 30 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 10mM NaPO4, pH 6,8/150 mM NaCl) und dann 60 ml 10
mM Tris, pH 8,0/1 M NaCl/1mM CHAPS gewaschen. Der mpl-Ligand 1-174
wurde mit 30 ml 20 mM CHAPS (3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure), pH
10,5/1 M NaCl/1mM CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat)
eluiert.
-
Die
Fraktionen wurden durch Zugeben von 0,6 ml 1M Tris, pH 7,0 zu jeder
eluierten Fraktion neutralisiert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigte ein
scheinbares „Ausbluten" vom 1-174 mpl- Liganden während des Waschschritts
mit 10 mM Tris, pH 8,0/1M NaCl/1mM CHAPS. Die eluierten Fraktionen
wurden durch SDS-PAGE analysiert. Solche Fraktionen, die den mpl-Liganden 1-174 enthielten,
wurden vereinigt. Diese Affinitätsreinigung
wurde dann modifiziert und mit folgenden Änderungen wiederholt: 0,5 ml/min
Beladung und Elution und Weglassen des Waschschritts mit 10 mM Tris,
pH 8,0/1M NaCl/1 mM CHAPS.
-
Alle
Fraktionen, welche die einzelne Bande mit mpl-Liganden enthielten,
wurden unter Verwendung einer YM10-Membran (10000 Da Molekulargewichtsausschluss)
in einer 50 ml-Rührzelle
mit Wechsel zu einer Centricon-Vorrichtung konzentriert. Dieses
Konzentrat von 0,5 ml wurde direkt auf eine mit PBS äquilibrierte Pharmacia
Superdex 200 HR 10/30-Gelfiltrationssäule bei
0,25 ml/min geladen, wobei Fraktionen von 0,25 ml gesammelt wurden.
Alle eluierten Fraktionen, welche eine einzelne mpl-Liganden-Bande
(auf der Grundlage einer SDS-PAGE-Analyse) enthielten, wurden vereinigt.
-
Andere
Formen (N4 und N15) von in CHO-Zellen exprimiertem mpl-Liganden
wurden auf ähnliche Weise
gereinigt (Proben aus zwei Affinitätsreinigungen wurden vereinigt
und über
eine Superdex 200-Gelfiltrationssäule laufen gelassen).
-
BEISPIEL 11
-
Bestimmung von Kohlenhydrat-Additionen
bei in CHO-Zellen exprimierten N4 und N15
-
Um
zu bestimmen, ob N-verknüpftes
Kohlenhydrat in den in CHO-Zellen exprimierten Formen von mpl-Liganden
enthalten war, wurde konditioniertes Medium durch SDS-PAGE und Western
blot wie in Beispiel 6 beschrieben mit den folgenden Modifikationen
analysiert.
-
Es
wurde CHO-D-konditioniertes Medium aus Rollflaschen verwendet. Die
Proben wurden in die Centricon-10-Zentrifugenkonzentratoren (Amicon,
Beverly, MA.) geladen und bei 6000 Upm eine Stunde in einer Beckman
J2-HS-Zentrifuge unter Verwendung eines Festwinkelrotors (JA 20.1)
zentrifugiert. Ein Volumen konzentrierte Probe, welches ungefähr 100 ng
des mpl-Ligandenanalogons enthielt, wurde auf ein SDS-PAGE-Gel zusammen
mit SDS-Probenpuffer
(beschrieben in Beispiel 6) geladen. In E. coli exprimierter mpl-Ligand
MK 1-174, der kein
Kohlenhydrat enthielt, wurde ebenfalls geladen. 9 zeigt
die Unterschiede in der Mobilität, die
mit der erwarteten Menge an Kohlenhydrat korrelieren. Die Spezies
mit der höchsten
Mobilität
war der in E. coli exprimierte Met-Lys (1-174)-mpl-Ligand, gefolgt
durch mpl-Ligand 1-174 (CHO), N4 (CHO) und N15 (CHO), in dieser
Reihenfolge. Siehe 9. Die wahrscheinlichste Erklärung für die Größenzunahmen
im Verhältnis
zu nicht glykosyliertem mpl-Liganden ist zusätzliches O-verknüpftes Kohlenhydrat
am mpl-Liganden 1-174 (CHO), zusätzliches
O-verknüpftes
Kohlenhydrat und ein zusätzliches
N-verknüpftes
Oligosaccharid an N4 (CHO) und zusätzliches O-verknüpftes Kohlenhydrat
und zwei zusätzliche
N-verknüpfte
Oligosaccharide an N15 (CHO).
-
Um
nachzuweisen, dass die Zunahme des Molekulargewichts tatsächlich auf
die Addition von N-verknüpften
Kohlenhydratketten zurückzuführen war,
wurden die Proben mit N-Glykanase behandelt, um jedes N-verknüpfte Kohlenhydrat
zu entfernen, wie in Bespiel 6 beschrieben. Jede Probe enthielt
ungefähr
100 ng mpl-Ligandenanalogon, gereinigt aus konditioniertem Medium.
-
Nach
Behandlung mit N-Glykanase war die Mobilität von N4 (CHO) und N15 (CHO)
auf diejenige des mpl-Liganden 1-174 (CHO) reduziert. Eine Behandlung
von mpl-Liganden MK 1-174 (E. coli) oder mpl-Liganden 1-174 (CHO)
mit N-Glykanase beeinflusste die Mobilität nicht, da von keiner Form
erwartet wurde, dass sie N-verknüpftes
Kohlenhydrat enthält.
Ein Vergleich der N-Glykanase-Behandlung mit keiner Behandlung zeigt,
dass der Größenunterschied
für N4
der Größe einer
N-verknüpften
Kohlenhydratkette entspricht, und dass der Größenunterschied für N15 der
Größe von 2
Kohlenhydratketten entspricht. Folglich führt eine Addition von N-verknüpften Glykosylierungsstellen
bei diesen beiden mpl-Ligandenformen
zu zusätzlichem
N-verknüpftem
Kohlenhydrat, wenn diese Spezies in CHO-Zellen exprimiert werden. Siehe 10.
-
BEISPIEL 12
-
Biologische in vitro-Aktivität von in
CHO-hergestellten mpl-Ligandenanaloga
-
Gereinigter
mpl-Ligand und gereinigte mpl-Analoga, exprimiert in und gereinigt
aus CHO-Zellen oder E.
coli-Zellen, wurden in Bezug auf ihre biologischen Aktivität in vitro
unter Verwendung der Faktor-abhängigen Zelllinie
32D-MPL und eines in Beispiel 9 beschriebenen Tests analysiert,
außer
dass die Aktivität
aus einer Kurve unter Verwendung eines in CHO-Zellen hergestellten
mpl-Liganden 1-332 als Standard verwendet wurde. Die spezifi schen
biologischen Aktivitäten
in vitro der verschiedenen Formen werden in Tabelle 5 gezeigt. Aus
dieser Tabelle ist ersichtlich, dass die mpl-Ligandenanaloga, die
zusätzliches
Kohlenhydrat enthalten und in CHO-Zellen exprimiert werden, eine
biologische Aktivität
in vitro aufweisen.
-
TABELLE
5 In
vitro-Aktivität
von mpl-Liganden
-
BEISPIEL 13
-
Biologische in vitro-Aktivität von mpl-Ligandenanaloga
-
Die
Zahlen der Blutplättchen
bei Mäusen,
die mit verschiedenen Formen vom mpl-Liganden behandelt wurden,
wurden gemessen, und die Ergebnisse werden in 11 dargestellt.
Die aus CHO-Zellen stammenden mpl-Liganden 1-332, 1-174, N4 und
N15 wurden hergestellt und durch mpl-Rezeptoraffinitätschromatographie
gereinigt. Der aus E. coli stammende Met-Lys-mpl-Ligand 1-174 wurde hergestellt
und durch herkömmliche
Chromatographie gereinigt. Die angegebene Konzentration von jeder
Form wurde normalen Balb/c-Mäuseweibchen
einmal täglich über 5 Tage
subkutan verabreicht. Blutproben aus einem kleinen lateralen Schnitt
in eine Schwanzvene wurden 24 Stunden nach der letzten Injektion
gesammelt. Blutzellanalysen wurden mit einem elektronischen Sysmex-Blutzellanalysegerät (Baxter
Diagnostics, Inc. Irvine, CA.) durchgeführt. Die Daten werden dargestellt
als der Mittelwert von Bestimmungen von vier Tieren, +/– Standardfehler des
Mittelwerts. Andere Blutzellparameter, wie etwa die Gesamtzahl an
weißen
Blutzellen oder die Zahl an roten Blutzellen, wurde durch diese
Behandlungen nicht beeinflusst (Daten nicht gezeigt).
-
Alle
Formen stimulierten Zunahmen der Blutplättchenzahlen. Dennoch variierten
die Aktivitäten
der verschiedenen Formen. Die relative in vitro-Aktivität war mpl-Ligand
MK 1-174 (E. coli) < mpl-Ligand
1-174 (CHO) < N4
(CHO) < mpl-Ligand
1-332 (CHO) < N15
(CHO). Die Ergebnisse zeigen, dass die Addition eines nicht natürlich vorkommenden
N-verknüpften
Kohlenhydrats zu einer erhöhten
Aktivität
in vivo führt.
Sie zeigen weiterhin, dass Zunahmen der Menge an Kohlenhydrat zu
proportionalen Zunahmen der Aktivität in vivo führen.
-
BEISPIEL 14
-
Konstruktion von mpl-Ligandenanaloga
und trunkierten N16–N40
durch Überlappungs-PCR
-
Es
wurden Analoga N16 bis N40 (siehe Tabelle 6 im Bezug auf die Strukturen
dieser Analoga) durch Überlappungs-PCR
(overlap polymerase chaim reaction, overlap PCR) unter Verwendung
eines angepassten Protokolls von Cheng et al., PNAS 91, 5695 (1994)
konstruiert. Typischerweise werden ein bis zwei Mutationen in jede
Konstruktion eingeführt.
-
Die
folgenden Oligonukleotid-Primer wurden synthetisiert, um zum Herstellen
der Analoga N16 bis N40 verwendet zu werden.
-
- F = forward = Vorwärts
- R = reverse = Rückwärts
-
Konstruktionen,
die eine neue Glykosylierungsstelle einführen, wurden in zwei aufeinanderfolgenden Schritten
durchgeführt.
In Schritt 1 wurden zwei Reaktionen unter Verwendung von vier verschiedenen
Oligonukleotiden durchgeführt.
Diese Oligos beinhalteten einen 5'-Vorwärts-Primer,
einen mutagenen Rückwärts-Primer,
einen mutagenen Vorwärts-Primer
(der gewöhnlich
zu dem mutagenen Rückwärts-Primer
komplementär
ist) und einen 3'-Rückwärts-Primer. Der 3'-Rückwärts-Primer
enthielt Sequenzen, welche Stoppkodons, gefolgt durch SalI-Restriktionsstellen,
einführten.
Stoppkodons wurden in den Positionen 175, 184, 192 und 200 eingeführt. Folglich
konnten Formen mit den Längen
1-174, 1-183 (N16), 1-191 (N17) und 1-199 (N31) hergestellt werden.
Die PCR1 verwendete Matrizen-DNA (pDSRα2, das Sequenzen vom mpl-Liganden
1-174 oder Volllängesequenzen
vom mpl-Liganden
1-332 enthielt), den 5'-Vorwärts-Primer
und den mutagenen Rückwärts-Primer.
Die PCR 2 verwendete Matrizen-DNA, den 3'-Rückwärts-Primer
und den mutagenen Vorwärts-Primer. Die beiden
PCR-Reaktionen wurden dann durchgeführt, und die amplifizierten
DNA-Fragmente wurden
durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Es wurden kleine Stücke von
Agarose, welche DNA-Fragmente der richtigen Größe enthielten, aus dem Gel
ausgeschnitten.
-
Die
DNA-Fragmente aus den PCR1 und PCR2 wurden miteinander kombiniert,
und es wurde eine dritte PCR-Reaktion durchgeführt, bei der nur die 5'-Vorwärts- und
3'-Rückwärts-Primer
verwendet wurden. Folglich wurde ein Volllänge-DNA-Segment, welches die
gewünschten
Mutationen in den mpl-Liganden eingefügt enthielt, amplifiziert.
-
Die
amplifizierten Fragmente wurden wieder durch Agarosegelelektrophorese
aufgetrennt, das DNA-Fragment mit der richtigen Größe wurde
unter Verwendung eine GenecleanTM-Kits und
Vorgehensweisen, die durch den Hersteller (Bio 101, Inc.) geliefert
wurden, gereinigt. Die gereinigte DNA wurde mit XbaI und SalI verdaut,
dann wurde sie wieder unter Verwendung des GenecleanTM-Kits
gereinigt. Das Fragment wurde dann in mit XbaI und SalI geschnittenes
pDSRα2 ligiert.
Die ligierte DNA wurde mit 2 Volumen Ethanol in 0,3 M NaOAc, pH
5,2 in Gegenwart von Träger-t-RNA
präzipitiert
und in E. coli transformiert. Die Klone wurden durch Restriktionsanalyse
und Agarosegelelektrophorese getestet, um solche zu identifizieren,
welche die DNA-Inserts mit der korrekten Größe enthielten. Die gereinigte
Plasmid-DNA wurde dann hergestellt, und es wurde das mpl-Liganden-Insert
sequenziert, um das Vorhandensein der gewünschten Mutationen zu bestätigen und
um sicherzustellen, dass keine zusätzlichen Aminosäureänderungen
eingeführt
worden waren.
-
In
etlichen Fällen
wurden zwei oder mehr Mutationen gleichzeitig kombiniert, d.h. siehe
N29, N33, N34, N35, N39 und N40. Dies konnte durch Einführen einer
neuen Substitution in DNA durchgeführt werden, die bereits eine Änderung
enthielt. Beispielsweise wurde N33 durch Einführen der N23-Änderung
in N15 hergestellt. In diesem Fall wurde die oben beschriebene Vorgehensweise
unter Verwendung von mutagene N23-Primern und der N15-Matrizen-DNA
durchgeführt.
-
Bei
einer anderen Strategie konnten zwei Änderungen gleichzeitig in Matrizen-DNA
eingeführt
werden. Die Matrizen-DNA konnte natürliche Sequenzen enthalten
oder sie konnte Sequenzen enthalten, welche mpl-Ligandenformen kodiert,
die bereits Änderungen
enthielten. In diesen Fällen
umfasste Schritt 1 drei PCR-Reaktionen und sechs Oligos. Die Oligos
beinhalteten einen 5'-Vorwärts-Primer,
zwei Paare von mutagenen Vorwärts-
und Rückwärts-Primern und einen
3'-Rückwärts-Primer.
Die beiden Primer eines Paares waren zueinander komplementär und enthielten
Sequenzen, welche entworfen wurden, um eine neue Glykosylierungsstelle
einzuführen.
-
Die
PCR1 beinhaltete Matrizen-DNA, den 5'-Vorwärts-Primer und den mutagenen
Rückwärts-Primer von
Paar 1. Die PCR2 beinhaltete Matrizen-DNA, den mutagenen Vorwärts-Primer von Paar 1
und den mutagene Rückwärts-Primer
von Paar 2, wobei das Primerpaar 2 in 3'-Position zu dem Primerpaar 1 lokalisiert
war. Die PCR3 beinhaltete Matrizen-DNA, den mutagenen Vorwärts-Primer
von Paar 2 und den 3'-Rückwärts-Primer.
-
Die
DNA-Fragmente aus jeder PCR-Reaktion wurden durch Agarosegelelektrophorese
aufgetrennt und wie zuvor beschrieben ausgeschnitten. Die drei DNA-Fragmente
wurden dann miteinander kombiniert und durch PCR wieder unter Verwendung
von nur den 5'-Vorwärts- und
3'-Rückwärts-Primern
amplifiziert.
-
Das
DNA-Segment, welche das gesamte Gen von Interesse mit Sequenzen
kodierte, welche zwei neue Glykosylierungsstellen enthielten, wurden
dann gereinigt, mit XbaI und SalI geschnitten und in mit XbaI und
SalI geschnittenes pDSRα2
wie zuvor ligiert.
-
Eine
Vielzahl von Mutationen konnte auch kombiniert werden, indem die
PCR-Reaktionen an Matrizen durchgeführt wurden, die bereits Mutationen
enthielten. Beispielsweise wurde N39 hergestellt, indem N36- und N38-Änderungen
in N15-Matrizen-DNA eingeführt
wurden. Dies wurde unter Verwendung eines anderen Sets von Primern
(N36 (2)) durchgeführt,
als dem, das verwendet wurde, um N36 (N36(1)) herzustellen. Siehe
die oben dargestellten Primer. Beide Sets von Primern führten dieselbe
Mutation ein.
-
Längere Formen
von mpl-Liganden konnten auch hergestellt werden. Folglich wurde
N40 auf ähnliche Weise
wie N39 hergestellt, außer
dass der 3'-Rückwärts-Primer
in der PCR3 (Schritt 1) und der PCR-Primer in Schritt 2 derjenige
Primer war, der verwendet wurde, um N31 herzustellen. Dieser Primer
führte
ein Stoppkodon in der Position 200, gefolgt durch eine SalI-Restriktionsstelle
ein. Zusätzlich
enthielt die Matrizen-DNA, die für
die PCR3 verwendet wurde, Sequenzen, welche den Volllänge-mpl-Liganden
(1-332) kodierten.
-
Die
typische PCR-Reaktionsmischung enthielt Folgendes: jeweils 3 μl Vorwärts- und
Rückwärts-Primer
(5 pMol/μl),
1 μl Matrize
(50 ng), 10 μl
5 × LP-Puffer
(100 mM Tricine, pH 8,7/25% Glyzerin/425 mM KOAc), 10 μl dNTP-Stammlösung (jeweils
1 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,8 μl rtTh-Polymerase (Perkin Elmer;
2,5 U/μl)
und 2 μl „Vent"-Polymerase (NEB;
0,01 U/μl
nach frischer 1:100 Verdünnung
in 1 × PL-Puffer).
Es wurde H2O zugegeben, um die Reaktionsmischung
auf ein Endvolumen von 50 μl
zu bringen. Alle Bestandteile wurden in der angegebenen Reihenfolge
zusammen gegeben und die PCR wurden gestartet, wenn die Temperatur
während
des ersten Zyklus mehr als 60°C
betrug, indem 1 μl
50 mM MgOAc zugegeben wurde. Die Reaktionsbedingungen waren die
Folgenden: Zwei Zyklen bei 94°C,
10 sec/45°C,
1 min/68°C,
5 min, gefolgt durch 25 Zyklen bei 95°C, 10 sec/55°C, 1 min/68°C, 5 min.
-
Diese
allgemeinen Vorgehensweisen wurden verwendet, um die in Tabelle
6 gezeigten mpl-Ligandenanaloga
und trunkierten Versionen N16 bis N40 zu konstruieren. Die Änderungen
der DNA-Sequenz für jede
der Formen werden gezeigt.
-
TABELLE
6 mpl-Ligandenanaloga
mit Stellen für
N-verknüpfte
Kohlenhydratketten
-
-
Das
Symbol „(i)" in der oben dargestellten
Tabelle bedeutet, dass die Aminosäure, auf die Bezug genommen
wird, eingeführt
worden ist. Beispielsweise bedeutet Glu57 → Asn55'(i),
Thr57 (Analogon N23 in Tabelle 6), dass
das Glu in Position 57 durch ein Thr ersetzt worden ist und zusätzlich ein
Asn direkt nach dem Met in Position 55 eingefügt worden ist, wobei Asn die
neue Nummer 55' erhalten
hat, so dass nachfolgende Aminosäuren
ihre zuvor zugeordneten Nummern beibehalten haben.
-
Beispiele,
die alle Änderungen
aus den vorhergehenden Beispielen einschließen, werden durch die spezifischen
Nummern der Analoga, die durch „+"-Zeichen verbunden werden, angegeben.
Siehe die Analoga N35, N39 und N40. Die Längen der Aminosäureketten
dieser Analoga werden in Klammern angegeben. Folglich enthält das Analogon
N35 eine Kombination aus allen Änderungen,
die für
die Analoga N4, N23, N30 und N31 hergestellt wurden. Die Änderungen,
die für
N31 angegeben wurden, bedeuten, dass Analogon N35 eine Länge von
199 Aminosäuren
aufweist. Alle Analoga in Tabelle 6 weisen eine Länge von
174 Aminosäuren
auf, außer
wenn eine andere Länge
angegeben ist (oder in den Fällen,
in denen eine Aminosäure
eingefügt
worden ist, wird die Gesamtlänge
durch die Anzahl der eingefügten
Aminosäuren
zunehmen).
-
BEISPIEL 15
-
Charakterisierung on mp-Ligandenanaloga
und trunkierten N16 bis N40
-
A. Bestimmung der Expressionsstärke und
der biologischen Aktivität
in vitro von mpl-Ligandenanaloga.
-
Die
Spezies N16 bis N40 wurden in COS-Zellen unter Verwendung von entweder
dem Elektroporationsverfahren (Beispiel 5) oder dem CaPO4-Verfahren („Mammalian Cell Transfection
Kit"; Speciality
media) transfiziert. Nach drei bis vier Tagen wurde zellfreies konditioniertes
Medium gesammelt, aliquotiert und bei –70°C gelagert. Die Expressionsstärke wurde
durch einen ELISA-Test wie in Beispiel 7 beschrieben bestimmt. Die Überstände wurden
auch auf ihre biologische Aktivität wie in Beispiel 9 beschrieben
mit einer Modifikation getestet. Die Aktivitäten wurden aus einer Standardkurve
unter Verwendung von in CHO-Zellen exprimiertem und gereinigtem
mpl-Liganden 1-332 als Standard berechnet.
-
Die
Ergebnisse werden in Tabelle 7 gezeigt. Wie in Tabelle 7 gezeigt
wird, werden die meisten der mpl-Ligandenanaloga exprimiert und
sezerniert. Die Sekretion einiger der Analoga schien erhöht zu sein.
Biotests mit diesen Proben zeigten, dass die spezifischen Aktivitäten bei
den meisten auch mit nicht modifizierten Formen vergleichbar war.
Einige der Analoga enthielten eine Vielzahl von N-verknüpften Kohlenhydratketten (siehe
unten). Dies zeigt, dass eine Addition von Kohlenhydrat zu einer
erhöhten
Sekretion und einer normalen Aktivität der Analoga in vitro führen kann.
-
-
Anmerkungen
-
- (a) Die Anzahl an zusätzlichen N-verknüpften Ketten
wurde auf der Grundlage der Mobilität der Peptidanaloga in SDS-Gelen
abgeschätzt.
- (b) Die Mengen an mpl-Ligandenanaloga in COS-Zellüberständen wurden
durch EIA bestimmt.
- (c) Die in vitro-Aktivität
wurde bestimmt, indem die Proliferation von 32D-mpl-Zellen, deren
Wachstum vom mpl-Liganden abhängig
ist, gemessen wurde.
- (d) Das Verhältnis
der in vitro-Aktivität
vom mpl-Ligandenanalogon, wie durch Proliferationstests gemessen,
zur Länge
vom mpl-Ligandenanalogon, gemessen durch mpl-Liganden-ELISA
-
- i = Insertion
- NA = not available = nicht verfügbar
-
B. Bestimmung einer Kohlenhydrat-Addition
-
Die
in Tabelle 6 gezeigten Analoga wurden unter Verwendung der in Beispiel
6 beschriebenen Vorgehensweisen getestet, um zu sehen, ob sie N-verknüpftes Kohlenhydrat
anfügen.
-
Einige
Analoga (N21, N22, N30, N33 und N36) wurden auch mit einer modifizierten
Vorgehensweise getestet. Dies war notwendig, da der monoklonale
Antikörper,
der verwendet wurdet wurde, um den Westen blot zu entwickeln, gegen
ein Peptid gerichtet war, welches die Aminosäurereste 47 bis 62 einschloss,
und einige der in Tabelle 6 beschriebenen Analoga Substitutionen
enthalten, welche die Immunreaktivität mit diesem Antikörper beeinflussen,
z.B. N21. Um diese Analoga zu analysieren, wurden deshalb die Überstände unter Verwendung
eines monoklonalen Antikörpers,
der in Mäusen
gegen den in E. coli-Zellen exprimierten mpl-Liganden 1-163 erzeugt
wurde, immunpräzipitiert.
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Typischerweise
wurden 15 μg
Antikörper
verwendet, um 50 ng mpl-Ligandenanalogon zu immunpräzipitieren.
Western blots mit immunpräzipitiertem
Material wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, abgesehen
davon, dass die immunpräzipitierten
Banden sichtbar gemacht wurden, indem die Blots mit dem polyklonalen
Kaninchen-anti-mpl-Liganden-Antikörper (typischerweise
1 μ/ml;
gerichtet gegen in E. coli-Zellen exprimierten mpl-Liganden 1-163) und
ein anti-Kaninchen-ECL-Kit (Amersham) inkubiert wurde. Die Ergebnisse
der verschiedenen Experimente werden in Tabelle 7 gezeigt. Einige
der Analoga zeigten eine Größenzunahme,
welche die Anwesenheit von N-verknüpftem Kohlenhydrat angibt (N21,
N22, N23, N29, N30, N31, N33, N34, N35, N36, N38, N39 und N40).
Eine Untergruppe dieser Analoga wies mehr als eine N-verknüpfte Kette
auf, z.B. N29, N33, N34, N35, N39 und N40. Diese Analoga wurden
mit normalen oder erhöhten
Spiegeln sezerniert und wiesen in vitro eine biologische Aktivität auf, die
der des mpl-Liganden 1-174 vergleichbar ist. Dies zeigt, dass eine
Vielzahl von funktionellen N-verknüpften Glykosylierungsstellen
in einem mpl-Liganden ohne eine nachteilige Wirkung sowohl auf die
Expression oder die biologische Aktivität eingeführt werden kann.
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Um
zu zeigen, dass eine Vielzahl von Oligosaccharidketten an einen
mpl-Liganden angefügt
werden kann, wurden verschiedene Analoga, die in COS-Zellen exprimiert
wurden, durch Western blot wie in Beispiel 6 beschrieben analysiert. 12 zeigt,
dass die Mobilität
der Analoga mit zunehmender Anzahl von angefügten N-verknüpften Glykosylierungsstellen
abnimmt. Es werden Analoga mit vier neuen Stellen gezeigt, nämlich N39
und N40. Die Analoga mit den meisten N-verknüpften Stellen zeigten die geringste
Mobilität.
Dieses Ergebnis wird bei den beiden Formen 1-174 und 1-199 des mpl-Liganden
beobachtet. Dies zeigt, dass mindestens vier Analoga miteinander
kombiniert werden können,
was zu neuen Analoga mit einer Vielzahl von N-verknüpften Kohlenhydratketten
führt.
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BEISPIEL 16
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Vergleich von Asn-X-Ser
und Asn-X-Thr enthaltenden Glykosylierungsstellen
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N-verknüpfte Glykosylierungsstellen
beinhalten entweder Asn-X-Thr oder Asn-X-Ser, wobei X jede der 20
natürlich
vorkommenden Aminosäuren
mit Ausnahme von Pro sein kann. Wir wollten bestimmen, ob Ser oder
Thr in der dritten Position bevorzugt ist. Deshalb wurden zwei Sets
von Analoga, wobei jedes Set ein mpl-Liganden-Glykosylierungs-Analogon
ent hielt, das entweder ein Ser oder ein Thr in der dritten Position
in dem Sequon enthielt, untersucht, um zu sehen, ob dies eine Wirkung
auf die prozentuale Besetzung der N-verknüpften Glykosylierungsstellen
hatte. N15 enthält
zwei Asn-X-Thr-Stellen, während
N29 zwei Asn-X-Ser-Stellen
in genau denselben Positionen enthält. Auf ähnliche Weise enthält N30 ein
Asn-X-Ser, während
N38 ein Asn-X-Thr in derselben Position enthält.
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Um
diese beiden Sets von Analoga zu vergleichen, wurden sie in COS-Zellen
exprimiert und der sezernierte mpl-Ligand wurde einer Western blot-Analyse
wie in Beispiel 6 beschrieben unterzogen.
13 zeigt die
Ergebnisse. N15 weist einen signifikant gestiegenen Anteil an glykosyliertem
mpl-Liganden im Vergleich zu N29 auf. Im Gegensatz dazu gab es wenig
Unterschied am Anteil an glykosyliertem und unglykosyliertem mpl-Liganden,
wenn N30 und N38 verglichen wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass
sowohl Asn-X-Ser als auch Asn-X-Thr
in einen mpl-Liganden eingeführt
werden kann, und dass beide als Stellen für eine N-verknüpfte Kohlenhydrat-Addition
fungieren können.
Zusätzlich
kann in einigen Fällen
das Asn-X-Thr-Sequon bervorzugt sein (d.h. es kann mit größerer Effizienz
glykosyliert werden). Sequenzprotokoll