DE19858447A1

DE19858447A1 - Verfahren zur Isolierung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE19858447A1
Application number: DE19858447A
Authority: DE
Inventors: Timo Dr Hillebrand; Peter Dr Bendzko
Original assignee: Invitek GmbH
Current assignee: Invitek Gesellschaft fuer Biotechnik und Biodesign mbH
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-18
Publication date: 1999-07-01
Also published as: AU2509799A; WO1999032616A3; WO1999032616A2; JP2001526888A; EP1037973A2; CA2315257A1

Description

Die Erfindung betrifft ein einfaches und extrem schnelles Verfahren zur Isolierung und Reinigung großer Mengen von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien. Es ist für eine Vielzahl von biologisch-, molekularbiologisch-, forensisch-, medizinisch- analytisch- sowie biochemisch arbeitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die forensische Medizin, medizinische Diagnostik, Molekularbiologie, Biochemie, Gentechnik und alle anderen angrenzenden Gebiete.

Alle kommerziell verfügbaren Kits basieren auf dem hinlänglich bekannten Prinzip der Bindung von Nukleinsäuren an mineralische Träger unter Anwesenheit von Lösungen unterschiedlicher chaotroper Salze und verwenden als Trägermaterialien Suspensionen feingemahlener Glaspulver (z. B. Glasmilk, BIO 101, La Jolla, CA), Diatomenerden (Fa. Sigma) oder auch Silicagele. (Diagen, DE 41 39 664 A1).

Ein für eine Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen praktikables Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren ist in US 5,234,809 (Boom) dargestellt. Dort ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch die Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase beschrieben. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials wie auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu Isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren zu entwickeln, insbesondere von Plasmid-DNS, vorzugsweise aus unterschiedlichsten Ausgangsmengen, welches zu isolierten Nukleinsäuren führt, die den hohen Qualitätsparametern nachfolgender Applikationen gerecht werden, extrem einfach in der Durchführung, schnell und kostengünstig ist.

Die Aufgabe wurde gemäß den Ansprüchen realisiert, erfindungsgemäß durch ein kombiniertes Batch-Säulenverfahren, indem die Nukleinsäurebindung an mineralische Trägermaterialien als Batch-Verfahren erfolgt und man die gebundenen Nukleinsäuren danach chromatographisch aufbereitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien ist gekennzeichnet durch

- Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,
- Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,
- Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,
- Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel überraschend auf der Membran zurückbleiben.

Als bevorzugte Ausgangsmaterialien, die Nukleinsäuren enthalten, kommen komplexe biologische Systeme, wie z. B. Blut, Gewebe, Urin oder Stuhlproben, die gegebenenfalls an festen Materialien gebunden sind, in Frage. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch auch für die Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus anderen Ausgangsmaterialien geeignet, wie z. B. aus bakteriellen Lysaten, pflanzlichen Komponenten, von DNS-Fragmenten aus PCR-Ansätzen oder aus Agarosegelen.

Bevorzugte Trägermaterialien sind Siliziumverbindungen, wie z. B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren oder Silicagele. Die erfindungsgemäß eingesetzten Siliciumverbindungen weisen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, auf.

Die Lyse der Ausgangsstoffe und die anschließende Inkubation mit den Trägermaterialien erfolgt in einem Puffersystem, das chaotrope Salze aufweist. Chaotrope Salze sind z. B. Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff- vorzugsweise in Konzentrationen 1 bis 10 M.

Als die Lyse fördernde Komponenten werden Detergentien wie z. B. TritonX-100, Tween, N-Lauryl-Sarcosyl, SDS und/oder CTAB, ggf. Protein-abbauende Enzyme, wie z. B. Proteinasen eingesetzt.

Erfindungsgemäß werden zur Separierung der verwendeten mineralischen Trägermaterialien Membranen verwendet, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die der eingesetzten Trägermaterialien, vorzugsweise in Zentrifugationskartuschen, wobei man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert. Bevorzugt werden gemäß der Erfindung Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt.

Die Träger mit den fixierten Nukleinsäuren werden vor oder nach ihrem Aufbringen auf die Membran gewaschen. Die anschließende Elution der Nukleinsäure vom Träger wird fachgemäß mit Puffern geringer Ionenstärke durchgeführt.

Es ist allgemein naheliegend, daß die für Nukleinsäurereinigungen effektiv nutzbaren Zentrifugationsmembranen eine Porengröße aufweisen müssen, die kleiner ist, als die der eingesetzten Trägermatrices, da mineralische Partikel, welche kleinere Partikeldurchmesser als die Poren von den Zentrifugationsmembranen haben, während eines Zentrifugationsschrittes immer durch die Poren zentrifugiert werden.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, daß ein kombiniertes Batch- Säulen-Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren unter Einbeziehung von mineralischen Trägerpartikeln, die sogar sehr viel kleiner als die Porendurchmesser kommerziell verfügbarer Zentrifugationssäulen sein können, möglich ist.

Überraschenderweise kann ein solches Kombinationsverfahren sogar mit mineralischen Trägermaterialien kleiner 50 nm realisiert werden, wodurch der Vorteil der extrem hohen Bindungsoberflächen solcher Partikeln ausgenutzt werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren der Kombination eines Batch- mit einem Säulenverfahren ist durch die Verwendung beliebiger mineralischer Trägermaterialien, auch sehr kleiner mineralischer Trägerpartikel und deren extrem großen spezifischen Oberflächen, hinsichtlich der Volumina der Ausgangsmaterialien nicht limitiert.

Das bedeutet, notwendige Ausgangslösungen, welche in Abhängigkeit von der Menge des Ausgangsmaterials (z. B. bakterielle Lysate) ansonsten erhöht werden müssen, sind nicht mehr limitiert, da die Schritte der Bindung der Plasmid-DNA an die verwendeten Trägerpartikel nicht innerhalb einer Säule erfolgen müssen.

Das Verfahren liefert sehr hohe Ausbeuten an hochreiner DNA und ist außerdem sehr einfach in der Durchführung und kann im Vergleich zu weitverbreiteten Anionenaustauschersystemen z. B. bei der Isolierung von Plasmid-DNA in einer sehr viel kürzeren Zeit realisiert werden.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen dargestellt werden.

1. Miniprep-Isolierung von Plasmid-DNA

2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für 1 min bei 12.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 100 µl Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 300 µl Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes. Durch Zugabe von 300 µl Solution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 5minutigen Zentrifugationsschritt bei 14.000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 20 µl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica- Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Minizentrifugationssäule (z. B. Micro Spin Nylon oder Micro Spin PSE; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 1 Minute bei bei 12.000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 12.000 rpm für 2 min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 100 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B. 10 mM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 1 Minute bei 12.000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.

Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Miniprep) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abb. 1 dargestellt.

2. Midiprep-Isolierung von Plasmid DNA

25 ml einer bakteriellen Übernachtkultur werden in ein 50 ml Flacon-Reaktionsgefäß überführt und für 10 min bei 5.000 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wird anschließend mit 1 ml Solution I (Tris-HCl, EDTA; Glucose) resuspendiert. Die Zellyse erfolgt durch Zugabe von 1,8 ml Solution II (NaOH; SDS) durch kurzes vorsichtiges Schwenken des Reaktionsgefäßes und Inkubation für 5 min. . Durch Zugabe von 1,8 ml Solution III (Natriumacetat; Guanidiniumhydrochlorid) und nachfolgender Inkubation für 10 min auf Eis erfolgt die notwendige Neutralisationsreaktion. Chromosomale DNA und Proteine werden nachfolgend durch einen 10minütigen Zentrifugationsschritt bei 5000 rpm sedimentiert und der klarzentrifugierte Überstand wird nachfolgend mit 150 µl einer Suspension aus einem mineralischen Trägermaterial bestehend aus Silica-Nanopartikeln (durchschnittliche Teilchengröße 40 nm) inkubiert. Die Lösung wird anschließend auf eine Zentrifugationssäule (z. B. Macro Spin Nylon; Fa. LIDA) überführt. Die Trägerpartikel mit der gebundenen Plasmid-DNA werden durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm an die Oberfläche der Filtermembran verbracht und dort durch Zugabe einer Waschlösung (60% Ethanol; NaCl) und einem erneutem Zentrifugationsschritt gewaschen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min oder durch die Inkubation der Zentrifugationssäule bei 37°C für 10 min wird der restliche Ethanol abschließend vom Trägermaterial entfernt. Das Ablösen der gebundenen Plasmid-DNA erfolgt durch die Zugabe von 200 µl-300 µl eines Niedrigsalzpuffers (z. B. 10 mM Tris-HCl) bei 70°C und nachfolgender Zentrifugation für 5 Minuten bei 5000 rpm. Das Zentrifugat enthält die isolierte Plasmid-DNA.

Die gelelektrophoretische Darstellung isolierter Plasmid-DNA (Midipreparation) aus individuellen Einzelzellkolonien ist in Abb. 2 dargestellt.

3. Vergleich der benötigten Arbeitsschritte und des notwendigen Zeitaufwandes der erfinderischen Methode mit einem kommerziell eingesetzten Systems zur Isolierung von Plasmid-DNA (Midiprep) auf der Basis eines Anionenaustauschers

Claims

1. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von kurz- und langkettigen Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen und anderen Ausgangsmaterialien durch

- Lyse von Nukleinsäuren enthaltenden Materialien,
- Inkubation mit einem mineralischen Trägermaterial,
- Aufbringen auf Membranen, die eine Porengröße aufweisen, die größer ist, als die Partikelgröße der Trägermaterialien,
- Abtrennung der Nukleinsäuren vom Trägermaterial durch Elution, wobei die Trägerpartikel auf der Membran zurückbleiben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Ausgangsmaterialien komplexe biologische Systeme, wie z. B. Blut, Gewebe, Urin, Stuhl, die ggf. an festen Materialien gebunden sind, bakterielle Lysate, pflanzliche Komponenten, DNS-Fragmente aus PCR-Ansätzen oder Agarosegele sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermaterialien Siliziumverbindungen, wie, z. B. Siliciumdioxid, Kieselsäuren, Silicagele eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Siliciumverbindungen eine durchschnittliche Teilchengröße von 7 nm bis 5000 nm, vorzugsweise 7-40 nm oder 500-5000 nm, aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse der Nukleinsäuren und ihre Bindung an das mineralische Trägermaterial mit chaotropen Salzlösungen in Kombination mit lysierenden Komponenten erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als chaotrope Salze Guanidinisothiocyanat, Guanidinhydrochlorid, Lithiumchlorid, Natriumperchlorat, Natriumjodid und/oder Harnstoff eingesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als lysierende Komponenten Detergentien und/oder protein-abbauende Enzyme eingesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Membranen Nylon- oder Polysulfonmembranen eingesetzt werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Porengröße der Membranen in Abhängigkeit der durchschnittlichen Partikelgröße des eingesetzten Trägermaterials spezifiziert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Träger fixierten Nukleinsäuren vor oder nach ihrem Aufbringen auf die Membran wäscht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution der Nukleinsäure vom Träger mit Puffern geringer Ionenstärke durchführt.