DE19837737C2 - Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion - Google Patents

Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion

Info

Publication number
DE19837737C2
DE19837737C2 DE19837737A DE19837737A DE19837737C2 DE 19837737 C2 DE19837737 C2 DE 19837737C2 DE 19837737 A DE19837737 A DE 19837737A DE 19837737 A DE19837737 A DE 19837737A DE 19837737 C2 DE19837737 C2 DE 19837737C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
test method
spermatozoa
ejaculate
examined
test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE19837737A
Other languages
English (en)
Other versions
DE19837737A1 (de
Inventor
Klaus-Dieter Hinsch
Elvira Hinsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to DE19837737A priority Critical patent/DE19837737C2/de
Publication of DE19837737A1 publication Critical patent/DE19837737A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19837737C2 publication Critical patent/DE19837737C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B10/00—Other methods or instruments for diagnosis, e.g. instruments for taking a cell sample, for biopsy, for vaccination diagnosis; Sex determination; Ovulation-period determination; Throat striking implements
    • A61B10/0045—Devices for taking samples of body liquids
    • A61B10/0058—Devices for taking samples of body liquids for taking sperm samples

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion.
Prävention und kausaule Therapie umweltbedingter Fertili­ tätsstörungen erfordern das Wissen um potentielle Störfaktoren. Andererseits sucht man aufgrund der steigenden Weltbevölkerung nach einfachen, preiswerten und nebenwirkungsarmen Substanzen zur Kontrazeption.
So hat die große Anzahl ungewollt kinderloser Paare in den westeuropäischen Industrienationen und die zunehmende Belastung des menschlichen Körpers durch bekannte und unbekannte Substan­ zen in den letzten Jahren dazu geführt, dass eingeschränkte Fruchtbarkeit und negative Einflüsse durch Schadstoffe oder Pharmaka kausal miteinander verknüpft werden. Prävention und kausale Therapie iatrogen bedingter Fertilitätsstörungen erfor­ dern aber konkretes Wissen um mögliche Störfaktoren. Ein we­ sentlicher Faktor für Kinderlosigkeit kann die Beeinträchtigung der Spermatozoenfunktion und Spermatozoen-Eizell-Interaktion sein.
Die Befruchtung der Eizellen bzw. Oocyte stellt das Ergebnis komplexer Interaktionen von Spermatozoen bzw. Samenzelle und Oocyte dar. Von entscheidender Bedeutung ist dabei das aktive Eindringen des Spermatozoenkerns in die Eizelle. Initial sind deshalb folgende Funktionen des Spermatozoons für eine erfolg­ reiche Befruchtung essentiell:
  • 1. Die Vitalität (intakte Membranintegrität) und die Beweg­ lichkeit der Zelle,
  • 2. die Bindung des Spermatozoens an die Zona pellucida und
  • 3. die Akrosomreaktion,
    • a) (akrosomaler Status) und
    • b) (Induzierbarkeit der akrosomalen Exozytose)
Diese Vorgänge sind bei der Befruchtung in idealer Weise auf­ einander abgestimmt. Sie können in vitro dissoziiert werden und hinsichtlich der Funktionalität der Samenzelle bzw. des Sperma­ tozoons mit Hilfe unterschiedlicher schon vorhandener Testme­ thoden in verschiedenen Spezies bestimmt werden.
Experimentielle Studien (Toth et al. 1989 und Young et al., 1992) befassen sich mit direkten kurz- oder mittelfristigen Veränderungen von Spermatozoenfunktionen durch Schadstoffe. In diesen Untersuchungen wurden die Bewegungsaktivität und das Mo­ tilitätsmuster von Spermatozoen in Zusammenhang mit relevanten Noxen gebracht (Seibert et al., 1986, Seibert et al., 1989).
Nachteilig bei den bekannten in vitro-Testfahren zur Überprü­ fung von Spermatozoenfunktionen ist, dass es zu erhebliche Problemen mit der Reproduzierbarkeit ihrer Ergebnisse kommt, so dass deren Validität infrage gestellt wird (Pilikian et al. 1986; Franken et al. 1991).
Weiterhin ist aus Datenbank BIOSIS bei STN; AN 1996: 227344 BIOSIS zu: Validation of a scoring method predicting the in­ vitro fertilizing ability of human spermatozoa. Parinaud, J. et al., International Journal of Andrology, (1996) vol. 19, No. 1, pp. 18-22 (D1) die Bestimmung der Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen durch Ermittlung der Parameter Spermienmorpholo­ gie, Vitalität, Motilität und Akrosomreaktion bekannt. Weiter­ hin wird hier die Fähigkeit zur Bindung an die Zona pellucida als wichtige Funktion genannt.
Aus Datenbank MEDLINE bei STN; AN 96039906 MEDLINE zu: Assess­ ment of the vitality an acrosomal status of human sprematozoa using fluorescent probes. Kinger, S. & Rajalakshmi, M. INTERNATIONAL JOURNAL OF ANDROLOGY, (1995 Jun) 18 Suppl. 1, 12-­ 8 (D2) ist weiterhin die Bestimmung des Akrosomenstatus und der Vitalität unter Verwendung der Lektine PSA, PNA und ConA zusammen mit entweder Hoechst 33258 oder dem HOS-Test bekannt. Die Vitalität wurde hierbei auch durch das E-N-Verfahren be­ stimmt.
Die D1 und die D2 beschreiben Methoden zur Bestimmung von Sper­ mienfunktionen und machen eine Aussage über die Befruchtungsfä­ higkeit humaner Spermatozoen. Nachteilig bei diesen Verfahren ist, dass das verwendete frische Ejakulat am gleichen Tag ver­ arbeitet werden muss und die Menge des Ejakulats nicht geeignet ist, um dessen Spermien bzw. Spermatozoen als Testzellen in ei­ nem Testverfahren mit einer Vielzahl von Tests, einzusetzen.
Weiterhin ist aus Datenbank CAPLUS bei STN; AN 1992.228205 CAPLUS zu: Effect of caffeine on vitality an fertility of mam­ malian spermatozoa measured in ejaculated cattle semen. Haber­ zettl, R. Dermatol. Monatsschr. (1991), 177 (5), 295-300 (D3) die Bestimmung des Einflusses von Koffein auf die Motilität, die Membranintegrität und den Akrosomenstatus bekannt. Gefrore­ ner Stiersamen war hierbei in Kontakt mit einer Auftauflüssig­ keit enthaltend Koffein (6 mM). Koffein wurde hier eingesetzt, um bestimmte Funktionen von Rinderspermatozoen zu verbessern.
Das Ziel aus den D1, D2 und D3 bekannten Untersuchungen waren damals, die Fruchtbarkeit von Spendern oder Patienten vorherzu­ sagen bzw. die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen zu verbessern.
Nachteilig bei den aus der D1 bis D3 bekannten Verfahren ist, dass die Ergebnisse von Ejakulat zu Ejakulat unterschiedlich sind und diese Verfahren wegen ihrer erheblichen Probleme mit der Reproduzierbarkeit bei größeren Testreihen nicht zur Über­ prüfung des Einflusses von Chemikalien oder anderen Substanzen auf die männliche Fruchtbarkeit bzw. Spermatozoenfunktionen ge­ eignet sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Testver­ fahren zu finden, bei dem die Validität bzw. Validierung gegen­ über bekannten Testverfahren verbessert wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in Verbindung mit dem Ober­ begriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass als Ejakulat ein aus einer Mehrzahl von miteinander vermischten Ejakulaten ge­ bildetes Pool-Ejakulat, das portionsweise kryokonserviert und vor Zugabe der zu testenden Substanz aufgetaut wird, verwendet wird und dass Spermatozoen des portionierten Ejakulats nach Zu­ gabe der zu testenden Substanz in getrennten Testsystemen auf mindestens zwei definierte unterschiedliche Funktionsparameter untersucht werden.
Die Kryokonservierung vereinigter humaner oder tierischer Eja­ kulate (Verwendung von Spermatozoenbanken) bietet den Vorteil der funktionellen Charakterisierung portionierter, kryokonser­ vierter Samenzellen bzw. Spermatozoen aus mehreren Ejakulaten. Durch die Verwendung eines portionierten Pool-Ejakulats werden für die Untersuchung in getrennten Testsystemen gleiche Voraus­ setzungen geschaffen, wodurch die Validität des kombinierten Testverfahrens erheblich verbessert wird. Unterschiede in der Qualität von Germeten (Samenzellen) verringern sich durch die Verwendung des selben portionierten Pool-Ejakulats für jedes Testsystem bzw. für jeden Funktionsparameter die Aussagekraft des Testverfahrens nicht, so dass die Validität des Testverfah­ rens in Verbindung mit der Untersuchung mehrerer unterschiedli­ cher Funktionsparameter insgesamt erhöht wird. Durch das erfin­ dungsgemäße Verfahren wird somit die Möglichkeit geschaffen, Spermatozoen als Testzellen einzusetzen.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden fünf unterschiedliche Funktionsparameter untersucht, nämlich die Motilität der Spermatozoen, die Vitalität der Spermatozoen, der akrosomale Status der Spermatozoen, die Auslösbarkeit einer Akrosomreaktion durch Induktoren und das Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle.
Durch die Verwendung dieser fünf Funktionsparameter wird die Aussagekraft des Testverfahrens weiter verbessert.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Pool-Ejakulat vor Zugabe der zu testenden Substanz ka­ libriert.
Durch die Kalibrierung bzw. Standardisierung können einzelne Testsysteme nunmehr auch zu verschiedenen Zeiten und Orten aus­ geführt werden, da sie wegen ihrer Standardisierung vergleichbar sind. Die Reproduzierbarkeit und Validität der Ergebnisse wird somit entscheidend erhöht.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zur Bestimmung der Dosis der zu testenden Substanz ein tierisches Ejakulat verwendet.
Durch die Dosisfindung unter Verwendung von tierischen Ejakulat ist es möglich, das zu testende humane Ejakulat für das eigent­ liche Testverfahren aufzusparen.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nach­ folgenden ausführlichen Beschreibung und der beigefügten Zeich­ nung, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung bei­ spielsweise veranschaulicht sind.
In der Zeichnung zeigt:
Fig. 1: ein vereinfachtes Fließbild eines Testverfahrens.
In dem Testverfahren werden humane oder tierische Ejakulate vereinigt bzw. vermischt, portioniert, kryokonserviert und funktionell charakterisiert. Hierzu werden vereinigte Eja­ kulate fertiler Spender oder tierischer Samenproben in üb­ licher Weise gewonnen, aufbereitet und mittels eines Ein­ frierautomaten portionsweise (bis zu mehr als 1000) einge­ froren. Nach dem Einfriervorgang werden die einzelnen Por­ tionen kryokonservierter Spermatozoen bzw. Ejakulate aufge­ taut und hinsichtlich ihrer Funktionalität überprüft. Ein definierter Standard wird somit geschaffen. Das Pool- Ejakulat wird kalibriert und steht portionsweise für ein funktionsanalytisches Verfahren zur Verfügung. Zur Untersu­ chung der Motilität bzw. Bewegungsaktivität von Spermatozo­ en wird in bekannter Weise eine Kombination von Videomikro­ graphie und automatischer Auswertung der Videobildsequenzen mit Hilfe einer Computeranalyse verwendet. Der Vorteil des sogenannten CASA-Systems liegt in der objektiven, reprodu­ zierbaren, schnell und gut dokumentierbaren Analyse von Spermatozoen-Bewegungsmustern. Auch Motilitätsanalysen be­ stimmter Spermatozoen zu Populationen, deren typische Bewe­ gungsmuster nur schwer mit dem Auge zu erfassen sind (z. B. Samenzellen mit einem Hyperaktivierungsmuster) werden in solchen computerunterstützten Bewegungsanalysesystemen durchgeführt (Hinsch et al., 1997).
Zur Vitalitätsbestimmung der Spermatozoen wird die Anzahl lebender und toter Spermatozoen mit Hilfe von Fluoreszenz­ farbstoffen bestimmt. Z. B. kann der Fluoreszenzfarbstoff bis-Benzimide 33258 (Hoechst 33258) oder andere Farbstoffe verwendet werden (Gundersen und Shapiro, 1984). Hoechst 33258 Farbstoff kann z. B. die nicht-intakten Membranen to­ ter Spermatozoen permiieren, in den Zellkern eindringen und dort irreversibel an die im Spermatozoenkopf befindliche DNA binden. Alternativ können andere lebend/tot Farbstoffe eingesetzt werden.
Der akrosomale Status von Spermatozoen kann durch ein fluo­ reszenz-markiertes Lektin, durch markierte Antikörper sowie durch Färbetechniken in verschiedenen Spezies dargestellt werden (Cross und Meizel, 1989). Pisum-sativum-Agglutinin (PSA) ist ein Lektin, das sich durch seine Bindungsfähig­ keit an bestimmte Glykoproteine auszeichnet. Durch die Kopplung von PSA mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeini­ sothiocyanat (FITC) können PSA-FITC-markierte akrosomale Glykoproteine im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wer­ den.
Als weiterer Funktionsparameter wird eine Auslösbarkeit ei­ ner Akrosomreaktion durch Induktoren untersucht. Physiolo­ gische Induktoren der Akrosomreaktion im humanen wie auch im bovinen System sind solubilisierte Zona pellucida- Proteine, Follikularflüssigkeit und Progesteron. Die Induzierbarkeit der akrosomalen Exozytose wird im erfindungsge­ mäßen Verfahren mit physiologischen Induktoren oder Iono­ phoren und mit den beschriebenen Färbeverfahren gemessen. Zur Isolation progressiv motiler Samenzellen werden frische Ejakulate oder aufgetaute kryokonservierte Spermatozoen ei­ nem "swim up"-Verfahren unterzogen und anschließend kapazi­ tiert. Bei dem "swim up"-Verfahren können progressiv motile Spermatozoen durch Aufschwemmen isoliert werden.
Als weiterer Funktionsparameter wird ein Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle unter­ sucht. Hierzu wird ein sogenannter Hemizona Assay (HZA) durchgeführt. Der HZA (Burkmann et al. 1988), ist als dia­ gnostischer Test für die Bindung von Spermatozoen an die Zona pellucida entwickelt worden, um das Befruchtungspoten­ tial von Spermatozoen zu evaluieren. Mit dem HZA steht ein Testsystem zur Verfügung, mit dem das Bindungsverhalten von Test- und unbehandelten Spermatozoen an die Zona pellucida verglichen werden kann und der valide Prognosen über die Befruchtungsfähigkeit von Spermatozoen zuläßt. Im HZA wird eine humane Eizelle in korrespondierende Hälften geteilt und zwei Zona pellucida Halbkugeln (Hemizonae) gewonnen. Anschließend werden Spermatozoen mit den entsprechenden He­ mizonae inkubiert und Unterschiede im Bindungsverhalten an die jeweilige Hemizona rechnerisch ermittelt. Der Vorteil dieses Testsystems liegt darin, daß der HZA eine interne Kontrolle beinhaltet und klinisch ein ausgezeichneter dia­ gnostischer Parameter für die Fähigkeit der Spermatozoen ist, eine Eizelle in vitro zu befruchten. Für das erfin­ dungsgemäße Verfahren wird der HZA an die spezielle Frage­ stellung adaptiert, nämlich inwieweit Substanzen (z. B. Pharmaka, Chemikalien) einen Effekt auf die Bindungsfähig­ keit auf Spermatozoen an die Zona pellucida haben. Hemizo­ nae pellucida (HZ) werden mit kryokonservierten Spermatozo­ en fertiler Spender (Mensch, Bulle) inkubiert, wobei die Test-Spermatozoen vorher mit den jeweils zu testenden Substanzen behandelt und Kontroll-Zellen bzw. Kontroll- Spermatozoen in den entsprechenden Medien inkubiert worden sind.
Zur Dosisfindung der zu testenden Substanz werden bovine kryokonservierte Spermatozoen aufgetaut und nach Zugabe der Testsubstanz bzw. der zu testenden Substanz und/oder Semi­ nalplasma von Patienten in getrennten Testsystemen die Funktionsparameter Motilität, Vitalität und Akrosomreakti­ on, Induktion der Akrosomreaktion und Bindungsverhalten mittels Hemizona Assay untersucht.
Nach erfolgter Dosisfindung werden humane kryokonservierte Spermatozoen fertiler Spender nach Zugabe der Testsubstanz in gefundener Dosis und/oder Seminalplasma von Patienten auf die definierten unterschiedlichen Funktionsparameter, Motilität, Vitalität und Akrosomreaktion, Induktion der Akrosomreaktion und Bindungsverhalten im Hemizona Assay un­ tersucht. Durch Vergleich mit Spermatozoen, denen keine Testsubstanz zugefügt wurde, kann die Wirkung der zu te­ stenden Substanzen festgestellt werden.
Als zu testende Substanzen werden antroprogene Substanzen mit unbekannten oder bekannten die Fertilität beeinträchti­ gendem Potential in diesem Testverfahren getestet. Über­ prüft werden Chemikalien und Pharmaka, die a) im Zusammen­ hang mit Fertilitätsproblemen gebracht werden oder b) Sub­ stanzen, die einen Kontrazeptiven Effekt aufweisen könnten.
Zielgruppe sind Mensch und Tier, die in zunehmendem Maße mit anthropogenen Stoffen in Kontakt kommen. Mit Hilfe des feinmaschigen neuen und erfinderischen Untersuchungsrasters werden mit diesem Testverfahren wissenschaftlich fundierte Aussagen über die Relevanz potentiell reproduktionstoxi­ scher Noxen gemacht. Durch die Kombination von in vitro- Testsystemen wird die Empfindlichkeit des Meßsystems erhöht. Somit kann mit diesem neuen Verfahren eine wissen­ schaftlich fundierte Aussage darüber gemacht werden, ob ia­ trogen induzierte Infertilität mit dem Vorhandensein be­ stimmter anthropogener Stoffe im Organismus in einem kausa­ len Zusammenhang stehen. Tierversuche und Untersuchungen am Menschen werden durch dieses Testverfahren umgangen.
LITERATUR
Benoff, S., Cooper, G. W., Herley, I., Mandel, F. S., Rosenfeld, D. L., Scholl, G. M., Gilbert, B. R., Hershlag, A. The effect of calcium ion channel blockers on sperm fertilization po­ tential. Fertil. Steril., 62 (
3
): 606-617, 1994
Burkman, L. J., Coddington, C. C., Franken, D. R., Krugen, T. F., Rosenwaks, Z., Hagen, G. D.: The hemizona assay (HZA): deve­ lopment of a diagnostic test for the binding of human sper­ matozoa to the human hemizona pellucida to predict ferti­ lization potential. Fertil. Steril. 49 (
4
): 688-97, 1988
Cross, N. L., Meizel, S.: Methods for evaluating the acrosomal status of mammalian sperm. Biol. Reprod. 41: 635-641, 1989
Franken, D. R., Coddington, C. C., Burkman, L. J., Oosthuizen, W. T., Oehninger, S. C., Kruger, T. F., Hodgen, G. D.: Defining the valid hernizona assay: accounting for binding variabi­ lity within zonae pellucidae and within semen samples from fertile males. Fertil. Steril. 56 (
6
): 1156-61, 1991
Gundersen, G. G., Shapiro, B. M.: Sperm surface proteins persist after fertilization. J. Cell. Biol. 99 (4 Pt
1
): 1343-53, 1984
Hinsch, F,., Hinsch, K. D., Boehm, J. G., Schill, W. B., Mueller- Schloesser, F: Functional parameters and fertilization suc­ cess of bovine semen cryopreserved in egg-yolk free and egg-yolk containing extenders. Reprod Dom Anini, 3 2, 143-­ 149, 1997
Lerchl, A., Nieschlag, E.: Gibt es eine Spermienkrise? Deut­ sches Ärzteblatt
39
B: B-1936-B1939, 1996
Pilikian, S., Guerin, J. F.: Acrosome-reacting capacity of fro­ zen-thawed human semen: relation to hamster ova penetrati­ on. Arch. Androl. 16 (
3
): 209-14, 1986
Seibert, H., Kolossa, M., Wassermann, 0.: Bovine spermatozoa as an in vitro model for studies on the cytotoxicity of chemicals: effects of chlorophenols. Cell. Biol. Toxicol. 5 (
3
): 315-30, 1989
Toth, G. P., Stober, J. A., Read, E. J., Zenick, H., Smith, M. K.: The automated analysis of rat sperm motility following sub­ ohronic epichlorohydrin administration: methodologic and statistical considerations. J. Androl. 10 (
5
): 401-15, 1989
Yanagimachi, R.: Mammalian fertilization, in: E. Knobil, J. D. Neill (eds.): The Physiology of Reproduction, Second Editi­ on. Raven Press Ltd., New York, 1994
Young, R. J., Bodt, B. A., Iturralde, T. G., Starke, W. C.: Automa­ ted analysis of rabbit sperm motility and the effect of chemicals on sperm motion parameters. Mol. Reprod. Dev. 33 (
3
): 347-56, 1992

Claims (28)

1. Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substan­ zen auf die Spermatozoenfunktion, dadurch gekennzeichnet, dass als Ejakulat ein aus einer Mehrzahl von miteinander vermischten Ejakulaten gebildetes Pool-Ejakulat, das portionsweise kryokon­ serviert und vor Zugabe der zu testenden Substanzen aufgetaut wird, verwendet wird und dass Spermatozoen des portionierten Ejakulats nach Zugabe der zu testenden Substanz in getrennten Testsystemen auf mindestens zwei definierte unterschiedliche Funktionsparameter untersucht werden.
2. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Motilität der Spermatozoen als Funktionsparameter un­ tersucht wird.
3. Testverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, dass eine Vitalität der Spermatozoen als Funk­ tionsparameter untersucht wird.
4. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein akrosomaler Status der Spermatozoen als Funktionsparameter untersucht wird.
5. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auslösbarkeit einer Akrosomreaktion durch Induktoren als Funktionsparameter untersucht wird.
6. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Bindungsverhalten von Spermatozoen an die Zona pellucida einer Eizelle als Funktionsparameter unter­ sucht wird.
7. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Motilität und der Vitalität min­ destens ein weiterer Funktionsparameter untersucht wird.
8. Testverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Motilität und der Vitalität drei weitere Funkti­ onsparameter untersucht werden.
9. Testverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Motilität mit Hilfe einer Kombination von Videomikrographie und automatischer Auswertung von Video­ bildsequenzen mit Hilfe einer Computerbildanalyse untersucht wird.
10. Testverfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vitalität mit Hilfe von Fluoreszenz­ farbstoff untersucht wird.
11. Testverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Fluoreszenzfarbstoff bis-Benzimide 33258 verwendet wird.
12. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der akrosomale Status von Spermatozoen durch ein fluoreszenz-markiertes Lektin im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.
13. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der akrosomale Status von Spermatozoen durch markierte Antikörper dargestellt wird.
14. Testverfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der akrosomale Status von Spermatozoen durch Färbetechniken dargestellt wird.
15. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als Induktoren physiologische Induktoren verwendet werden.
16. Testverfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass als physiologische Induktoren solubilisierte Zona pelluci­ da-Proteine verwendet werden.
17. Testverfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekenn­ zeichnet, dass als physiologischer Induktor Follikularflüssig­ keit verwendet wird.
18. Testverfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass als physiologischer Induktor Progesteron verwendet wird.
19. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass als Induktor Ionophoren verwendet wird.
20. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Auslösbarkeit mit Hilfe von Färbever­ fahren dargestellt und gemessen wird.
21. Testverfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass progressiv motile Spermatozoen isoliert werden.
22. Testverfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolation die Spermatozoen einem swim up-Verfahren un­ terzogen und anschließend kapazitiert werden.
23. Testverfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass zur Untersuchung des Bindungsverhaltens ein Hemizona Assay durchgeführt wird.
24. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Pool-Ejakulat vor Zugabe der zu tes­ tenden Substanz kalibriert wird.
25. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Ejakulat ein tierisches Ejakulat ver­ wendet wird.
26. Testverfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass als Ejakulat ein bovines Ejakulat verwendet wird.
27. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Ejakulat ein humanes Ejakulat verwen­ det wird.
28. Testverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Dosis der zu testenden Substanz ein tierisches Ejakulat verwendet wird.
DE19837737A 1997-08-28 1998-08-20 Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion Expired - Fee Related DE19837737C2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19837737A DE19837737C2 (de) 1997-08-28 1998-08-20 Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19737320 1997-08-28
DE19837737A DE19837737C2 (de) 1997-08-28 1998-08-20 Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19837737A1 DE19837737A1 (de) 1999-07-01
DE19837737C2 true DE19837737C2 (de) 2003-03-13

Family

ID=7840326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19837737A Expired - Fee Related DE19837737C2 (de) 1997-08-28 1998-08-20 Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE19837737C2 (de)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbank BIOSIS bei STN: AN 1996:227344 BIOSIS zuValidation of a scoring method predicting the in-vitro fertilizing ability of human spermatozoa Parinaud, J. et al., International Journal of Andrology, (1996) Vol. 19, No. 1, pp. 18-22 *
Datenbank CAPLUS bei STN, AN 1992:228205 CAPLUS zu: Effekt of caffeine on vitality and fertility of mammalian spermatozoa measured in ejaculated cattle semen, Haberzettl, R. Dermatol, Monatsschr.(1991), 177(5), 295-300 *
Datenbank MEDLINE bei STN, AN 96039906 MEDLINE zu: Assessment of the vitality and acrosomal status of human spermatozoa using fluorescent probes, Kinges, S. & Rajalakshmi, M. INTERNATIONALJOURNAL OF ANDRLOLOGY, (1995 Jun) 18 Suppl. 1, 12-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE19837737A1 (de) 1999-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Contri et al. Effect of semen preparation on casa motility results in cryopreserved bull spermatozoa
Brito et al. Comparison of methods to evaluate the plasmalemma of bovine sperm and their relationship with in vitro fertilization rate
Januskauskas et al. Effect of cooling rates on post-thaw sperm motility, membrane integrity, capacitation status and fertility of dairy bull semen used for artificial insemination in Sweden
Verstegen et al. Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice
Gillan et al. Capacitation status and fertility of fresh and frozen–thawed ram spermatozoa
Barros et al. Human sperm penetration into zona‐free hamster oocytes as a test to evaluate the sperm fertilizing ability
Partyka et al. Methods of assessment of cryopreserved semen
DE69938000T2 (de) System zur künstlichen nicht-chirurgischen besamung von pferden
DE60222121T2 (de) Diagnose von metall-allergien durch zytokin-freigabe von t-zellen in vitro
Price et al. Glycine-specific synapses in rat spinal cord. Identification by electron microscope autoradiography.
Juhász et al. Methods for semen and endocrinological evaluation of the stallion: a review
Suzuki et al. Functional changes and motility characteristics of Japanese Black bull spermatozoa separated by Percoll
DE69924472T2 (de) Selektion von reifem sperma durch membranoberflächen-determinanten
Farrell et al. Motility and other characteristics of human sperm can be measured by computer-assisted sperm analysis of samples stained with Hoechst 33342
DE19837737C2 (de) Testverfahren zur Überprüfung des Einflusses von Substanzen auf die Spermatozoenfunktion
Nikolaeva et al. Evaluation of stimulus-induced acrosome reaction by two-colour flow cytometric analysis.
Aitken Development of in vitro tests of human sperm function: a diagnostic tool and model system for toxicological analyses
EP1192470B1 (de) Verfahren zur fertilitätsbestimmung von säugetieren, insbesondere von menschen
Chenoweth Semen quality assessment
DE102005044530A1 (de) Verfahren zur verbesserten Konservierung von Säugerspermatozoen und verbessertes Verfahren zur geschlechtsspezifischen Selektion von Säugerspermatozoen
DE3603053A1 (de) Schwangerschaftsnachweis mit epf
Davidson et al. Nuclei and sex
Januskauskas et al. Bull semen evaluation post-thaw and relation of semen characteristics to bull’s fertility
Tweedle Single-cell staining techniques
Schill Funktionelle und immunologische Untersuchungsmethoden in der Andrologie

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
8304 Grant after examination procedure
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee