EP3359997A1 - Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer probe mit einer strukturiereten lichtblattbeleuchtung - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer probe mit einer strukturiereten lichtblattbeleuchtung

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EP3359997A1
EP3359997A1 EP16778396.8A EP16778396A EP3359997A1 EP 3359997 A1 EP3359997 A1 EP 3359997A1 EP 16778396 A EP16778396 A EP 16778396A EP 3359997 A1 EP3359997 A1 EP 3359997A1
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EP
European Patent Office
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illumination
partial
illumination light
plane
objective
Prior art date
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Application number
EP16778396.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Florian Fahrbach
Werner Knebel
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Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
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Pending legal-status Critical Current

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    • G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for examining a sample, in particular in light-sheet microscopy.
  • SPIM Single Plane Illumination Microscopy
  • a well-known field of application of the SPIM technology is the field of fluorescence microscopy, wherein fluorophores are excited in the sample with laser light.
  • excitation takes place here only in one of an illumination light sheet (also called "light stripe”) .
  • illumination light sheet also called "light stripe”
  • a device operating according to the SPIM method is described in DE 102 57 423 AI
  • a specimen is illuminated with a thin light sheet while the observation is made from a direction perpendicular to the plane of the illuminating light sheet, whereby the illumination and the detection are effected via two separate optical paths with separate optics
  • the specimen is moved through the light sheet which is fixed relative to the detector in order to record fluorescence and / or scattered light layer by layer with a two-dimensional detector, which can then be converted into a three-dimensional image d he assemble sample corresponding record.
  • an optical arrangement with a light source for emitting a light beam and with optical elements for converting this light beam in the form of a light sheet is known.
  • the optical arrangement is particularly suitable for illuminating individual planes of a three-dimensional sample in the case of selective plane illumination microscopy (SPIM).
  • SPIM selective plane illumination microscopy
  • the object is achieved by a device that
  • the invention has the very special advantage that an improvement of the imaging quality can be achieved by illumination with a lighting pattern, in light-sheet microscopy and / or in TIRF microscopy.
  • This on the one hand by the fact that at least one background suppression is made possible by the illumination with an illumination pattern generated by interference of at least two partial illumination light bundles.
  • advantageously even an increase in resolution can be achieved.
  • the partial illumination light beams, which are brought to generate the illumination pattern to the interference the same illumination lens through, so that in the sample only a single illumination lens needs to be present, allowing a particularly good accessibility of the sample.
  • the increase in resolution depends on the period of the lattice.
  • an illumination with a grating takes place through the detection objective, this usually takes place in such a way that the illuminating light is irradiated at a steep angle with respect to the optical axis into the sample volume in two opposite directions, so that a standing wave arises as an interference pattern whose period of the angle 2a between the two beams depends.
  • the angle a is clearly less than 90 degrees, with an angle of 90 degrees being optimal to achieve the minimum period of the interference pattern.
  • the interfering beams before and after they reach the focal plane of the detection lens reach large parts of the sample and there, ie above and below the focal plane of the detection lens (except for TIRF) fluorescence, which causes a strong background signal in the image, the fluorophores of the There sample unnecessarily bleaches and damage the sample by phototoxic effects.
  • a lighting pattern for example with regard to a lattice constant and / or with regard to its position and / or with regard to its orientation, can be changed in different ways, in order to generate a changed illumination pattern in each case.
  • the relative phase of the partial illumination light beams can be achieved, for example, by changing the optical light path of a subset of the interfering partial illumination light bundles.
  • the angle of incidence of the interfering partial illumination light beam is changed to the illumination plane, in particular, for example, to change a lattice constant.
  • a further illumination pattern is generated in addition to the illumination pattern, which is superimposed coherently or incoherently on the illumination pattern.
  • a further illumination pattern can be generated by splitting off at least two further partial illumination light bundles from the illumination light bundle which interfere with one another in the illumination plane.
  • at least two further partial illumination light beams are generated by means of a further light source, which interfere with one another in the illumination plane, so that the further illumination pattern arises in the illumination plane.
  • an over-resolved image can be generated.
  • a high-frequency illumination pattern results overall in the illumination plane. If the relative phase of the partial illumination light bundles belonging to each illumination pattern is then changed, the phase of the high-frequency grating is also changed so that the respective resulting image data are raw data for generating or calculating an over-resolved and / or contrast-enhanced imaging of the illuminated in the illumination plane sample area can be used.
  • the sample in the illumination plane is illuminated with a plurality of crossed illumination gratings which are coherently superimposed.
  • an incoherent superimposition of the illumination pattern at least one further illumination pattern.
  • the main difference between the two types of superimpositions is that in one case isolated maxima are generated, for example for excitation, in the other case isolated minima / zeros are generated.
  • the incoherent overlay can be understood as a simple sum of the two grids: the lattices overlap without any deviation due to interference.
  • the resulting illumination pattern then has an annular character on the one hand. In particular, real zeros are then only in the center or at the intersections of the (linear) zeros of the two crossed lattices.
  • incoherent superimposition of a lighting pattern with a single further, rotated by 90 degrees in the lighting level further lighting patterns are the real zeros only in the center of the lighting level within a square formed of four adjacent points (intensity maxima).
  • a total illumination pattern generated by incoherent superposition has a smaller period.
  • the illumination pattern generated by incoherent superimposition can also be exploited for parallelized STED or RESOLFT experiments when parallel or alternating excitation light of a different, suitable wavelength is irradiated (alternating with switchable fluorophores, with STED / RESOLFT-like techniques simultaneously) ,
  • the superimposition of two gratings with different wavelengths is particularly attractive.
  • a point grid is generated by coherent superposition, whose maxima lie at the zeros of a grid, which was generated with light of a second wavelength and is generated by incoherent superimposition.
  • the first wavelength is suitable for exciting the fluorophores
  • the second wavelength for stimulated excitation by means of the STED process or for switching the fluorophores by means of RESOLFT is explained below.
  • the present invention offers the very special advantage in a higher spatial frequency of the resulting illumination pattern and the resulting higher resolution.
  • RESOLFT experiments and STED (Stimulated Emission Depletion) due to the higher grid frequency, a higher resolution at lower illumination light achievable achievable.
  • the present invention also provides more efficient use of the light because it illuminates only in a narrow area outside the illumination plane.
  • the interfering partial illumination light bundles and / or the further interfering partial illumination light bundles are designed as Bessel beams.
  • the interfering partial illumination light bundles and / or the further interfering partial illumination light bundles are designed as sectioned-Bessel beams.
  • the interfering Bessel beams for example, using one or more with respect to the deflection angle adjustable beam deflecting device, are moved in the lighting plane synchronously back and forth.
  • Focusing the light passing through a ring aperture causes intensity maxima along the optical axis in the region of the focus due to constructive interference.
  • a disturbance in a small partial area of the annular illumination light beam has almost no effect in the area of the focus on the optical axis because the entire illumination light there interferes. Hiding in a small portion outside the optical axis thus has almost no influence on the constructive interference.
  • a disturbance in the area of the incident light is "healed" in that the remaining light behind the disturbance avoids a shadow cast by the disturbance.
  • a Bessel beam generated with an annular illumination is rotationally symmetric with respect to the optical axis.
  • such a Bessel beam has intensity maxima in the form of concentric rings in a cross section perpendicular to the optical axis, the largest intensity being located on the optical axis. If one now disregards segments of the annular illumination light, in particular symmetrically, one speaks of a "sectioned Bessel beam.” For example, one could use an annular diaphragm which additionally covers two peripheral areas lying opposite one another with mirror symmetry The light then passes only through the two intermediate circumferential regions of the annular diaphragm The focus of such a "sectioned Bessel beam” is not rotationally symmetrical in cross-section perpendicular to the optical axis. Rather, in such a "sectioned Bessel beam” parts of the originally annular intensity maxima are hidden, so that adjacent curved, aligned to the optical axis curved intensity maxima in the form of ring segments or "sections" remain.
  • Sectioned-Bessel rays The main advantage of the Sectioned-Bessel rays is that a grid can be created by superimposing only two rays from opposite directions. So you only need two mirror caps or lenses. The possibility of moving the grating also laterally by means of a scan mirror is only necessary if the width of the image field is greater than that of the sectioned-beam beam.
  • the partial illumination light beams that are brought into interference have the same polarization.
  • deflecting mirrors as deflecting here is to be noted that the reflection Linearpolarisationscardi the partial illumination light beam is changed when the incident on the mirror Crystalbeleuchfungsfundbündel has a parallel to the plane of incidence aligned linear polarization.
  • the linear polarization direction is not changed when the respective incident partial illumination light beam has a linear polarization direction which is oriented perpendicular to the plane of incidence.
  • the illumination pattern and the at least one further illumination pattern are to be superimposed incoherently, this can be achieved, for example, by having different polarizations at the location of the superposition in the illumination plane.
  • two perpendicularly aligned illumination patterns which are generated by four partial illumination light beams (two each), are incoherently superimposed, the partial illumination light beams being equally polarized in the entrance pupil of the illumination objective, and after passing through the illumination objective each being guided by one of four deflection mirrors aligned in a square, in particular by 90 degrees, are deflected into the illumination plane, since they have, because of the described effects with respect to the linear polarization in the reflection, after deflecting in the illumination plane mutually perpendicular linear polarization directions.
  • the illumination pattern it is also possible to illuminate in a temporally pulsed manner, wherein the pulse length and the repetition rate and the temporal offset of the light pulses of the illumination pattern relative to the light pulses of the further illumination pattern are selected such that the illumination pattern and the further Illumination patterns arise alternately at different times in the illumination plane.
  • Another possibility for generating an incoherent superimposition is the light path of the partial illumination light beam and the light path of the other Design partial illumination light beam such that the optical path lengths differ from each other by more than the coherence length.
  • the illumination light for the illumination pattern could be coupled directly into the sample volume, while the light for the further illumination pattern is guided by a long glass fiber that is longer than the coherence length, or vice versa.
  • the light for generating the illumination pattern and the light for generating the further illumination pattern in each case in a polarization-maintaining glass fiber, which are rotated against each other or not rotated against each other.
  • the light of the light source is coupled into four fibers, which in turn couple the light into the pupil of the illumination objective.
  • the fibers are arranged in pairs opposite each other and thereby rotated so that the emitted light is polarized in the same direction.
  • a modulator for example an AOM (Acusto Optical Mudulator) or an AOD (Acusto Optical Deflector), in order to manipulate the frequency of the illumination light of the sub-illuminating light bundle so that it stops interfere with the unmanipulated light of the further partial illumination light beams.
  • the modulator should be able to shift the frequency of the light, for example by photon-photon interaction.
  • the linear polarization direction of the two partial illumination light beams of one of the illumination patterns can be rotated, for example by means of a lambda / 2 plate.
  • a phase plate with four quadrants is used for this purpose, wherein two diagonally opposite quadrants do not influence the linear polarization direction, while the other two diagonally opposite quadrants each as lambda / 2 phase plates are executed.
  • the illuminating pattern-generating partial illuminating light bundles can each extend through one of two diagonally opposite quadrants, while the further illuminating pattern-generating further partial illuminating light bundles each extend through one of the two other diagonally opposite quadrants.
  • the phase plate can advantageously be arranged in a plane conjugate to the focal plane of the illumination objective.
  • active optical components such as an SLM (spatial light modulator), in particular a ferroelectric SLM, or, for example, by means of an LcoS component ("liquid crystal on silicon" component)
  • SLM spatial light modulator
  • LcoS component liquid crystal on silicon
  • the image acquisition of several images can each take place with structured illumination with the illumination pattern and / or the further illumination pattern by successive shifting of the respective illumination pattern in the illumination plane.
  • Part illumination light beam to be changed. This is possible, for example, by changing the length of the light path of a subset of the respectively interfering partial illumination light bundles or further partial illumination light bundles.
  • a change in the length of the light path can be achieved, for example, by means of an active mirror, which can be displaced, for example, with a piezoelectric element.
  • the use of an acousto-optical element is possible.
  • SLM spatial light modulators
  • DMD digital mirror devices
  • DM deformable mirrors
  • the splitting means may comprise a simple beam splitter or a polarization beam splitter.
  • the splitting agent has a phase grating. Such a design is particularly advantageous because a largely symmetrical beam path can be achieved for the different partial illumination light bundles.
  • the deflection means may for example comprise one or more mirrors (deflecting mirrors) as deflection elements.
  • the mirrors may be flat.
  • one or more mirrors are curved.
  • the deflection means comprises at least one prism.
  • the device according to the invention can advantageously have a deflecting means which deflects the illuminating light bundle after it has passed through the illuminating objective in such a way that the illuminating light bundle extends in the illumination plane.
  • the deflection means may be arranged such that the deflected illumination light beam has an angle different from zero degrees to the optical axis of the illumination objective and / or the detection objective.
  • the illumination plane can be aligned perpendicular to the optical axis of the illumination objective.
  • the illumination light bundle in particular formed into a light sheet, initially runs in the vertical direction through the illumination objective and is then deflected in the horizontal direction with the deflection device in order to illuminate the sample in the sample plane along the illumination strip.
  • the detection light emanating from the illumination strip in particular fluorescent light, preferably runs in the vertical direction through a detection objective.
  • the illumination objective and the deflection device which may, for example, have one or more deflection mirrors, are arranged so as to be movable relative to one another in order to be able to move the illumination light bundle relative to the sample.
  • the deflection device in particular movably, is fastened and / or arranged on the detection objective or the illumination objective.
  • the illumination pattern and / or the further illumination pattern for fluorescence excitation of the sample in the sample plane is preferably used.
  • the sample plane is simultaneously subjected to homogeneous de-excitation light.
  • the illumination pattern is used to switch fluorescent dyes.
  • the lattice illumination can also be used in a particularly favorable manner for RESOLFT-like effects (for example STED, stimulated emission depletion or for GSD, ground-state depletion).
  • RESOLFT-like effects for example STED, stimulated emission depletion or for GSD, ground-state depletion.
  • structured illumination for fluorescence excitation is that a structured or unstructured illumination for fluorescence excitation is superimposed more or less at the same time (e.g., offset in GatedSTED) with further structured illumination (at a different wavelength) in the sample.
  • a "common” eg blue light sheet could be irradiated into the sample and superimposed with eg a red "grid", where the red grid would cause the fluorophores to be either stimulated to be de-excited or held in a dark state or by conformational change into one can not be transferred to the stimulable state of the blue light sheet, whereby the emission of fluorescence in the direction of the detector is always effectively suppressed by the 'red' illumination.
  • the excitation light may also have a gifter form for this purpose.
  • the maxima of the excitation would then have to be in the minima of the excitement.
  • the problem here is that the light beams have different wavelengths and therefore does not adjust the same grating period when the grid be generated in the same way.
  • the partial illumination light beam it is not necessary for the partial illumination light beam to be deflected by an illumination objective common to both partial illumination light bundles and / or for at least one of the partial illumination light bundles to be deflected with at least one deflection means such that the partial illumination light bundles are deflected after passing through the illumination objective interfere with each other in an illumination plane, so that a lighting pattern is created in the illumination plane.
  • a device which is suitable for carrying out the method according to the invention can advantageously be constructed on the basis of a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope.
  • a scanning microscope in particular a confocal scanning microscope.
  • the use of an inverted microscope stand is suitable.
  • a (possibly-present in a laboratory anyway) grid microscope for carrying out the method according to the invention.
  • 1 shows an embodiment of a detail of a device according to the invention
  • 2 schematically shows the generation of an illumination pattern in a device according to the invention designed as a SPIM microscope
  • FIG. 3 schematically shows the generation of the superimposition of an illumination pattern and a further illumination pattern in a device according to the invention designed as a SPIM microscope
  • FIG. 4 schematically shows the generation of the superimposition of an illumination pattern with three further illumination patterns in a device according to the invention designed as a SPIM microscope
  • FIG. 5 shows the light distribution in the superimposition of an illumination pattern and a further illumination pattern in a device according to the invention designed as a SPIM microscope
  • FIG. 8 shows the interference pattern of two of the counter-propagating Sectioned Bessel beams
  • FIG. 9 shows schematically the generation of an illumination pattern in a device according to the invention designed as a TIRF microscope
  • FIG. 9 shows schematically the generation of an illumination pattern in a device according to the invention designed as a TIRF microscope
  • Fig. 10 is a detail view of the device shown in Fig. 9.
  • Fig. 1 shows an embodiment of a detail of a device according to the invention.
  • the device includes a splitting means 1, which spatially splits an illuminating light beam 2 into two partial illuminating light bundles 3, 4.
  • the partial illumination light beams 3, 4 pass through a lens 5 which focuses the partial illumination light beams 3, 4 and a tube lens 6 which collimates the partial illumination light beams 3, 4 and in the opposite direction tilted the optical axis in the entrance pupil of a lighting objective 7 couples.
  • the partial illumination light bundles 3, 4 After passing through the illumination objective 7, the partial illumination light bundles 3, 4 respectively strike one of two deflecting mirrors 9, 10 of a deflecting means arranged opposite one another on a detection objective 8, which deflects the partial illumination light bundles 3, 4 in such a way that the partial illumination light bundles 3, 4 in an illumination plane 1 1, which is also the focal plane of the detection lens 8, interfere with each other, so that in the illumination plane 1 1 creates a lighting pattern.
  • the illumination pattern 12 is formed in the illumination plane 1 1 by interference of two partial illumination light beams, which are deflected by opposite deflection elements, namely deflecting mirrors 9, 10, after passing through an illumination objective 7, so that they propagate in the illumination plane with opposite propagation directions.
  • the vertical lines between the deflecting mirrors show, by way of example, the positions of the maxima / minima of a forming standing wave for two counter-rotating beam bundles with a planar phase front, as they are known for SPIM microscopes usual illumination beams, also called light sheets, to a good approximation.
  • the illumination pattern 12 is formed in the illumination plane 1 1 by interference of two partial illumination light bundles, which are deflected by mutually opposite deflection elements, namely deflecting mirrors 9, 10, after passing through an illumination objective.
  • the further illumination pattern 13 is formed in the illumination plane 1 1 by interference of two further partial illumination light beams, which are deflected by opposing further deflection elements, namely further deflection mirrors 14, 15, after passing through an illumination objective. Due to the superimposition and interference of the illumination pattern 12 with the further illumination pattern 13, a dot grid 16 arises in the center.
  • FIG. 4 schematically shows the generation of the superimposition of an illumination pattern 12 with three further illumination patterns 13, 17, 18 in a device according to the invention designed as a SPIM microscope.
  • Fig. 4 is not necessarily an illustration of a real deflection means, but rather also shows the possibility of temporal integration, which can be implemented, for example, by using a rotatable deflection means:
  • the in the figure shown deflecting mirror can be permanently installed, but they must not all be present in the structure.
  • a movable pair of deflecting mirrors 9, 10 may be provided rotatable so that it can successively occupy the positions of the deflecting mirrors 9, 10 and then 21, 22 and then 14, 15 and then 19, 20 or any number of any other positions.
  • a strip-shaped illumination pattern 12 is thereby rotated twice by angles of 60 degrees in order to achieve an isotropic increase in resolution in the plane 11. This happens during the exposure of a single image of the camera.
  • the illumination pattern 12 is formed in the illumination plane 1 1 by interference of two partial illumination light bundles, which are deflected by mutually opposite deflection elements, namely deflecting mirrors 9, 10, after passing through an illumination objective.
  • the further illumination pattern 13 is formed in the illumination plane 11 by interference between two further partial illumination light beams, which are deflected by opposing (further) deflection elements, namely further deflection mirrors 14, 15, after passing through an illumination objective
  • the further illumination pattern 17 is formed in the illumination plane 1 1 by interference of two partial illumination light bundle, the opposing deflection elements, namely deflecting mirrors 19, 20 (or Deflection mirrors 9, 1 0 which were rotated to the position of 19, 20) are deflected after passing through a lighting objective.
  • the further illumination pattern 18 is formed in the illumination plane 11 by interference between two further partial illumination light beams, which are deflected by opposing further deflection elements, namely further deflection mirrors 21, 22, after passing through an illumination objective.
  • a dot grid 23 is formed in the center.
  • a subgroup, e.g. of 12 and 1 3 or 1 7 and 18 are brought to overlay.
  • FIG. 5 shows the light distribution in the superimposition of an illumination pattern and a further illumination pattern in a device according to the invention designed as a SPIM microscope.
  • FIG. 5 shows in the upper line a lighting pattern just produced in the illumination in three different views.
  • a view of the illumination plane 11 is seen looking along the optical axis of the detection objective (Z-direction).
  • the other two diagrams show the illumination pattern with a viewing direction along the X direction (propagation direction of the rays of the first illumination pattern) and with a viewing direction along the Y direction perpendicular to X and Z (propagation direction of the rays of the second illumination pattern).
  • FIG. 5 shows in the middle row a further illumination pattern just generated in the illumination in the three different views as in the upper row.
  • a view with a viewing direction along the optical axis of the detection objective Z-direction
  • the two other illustrations show the illumination pattern with a viewing direction along the X direction and with a viewing direction along the Y direction.
  • the further illumination pattern is just rotated by 90 degrees in the illumination just relative to the illumination pattern shown in the upper line.
  • Fig. 5 shows in the bottom line the result of the coherent superimposition of the Illumination pattern with the further illumination pattern in the three different views as in the upper line.
  • a view is seen along the optical axis of the directional objective (Z-direction).
  • the two other illustrations show the illumination pattern with a viewing direction along the X direction and with a viewing direction along the Y direction.
  • FIG. 6 shows an enlarged view of the light distribution of the coherent superposition of the illumination pattern with the further illumination pattern, as already illustrated in the lower line of FIG.
  • FIG. 7 shows the light distribution which arises during the incoherent superimposition of the illumination pattern and the further illumination pattern.
  • Fig. 8 shows the interference pattern of two mutually opposed Sectioned Bessel beams. For example, by changing the phase and lateral position of the overlapping Sectioned Bessel beams, the interference pattern can be successively changed to generate multiple images, from which image data can be computed to yield a higher contrast, higher resolution image.
  • FIG. 9 shows schematically the generation of an illumination pattern in a device according to the invention designed as a TIRF microscope.
  • the device has an illumination objective 7 and a detection objective 8, between which a sample 24 to be examined is arranged in an examination position.
  • the sample 24 is in contact with an optically transparent medium 25, which has a higher refractive index than the sample 24.
  • the sample may also be prepared on a cover glass, which is in contact with the optically transparent medium 25, wherein in the space an immersion medium can be inserted to minimize jumps in the refractive index.
  • Two partial illumination light bundles 3, 4 pass over a beam deflection device 26, which can be adjusted with respect to the deflection angle, a scan lens 27 and a Tubus lens 28 to the illumination lens 7, pass through this and are then deflected by a deflection means 29 which has two deflecting elements 30, 31 and is attached to the detection objective 8.
  • the deflection means 29 has a first deflection element 30 and a second deflection element 31, wherein the optically transparent medium 25 (in addition to its function of providing a flat boundary surface to the sample 24) also forms a further deflection element.
  • the deflection elements 30, 31 and the entrance windows of the optically transparent medium 25 redirect the partial illumination light bundles 3, 4 successively with deflection angles of different sign and different amounts.
  • the interfering sectionbeleuchtungslichtbundel 3, 4 for evanescent illumination of the sample 24 are totally reflected.
  • the evanescent field 33 protrudes into the sample 24 and leads there to an optical excitation of fluorescent dyes.
  • the fluorescent light emanating from the sample 24 passes through the detection objective 8 and is focused on the active surface of a spatially resolving detector (not shown), which is embodied as an area detector, for example.
  • the beam deflection device 26 has a gimbal-mounted mirror, which makes it possible for the partial illumination light bundles 3, 4 to be able to deflect in two mutually perpendicular planes with any desired deflection angle. In this way, the spatial position and the propagation direction of the emerging from the illumination lens 7 Illusttungslichtbundel 3, 4 can be adjusted largely freely. In this way, it is possible, for example, to direct the partial illumination light bundles 3, 4, instead of the deflection elements 30, 31, to another pair of deflection means, for example to change the orientation of the illumination pattern.
  • the beam deflection device could, for example, at least two optically in series switched baffles, in particular deflecting mirror, which can divert the partial illumination light beams 3, 4 in mutually perpendicular Ablenkebenen.
  • the partial illumination light beams 3, 4 are generated from an illumination light beam 2 by means of a splitting means 1, which may be formed, for example, as a grating.
  • splitting means 1 to be rotatable or gimbal-mounted about an axis and for the rotatability of the beam deflecting device 26 to be restricted to only one axis, as long as the free alignability of the partial illuminating light bundle remains ensured.
  • FIG. 10 shows a detail view of the sample area of the device illustrated in FIG. 9 and in particular the light paths of the interfering partial illumination light bundles 3, 4 in the region of the sample 24.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Probe (24). Das Verfahren beinhaltet den Schritt des Erzeugens eines Beleuchtungslichtbündels (2) mit einer Lichtquelle, den Schritt des räumlichen Aufspaltens des Beleuchtungslichtbündels (2) mit einem Aufspaltungsmittel (1) in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), den Schritt des Lenkens der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv (7), den Schritt des Umlenkens wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv (7) durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel (29) derart, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) in einer Beleuchtungsebene (11) miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene (11) ein Beleuchtungsmuster (12) entsteht, und den Schritt des Erzeugenseiner Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster (12) beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv (8) zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt.

Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUM UNTERSUCHEN EINER PROBE MIT EINER STRUKTURIERETEN
LICHTBLATTBELEUCHTUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe, insbesondere in der Lichtblatt-Mikroskopie.
Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt (auch„Lichtstreifen" genannt) statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden. Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in DE 102 57 423 AI beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik. Das Lichtblatt wird von einer Zylinderlinse erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch das bezüglich des Detektors feststehende Lichtblatt bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.
Aus DE 10 2007 015 063 AI ist eine optische Anordnung mit einer Lichtquelle zum Abstrahlen eines Lichtbündels und mit optischen Elementen zur Umwandlung dieses Lichtbündels in die Form eines Lichtblattes bekannt. Die optische Anordnung ist insbesondere geeignet zur Beleuchtung einzelner Ebenen einer dreidimensionalen Probe bei der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Es sind Mittel zur Variation des Querschnittes des Lichtblattes, zur Variation der Länge des Lichtblattes und/oder zur Beeinflussung der Richtung, der innerhalb des Lichtblattes verlaufenden Strahlungsanteile vorhanden, um die Geometrie des Lichtblattes an die Beleuchtungserfordernisse bei der Beobachtung ein und derselben Probenebene mit mehreren verschiedenartigen Objektiven zu ermöglichen.
Alternativ zu einer direkten Probenbeleuchtung ist es auch möglich, die Probe evaneszent zu beleuchten. Hierbei wird das Anregungslicht an einer Grenzfläche zur Probe totalreflektiert, wobei die Anregung der Probe durch das mit der Eindringtiefe abklingende evaneszente elektromagnetische Feld erfolgt. Für diese Art der Probenuntersuchung hat sich der Begriff TIRF Microscopy bzw. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie) eingebürgert.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe anzugeben, das bei verbesserter Abbildungsqualität eine gute Zugänglichkeit der Probe erlaubt.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:
a. Erzeugen eines Beleuchtungslichtbündels mit einer Lichtquelle, b. räumliches Aufspalten des Beleuchtungslichtbündels mit einem Aufspaltungsmittel in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel, c. Lenken der Teilbeleuchtungslichtbündel durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv, d. Umlenken wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel derart, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht, und e. Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe anzugeben, die bei verbesserter Abbildungsqualität eine gute Zugänglichkeit der Probe erlaubt.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gelöst, die
a. eine Lichtquelle, die ein Beleuchtungslichtbündel erzeugt, b. ein Aufspaltungsmittel, das das Beleuchtungslichtbündel räumlich in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel aufspaltet, c. ein Beleuchtungsobjektiv, das von den Teilbeleuchtungslichtbündeln durchlaufen wird, d. wenigstens ein Umlenkmittel, das wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, derart umlenkt, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht, und e. einem ortsauflösenden Detektor zum Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt, beinhaltet.
Die Erfindung hat den ganz besonderen Vorteil, dass durch die Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster, in der Lichtblatt-Mikroskopie und/oder in der TIRF- Mikroskopie eine Verbesserung der Abbildungsqualität erreicht werden kann. Dies zum einen dadurch, dass durch die Beleuchtung mit einem durch Interferenz wenigstens zweier Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugten Beleuchtungsmusters zumindest eine Hintergrundunterdrückung ermöglicht ist. Insbesondere kann jedoch auch, was weiter unten im Detail beschrieben ist, vorteilhaft sogar eine Auflösungssteigerung erreicht werden. Von ganz besonderem Vorteil ist hierbei, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel, die zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters zur Interferenz gebracht werden, dasselbe Beleuchtungsobjektiv durchlaufen, so dass im Bereich der Probe lediglich ein einziges Beleuchtungsobjektiv vorhanden zu sein braucht, was eine besonders gute Zugänglichkeit der Probe ermöglicht. Es ist zwar grundsätzlich bekannt, in der Weitfeldmikroskopie oder der TIRF- Mikroskopie die laterale Auflösung und den Bildkontrast in einem Mikroskop durch strukturierte Beleuchtung zu erhöhen. Eine Beleuchtung durch das Detektionsobjektiv hat jedoch den Nachteil, dass die möglichen Einfallswinkel und damit die möglichen Perioden des Interferenzmusters durch die numerische Apertur des Detektionsobjektivs sehr beschränkt sind. Eine in der Bildebene isotrope Auflösungssteigerung bzw. entlang aller 3 Raumrichtungen durch eine strukturierte Beleuchtung in der SPIM-Mikroskopie ist bislang unbekannt.
Im Allgemeinen gilt, dass die Auflösungssteigerung von der Periode des Gitters abhängt. Wenn eine Beleuchtung mit einem Gitter durch das Detektionsobjektiv erfolgt, geschieht dies zumeist in der Weise, dass das Beleuchtungslicht unter steilem Winkel gegenüber der optischen Achse in das Probenvolumen in zwei gegenläufigen Richtungen eingestrahlt wird, so dass als Interferenzmuster eine stehende Welle entsteht, deren Periode von dem Winkel 2a zwischen den beiden Strahlen abhängt. Der Winkel a = arcsin(NA/n) hängt dabei insbesondere durch die numerische Apertur (NA) des Detektionsobjektivs und den Brechungsindex des Mediums ab. Typischerweise ist NA < 1 ,2 und damit a < 65 Grad in Wasser (n = 1 ,33). In jedem Fall ist der Winkel a deutlich kleiner als 90 Grad, wobei ein Winkel von 90 Grad optimal wäre, um die minimale Periode des Interferenzmusters zu erreichen. Nachteiligerweise durchleuchten die interferierenden Strahlenbündel bevor und nachdem sie die Fokusebene des Detektionsobjektivs erreichen große Teile der Probe und regen dort, also ober- und unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs (außer bei TIRF) Fluoreszenz an, was ein starkes Hintergrundsignal im Bild bedingt, die Fluorophore der Probe dort unnötig bleicht und die Probe durch fototoxische Effekte schädigt.
Diese Nachteile sind erfindungsgemäß, insbesondere bei einer SPIM-Untersuchung einer Probe, vorteilhaft vermieden bzw. reduziert. Hierbei ist es, insbesondere zur Erzielung einer Auflösungssteigerung, sogar möglich, das Beleuchtungsmuster durch Überlagerung von 2, 3 oder einer noch höheren Zahl von Teilbeleuchtungslichtbündeln zu erzeugen, ohne dass eine gleichhohe Anzahl von Beleuchtungsobjektiven nötig wäre. Die Verwendung einer Vielzahl von Beleuchtungsobjektiven wäre teuer, kompliziert und störungsanfällig. Abgesehen davon ist es kaum möglich, ein zur Erzielung hoher Auflösungen notwendiges Detektionsobjektiv mit mehreren, beispielsweise vier Beleuchtungsobjektiven räumlich so zu kombinieren, dass die Beleuchtungsobjektive die erforderlichen Beleuchtungsteillichtbündel in die Fokusebene des Detektionsobjektivs fokussieren können, weil hochaperturige Objektive einen großen Durchmesser aufweisen und einen kurzen Arbeitsabstand erfordern, so dass es zu einer räumlichen Kollision der Objektive kommet, wenn nicht spezielle und dadurch teure Beleuchtungsobjektive mit besonders großem Arbeitsabstand und typischerweise geringer numerischer Apertur verwendet werden.. Eine weitere Schwierigkeit würde bei der Verwendung einer Vielzahl von Beleuchtungsobjektiven darin bestehen, dass hochaperturige Objektive auch die Polarisation des Lichts manipulieren, so dass es zu einer nicht vollständigen Interferenz der Teilbeleuchtungslichtbündel führt, wodurch zum Beispiel Nullstellen des Beleuchtungsmusters weniger stark ausgeprägt sind und/oder der Kontrast des Beleuchtungsmusters insgesamt abnimmt, was für die Bildqualität nachteilig wäre. Diese Nachteile vermeidet die vorliegende Erfindung.
Insbesondere um eine in der Bildebene isotrop überaufgelöste Abbildung zu erzeugen, können in der Beleuchtungsebene zeitlich nacheinander unterschiedliche und/oder unterschiedlich positionierte und/oder unterschiedlich ausgerichtete Beleuchtungsmuster erzeugt werden, mit denen jeweils derselbe Probenbereich beleuchtet wird. Die Daten der auf diese Weise erzeugten Abbildungen können danach miteinander verrechnet werden, um insgesamt eine Auflösungssteigerung zu erreichen. Hierzu kann ein Beleuchtungsmuster, beispielsweise hinsichtlich einer Gitterkonstanten und/oder hinsichtlich seiner Position und/oder hinsichtlich seiner Ausrichtung, auf unterschiedliche Weise verändert werden, um jeweils ein verändertes Beleuchtungsmuster zu erzeugen.
Beispielsweise ist es möglich, die relative Phase der Teilbeleuchtungslichtbündel zu verändern. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der optische Lichtweg einer Untermenge der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel verändert wird. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, die Einfallsrichtung der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel zu ändern. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils mit unterschiedlich angeordneten Umlenkmitteln oder unterschiedlich angeordneten Umlenkelementen eines Umlenkmittels umgelenkt werden, bevor sie interferieren, so dass die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils aus unterschiedlichen Richtungen einfallen, was weiter unten noch im Detail erläutert ist.
Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass der Einfallswinkel der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel auf die Beleuchtungsebene verändert wird, insbesondere um beispielsweise eine Gitterkonstante zu verändern.
Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich zu dem Beleuchtungsmuster ein weiteres Beleuchtungsmuster erzeugt, das dem Beleuchtungsmuster kohärent oder inkohärent überlagert wird.
Beispielsweise kann ein weiteres Beleuchtungsmuster dadurch erzeugt werden, dass aus dem Beleuchtungslichtbündel wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel abgespalten werden, die in der Beleuchtungsebene miteinander interferieren. Alternativ ist es auch möglich, dass mittels einer weiteren Lichtquelle wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt werden, die in der Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene das weitere Beleuchtungsmuster entsteht.
Auch auf diese Weise kann beispielsweise eine überaufgelöste Abbildung erzeugt werden. Durch die Überlagerung mehrerer Beleuchtungsmuster entsteht in der Beleuchtungsebene insgesamt ein hochfrequentes Beleuchtungsmuster. Wird dann die relative Phase der jeweils zu einem Beleuchtungsmuster gehörenden Teilbeleuchtungslichtbündel geändert, wird dadurch auch die Phase des hochfrequenten Gitters geändert, so dass die jeweils resultierenden Bilddaten als Rohdaten zur Erzeugung bzw. Berechnung einer überaufgelösten und/oder kontrastgesteigerten Abbildung des in der Beleuchtungsebene beleuchteten Probenbereichs verwendet werden können. Hierbei kann insbesondere vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Probe in der Beleuchtungsebene mit mehreren gekreuzten Beleuchtungsgittern, die sich kohärent überlagern beleuchtet wird.
Außer einer kohärenten Überlagerung von Beleuchtungsmustern, insbesondere einer Überlagerung gekreuzter Beleuchtungsgitter, besteht, wie bereits erwähnt, auch die Möglichkeit einer inkohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit wenigstens einem weiteren Beleuchtungsmuster. (Der Hauptunterschied der beiden Überlagerungsarten besteht darin, dass in einem Fall isolierte Maxima erzeugt werden, z. B. zur Anregung, im anderen Fall werden isolierte Minima/Nullstellen erzeugt. Die inkohärente Überlagerung lässt sich als einfache Summe der beiden Gitter verstehen: Die Gitter überlagern sich, ohne dass es durch Interferenz zu irgendwelchen Abweichungen kommt.) Das resultierende Beleuchtungsmuster besitzt dann einerseits einen ringförmigen Charakter. Insbesondere liegen echte Nullstellen dann nur noch im Zentrum bzw. an den Schnittpunkten der (linienförmigen) Nullstellen der beiden gekreuzten Gitter. Bei einer inkohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters mit einem einzigen weiteren, um 90 Grad in der Beleuchtungsebene gedrehten, weiteren Beleuchtungsmuster liegen die echten Nullstellen nur noch im Zentrum der Beleuchtungsebene innerhalb eines Quadrates, das aus vier benachbarten Punkten (Intensitätsmaxima) gebildet ist. Darüber hinaus besitzt ein durch inkohärente Überlagerung erzeugtes Gesamtbeleuchtungsmuster andererseits eine kleinere Periode. Insbesondere lässt sich das durch inkohärente Überlagerung erzeugte Beleuchtungsmuster auch für parallelisierte STED- bzw. RESOLFT-Experimente ausnutzen, wenn zeitlich parallel bzw. abwechselnd Anregungslicht einer anderen, passenden Wellenlänge eingestrahlt wird (bei schaltbaren Fluorophoren abwechselnd, bei STED/RESOLFT-artigen Techniken gleichzeitig).
Insbesondere reizvoll ist auch die Überlagerung von zwei Gittern mit unterschiedlichen Wellenlängen möglich. Mit Licht einer ersten Wellenlänge wird ein Punktgitter durch kohärente Überlagerung erzeugt, dessen Maxima an den Nullstellen eines Gitters liegen, welches mit Licht einer zweiten Wellenlänge erzeugt wurde und durch inkohärente Überlagerung erzeugt wird. Dabei ist die erste Wellenlänge zur Anregung der Fluorophore geeignet, die zweite Wellenlänge zur stimulierten Abregung mittels STED-Prozess bzw. zur Schaltung der Fluorophore mittels RESOLFT wie im weiteren erklärt wird.
Gegenüber Weitfeld-Realisierungen für RESOLFT-Experimente (Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions) bietet die vorliegende Erfindung den ganz besonderen Vorteil in einer höheren Raumfrequenz des resultierenden Beleuchtungsmusters und der hierdurch erzielbaren höheren Auflösung. Darüber hinaus ist bei RESOLFT-Experimenten und bei STED-Experimenten (Stimulated Emission Depletion) wegen der höheren Gitterfrequenz eine höhere Auflösung bei geringeren Beleuchtungslichtleistungen erzielbar. Darüber hinaus bietet die vorliegende Erfindung auch durch effizientere Nutzung des Lichts, da nur in einem schmalen Bereich außerhalb der Beleuchtungsebene beleuchtet wird.
Bei einer ganz besonders voreilhaften Ausführung sind die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als Besselstrahlen ausgebildet. In ganz besonders vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, dass die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als Sectioned-Bessel-Strahlen ausgebildet sind. Insbesondere kann vorerst vorgesehen sein, dass die interferierenden Besselstrahlen, beispielsweise unter Verwendung einer oder mehrerer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung, in der Beleuchtungsebene synchron zueinander hin und her bewegt werden.
Der Hintergrund einer Beleuchtung unter Verwendung von Besselstrahlen oder Sectioned-Bessel-Strahlen ist folgender:
Wenn man das durch eine Ringblende tretende Licht fokussiert, entstehen entlang der optischen Achse im Bereich des Fokus aufgrund konstruktiver Interferenz Intensitätsmaxima. Eine Störung in einem kleinen Teilbereich des ringförmigen Beleuchtungslichtbündels wirkt sich im Bereich des Fokus auf der optischen Achse nahezu gar nicht aus, weil dort das gesamte Beleuchtungslicht interferiert. Ein Ausblenden in einem kleinen Teilbereich außerhalb der optischen Achse hat folglich auf die konstruktive Interferenz nahezu keinen Einfluss. In den Bereichen des Fokus mit einem Axialabstand zur optischen Achse wird eine Störung im Bereich des einfallenden Lichtes dadurch „geheilt", dass das übrige Licht hinter der Störung einen Schattenwurf durch die Störung vermeidet.
Ein mit einer ringförmigen Beleuchtung erzeugter Besselstrahl ist in Bezug auf die optische Achse rotationssymmetrisch. Darüber hinaus weist ein solcher Besselstrahl in einem Querschnitt senkrecht zur optischen Achse Intensitätismaxima in Form konzentrischer Ringe auf, wobei sich auf der optischen Achse das größte Intensitätsmaximum befindet. Blendet man nun von dem im Querschnitt ringförmigen Beleuchtungslicht, insbesondere symmetrisch, Segmente aus, so spricht man von einem „sectioned Bessel beam" (Sectioned-Bessel-Strahl). Beispielsweise könnte man eine Ringblende verwenden, bei der zusätzlich zwei einander spiegelsymmetrisch gegenüberliegende Umfangsbereiche abgedeckt sind. Das Licht tritt dann nur noch durch die zwei dazwischen liegenden Umfangsbereiche der Ringblende. Der Fokus eines solchen „sectioned Bessel beam" ist im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse nicht rotationssymmetrisch. Vielmehr sind bei einem solchen„sectioned Bessel beam" Teile der ursprünglich ringförmigen Intensitätsmaxima ausgeblendet, so dass nebeneinanderliegende, zur optischen Achse konkav ausgerichtete gebogene Intensitätsmaxima in der Form von Ringsegmenten bzw.„sections" verbleiben.
Durch ein laterales Versetzen, beispielsweise unter Verwendung einer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung, um einen Bruchteil der Periode des Gitters eines Sectioned-Bessel-Strahles (beispielsweise um ein Drittel der Gitterperiode), können nacheinander mehrere Abbildungen (zweite drei Abbildungen) erzeugt und jeweils Bilddaten gewonnen werden, aus denen sich eine Gesamtabbildung mit höherem Kontrast errechnen lässt. Alternativ zur Überlagerung von zwei oder mehr senkrecht zueinander ausgerichteten Beleuchtungsmustern ist eine ähnliche Struktur erzeugbar, indem zwei gegeneinander laufende Sectioned- Bessel-Strahlen zur Interferenzen gebracht werden. Insoweit ist eine solche Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzielung einer Auflösungssteigerung und/oder zur Erzielung einer Kontraststeigerung besonders vorteilhaft. Der Hauptvorteil der Sectioned-Bessel-Strahlen besteht darin, dass durch die Überlagerung von lediglich zwei Strahlen aus entgegengesetzten Richtungen ein Gitter erzeugt werden kann. Man benötigt also nur zwei Spiegelkappen bzw. Objektive. Die Möglichkeit, das Gitter auch noch seitlich mittels einen Scan-Spiegels zu versetzen ist nur notwendig, wenn die Breite des Bildfeldes größer ist als die des Sectioned-Bessel-Strahls.
Sollen das Beleuchtungsmuster und das wenigstens eine weitere Beleuchtungsmuster kohärent interferieren, muss zwingend darauf geachtet werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel, die zur Interferenz gebracht werden, dieselbe Polarisation aufweisen. Bei der Verwendung von Umlenkspiegeln als Umlenkelementen ist hierbei zu beachten, dass durch die Reflektion die Linearpolarisationsrichtung des Teilbeleuchtungslichtbündels geändert wird, wenn das auf den Spiegel einfallende Teilbeleuchfungslichfbündel eine parallel zur Einfallsebene ausgerichtete Linearpolarisation aufweist. Im Gegensatz hierzu wird die Linearpolarisationsrichtung nicht verändert, wenn das jeweils einfallende Teilbeleuchtungslichtbündel eine Linearpolarisationsrichtung aufweist, die senkrecht zur Einfallsebene ausgerichtet ist.
Sollen das Beleuchtungsmuster und das wenigstens eine weitere Beleuchtungsmuster inkohärent überlagert werden, so kann dies beispielsweise dadurch erreicht werden, dass diese am Ort der Überlagerung in der Beleuchtungsebene unterschiedliche Polarisationen aufweisen. Beispielsweise überlagern sich zwei senkrecht zueinander ausgerichtete Beleuchtungsmuster inkohärent, die durch vier Teilbeleuchtungslichtbündel (jeweils zwei) erzeugt werden, wobei die Teilbeleuchtungslichtbündel in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs gleich polarisiert sind und die nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs jeweils von einem von vier im Quadrat zueinander ausgerichteten Umlenkspiegel, insbesondere um 90 Grad, in die Beleuchtungsebene umgelenkt werden, da sie, wegen der geschilderten Effekte hinsichtlich der Linearpolarisation bei der Reflexion, nach dem Umlenken in der Beleuchtungsebene senkrecht zueinander stehende Linearpolarisationsrichtungen aufweisen.
Wenn eine inkohärente Überlagerung der Beleuchtungsmuster gewünscht ist, ist es auch möglich, zeitlich gepulst zu beleuchten, wobei die Pulslänge und die Repetitionsrate und der zeitliche Versatz der Lichtpulse des Beleuchtungsmusters relativ zu den Lichtpulsen des weiteren Beleuchtungsmusters so gewählt sind, dass das Beleuchtungsmuster und das weitere Beleuchtungsmuster abwechselnd zu unterschiedlichen Zeiten in der Beleuchtungsebene entstehen.
Alternativ ist es zu Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung auch möglich, das Licht für das Beleuchtungsmuster und für das weitere Beleuchtungsmuster jeweils mit unterschiedlichen Lichtquellen zu erzeugen, weil das Licht unabhängiger Lichtquellen per se keine Kohärenz aufweist.
Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung besteht darin, den Lichtweg der Teilbeleuchtungslichtbündel und den Lichtweg der weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel derart auszugestalten, dass sich die Lichtweglängen um mehr als die Kohärenzlänge voneinander unterscheiden. Beispielsweise könnte das Beleuchtungslicht für das Beleuchtungsmuster unmittelbar ins Probenvolumen eingekoppelt werden, während das Licht für das weitere Beleuchtungsmuster durch eine lange Glasfaser, die länger ist als die Kohärenzlänge, geleitet wird, oder umgekehrt.
Alternativ ist es auch möglich, das Licht zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters und das Licht zur Erzeugung des weiteren Beleuchtungsmusters jeweils in eine polarisationserhaltende Glasfaser einzukoppeln, wobei diese gegeneinander verdreht beziehungsweise nicht gegeneinander verdreht werden. Das Licht der Lichtquelle wird dabei in vier Fasern eingekoppelt, die wiederum das Licht in die Pupille des Beleuchtungsobjektivs einkoppeln. Die Fasern werden dabei jeweils paarweise gegenüberliegend angeordnet und dabei so gedreht, dass das emittierte Licht in der gleichen Richtung polarisiert ist. Mit dieser Anordnung ist es in einfacher Weise möglich zwischen kohärenter Überlagerung der gekreuzten Gitter und inkohärenter Überlagerung zu wechseln indem die einzelnen Fasern des einen Paares gegenüberliegender Fasern jeweils um 90 Grad um ihre eigene Achse gedreht werden (und zwar nur an einem Ende gegenüber dem anderen der Faser).
Als weitere Alternative ist es zur Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung auch möglich, einen Modulator, beispielsweise einen AOM (Acusto Optical Mudulator) oder ein AOD (Acusto Optical Deflector) zu verwenden um damit die Frequenz des Beleuchtungslichts der Teilbeleuchtungslichtbündel so zu manipulieren, dass sie nicht mehr mit dem unmanipulierten Licht der weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel interferieren. Der Modulator sollte dabei in der Lage sein, beispielsweise durch Photon-Photon-Wechselwirkung die Frequenz des Lichts zu schieben.
Ist hingegen eine kohärente Überlagerung gewünscht, kann die Linearpolarisationsrichtung der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel eines der Beleuchtungsmuster, beispielsweise mittels einer Lambda/2-Platte, gedreht werden. Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung wird hierzu eine Phasenplatte mit vier Quadranten verwendet, wobei zwei diagonal gegenüberliegende Quadranten die Linearpolarisationsrichtung nicht beeinflussen, während die beiden anderen diagonal gegenüberliegenden Quadranten jeweils als Lambda/2 Phasenplatten ausgeführt sind. Beispielsweise können die das Beleuchtungsmuster erzeugenden Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils durch einen von zwei diagonal gegenüberliegenden Quadranten verlaufen, während die das weitere Beleuchtungsmuster erzeugenden weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils durch einen der beiden anderen diagonal gegenüberliegenden Quadranten verlaufen.
Die Phasenplatte kann vorteilhaft in einer zur Fokusebene des Beleuchtungsobjektivs konjugierten Ebene angeordnet sein. Alternativ zu einer Phasenplatte ist es auch möglich, die Polarisation mittels aktiven optischen Bauteilen, wie beispielsweise einem SLM (spatial light modulator), insbesondere einem ferroelektrischen SLM, oder beispielsweise mittels eines LcoS-Bauteils („Liquid crystal on Silicon"-Bauteils) zu beeinflussen. Die Verwendung derartiger Bauteile hat den ganz besonderen Vorteil, dass die Polarisation ortsabhängig und individuell gesteuert verändert werden kann. Auf diese Weise kann vorteilhaft einfach, schnell und zuverlässig eine Veränderung des Beleuchtungsmusters und/oder des wenigstens einem weiteren Beleuchtungsmusters erreicht werden und/oder schnell von einer kohärenten Überlagerung der Beleuchtungsmuster zu einer inkohärenten Überlagerung der Beleuchtungsmuster umgeschaltet werden.
Wie oben bereits erläutert, kann die Bildaufnahme mehrerer Abbildungen jeweils bei strukturierter Beleuchtung mit dem Beleuchtungsmuster und/oder dem weiteren Beleuchtungsmuster durch sukzessives Verschieben des jeweiligen Beleuchtungsmusters in der Beleuchtungsebene erfolgen. Hierzu kann die relative Phase der das Beleuchtungsmuster erzeugenden Teilbeleuchtungslichtbündel oder der das weitere Beleuchtungsmuster erzeugenden weiteren
Teilbeleuchtungslichtbündel verändert werden. Dies ist beispielsweise durch Verändern der Länge des Lichtwegs einer Untermenge der jeweils interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel beziehungsweise weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel möglich. Eine Veränderung der Länge des Lichtwegs kann beispielsweise mittels eines aktiven Spiegels, der beispielsweise mit einem Piezoelement verschoben werden kann, erreicht werden. Alternativ oder zusätzlich ist auch die Verwendung eines akustooptischen Elements möglich. Als weitere Alternative ist es zur Veränderung des Lichtwegs auch möglich, wahlweise unterschiedliche optische Elemente mit unterschiedlicher Dicke und/oder unterschiedlicher optischer Dichte in den Strahlengang einzubringen. Es ist auch möglich, räumliche Lichtmodulatoren (SLM) oder Digital Mirror Devices (DMD) oder Deformable Mirrors (DM) zur Veränderung des Lichtweges zu verwenden. Das Aufspaltungsmittel kann beispielsweisen einen einfachen Strahlteiler oder einen Polarisationsstrahlteiler aufweisen. Bei einer besonderen Ausführung weist das Aufspaltungsmittel ein Phasengitter auf. Eine solche Ausführung ist besonders vorteilhaft, weil ein weitgehend symmetrischer Strahlengang für die unterschiedlichen Teilbeleuchtungslichtbündel erreicht werden kann.
Das Umlenkmittel kann beispielsweise einen oder mehrere Spiegel (Umlenkspiegel) als Umlenkelemente aufweisen. Insbesondere können die Spiegel eben ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass ein oder mehrere Spiegel gekrümmt ausgebildet sind. Es ist, alternativ oder zusätzlich, auch möglich, dass das Umlenkmittel wenigstens ein Prisma aufweist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft ein Umlenkmittel aufweisen, das das Beleuchtungslichtbündel, nachdem es das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat, derart umlenkt, dass das Beleuchtungs-lichtbündel in der Beleuchtungsebene verläuft. Insbesondere kann das Umlenkmittel derart angeordnet sein, dass das umgelenkte Beleuchtungslichtbündel einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs und/oder des Detektionsobjektivs aufweist. Insbesondere kann die Beleuchtungsebene senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausgerichtet sein.
Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das, insbesondere zu einem Lichtblatt geformte, Beleuchtungslichtbündel zunächst in vertikaler Richtung durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und anschließend in horizontale Richtung mit der Umlenkeinrichtung umgelenkt wird, um die Probe in der Probenebene entlang des Beleuchtungsstreifens zu beleuchten. Vorzugsweise verläuft das von dem Beleuchtungsstreifen ausgehende Detektionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, in vertikaler Richtung durch ein Detektionsobjektiv. Ein solcher Aufbau ermöglicht die Verwendung von aufrechten oder inversen Standard-Mikroskopstativen zur Herstellung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung. Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung ist vorgesehen, dass das Beleuchfungsobjekfiv und die Umlenkeinrichfung, die beispielsweise einen oder mehrere Umlenkspiegel aufweisen kann, relativ zueinander beweglich angeordnet sind, um das Beleuchtungslichtbündel relativ zur Probe bewegen zu können. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass die Umlenkeinrichtung, insbesondere beweglich, an dem Detektionsobjektiv oder dem Beleuchtungsobjektiv befestigt und/oder angeordnet ist.
Bevorzugt wird das Beleuchtungsmuster und/oder das weitere Beleuchtungsmuster zur Fluoreszenzanregung der Probe in der Probenebene verwendet. Alternativ oder zusätzlich wird die Probenebene gleichzeitig homogen mit Abregungslicht beaufschlagt.
Ganz besonders bevorzugt wird das Beleuchtungsmuster zum Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet.
Grundsätzlich kann die Gitter-Beleuchtung in besonders günstiger Weise auch für RESOLFT-ähnliche Effekte verwendet werden (z.B. STED ,stimulated emission depletion' oder für GSD ,Ground State Depletion'). Der Unterschied zur strukturierten Beleuchtung zur Fluoreszenzanregung liegt darin, dass eine strukturierte oder nicht strukturierte Beleuchtung zur Fluoreszenzanregung mehr oder weniger Zeitgleich (z.B. versetzt bei GatedSTED) mit einer weiteren strukturierten Beleuchtung (auf einer anderen Wellenlänge) in der Probe überlagert wird. Beispielsweise könnte ein „gewöhnliches" z.B. blaues Lichtblatt in die Probe eingestrahlt und mit einem z.B. roten „Gitter" überlagert werden, wobei das rote Gitter dazu führt, dass dort die Fluorophore entweder stimuliert abgeregt werden oder in einem Dunkelzustand gehalten werden oder durch Konformationsänderung in einen nicht von dem blauen Lichtblatt anregbaren Zustand überführt werden, wobei durch die ,rote' Beleuchtung immer effektiv die Emission von Fluoreszenz in Richtung Detektor unterdrückt wird.
Gemäß einer Variante kann dazu auch das Anregungslicht eine Gifterform haben. Die Maxima der Anregung müssten dann in den Minima der Abregung liegen. Problematisch hierbei ist, dass die Lichtstrahlen unterschiedliche Wellenlängen aufweisen und daher sich nicht die gleiche Gitterperiode einstellt, wenn die Gitter auf die gleiche Weise erzeugt werden. Als Lösung bietet es sich daher an, die Periode des Gitters mit der kürzeren Periode zu strecken, um es an die Periode des längeren Gitters anzupassen. Dies ist möglich, indem die beiden gegenläufigen Lichtstrahlen, die das Gitter erzeugen sollen, innerhalb der beleuchteten Ebene gegeneinander verkippt werden (also nicht unter einem Winkel von 180° gegenläufig sind, sondern z.B. unter einem Winkel von 160° gegenläufig sind).
Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass die hier beschriebenen Konzepte bezüglich der Schaltbarkeit der Fluoreszenzfarbstoffe und/oder die Konzepte um die RESOLFT, STED, GatedSTED und/oder GSD einerseits im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und andererseits auch losgelöst von der konkreten Merkmalskombination der vorliegenden Erfindung gemäß den ursprünglich formulierten unabhängigen Ansprüchen realisiert werden können. Insbesondere ist es im letztgenannten Fall nicht erforderlich, dass der Teilbeleuchtungslichtbündel durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv gelenkt wird und/oder dass wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel derart umgelenkt werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht.
Eine Vorrichtung, die geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, kann vorteilhaft auf der Basis eines Rastermikroskops, insbesondere eines konfokalen Rastermikroskops, aufgebaut sein. Hierbei bietet sich insbesondere die Verwendung eines inversen Mikroskopstatives an. Von besonderem Vorteil ist insoweit die Verwendung eines (möglicher-weise in einem Labor ohnehin vorhandenen) Rastermikroskops zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel eines Details einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, Fig. 2 schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 3 schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 4 schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters mit drei weiteren Beleuchtungsmustern bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 5 die Lichtverteilung bei der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 6 die Lichtverteilung bei der kohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters,
Fig. 7 die Lichtverteilung bei der inkohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters,
Fig. 8 das Interferenzmuster zweier einender entgegenlaufender Sectioned-Bessel- Strahlen, Fig. 9 schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als TIRF- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung, und
Fig. 10 eine Detailansicht der in Fig. 9 dargestellten Vorrichtung. Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Details einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung beinhaltet ein Aufspaltungsmittel 1 , das ein Beleuchtungslichtbündel 2 räumlich in zwei Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 aufspaltet. Die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 durchlaufen eine Linse 5, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 fokussiert und eine Tubuslinse 6, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 kollimiert und in entgegengesetzter Richtung gegen die optische Achse verkippt in die Eintrittspupille eines Beleuchtungsobjektivs 7 koppelt.
Nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs 7 treffen die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 jeweils auf einen von zwei einander gegenüberliegend an einem Detektionsobjektiv 8 angeordneten Umlenkspiegeln 9, 10 eines Umlenkmittels, das die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 derart umlenkt, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 in einer Beleuchtungsebene 1 1 , die gleichzeitig die Fokalebene des Detektionsobjektivs 8 ist, miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene 1 1 ein Beleuchtungsmuster entsteht.
Fig. 2 zeigt schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters 12 in einem Probenvolumen 34 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs 7 umgelenkt werden, so dass sie in der Beleuchtungsebene sich mit entgegengesetzten Ausbreitungsrichtungen ausbreiten. Die vertikalen Linien zwischen den Umlenkspiegeln zeigen beispielhaft die Positionen der Maxima/Minima einer sich ausbildenden stehenden Welle für zwei gegenläufige Strahlbündel mit ebener Phasenfront wie sie für in SPIM-Mikroskopen übliche Beleuchtungsstrahlen, auch Lichtblätter genannt, in guter Näherung aufweisen.
Fig. 3 zeigt schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters 12 und eines weiteren Beleuchtungsmusters 13 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 13 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden weiteren Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 14, 15, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Durch die Überlagerung und Interferenz des Beleuchtungsmusters 12 mit dem weiteren Beleuchtungsmusters 13 entsteht im Zentrum ein Punktgitter 1 6. Fig. 4 zeigt schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters 12 mit drei weiteren Beleuchtungsmustern 13, 1 7, 18 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Es sei an dieser Stelle betont, dass es sich bei Fig. 4 nicht zwingend um eine Darstellung eines realen Umlenkmittels handelt, sondern vielmehr ebenfalls die Möglichkeit einer zeitlichen Integration zeigt, die bspw. durch Einsatz eines drehbaren Umlenkmittels umgesetzt werden kann: Die in der Figur gezeigten Umlenkspiegel können fest verbaut sein, aber sie müssen nicht alle im Aufbau vorhanden sein. Insbesondere kann auch ein bewegliches Paar von Umlenkspiegeln 9, 10 derart verdrehbar vorgesehen sein, dass es nacheinander die Positionen der Umlenkspiegel 9,10 und dann 21 , 22 und dann 14, 15 und dann 19, 20 einnehmen kann oder eine beliebige Zahl von beliebigen anderen Positionen. Idealerweise wird ein streifenförmiges Beleuchtungsmuster 12 dabei zwei Mal um jeweils um Winkel von 60 Grad verdreht um eine in der Ebene 1 1 isotrope Auflösungserhöhung zu erreichen. Dies geschieht während der Belichtung eines einzigen Bildes der Kamera.
Wenn mehrere Spiegel fest verbaut sind und deren Gitter sich überlagern führt das zu komplexen Beleuchtungsmustern. Diese würden dann strukturierte Beleuchtung höherer Ordnungen ermöglichen. Wenn das Beleuchtungsmuster kein regelmäßiger Sinus ist, dann muss man das Gitter mehr als zwei Mal verschieben und mehr als drei Bilder aufnehmen, erhält aber auch eine höhere Steigerung der Auflösung.
Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 13 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden (weiteren) Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 14, 15, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden
Das weitere Beleuchtungsmuster 17 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 19, 20 (oder Umlenkspiegeln 9, 1 0 die an die Position von 19, 20 gedreht wurden), nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 18 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden weiteren Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 21 , 22, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden.
Durch die Überlagerung des Beleuchtungsmusters 12 und mit den weiteren Beleuchtungsmustern 1 3, 1 7, 18 entsteht im Zentrum ein Punktgitter 23. Es kann auch eine Untergruppe z.B. von 12 und 1 3 oder 1 7 und 18 zur Überlagerung gebracht werden.
Fig. 5 zeigt die Lichtverteilung bei der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Konkret zeigt Fig. 5 in der oberen Zeile ein in der Beleuchtung eben erzeugtes Beleuchtungsmuster in drei verschiedenen Ansichten. In der linken Darstellung ist eine Ansicht der Beleuchtungsebene 1 1 mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Detektionsobjektivs (Z-Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung (Ausbreitungsrichtung der Strahlen des ersten Beleuchtungsmusters) und mit einer Blickrichtung entlang der zu X und Z senkrecht verlaufenden Y-Richtung (Ausbreitungsrichtung der Strahlen des zweiten Beleuchtungsmusters).
Fig. 5 zeigt in der mittleren Zeile ein in der Beleuchtung eben erzeugtes weiteres Beleuchtungsmuster in den drei verschiedenen Ansichten wie in der oberen Zeile. In der linken Darstellung ist eine Ansicht mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Detektionsobjektivs (Z-Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung und mit einer Blickrichtung entlang der Y-Richtung. Das weitere Beleuchtungsmuster ist in der Beleuchtung eben nur relativ zu dem in der oberen Zeile gezeigten Beleuchtungsmuster um 90 Grad gedreht. Fig. 5 zeigt in der unteren Zeile das Resultat der kohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit dem weiteren Beleuchtungsmuster in den drei verschiedenen Ansichten wie in der oberen Zeile. In der linken Darstellung ist eine Ansicht mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Direktionsobjektivs (Z- Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung und mit einer Blickrichtung entlang der Y-Richtung.
Fig. 6 zeigt vergrößert die Lichtverteilung der kohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit dem weiteren Beleuchtungsmuster, wie es bereits in der unteren Zeile der Figur 5 dargestellt ist.
Fig. 7 zeigt die Lichtverteilung, die bei der inkohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters und des weiteren Beleuchtungsmusters entsteht. Fig. 8 zeigt das Interferenzmuster zweier einander entgegenlaufender Sectioned- Bessel-Strahlen. Beispielsweise durch Verändern der Phase und der lateralen Position der sich überlagernden Sectioned-Bessel-Strahlen kann das Interferenzmuster sukzessive geändert werden, um mehrere Abbildungen zu generieren, aus deren Bilddaten sich im Ergebnis ein Bild mit höherem Kontrast und höherer Auflösung errechnen lässt.
Fig. 9 zeigt schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als TIRF- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung weist ein Beleuchtungsobjektiv 7 und ein Detektionsobjektiv 8 auf, zwischen denen eine zu untersuchende Probe 24 in einer Untersuchungsposition angeordnet ist. Die Probe 24 steht mit einem optisch transparenten Medium 25 in Kontakt, das einen höheren Brechungsindex aufweist als die Probe 24. Die Probe kann dabei auch auf einem Deckglas präpariert sein, welches mit dem optisch transparenten Medium 25 in Kontakt steht, wobei im Zwischenraum ein Immersionsmedium zur Minimierung von Sprüngen im Brechungsindex eingefügt werden kann.
Zwei Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 gelangen über eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 26, eine Scanlinse 27 und eine Tubuslinse 28 zu dem Beleuchtungsobjektiv 7, durchlaufen dieses und werden anschließend von einem Umlenkmittel 29, das zwei Umlenkelemente 30, 31 aufweist und an dem Detektionsobjektiv 8 befestigt ist, umgelenkt. Das Umlenkmittel 29 weist ein erstes Umlenkelement 30 und ein zweites Umlenkelement 31 auf, wobei das optisch transparente Medium 25 (neben seiner Funktion, eine ebene Grenzfläche zur Probe 24 bereit zu stellen) auch ein weiteres Umlenkelement bildet. Die Umlenkelemente 30, 31 und die Eintrittsfenster des optisch transparenten Mediums 25 lenken die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 jeweils nacheinander mit Ablenkwinkeln unterschiedlichen Vorzeichens und unterschiedlicher Beträge um.
An der Grenzfläche 32 zwischen dem optisch transparenten Medium 25 und der Probe 24 werden die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 zur evaneszenten Beleuchtung der Probe 24 totalreflektiert. Das evaneszente Feld 33 ragt in die Probe 24 und führt dort zu einer optischen Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen.
Das von der Probe 24 ausgehende Fluoreszenzlicht gelangt durch das Detektionsobjektiv 8 hindurch und wird auf die aktive Fläche eines (nicht dargestellten ortsauflösenden Detektors fokussiert, der beispielsweise als Flächendetektor ausgebildet ist.
Die Strahlablenkeinrichtung 26 weist einen kardanisch aufgehängten Spiegel auf, der es ermöglicht, dass die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 in zwei zueinander senkrechten Ebenen mit jeweils beliebigem Ablenkwinkel ablenken zu können. Auf diese Weise können die räumliche Lage und die Ausbreitungsrichtung der aus dem Beleuchtungsobjektiv 7 austretenden Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 weitgehend frei eingestellt werden. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 statt auf die Umlenkelemente 30, 31 auf ein anderes Paar von Umlenkmitteln zu lenken, beispielsweise um die Ausrichtung des Beleuchtungsmusters zu ändern.
Alternativ zu einem kardanisch aufgehängten Spiegel 26 könnte die Strahlablenkeinrichtung beispielsweise auch mindestens zwei optisch in Reihe geschaltete Ablenkelemente, insbesondere Ablenkspiegel, aufweisen, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 in zueinander senkrechten Ablenkebenen ablenken können. Die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 werden aus einem Beleuchtungslichtbündel 2 mithilfe eines Aufspaltungsmittels 1 , das beispielsweise als Gitter ausgebildet sein kann, erzeugt.
Alternativ oder zusätzlich ist es bspw. auch vorstellbar, dass das Aufspaltungsmittel 1 um eine Achse drehbar oder kardanisch gelagert ist und sich die Drehbarkeit der Strahlablenkeinrichtung 26 ggf. auf nur eine Achse beschränkt, solange die freie Ausrichtbarkeit der Teilbeleuchtungslichtbündel gewährleistet bleibt.
Fig. 10 zeigt eine Detailansicht des Probenbereichs der in Fig. 9 dargestellten Vorrichtung und insbesondere die Lichtwege der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 im Bereich der Probe 24.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken. Insbesondere sind sämtliche, in dieser Beschreibung enthaltenen Merkmale und/oder deren Funktionen, Wirkungen und Eigenschaften für sich gesehen und/oder in Kombination miteinander als hierin offenbart anzusehen, die ein auf dem vorliegenden Gebiet tätiger Fachmann ggf. unter Hinzuziehung seines Fachwissens einzeln oder in Kombination zur Lösung der objektiven Aufgabe oder damit zusammenhängenden Problemstellungen vorsehen würde.
Bezuqszeichenliste:
1 Aufspal†ungsmi††el
2 Beleuchtungslichtbündel
3 Teilbeleuchtungslichtbündel 4 Teilbeleuchtungslichtbündel
5 Linsen
6 Tubuslinse
7 Beleuchtungsobjektiv
8 Detektionsobjektiv
9 Umlenkspiegel
10 Umlenkspiegel
1 1 Beleuchtungsebene
12 Beleuchtungsmuster
13 weiteres Beleuchtungsmuster 14 weiterer Umlenkspiegel
15 weiterer Umlenkspiegel
1 6 Punktgitter
1 7 weiteres Beleuchtungsmuster
18 weiteres Beleuchtungsmuster 19 weiterer Umlenkspiegel
20 weiterer Umlenkspiegel
21 weiterer Umlenkspiegel
22 weiterer Umlenkspiegel
23 Punktgitter
24 Probe
25 optisch transparentes Medium
26 Strahlablenkeinrichtung
27 Scanlinse
28 Tubuslinse
29 Umlenkmittel
30 Umlenkelement
31 Umlenkelement
32 Grenzfläche
33 evaneszentes Feld
34 Probenvolumen

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Untersuchen einer Probe (24), insbesondere in der Lichtblatt- Mikroskopie, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a. Erzeugen eines Beleuchtungslichtbündels (2) mit einer Lichtquelle, b. räumliches Aufspalten des Beleuchtungslichtbündels (2) mit einem Aufspaltungsmittel (1 ) in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), c. Lenken der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv (7), d. Umlenken wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv (7) durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel (27) derart, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) in einer Beleuchtungsebene (1 1 ) miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) ein Beleuchtungsmuster (12) entsteht, und e. Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster (12) beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv (8) zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) nacheinander unterschiedliche und/oder unterschiedlich positionierte und/oder unterschiedlich ausgerichtete Beleuchtungsmuster (12), 13) erzeugt werden und dabei jeweils wenigstens eine Abbildung des von dem Beleuchtungsmuster (12,13) beleuchteten Probenbereichs erzeugt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die nacheinander erzeugten Abbildungen miteinander verrechnet werden und/oder dass die nacheinander erzeugten Abbildungen miteinander zu einer überaufgelösten und/oder kontrastgesteigerten Abbildung verrechnet werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche und/oder unterschiedlich positionierte und/oder unterschiedlich ausgerichtete Beleuchtungsmuster (12, 13) durch a. Verändern der Phase der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) erzeugt werden und/oder durch b. Verändern der Einfallsrichtung der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder durch c. Verändern des Einfallswinkels der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) auf die Beleuchtungsebene (1 1 ) erzeugt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass a. aus dem Beleuchtungslichtbündel (2) wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt werden, die in der Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) ein weiteres Beleuchtungsmuster (13) entsteht, oder dass b. mittels einer weiteren Lichtquelle wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt werden, die in der Beleuchtungsebene (1 1 ) miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) ein weiteres Beleuchtungsmuster (13) entsteht.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Beleuchtungsmuster (12) und das weitere Beleuchtungsmuster (13) in der Beleuchtungsebene (1 1 ) kohärent überlagert werden oder dass b. das Beleuchtungsmuster (12) und das weitere Beleuchtungsmuster (13) in der Beleuchtungsebene (1 1 ) inkohärent überlagert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass a. die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als Bessel-Strahlen ausgebildet sind und/oder dass b. die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als sectioned Bessel- Strahlen ausgebildet sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass a. jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder jedes weitere Teilbeleuchtungslichtbündel als Lichtblatt ausgebildet ist, und/oder dass b. jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (3) und/oder jedes weitere Teilbeleuchtungslichtbündel (4) in die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs (7) fokussiert wird, und/oder dass c. die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel unter unterschiedlichen Einfallswinkeln und/oder an unterschiedlichen Positionen in die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs (7) fokussiert werden.
9. Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel nach dem Umlenken innerhalb der Beleuchtungsebene (1 1 ) mit unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen propagieren, und/oder dass b. zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel nach dem Umlenken innerhalb der Beleuchtungsebene (1 1 ) mit einander entgegengesetzten Ausbreitungsrichtungen propagieren, und/oder dass c. die Beleuchtungsebene (1 1 ) einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) aufweist, und/oder dass d. die Beleuchtungsebene (1 1 ) senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) ausgerichtet ist, und/oder dass e. die Beleuchtungsebene (1 1 ) einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (8) aufweist, und/oder dass f. die Beleuchtungsebene (1 1 ) senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (8) ausgerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (24) mit einem optisch transparenten Medium (25) in Kontakt steht, das einen höheren Brechungsindex aufweist als die Probe (24) und dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel auf der Grenzfläche zwischen dem optisch transparenten Medium (25) und der Probe (24) zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters (12) interferieren und dort zur evaneszenten Beleuchtung der Probe (24) totalreflektiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Umlenkmittel (29) oder wenigstens eines von mehreren Umlenkelementen des Umlenkmittels (29) an dem Detektionsobjektiv (8) oder an dem Beleuchtungsobjektiv (7) - insbesondere verdrehbar - angeordnet und/oder befestigt sind, und/oder dass b. das Umlenkmittel (29) mehrere Umlenkelemente aufweist, die unterschiedlich ausgerichtet sind, und/oder dass c. und dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder weiteres Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils mittels eines eigenen Umlenkelements umgelenkt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Umlenkmittel (29) wenigstens einen Umlenkspiegel (9) aufweist und/oder dass wenigstens eines von mehreren Umlenkelementen des Umlenkmittels (29) als Umlenkspiegel (9, 10) ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) und die optische Achse des Detektionsobjektivs (8) zueinander (anti-) parallel oder koaxial ausgerichtet sind und/oder dass das Detektionsobjektiv (8) und das Beleuchtungsobjektiv (7) einander entgegengesetzt und einander gegenüberliegend ausgerichtet sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsmuster (12) und/oder das weitere Beleuchtungsmuster (13) zur Fluoreszenzanregung der Probe (24) in der Probenebene verwendet werden und dass die Probenebene gleichzeitig homogen mit Abregungslicht beaufschlagt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungsmuster (12) zum Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet wird.
16. Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe (24), insbesondere in der Lichtblatt- Mikroskopie, beinhaltend: a. eine Lichtquelle, die ein Beleuchtungslichtbündel (2) erzeugt, b. ein Aufspaltungsmittel, das das Beleuchtungslichtbündel (2) räumlich in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) aufspaltet, c. ein Beleuchtungsobjektiv (7), das von den Teilbeleuchtungslichtbündeln (3, 4) durchlaufen wird, d. wenigstens ein Umlenkmittel (29), das wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv (7) durchlaufen haben, derart umlenkt, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) in einer Beleuchtungsebene (1 1 ) miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) ein Beleuchtungsmuster (12) entsteht, und e. einem ortsauflösenden Detektor zum Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster (12) beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv (8) zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass in der Beleuchtungsebene (1 1 ) nacheinander unterschiedliche und/oder unterschiedlich positionierte und/oder unterschiedlich ausgerichtete Beleuchtungsmuster (12, 13) erzeugbar sind und dabei jeweils wenigstens eine Abbildung des von dem Beleuchtungsmuster (12, 13) beleuchteten Probenbereichs erzeugbar ist, wobei eine Verrechungsvorrichtung die nacheinander erzeugten Abbildungen miteinander verrechnet und/oder wobei eine Verrechungsvorrichtung die nacheinander erzeugten Abbildungen miteinander zu einer überaufgelösten und/oder kontrastgesteigerten Abbildung verrechnet.
18. Vorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, gekennzeichnet durch a. ein Phasenveränderungsmittel zum Verändern der Phase der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4), und/oder durch b. wenigstens eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung (26) zum Verändern der Lage und/oder der Ausrichtung wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündels (3, 4).
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Aufspaltungsmittel (1 ) zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel abspaltet, die in der Beleuchtungsebene (1 1 ) miteinander interferieren, so dass in einer Beleuchtungsebene (1 1 ) ein weiteres Beleuchtungsmuster (13) entsteht, oder dass b. eine weitere Lichtquelle zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt, die in der Beleuchtungsebene (1 1 ) miteinander interferieren, so dass in einer Beleuchtungsebene (1 1 ) ein weiteres Beleuchtungsmuster (13) entsteht.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass a. sich das Beleuchtungsmuster (12) und das weitere Beleuchtungsmuster (13) in der Beleuchtungsebene (1 1 ) kohärent überlagern oder dass b. sich das Beleuchtungsmuster (12) und das weitere Beleuchtungsmuster (13) in der Beleuchtungsebene (1 1 ) inkohärent überlagern.
21 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass α. die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel (3, 4) und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel als Bessel- Strahlen ausgebildet sind und/oder dass b. die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel (3, 4) und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel als Sectioned- Bessel- Strahlen ausgebildet sind.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass a. wenigstens eine astigmatische Optik zum Ausbilden des Beleuchtungslichtbündels (2) und/oder der Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) jeweils als Lichtblatt vorhanden ist, und/oder dass b. eine Optik vorhanden ist, die jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder jedes weitere Teilbeleuchtungslichtbündel in die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs (7) fokussiert, und/oder dass c. wenigstens eine Optik vorhanden ist, die die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel unter unterschiedlichen Einfallswinkeln und/oder an unterschiedlichen Positionen in die Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs (7) fokussiert.
23. Vorrichtung nach einer der Ansprüche 1 6 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel nach dem Umlenken innerhalb der Beleuchtungsebene (1 1 ) mit unterschiedlichen Ausbreitungsrichtungen propagieren, und/oder dass b. zwei Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel nach dem Umlenken innerhalb der Beleuchtungsebene (1 1 ) mit einander entgegengesetzten Ausbreitungsrichtungen propagieren, und/oder dass c. die Beleuchtungsebene (1 1 ) einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) aufweist, und/oder dass d. die Beleuchtungsebene (1 1 ) senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) ausgerichtet ist, und/oder dass e. die Beleuchtungsebene (1 1 ) einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (8) aufweist, und/oder dass f. die Beleuchtungsebene (1 1 ) senkrecht zur optischen Achse des Detektionsobjektivs (8) ausgerichtet ist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (24) mit einem optisch transparenten Medium (25) in Kontakt steht, das einen höheren Brechungsindex aufweist als die Probe (24) und dass die Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder die weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel auf der Grenzfläche zwischen dem optisch transparenten Medium (25) und der Probe (24) zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters (12) interferieren und dort zur evaneszenten Beleuchtung der Probe (24) totalreflektiert werden.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Umlenkmittel (29) oder wenigstens eines von mehreren Umlenkelementen des Umlenkmittels (29) an dem Detektionsobjektiv (8) oder an dem Beleuchtungsobjektiv (7) angeordnet und/oder befestigt sind, und/oder dass b. das Umlenkmittel (29) mehrere Umlenkelemente aufweist, die unterschiedlich ausgerichtet sind, und/oder dass c. und dass jedes Teilbeleuchtungslichtbündel (3, 4) und/oder weiteres Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils mittels eines eigenen Umlenkelements umgelenkt wird.
26. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Umlenkmittel (29) wenigstens einen Umlenkspiegel (9) aufweist und/oder dass wenigstens eines von mehreren Umlenkelementen des Umlenkmittels (29) als Umlenkspiegel (9, 10) ausgebildet ist. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs (7) und die optische Achse des Detektionsobjektivs (8) zueinander parallel oder koaxial ausgerichtet sind und/oder dass das Detektionsobjektiv (8) und das Beleuchtungsobjektiv (7) einander entgegengesetzt und einander gegenüberliegend ausgerichtet sind.
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