DE19837737A1 - Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion - Google Patents

Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion

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Description

Die Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion.
Prävention und kausaule Therapie umweltbedingter Fertilitäts­ störungen erfordern das Wissen um potentielle Störfaktoren. An dererseits sucht man aufgrund der steigenden Weltbevölkerung nach einfachen, preiswerten und nebenwirkungsarmen Substanzen zur Kontrazeption.
So hat die große Anzahl ungewollt kinderloser Paare in den westeuropäischen Industrienationen und die zunehmende Belastung des menschlichen Körpers durch bekannte und unbekannte Substan­ zen in den letzten Jahren dazu geführt, daß eingeschränkte Fruchtbarkeit und negative Einflüsse durch Schadstoffe oder Pharmaka kausal miteinander verknüpft werden. Prävention und kausale Therapie iatrogen bedingter Fertilitätsstörungen erfor­ dern aber konkretes Wissen um mögliche Störfaktoren. Ein we­ sentlicher Faktor für Kinderlosigkeit kann die Beeinträchtigung der Spermatozoenfunktion und Spermatozoen-Eizell-Interaktion sein.
Die Befruchtung der Eizellen bzw. Oocyte stellt das Ergebnis komplexer Interaktionen von Spermatozoen bzw. Samenzelle und Oocyte dar. Von entscheidender Bedeutung ist dabei das aktive Eindringen des Spermatozoenkerns in die Eizelle. Initial sind deshalb folgende Funktionen des Spermatozoons für eine erfolg­ reiche Befruchtung essentiell:
  • 1. Die Vitalität (intakte Membranintegrität) und die Beweg­ lichkeit der Zelle,
  • 2. die Bindung des Spermatozoens an die Zona pellucida und
  • 3. die Akrosomreaktion,
    a) (akrosomaler Status) und
    b) (Induzierbarkeit der akrosomalen Exozytose).
Diese Vorgänge sind bei der Befruchtung in idealer Weise auf­ einander abgestimmt. Sie können in vitro dissoziiert werden und hinsichtlich der Funktionalität der Samenzelle bzw. des Sperma­ tozoons mit Hilfe unterschiedlicher schon vorhandener Testme­ thoden in verschiedenen Spezies bestimmt werden.
Experimentielle Studien (Toth et al. 1989 und Young et al., 1992) befassen sich mit direkten kurz- oder mittelfristigen Veränderungen von Spermatozoenfunktionen durch Schadstoffe. In diesen Untersuchungen wurden die Bewegungsaktivität und das Mo­ tilitätsmuster von Spermatozoen in Zusammenhang mit relevanten Noxen gebracht (Seibert et al., 1986, Seibert et al., 1989).
Nachteilig bei den bekannten in vitro-Testverfahren zur Überprü­ fung von Spermatozoenfunktionen ist, daß es zu erhebliche Pro­ blemen mit der Reproduzierbarkeit ihrer Ergebnisse kommt, so daß deren Validität in Frage gestellt wird (Pilikian et al. 1986; Franken et al. 1991).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Testver­ fahren zu finden, bei dem die Validität bzw. Validierung gegen­ über bekannten Testverfahren verbessert wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Sperma­ tozoen eines portionierten Ejakulats nach Zugabe der zu te­ stenden Substanz in getrennten Testsystemen auf mindestens zwei definierte unterschiedliche Funktionsparameter untersucht wer­ den.
Durch die Untersuchung mehrerer unterschiedlicher Funktionspa­ rameter und die Verwendung eines portionierten Ejakulats, das für die Untersuchung in getrennten Testsystemen gleiche Voraus­ setzungen schafft, wird die Validität des kombinierten Testver­ fahrens erheblich verbessert. Unterschiede in der Qualität von Gameten (Samenzellen oder Eizellen) verringern durch die Ver­ wendung desselben portionierten Ejakulats für jedes Testsystem bzw. für jeden Funktionsparameter die Aussagekraft des Testver­ fahrens nicht, so daß die Validität des Testverfahrens insge­ samt erhöht wird.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden fünf unterschiedliche Funktionsparameter untersucht, nämlich die Motilität der Spermatozoen, die Vitalität der Spermatozoen, der akrosomale Status der Spermatozoen, die Auslösbarkeit einer Akrosomreaktion durch Induktoren und das Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle.
Durch die Verwendung dieser fünf Funktionsparameter wird die Aussagekraft des Testverfahrens weiter verbessert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Ejakulat ein aus einer Mehrzahl von miteinander ver­ mischten Ejakulaten gebildetes Pool-Ejakulat verwendet, das vor Zugabe der zu testenden Substanz kalibriert wird.
Die Kryokonservierung vereinigter humaner oder tierischer Eja­ kulate (Verwendung von Spermatozoenbanken) bietet den Vorteil der funktionellen Charakterisierung portionierter, kryokonser­ vierter Samenzellen bzw. Spermatozoen aus mehreren Ejakulaten. Dadurch kann ein Pool von Testzellen kalibriert bzw. standardi­ siert werden. Einzelne Testsysteme können nunmehr auch zu ver­ schiedenen Zeiten und Orten ausgeführt werden, da sie wegen ih­ rer Standardisierung vergleichbar sind. Die Reproduzierbarkeit und Validität der Ergebnisse wird somit entscheidend erhöht.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zur Bestimmung der Dosis der zu testenden Substanz ein tierisches Ejakulat verwendet.
Durch die Dosisfindung unter Verwendung von tierischen Ejakulat ist es möglich, das zu testende humane Ejakulat für das eigent­ liche Testverfahren aufzusparen.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nach­ folgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Zeich­ nung, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung bei­ spielsweise veranschaulicht sind.
In der Zeichnung zeigt:
Fig. 1 ein vereinfachtes Fließbild eines Testverfahrens.
In dem Testverfahren werden humane oder tierische Ejakulate vereinigt bzw. vermischt, portioniert, kryokonserviert und funktionell charakterisiert. Hierzu werden vereinigte Eja­ kulate fertiler Spender oder tierischer Samenproben in üb­ licher Weise gewonnen, aufbereitet und mittels eines Ein­ frierautomaten portionsweise (bis zu mehr als 1000) einge­ froren. Nach dem Einfriervorgang werden die einzelnen Por­ tionen kryokonservierter Spermatozoen bzw. Ejakulate aufge­ taut und hinsichtlich ihrer Funktionalität überprüft. Ein definierter Standard wird somit geschaffen. Das Pool- Ejakulat wird kalibriert und steht portionsweise für ein funktionsanalytisches Verfahren zur Verfügung. Zur Untersu­ chung der Motilität bzw. Bewegungsaktivität von Spermatozo­ en wird in bekannter Weise eine Kombination von Videomikro­ graphie und automatischer Auswertung der Videobildsequenzen mit Hilfe einer Computeranalyse verwendet. Der Vorteil des sogenannten CASA-Systems liegt in der objektiven, reprodu­ zierbaren, schnell und gut dokumentierbaren Analyse von Spermatozoen-Bewegungsmustern. Auch Motilitätsanalysen be­ stimmter Spermatozoen zu Populationen, deren typische Bewe­ gungsmuster nur schwer mit dem Auge zu erfassen sind (z. B. Samenzellen mit einem Hyperaktivierungsmuster) werden in solchen computerunterstützten Bewegungsanalysesystemen durchgeführt (Hinsch et al., 1997).
Zur Vitalitätsbestimmung der Spermatozoen wird die Anzahl lebender und toter Spermatozoen mit Hilfe von Fluoreszenz­ farbstoffen bestimmt. Z. B. kann der Fluoreszenzfarbstoff bis-Benzimide 33258 (Hoechst 33258) oder andere Farbstoffe verwendet werden (Gundersen und Shapiro, 1984). Hoechst 33258 Farbstoff kann z. B. die nicht-intakten Membranen to­ ter Spermatozoen permiieren, in den Zellkern eindringen und dort irreversibel an die im Spermatozoenkopf befindliche DNA binden. Alternativ können andere lebend/tot Farbstoffe eingesetzt werden.
Der akrosomale Status von Spermatozoen kann durch ein fluo­ reszenz-markiertes Lektin, durch markierte Antikörper sowie durch Färbetechniken in verschiedenen Spezies dargestellt werden (Cross und Meizel, 1989). Pisum-sativum-Agglutinin (PSA) ist ein Lektin, das sich durch seine Bindungsfähig­ keit an bestimmte Glykoproteine auszeichnet. Durch die Kopplung von PSA mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeini­ sothiocyanat (FITC) können PSA-FITC-markierte akrosomale Glykoproteine im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wer­ den.
Als weiterer Funktionsparameter wird eine Auslösbarkeit ei­ ner Akrosomreaktion durch Induktoren untersucht. Physiolo­ gische Induktoren der Akrosomreaktion im humanen wie auch im bovinen System sind solubilisierte Zona pellucida- Proteine, Follikularflüssigkeit und Progesteron. Die Indu­ zierbarkeit der akrosomalen Exozytose wird im erfindungsge­ mäßen Verfahren mit physiologischen Induktoren oder Iono­ phoren und mit den beschriebenen Färbeverfahren gemessen. Zur Isolation progressiv motiler Samenzellen werden frische Ejakulate oder aufgetaute kryokonservierte Spermatozoen ei­ nem "swim up"-Verfahren unterzogen und anschließend kapazi­ tiert. Bei dem "swim up"-Verfahren können progressiv motile Spermatozoen durch Aufschwemmen isoliert werden.
Als weiterer Funktionsparameter wird ein Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle unter­ sucht. Hierzu wird ein sogenannter Hemizona Assay (HZA) durchgeführt. Der HZA (Burkmann et al. 1988), ist als dia­ gnostischer Test für die Bindung von Spermatozoen an die Zona pellucida entwickelt worden, um das Befruchtungspoten­ tial von Spermatozoen zu evaluieren. Mit dem HZA steht ein Testsystem zur Verfügung, mit dem das Bindungsverhalten von Test- und unbehandelten Spermatozoen an die Zona pellucida verglichen werden kann und der valide Prognosen über die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen zuläßt. Im HZA wird eine humane Eizelle in korrespondierende Hälften geteilt und zwei Zona pellucida Halbkugeln (Hemizonae) gewonnen. Anschließend werden Spermatozoen mit den entsprechenden He­ mizonae inkubiert und Unterschiede im Bindungsverhalten an die jeweilige Hemizona rechnerisch ermittelt. Der Vorteil dieses Testsystems liegt darin, daß der HZA eine interne Kontrolle beinhaltet und klinisch ein ausgezeichneter dia­ gnostischer Parameter für die Fähigkeit der Spermatozoen ist, eine Eizelle in vitro zu befruchten. Für das erfin­ dungsgemäße Verfahren wird der HZA an die spezielle Frage­ stellung adaptiert, nämlich inwieweit Substanzen (z. B. Pharmaka, Chemikalien) einen Effekt auf die Bindungsfähig­ keit auf Spermatozoen an die Zona pellucida haben. Hemizo­ nae pellucida (HZ) werden mit kryokonservierten Spermatozo­ en fertiler Spender (Mensch, Bulle) inkubiert, wobei die Test-Spermatozoen vorher mit den jeweils zu testenden Sub­ stanzen behandelt und Kontroll-Zellen bzw. Kontroll- Spermatozoen in den entsprechenden Medien inkubiert worden sind.
Zur Dosisfindung der zu testenden Substanz werden bovine kryokonservierte Spermatozoen aufgetaut und nach Zugabe der Testsubstanz bzw. der zu testenden Substanz und/oder Semi­ nalplasma von Patienten in getrennten Testsystemen die Funktionsparameter Motilität, Vitalität und Akrosomreakti­ on, Induktion der Akrosomreaktion und Bindungsverhalten mittels Hemizona Assay untersucht.
Nach erfolgter Dosisfindung werden humane kryokonservierte Spermatozoen fertiler Spender nach Zugabe der Testsubstanz in gefundener Dosis und/oder Seminalplasma von Patienten auf die definierten unterschiedlichen Funktionsparameter, Motilität, Vitalität und Akrosomreaktion, Induktion der Akrosomreaktion und Bindungsverhalten im Hemizona Assay un­ tersucht. Durch Vergleich mit Spermatozoen, denen keine Testsubstanz zugefügt wurde, kann die Wirkung der zu te­ stenden Substanzen festgestellt werden.
Als zu testende Substanzen werden antroprogene Substanzen mit unbekannten oder bekannten die Fertilität beeinträchti­ gendem Potential in diesem Testverfahren getestet. Über prüft werden Chemikalien und Pharmaka, die a) im Zusammen­ hang mit Fertilitätsproblemen gebracht werden oder b) Sub­ stanzen, die einen Kontrazeptiven Effekt aufweisen könnten.
Zielgruppe sind Mensch und Tier, die in zunehmendem Maße mit anthropogenen Stoffen in Kontakt kommen. Mit Hilfe des feinmaschigen neuen und erfinderischen Untersuchungsrasters werden mit diesem Testverfahren wissenschaftlich fundierte Aussagen über die Relevanz potentiell reproduktionstoxi­ scher Noxen gemacht. Durch die Kombination von in vitro- Testsystemen wird die Empfindlichkeit des Meßsystems er­ höht. Somit kann mit diesem neuen Verfahren eine wissen­ schaftlich fundierte Aussage darüber gemacht werden, ob ia­ trogen induzierte Infertilität mit dem Vorhandensein be­ stimmter anthropogener Stoffe im Organismus in einem kausa­ len Zusammenhang stehen. Tierversuche und Untersuchungen am Menschen werden durch dieses Testverfahren umgangen.
LITERATUR
Benoff, S., Cooper, G.W., Herley, I., Mandel, F.S., Rosenfeld, D.L., Scholl, G.M., Gilbert, B.R., Hershlag, A. The effect of calcium ion channel blockers on sperm fertilization po­ tential. Fertil. Steril., 62 (3): 606-617, 1994
Burkman, L.J., Coddington, C.C., Franken, D.R., Krugen, T.F., Rosenwaks, Z., Hogen, G.D.: The hemizona assay (HZA): deve­ lopment of a diagnostic test for the binding of human sper­ matozoa to the human hemizona pellucida to predict ferti­ lization potential. Fertil. Steril. 49 (4): 688-97, 1988
Cross, N.L., Meizel, S.: Methods for evaluating the acrosomal status of mammalian sperm. Biol. Reprod. 41: 635-641, 1989
Franken, D.R., Coddington, C.C., Burkman, L.J., Oosthuizen, W.T., Oehninger, S.C., Kruger, T.F., Hodgen, G.D.: Defining the valid hernizona assay: accounting for binding variabi­ lity within zonae pellucidae and within semen samples from fertile males. Fertil. Steril. 56 (6): 1156-61, 1991
Gundersen, G.G., Shapiro, B.M.: Sperm surface proteins persist after fertilization. J. Cell. Biol. 99 (4 Pt 1): 1343-53, 1984
Hinsch, F., Hinsch, K.D., Boehm, J.G., Schill, W.B., Mueller- Schloesser, F: Functional parameters and fertilization suc­ cess of bovine semen cryopreserved in egg-yolk free and egg-yolk containing extenders. Reprod Dom Anini, 3 2, 143-149, 1997
Lerchl, A., Nieschlag, E.: Gibt es eine Spermienkrise? Deut­ sches Ärzteblatt 39B: B-1936-B-1939, 1996
Pilikian, S., Guerin, J.F.: Acrosome-reacting capacity of fro­ zen-thawed human semen: relation to hamster ova penetrati­ on. Arch. Androl. 16(3): 209-14, 1986
Seibert, H., Kolossa, M., Wassermann, O.: Bovine spermatozoa as an in vitro model for studies on the cytotoxicity of chemi­ cals: effects of chlorophenols. Cell. Biol. Toxicol. 5 (3): 315-30, 1989
Toth, G.P., Stober, J.A., Read, E.J., Zenick, H., Smith, M.K.: The automated analysis of rat sperm motility following sub­ chronic epichlorohydrin administration: methodologic and statistical considerations. J. Androl. 10 (5): 401-15, 1989
Yanagimachi, R.: Mammalian fertilization, in: E. Knobil, J.D. Neill (eds.): The Physiology of Reproduction, Second Editi­ on. Raven Press Ltd., New York, 1994
Young, R.J., Bodt, B.A., Iturralde, T.G., Starke, W.C.: Automa­ ted analysis of rabbit sperm motility and the effect of chemicals on sperm motion parameters. Mol. Reprod. Dev. 33 (3): 347-56, 1992

Claims (30)

1. Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substan­ zen auf die Spermatozoenfunktion, dadurch gekennzeichnet, daß Spermatozoen eines portionierten Ejakulats nach Zugabe der zu testenden Substanz in getrennten Testsystemen auf mindestens zwei definierte unterschiedliche Funktionsparameter untersucht werden.
2. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Motilität der Spermatozoen als Funktionsparameter unter­ sucht wird.
3. Testverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß eine Vitalität der Spermatozoen als Funk­ tionsparameter untersucht wird.
4. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein akrosomaler Status der Spermatozoen als Funktionsparameter untersucht wird.
5. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Auslösbarkeit einer Akrosomreaktion durch Induktoren als Funktionsparameter untersucht wird
6. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle als Funktionsparameter unter­ sucht wird.
7. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß neben der Motalität und der Vitalität min­ destens ein weiterer Funktionsparameter untersucht wird.
8. Testverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß neben der Motalität und der Vitalität drei weitere Funktionspa­ rameter untersucht werden.
9. Testverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Motalität mit Hilfe einer Kombination von Videomikrographie und automatischer Auswertung von Video­ bildsequenzen mit Hilfe einer Computerbildanalyse untersucht wird.
10. Testverfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Vitalität mit Hilfe von Fluoreszenz­ farbstoff untersucht wird.
11. Testverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Fluoreszenzfarbstoff bis-Benzimide 33258 verwendet wird.
12. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der akrosomale Status von Spermatozoen durch ein fluoreszenz-markiertes Lektin im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.
13. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der akrosomale Status von Spermatozoen durch markierte Antikörper dargestellt wird.
14. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der akrosomale Status von Spermatozoen durch Färbetechniken dargestellt wird.
15. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Induktoren physiologische Induktoren verwendet werden.
16. Testverfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als physiologische Induktoren solubilisierte Zona pelluci­ da-Proteine verwendet werden.
17. Testverfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als physiologischer Induktor Follikular­ flüssigkeit verwendet wird.
18. Testverfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, da­ durch gekennzeichnet, daß als physiolgischer Induktor Pro­ gesteron verwendet wird.
19. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, da­ durch gekennzeichnet, daß als Induktor Ionophoren verwendet wird.
20. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, da­ durch gekennzeichnet, daß die Auslösbarkeit mit Hilfe von Färbeverfahren dargestellt und gemessen wird.
21. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 20, da­ durch gekennzeichnet, daß progressiv motile Spermatozoen isoliert werden.
22. Testverfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich­ net, daß zur Isolation die Spermatozoen einem swim up- Verfahren unterzogen und anschließend kapazitiert werden.
23. Testverfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 22, da­ durch gekennzeichnet, daß zur Untersuchung des Bindungsver­ haltens ein Hemizona Assay durchgeführt wird.
24. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, da­ durch gekennzeichnet, daß als Ejakulat ein aus einer Mehr­ zahl von miteinander vermischten Ejakulaten gebildetes Pool-Ejakulat verwendet wird.
25. Testverfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Pool-Ejakulat vor Zugabe der zu testenden Substanz ka­ libriert wird.
26. Testverfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Pool-Ejakulat portionsweise kryokonseviert und vor Zugabe der zu testenden Substanz aufgetaut wird.
27. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Ejakulat ein tierisches Ejakulat ver­ wendet wird.
28. Testverfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß als Ejakuklat ein bovines Ejakulat verwendet wird.
29. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Ejakulat ein humanes Ejakulat verwendet wird.
30. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Dosis der zu testenden Substanz ein tierisches Ejakulat verwendet wird.
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