WO2003029813A2 - Teststreifen für den nachweis von prionproteinen - Google Patents

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WO2003029813A2
WO2003029813A2 PCT/EP2002/010681 EP0210681W WO03029813A2 WO 2003029813 A2 WO2003029813 A2 WO 2003029813A2 EP 0210681 W EP0210681 W EP 0210681W WO 03029813 A2 WO03029813 A2 WO 03029813A2
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Paul Price
Bruno Oesch
Eric KÜBLER
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Prionics Ag
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the invention relates to a test strip according to the preamble of claim 1 and a holder with which several test strips can be used simultaneously in different sample vessels.
  • Test strips are used for the detection of a number of different analytes in liquid or homogenized samples.
  • at least one delimited area is provided on the test strip, in which a detection reagent for the specific analyte is immobilized.
  • test strips are brought into contact with the sample with a lower section.
  • the delimited detection area is either in the lower section of the test strip and is then wetted directly by the sample.
  • a further possibility is to provide the detection area further above on the test strip, in which case, however, the strip is made of a liquid-conducting material and the sample liquid can flow from the contact section to the detection area due to capillary action. Whether a proof is positive or negative can e.g. B. can be observed by discoloration in the detection area.
  • test strips are mainly used for such evidence that is particularly easy to standardize or that can be carried out by people who are otherwise not knowledgeable at home etc.
  • Known examples are e.g. B. pregnancy tests or test strips to check the kidney function.
  • the object of the present invention is therefore to provide a device with which prions in liquid or liquefied or homogenized samples can be detected much more easily than hitherto.
  • Another object of the invention is to provide a device with which the simultaneous measurement of several samples can be carried out in a particularly simple manner. The problems are solved with a test strip that has the characterizing features of claim 1 and with a device that has the characterizing features of claim 9.
  • the test strip according to the invention has a lower section which can be brought into contact with a liquid or homogenized sample, a first delimited area being provided according to the invention, in which antibodies or other detection reagents are immobilized, which form the prion protein tie.
  • Suitable antibodies are known to the person skilled in the art from the publication of "Korth, C. et al; Nature 1997, Vol 390, pages 74-77".
  • test strip is made according to claim 1 from an absorbent material, in particular nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF), so that a liquid transport between the lower portion that can be brought into contact with the sample and the first delimited area is possible.
  • an absorbent material in particular nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF)
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the sample is first mixed with a detection reagent such as antibodies which, together with a marker, form a detectable complex with the prion protein.
  • a detection reagent such as antibodies which, together with a marker, form a detectable complex with the prion protein.
  • Markers such as radioactive isotopes, fluorescent substances, light-absorbing chromophores etc. in the UV or visible range can be used for the detection.
  • markers can be, for example, colored polymer balls such as latex beads, gold particles, liposomes and dye particles or the like.
  • all detectable markers that bind or are bound to antibodies or other detection reagents actively or passively can. For the sake of simplicity, only examples with antibodies bound to colored markers are described below.
  • test strip is brought into contact with the sample and the sample liquid moves over the first delimited area in which the detection reagents immobilized there bind the prion protein contained in the sample with the colored marker attached to it.
  • the first delimited area There is discoloration in the first delimited area, e.g. can be observed with the eye.
  • Suitable detection reagents are e.g. Antibodies, aptamers or other specific recognition organs for prion proteins.
  • one or more further delimited areas can be provided on the test strip, in which control reagents are immobilized.
  • the test strip in this context has a second delimited area in which reagents are immobilized which can bind the colored reagent-marker complex in the sample.
  • the control reagents used for this can be, in particular, an antibody or a functional reagent that only specifically bind the colored reagent-marker complex. if it can still bind explicitly to the prion protein.
  • recombinant prion protein can be used as the control reagent.
  • a further advantageous embodiment relates to test strips which are used in detection reactions for PrP Sc . It is known that prion proteins are present in two different isoforms, called PrP c and PrP Sc . PrP c is the isoform of a normal mammalian protein, while PrP Sc is an abnormal, pathological isoform.
  • PrP Sc is specific for prion diseases. Usual tests and detection methods are based on PrP Sc as a disease marker and in particular check the presence of this molecule in samples.
  • a third delimited area can be used in the test strip according to the invention be provided in which control reagents are immobilized which specifically recognize and bind the N-terminus of the PrP protein. With complete digestion, the N-terminal region of PrP should no longer be detectable. If, on the other hand, there is discoloration in this third area, this indicates that PrP c is still intact in the sample and that the digestion was therefore not complete.
  • Suitable control reagents can be, for example, the antibodies known from the publication by "Barry, RA et al .; J. Immunol. 1988, Vol. 140, pages 1188-1193".
  • an area designated as a waste pad can also be provided, which absorbs the liquid that has passed through the strip.
  • an absorbent mat, or a fleece or blotting paper or the like may be provided.
  • the shape and depth of the test strip can be designed in such a way that a small chromatography column is created which allows PrP to be separated and detected even from larger volumes.
  • test strips according to the invention with waste pad described above are preferably made of absorbent material so that the liquid from the sample can flow over the possibly different detection and control areas.
  • test strips that are not made of absorbent material.
  • the delimited detection and possibly provided control areas would have to be provided on the test strip in such a way that they can be wetted directly with the sample or the liquid has to be moved actively (eg by suction or centrifugation).
  • the invention relates not only to the test strips mentioned, but also to a device for testing several samples simultaneously.
  • the preferred device according to the invention accordingly has a holder in which a plurality of test strips are arranged and received in such a way that their lower sections can be inserted simultaneously into one of the sample vessels of the composite used.
  • a further embodiment of the invention provides a holder which at the same time holds all the test strips required for a specific form.
  • a holder for a microtiter plate in which one of the sample vessels (cavities) number corresponding number of test strips is received.
  • such a device could have, for example, a frame in which a strip-shaped holder with a corresponding number of test strips can be inserted for each row of the microtiter plate. To read the results, the holders can be removed from the frame one after the other, which simplifies the evaluation.
  • FIG. 2 shows an embodiment of a holder in which a plurality of test strips are fastened in a row parallel to one another;
  • 3 shows a frame in the usual microtiter plate format, into which the frame shown in FIG.
  • FIG. 4 shows a frame fully equipped with holders according to FIG. 2
  • Fig. 3; Fig. 5 shows the results of an investigation in which several in one as in
  • Fig. 2 shown holder attached test strips for the detection of recombinant bovine prion protein different
  • FIG. 6 shows the results of an investigation with several test strips
  • Wild types 7 shows the results of an investigation with two test strips for the detection of disease-specific, protease-resistant prion protein
  • test strip 10 for the detection of prion proteins.
  • the test strip has a lower section 11 which can be brought into contact with a homogenized or liquid sample.
  • test strip 10 contains detection or control reagents.
  • detection or control reagents can e.g. B. applied by spraying on the test strip 10.
  • the test strip 10 consists of absorbent material, e.g. B. nitrocellulose. Sample liquid which comes into contact with the test strip 10 in the section 11 is sucked through the test strip along the regions 14, 12, 13 up to a waste pad 15 which absorbs the liquid which has passed through. An identification 16 is provided at the upper end of the test strip. B. indicates the coordinates of the sample in a microtiter plate.
  • each test strip contains reagents that may recognize prion protein contained in the sample.
  • these reagents which are special antibodies against the prion protein, are contained in the delimited region 12.
  • the area 13 contains control reagents with which the concentration or the presence of the colored detection reagent-marker complex mentioned above in the sample can be checked.
  • the area 14 finally contains reagents with which the digestion of prion proteins can be checked.
  • FIG. 2 shows a device 20 with which several samples can be analyzed simultaneously.
  • the device 20 has a holder 21, on which test strips 10, 10 ′, etc. are accommodated in parallel alignment with their downward-pointing sections 11.
  • the distance between the strips 10, 10 'to each other is chosen so that it z. B. corresponds to the usual distance between cavities in a microtiter plate.
  • the holder 21 can then be used to simultaneously check samples in the cavities of a row of a microtiter plate.
  • Perforations 22 can be formed between the individual test strips 10, 10 'on the holder 21, which in the case shown is in the form of a strip, which make it easier to separate individual test strips 10, 10'.
  • a frame 30 is shown in FIG. 3, the base area of which is selected such that it can be placed on a conventional microtiter plate with an adapter 32 and then completely covers it.
  • Opposite pairs of slots 31, 31 'etc. are provided in the area of the upper longitudinal edges 30, into each of which a holder 21 with the test strips 10, 10' can be inserted.
  • the number of opposing pairs of slits 31, 31 ' corresponds to the number of rows in a microtiter plate, so that a holder 21 can be used for each row of a microtiter plate.
  • FIG. 4 shows the fully inserted state of such a holder 30, the adapter 32 being omitted in this illustration.
  • test strips shown each contain a delimited area 12, 13, 14 which contain the different detection and control reagents.
  • the invention is also intended to cover embodiments in which not only one but several delimited areas are provided on the test strip per reagent, e.g. two or more delimited areas, each carrying detection reagents that recognize prion protein contained in the sample, or two or more areas that contain digestion reagents, etc.
  • FIG. 5 shows the results of an investigation with several test strips for the detection of recombinant bovine prion protein (RecBoPrP) of different concentrations.
  • the test strips were incubated with RecBoPrP of various starting dilutions using the methods outlined above. The dilution of the samples ranges between 1: 1 and 1:32. The respective dilutions are indicated under the test strips on the figure.
  • a test strip was incubated with a sample that did not contain RecBoPrP.
  • test strip While area 13 of the test strip, which reacts to the presence of the detection reagent-marker complex in the sample, is constantly colored, area 12 of the test strip, which recognizes PrP 27-30, has a decreasing value in accordance with the decreasing concentration of RecBoPrP Dye intensities. Within the 32-fold concentration range of the RecBoPrP one can see clearly distinguishable coloring intensities of the area 12 of the test strips.
  • the test strips can therefore also be used for the semi-quantitative detection of RecBoPrP.
  • FIG. 6 shows three rows 60, 60 'and 60 ", each with several test strips after incubation with urine from four transgenic mice or wild-type mice, respectively.
  • test strips in turn have the area 12 which recognizes PrP 27-30 and the area 13 which reacts to the presence of the detection reagent-marker complex in the sample.
  • the series 60 test strips were incubated with urine from four wild-type mice (WT1-WT4) producing normal amounts of prion protein, resulting in a clear staining of area 12 in the test strips.
  • the 60 'series test strips were incubated with urine from four transgenic mice (Tg20 1- Tg20 4) which produce greatly increased amounts of prion protein. This leads to an even clearer coloring of area 12 in the test strips.
  • test strips were incubated with urine from four transgenic mice (Prnp% l-Prnp% 4) which do not produce prion protein.
  • the area 12 in the test strips is therefore not colored.
  • FIG. 7 shows test strips A and B with which brain homogenate of a healthy cow and a cow suffering from BSE treated with protease were examined.
  • PrP c the non-infectious isoform of the prion protein
  • PrP Sc infectious isoform
  • test strips A and B each again have the area 12 which recognizes PrP 27-30, and the area 13 which reacts to the presence of the detection reagent-marker complex in the sample.
  • Test strip A was incubated with protease-treated brain homogenate from a healthy cow. The area 12 of the test strip remains undyed because the PrP c has been digested completely.
  • Test strip B was incubated with protease-treated brain homogenate from a cow suffering from BSE. It can be clearly seen that the area 12 of the test strip is colored. Despite the protease treatment, PrP 27-30 is therefore present, which suggests that the sample contained PrP Sc before digestion.
  • a strip test of the type shown here is therefore suitable for rapid BSE screening of bovine brain samples.
  • 8 shows test strips A, B and C which were incubated with different homogenates which were digested to different degrees.
  • test strips A, B, C have, in addition to regions 12 that recognize PrP 27-30, and 13 that react to the presence of the detection reagent-marker complex in the sample, regions 14 that are the N-terminal region of the prion protein bind and thus only recognize undigested or incompletely digested prion protein, but not undigested prion protein, which lacks the N-terminal region.
  • Test strip A was incubated with completely digested protease-treated brain homogenate from a cow suffering from BSE. Area 12 is colored because the homogenate contains PrP27-30, while area 14 remains uncolored because there are no more N-terminal areas due to complete digestion.
  • Test strip B was incubated with fully digested protease-treated brain homogenate from a healthy cow. This sample contains neither PrP 27-30 nor N-terminal areas, so that areas 12 and 14 remain unstained.
  • Test strip C was incubated with incompletely digested protease-treated brain homogenate from a healthy cow.
  • the area 12 is colored because the homogenate still contains the domain PrP 27-30 also contained in PrP c because of the poor digestion, while the area 14 is colored because N-terminal areas are also still present. Without region 14 it would not have been possible to differentiate with certainty whether the coloration of region 12 gives an indication of PrP 27-30 from a positive sample or is due to insufficient digestion of normal prion protein.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Teststreifen zum Nachweis eines Analyten in flüssigen oder homogenisierten Proben, mit einem in Kontakt mit der Probe bringbaren Abschnitt und mit mindestens einem ersten abgegrenzten Bereich auf dem Teststreifen, in dem Nachweisreagenzien immobilisiert sind, die das Prionprotein binden sowie eine Einrichtung zum gleichzeitigen Testen mehrerer Proben in Probegefässen, die in definierter geometrischer Anordnung in einem Verbund zusammengefasst sind, wobei die Einrichtung einem Halter aufweist, in dem mehrere Teststreifen in einer der definierten geometrischen Anordnung der Probengefässe entsprechenden Anordnung dergestalt sind, dass ihre unteren Abschnitte gleichzeitig in jeweils eines der Probengefässe einsetzbar sind.

Description

Teststreifen für den Nachweis von Prionproteinen
Die Erfindung betrifft einen Teststreifen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie einen Halter, mit dem mehrere Teststreifen gleichzeitig jeweils in unterschiedliche Probegefäße eingesetzt werden können.
Teststreifen finden Anwendung beim Nachweis einer Nielzahl unterschiedlicher Analyten in flüssigen oder homogenisierten Proben. Auf den Teststreifen ist in der Regel mindestens ein abgegrenzter Bereich vorgesehen, in dem ein Νachweisreagenz für den bestimmten Analyten immobilisiert ist.
Üblicherweise werden die Teststreifen mit einem unteren Abschnitt in Kontakt mit der Probe gebracht. Der abgegrenzte Νachweisbereich befindet sich entweder im unteren Abschnitt des Teststreifens und wird dann direkt von der Probe benetzt. Eine weitere Möglichkeit ist, den Νachweisbereich weiter oberhalb auf dem Teststreifen vorzusehen, wobei dann allerdings der Streifen aus einem flüssigkeitsleitenden Material hergestellt ist und die Probeflüssigkeit aufgrund von Kapillarwirkung von dem Kontaktabschnitt zu dem Νachweisbereich fließen kann. Ob ein Nachweis positiv oder negativ ist, kann z. B. durch eine Verfärbung im Nachweisbereich beobachtet werden.
Üblicherweise werden Teststreifen vor allem für solche Nachweise eingesetzt, die besonders gut standardisierbar sind bzw. die von ansonsten nicht kundigen Personen selbst zu Hause etc. durchgeführt werden können. Bekannte Beispiele sind z. B. Schwangerschaftstests oder Teststreifen zur Überprüfung der Nierenfunktion.
Ein Nachweis von Prionproteinen erfordert dagegen äußerst aufwendige Vorbereitungen, die bislang ausschließlich von hochspezialisiertem Personal in Sicherheitslaboren durchgeführt werden. Die eigentliche Nachweisreaktion, die üblicherweise für jede Probe einzeln erfolgt stellt im Vergleich zu der Probenvorbereitung nur einen geringen Aufwand dar und man hat bislang daher nicht gezielt über eine Standardisierung und Vereinfachung nachgedacht.
Andererseits ist natürlich im Hinblick auf die wachsende Zahl von Untersuchungen an z. B. Schlachtvieh nicht auszuschließen, daß eine Standardisierung auch der Reaktion zum Nachweis von Prionproteinen nicht doch erhebliche Einsparungen sowohl an Arbeit als auch Kosten bringen könnte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Einrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der sich Prionen in flüssigen oder verflüssigten, bzw. homogenisierten Proben deutlich einfacher als bislang nachweisen lassen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Einrichtung zu schaffen, mit der sich die gleichzeitige Messung mehrerer Proben in besonders einfacher Weise durchfuhren läßt. Gelöst werden die Aufgaben mit einem Teststreifen, der die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 1 aufweist sowie mit einer Einrichtung, die die kennzeichnenden Merkmale des Anspruches 9 aufweist.
Ähnlich wie bekannte Teststreifen für andere Analyte weist der erfϊndungsgemäße Teststreifen einen unteren Abschnitt auf, der in Kontakt mit einer flüssigen oder homogenisierten Probe gebracht werden kann, wobei erfindungsgemäß ein erster abgegrenzter Bereich vorgesehen ist, in dem Antikörper oder andere Nachweisreagenzien immobilisiert sind, die das Prionprotein binden. Geeignete Antikörper sind dem Fachmann aus der Veröffentlichung von "Korth, C. et al; Nature 1997, Vol 390, Seiten 74-77" bekannt.
Der Teststreifen ist gemäß Anspruch 1 aus saugfähigem Material, insbesondere Nitrozellulose oder Polyvinylidenfluorid (PVDF) hergestellt, so daß ein Flüssigkeitstransport zwischen dem unteren in Kontakt mit der Probe bringbaren Abschnitt und dem ersten abgegrenzten Bereich möglich ist.
Für einen üblichen Nachweis mit dem erfindungsgemäßen Teststreifen wird die Probe zunächst mit einem Nachweisreagenz wie z.B. Antikörpern versetzt, die zusammen mit einem Marker einen detektierbaren Komplex mit dem Prionprotein bilden. Für die Detektion können Marker wie radioaktive Isotopen, fluoreszierende Substanzen, im UV- oder im sichtbaren Bereich lichtabsorbierende Chromophore etc. verwendet werden. Im letzteren Falle können solche Marker z.B. gefärbte Polymerkugeln wie Latex-Beads, Goldpartikel, Liposomen und Farbstoffpartikel oder dergleichen sein. Grundsätzlich sind alle detektierbaren Marker geeignet, die aktiv oder passiv an Antikörper oder andere Nachweisreagenzien binden oder gebunden werden können. Der Einfachheit halber werden im Folgenden nur noch Beispiele mit an gefärbte Marker gebundene Antikörper beschrieben.
Dann wird der Teststreifen mit der Probe in Kontakt gebracht und die Probeflüssigkeit wandert über den ersten abgegrenzten Bereich, in dem die dort immobilisierten Nachweisreagenzien das in der Probe enthaltene Prionprotein mit dem daran hängenden farbigen Marker binden. Es kommt zu einer Verfärbung in dem ersten abgegrenzten Bereich, die z.B. mit dem Auge beobachtet werden kann.
Geeignete Nachweisreagenzien sind z.B. Antikörper, Aptamere oder andere spezifische Erkennungsorgane für Prionenproteine.
Zur Überprüfung, ob die Nachweisreaktion überhaupt funktioniert hat, können auf dem Teststreifen ein bzw. mehrere weitere abgegrenzte Bereiche vorgesehen sein, in denen Kontrollreagenzien immobilisiert sind.
In einer bevorzugten Ausgestaltung weist der Teststreifen in diesem Zusammenhang einen zweiten abgegrenzten Bereich auf, in dem Reagenzien immobilisiert sind, die den farbigen Reagenz-Markerkomplex in der Probe binden können. Hiermit kann überprüft werden, ob der Reagenz-Markerkomplex überhaupt der Probe zugesetzt wurde, bzw. ob die Konzentrationen stimmen, etc. Die hierfür verwendeten Kontrollreagenzen können insbesondere ein Antikörper oder ein funktionelles Reagenz sein, die spezifisch den farbigen Reagenz- Markerkomplex nur dann binden, wenn dieser noch explizit an das Prionprotein binden kann. Insbesondere kann als Kontrollreagenz rekombinantes Prionprotein eingesetzt werden. Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung betrifft Teststreifen, die in Nachweisreaktionen für PrPSc eingesetzt werden. Es ist bekannt, daß Prionproteine in zwei unterschiedlichen Isoformen vorliegen, die mit PrPc und PrPSc bezeichnet werden. PrPc stellt dabei die Isoform eines normalen Säugetierproteins dar, während PrPSc eine abnorme, pathologische Isoform ist.
Es wird zur Zeit davon ausgegangen, daß PrPSc spezifisch für Prionenkrankheiten ist. Übliche Tests und Nachweisverfahren gehen daher von PrPSc als Krankheitsmarker aus und überprüfen insbesondere die Anwesenheit dieses Moleküls in Proben.
Problematisch ist dabei in der Regel, daß Proben aus infizierten Quellen nicht ausschließlich PrPSc sondern auch PrPc enthalten. Im Nachweisverfahren muß daher eine Differenzierung zwischen dem üblicherweise vorliegenden PrPc und dem eventuell vorliegenden PrPSc erfolgen.
Zur Differenzierung wird zur Zeit eine Protease- Verdauung der Probe durchgeführt, wobei man sich zu Nutze macht, daß die PrPc-Form vollständig verdaubar ist, während bei der PrPSc-Form nur ein N-terminaler Bereich Protease- sensitiv ist und ein als PrP 27-30 bezeichneter Bereich nicht verdaut wird.
Bei einem speziellen Nachweis von PrPSc werden daher bei einem erfindungsgemäßen Teststreifen im ersten abgegrenzten Bereich Antikörper immobilisiert, die speziell PrP 27-30 binden, wobei natürlich nicht ausgeschlossen werden kann, daß bei unvollständiger Verdauung auch ein entsprechender Bereich der PrPc-Form gebunden würde.
Um hier Sicherheit zu haben, kann in einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung bei dem erfindungsgemäßen Teststreifen ein dritter abgegrenzter Bereich vorgesehen sein, in dem Kontrollreagenzien immobilisiert sind, die spezifisch den N-Terminus des PrP-Proteins erkennen und binden. Bei einer vollständigen Verdauung sollte kein N-terminaler Bereich von PrP mehr nachweisbar sein. Findet dagegen in diesem dritten Bereich eine Verfärbung statt, so spricht dies dafür, daß noch intaktes PrPc in der Probe vorliegt und daß demzufolge die Verdauung nicht vollständig war. Geeignete Kontrollreagenzien können z.B. die aus der Veröffentlichung von "Barry, R.A. et al.; J. Immunol. 1988, Vol. 140, Seiten 1188-1193" bekannten Antikörper sein.
Mit dieser Ausgestaltung läßt sich in besonders einfacher Weise bereits gleichzeitig mit dem Prionennachweis überprüfen, ob die Verdauung vollständig war oder nicht, wofür bei den bislang gängigen ELISA- Verfahren immer ein zusätzlicher Ansatz erforderlich wäre.
Auf dem erfindungsgemäßen Teststreifen kann weiterhin ein als Waste-Pad bezeichneter Bereich vorgesehen sein, der die durch den Streifen durchgelaufene Flüssigkeit aufnimmt. In diesem Bereich kann z.B. eine saugfähige Matte, bzw. ein Vlies oder auch Löschpapier oder dergleichen vorgesehen sein. Die Ausgestaltung des Teststreifens kann in Form und Tiefe derart erfolgen, dass eine kleine Chromatographiesäule entsteht, die es erlaubt, PrP auch aus größeren Volumina zu trennen und nachzuweisen.
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Teststreifen mit Waste-Pad sind bevorzugt aus saugfähigem Material hergestellt, damit die Flüssigkeit aus der Probe über die gegebenenfalls unterschiedlichen Nachweis- und Kontrollbereiche fließen kann. Denkbar wäre selbstverständlich auch, Teststreifen zu verwenden, die nicht aus saugfähigem Material bestehen. Hierzu müßten dann allerdings die abgegrenzten Nachweis- und ggf. vorgesehen Kontrollbereiche so auf dem Teststreifen vorgesehen werden, daß sie direkt mit der Probe benetzt werden können oder die Flüssigkeit muss aktiv (z.B. durch Saugen oder Zentrifugieren) bewegt werden.
Die Erfindung betrifft nicht nur die erwähnten Teststreifen, sondern auch eine Einrichtung zum gleichzeitigen Testen mehrerer Proben.
Üblicherweise erfolgt die gleichzeitige Aufarbeitung mehrerer Proben in Mikrotiterplatten oder sonstigen Formaten, in denen mehrere Probegefäße in definierter geometrischer Anordnung in einem Verbund zusammengefaßt sind.
Die bevorzugte erfindungsgemäße Einrichtung weist demnach einen Halter auf, in dem mehrere Teststreifen dergestalt angeordnet und ausgerichtet aufgenommen sind, daß ihre unteren Abschnitte gleichzeitig in jeweils eines der Probengefäße des verwendeten Verbunds einsetzbar sind.
Denkbar wäre z. B. ein streifenförmiger Halter, an dem die Teststreifen parallel und jeweils in einem Abstand zueinander befestigt sind, der dem jeweiligen Abstand der Probegefäße in einer Reihe einer Mikrotiterplatte entspricht.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung sieht einen Halter vor, der gleichzeitig alle für ein bestimmtes Fonnat erforderlichen Teststreifen aufnimmt. Denkbar wäre z. B. ein Halter für eine Mikrotiterplatte, in dem eine der Probengefäße(Kavitäten)anzahl entsprechende Anzahl von Teststreifen aufgenommen ist. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung könnte eine solche Einrichtung z.B. einen Rahmen aufweisen, in den für jede Reihe der Mikrotiterplatte ein streifenförmiger Halter mit einer entsprechenden Anzahl von Teststreifen einsetzbar ist. Zum Ablesen der Ergebnisse können die Halter nacheinander aus dem Rahmen entnommen werden, was die Auswertung erleichtert.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand mehrerer Abbildungen, die unterschiedliche Ausführungsbeispiele zeigen näher erläutert werden. Weitere Abbildungen zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen mit den erfindungsgemäßen Teststreifen.
Dabei zeigt:
Fig. 1 einen Teststreifen;
Fig. 2 eine Ausführung eines Halters, in dem mehrere Teststreifen parallel zueinander in einer Reihe befestigt sind; Fig. 3 einen Rahmen im üblichen Mikrotiterplattenforaiat, in den die in Fig.
2 gezeigten Halter einsetzbar sind; Fig. 4 einen vollständig mit Haltern gemäß Fig. 2 bestückten Rahmen gemäß
Fig. 3 ; Fig. 5 die Ergebnisse einer Untersuchung, bei der mehrere in einem wie in
Fig. 2 gezeigten Halter befestigte Teststreifen zur Detektion von rekombinantem bovinem Prionprotein unterschiedlicher
Konzentrationen eingesetzt wurden; Fig. 6 die Ergebnisse einer Untersuchung mit mehreren Teststreifen zur
Detektion von zellulärem Prionprotein in transgenen Mäusen und
Wildtypen; Fig. 7 die Ergebnisse einer Untersuchung, mit zwei Teststreifen zur Detektion von krankheitsspezifischem, Protease-resistentem Prionprotein; und
Fig. 8 die Ergebnisse einer Untersuchung mit drei Teststreifen zur Kontrolle der Verdauungsbedingungen von BSE-Homogenat.
Fig. 1 zeigt einen Teststreifen 10 zum Nachweis von Prionproteinen. Der Teststreifen weist einen unteren Abschnitt 11 auf, der in Kontakt mit einer homogenisierten oder flüssigen Probe bringbar ist.
Weiterhin sind auf dem Teststreifen 10 mehrere abgegrenzte Bereiche 12, 13 und 14 vorgesehen, die jeweils Nachweis- oder Kontrollreagenzien enthalten. Diese Reagenzien können z. B. durch Aufsprühen auf dem Teststreifen 10 aufgebracht werden.
Der Teststreifen 10 besteht aus saugfähigem Material, z. B. Nitrozellulose. Probeflüssigkeit, die im Abschnitt 11 in Kontakt mit dem Teststreifen 10 gelangt, wird durch den Teststreifen entlang der Bereiche 14, 12, 13, bis zu einem Waste- Pad 15 gesaugt, der die durchgelaufene Flüssigkeit aufnimmt. Am oberen Ende des Teststreifens ist eine Identifizierung 16 vorgesehen, die z. B. die Koordinaten der Probe in einer Mikrotiterplatte angibt.
Wie oben bereits angesprochen, sind in den abgegrenzten Bereichen 12, 13, und 14 unterschiedliche Reagenzien fixiert. Zwingend in jedem Teststreifen vorhanden sein müssen Reagenzien, die eventuell in der Probe enthaltenes Prionprotein erkennen. Im gezeigten Fall sind diese Reagenzien, bei denen es sich um spezielle Antikörper gegen das Prionprotein handelt, im abgegrenzten Bereich 12 enthalten. Der Bereich 13 enthält Kontrollreagenzien, mit denen die Konzentration bzw. das Vorliegen des oben angesprochenen farbigen Nachweisreagenz- Markerkomplexes in der Probe überprüft werden kann.
Der Bereich 14 schließlich enthält Reagenzien, mit denen sich die Verdauung von Prionproteinen überprüfen läßt.
In Fig. 2 ist eine Einrichtung 20 dargestellt, mit der gleichzeitig mehrere Proben analysiert werden können. Die Einrichtung 20 weist einen Halter 21 auf, an dem Teststreifen 10, 10' etc. parallel ausgerichtet mit ihren nach unten weisenden Abschnitten 11 aufgenommen sind. Der Abstand der Streifen 10, 10' zu einander ist so gewählt, daß er z. B. dem üblichen Abstand von Kavitäten in einer Mikrotiterplatte entspricht. Mit dem Halter 21 lassen sich dann gleichzeitig Proben in den Kavitäten einer Reihe einer Mikrotiterplatte überprüfen.
Zwischen den einzelnen Teststreifen 10, 10' können auf dem Halter 21, der im gezeigten Fall die Form eines Streifens aufweist, Perforationen 22 ausgebildet sein, die ein Abtrennen einzelner Teststreifen 10, 10' erleichtern.
Denkbar ist, dieses Format auf die gesamte Mikrotiterplatte zu erweitern.
Hierzu ist in Fig. 3 ein Rahmen 30 dargestellt, dessen Grundfläche so gewählt ist, daß er mit einem Adapter 32 auf eine übliche Mikrotiterplatte aufsetzbar ist und diese dann vollständig abdeckt. Im Bereich der oberen längsverlaufenden Kanten 30 sind jeweils gegenüberliegende Schlitzpaare 31, 31' etc. vorgesehen, in die jeweils ein Halter 21 mit den Teststreifen 10, 10' einsetzbar ist. Die Anzahl der gegenüberliegenden Schlitzpaare 31, 31' entspricht der Anzahl der Reihen in einer Mikrotiterplatte, so daß für jede Reihe einer Mikrotiterplatte ein Halter 21 eingesetzt werden kann.
Den vollständig eingesetzten Zustand eines solchen Halters 30 zeigt Fig. 4, wobei der Adapter 32 in dieser Darstellung weggelassen wurde.
Die dargestellten Teststreifen enthalten jeweils einen abgegrenzten Bereich 12, 13, 14, die die unterschiedlichen Nachweis- bzw. Kontrollreagenzien enthalten. Die Erfindung soll selbstverständlich auch solche Ausführungen abdecken, bei denen pro Reagenz nicht nur ein sondern mehrere abgegrenzte Bereiche auf dem Teststreifen vorgesehen werden, also z.B. zwei oder mehr abgegrenzte Bereiche, die jeweils Nachweisreagenzien tragen, die in der Probe enthaltenes Prionprotein erkennen, oder zwei oder mehr Bereiche, die Reagenzien zur Überprüfung der Verdauung enthalten etc.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung mit mehreren Teststreifen zur Detektion von rekombinantem bovinem Prionprotein (RecBoPrP) unterschiedlicher Konzentrationen. Die Teststreifen wurden mit RecBoPrP verschiedener Ausgangsverdünnungen nach den oben dargestellten Methoden inkubiert. Die Verdünnung der Proben rangiert zwischen 1 : 1 und 1 : 32. Die jeweiligen Verdünnungen sind unter den Teststreifen auf der Figur angegeben. Als O-Kontrolle wurde ein Teststreifen mit einer Probe inkubiert, die kein RecBoPrP enthielt.
Während der Bereich 13 der Teststreifen, der auf das Vorliegen des Nachweisreagenz-Markerkomplexes in der Probe reagiert, konstant gefärbt ist, weist der Bereich 12 der Teststreifen, der PrP 27-30 erkennt, entsprechend der abnehmenden Konzentration von RecBoPrP jeweils abnehmende Färbeintensitäten auf. Man erkennt innerhalb des 32-fachen Konzentrationsbereich des RecBoPrP visuell gut unterscheidbare Färbungsintensitäten des Bereichs 12 der Teststreifen. Die Teststreifen lassen sich daher auch zum semiquantitativen Nachweis von RecBoPrP benutzen.
In Fig. 6 sind drei Reihen 60, 60' und 60" mit jeweils mehreren Teststreifen nach Inkubation mit Urin von jeweils vier transgenen Mäusen bzw. Mäusen vom Wildtyp wiedergegeben.
Die Teststreifen weisen wiederum den Bereich 12 auf, der PrP 27-30 erkennt, sowie den Bereich 13, der auf das Vorliegen des Nachweisreagenz- Markerkomplexes in der Probe reagiert.
Die Teststreifen der Reihe 60 wurden mit Urin von vier Wildtyp-Mäusen (WT1- WT4) inkubiert, die normale Mengen an Prionprotein produzieren, was zu einer deutlichen Färbung des Bereichs 12 in den Teststreifen führt.
Die Teststreifen der Reihe 60' wurden mit Urin von vier transgenen Mäusen (Tg20 1- Tg20 4) inkubiert, die stark erhöhte Mengen an Prionprotein produzieren. Dies führt zu einer noch deutlicheren Färbung des Bereichs 12 in den Teststreifen.
Die Teststreifen der Reihe 60" wurden mit Urin von vier transgenen Mäusen (Prnp%l- Prnp%4) inkubiert, die kein Prionprotein produzieren. Der Bereich 12 in den Teststreifen ist daher nicht gefärbt.
Jeweils oberhalb der Teststreifen ist in der Figur die Abkürzung angegeben, die eine Zuordnung des Teststreifens zu der entsprechenden Maus erlaubt. Man erkennt in der Figur, daß mit Hilfe der beschriebenen Teststreifen das Prionprotein auch in komplexer Umgebung (Urin) spezifisch erkannt wird.
Fig. 7 zeigt Teststreifen A und B, mit denen mit Protease behandeltes Hirnhomogenat einer gesunden und einer an BSE erkrankten Kuh untersucht wurden.
Wie oben erwähnt, wird die nicht infektiöse Isoform des Prionproteins (PrPc) durch Proteasebehandlung vollständig verdaut, während die infektiöse Isoform (PrPSc) nur teilweise verdaut wird und eine PrP27-30 genannte Domäne zurücklässt.
Die Teststreifen A und B weisen wiederum jeweils den Bereich 12 auf, der PrP 27-30 erkennt, sowie den Bereich 13, der auf das Vorliegen des Nachweisreagenz-Markerkomplexes in der Probe reagiert.
Der Teststreifen A wurde mit proteasebehandeltem Hirnhomogenat einer gesunden Kuh inkubiert. Der Bereich 12 des Teststreifens bleibt ungefärbt, da das PrPc vollständig verdaut worden ist.
Der Teststreifen B wurde mit proteasebehandeltem Hirnhomogenat einer an BSE erkrankten Kuh inkubiert. Deutlich ist zu erkennen, daß der Bereich 12 des Teststreifens eine Färbung aufweist. Es ist also trotz Proteasebehandlung PrP 27- 30 vorhanden, was darauf schließen läßt, daß die Probe vor dem Verdau PrPSc enthielt.
Ein Streifentest der hier gezeigten Art eignet sich also zu einem schnellen BSE- Screening von Rinderhirnproben. Fig. 8 zeigt Teststreifen A, B und C, die mit unterschiedlichen Homogenaten inkubiert wurden, die unterschiedlich gut verdaut wurden.
Die Teststreifen A, B, C weisen neben den Bereichen 12, die PrP 27-30 erkennen, sowie 13, die auf das Vorliegen des Nachweisreagenz-Markerkomplexes in der Probe reagieren, zusätzlich noch Bereiche 14 auf, die den N-terminalen Bereich des Prionproteins binden und damit ausschließlich unverdautes oder unvollständig verdautes Prionprotein erkennen, jedoch nicht verdautes Prionprotein, dem der N-terminale Bereich fehlt.
Teststreifen A wurde mit vollständig verdautem proteasebehandeltem Hirnhomogenat einer an BSE erkrankten Kuh inkubiert. Der Bereich 12 ist gefärbt, da das Homogenat PrP27-30 enthält, während der Bereich 14 ungefärbt bleibt, da wegen der vollständigen Verdauung keine N-terminalen Bereiche mehr vorhanden sind.
Teststreifen B wurde mit vollständig verdautem proteasebehandeltem Hirnhomogenat einer gesunden Kuh inkubiert. Diese Probe enthält weder PrP 27- 30 noch N-terminale Bereiche, so daß die Bereiche 12 und 14 ungefärbt bleiben.
Teststreifen C wurde mit unvollständig verdautem proteasebehandeltem Hirnhomogenat einer gesunden Kuh inkubiert. Hier ist der Bereich 12 gefärbt, da das Homogenat wegen des schlechten Verdaus weiterhin die auch in PrPc enthaltene Domäne PrP 27-30 enthält, während der Bereich 14 gefärbt ist, weil auch N-terminale Bereiche weiterhin vorhanden sind. Ohne den Bereich 14 hätte man nicht sicher differenzieren können, ob die Färbung des Bereichs 12 einen Hinweis auf PrP 27-30 aus einer positiven Probe gibt oder auf eine nicht ausreichende Verdauung von normalem Prionprotein zurückzuführen ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:
1. Teststreifen zum Nachweis eines Analyten in flüssigen, verflüssigten oder homogenisierten Proben, mit einem in Kontakt mit der Probe bringbaren Abschnitt (11) und mit mindestens einem ersten abgegrenzten Bereich (12) auf dem Teststreifen (10), wobei der Teststreifen (10) aus saugfähigem Material besteht, dadurch gekennzeichnet, daß in dem ersten abgegrenzten Bereich (12) Nachweisreagenzien immobilisiert sind, die das Prionprotein spezifisch binden.
2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Nitrozellulose oder PVDF besteht.
3. Teststreifen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter abgegrenzter Bereich (13) vorgesehen ist, in dem ein Kontrollreagenz immobilisiert ist, das einen in der Probe befindlichen farbigen Nachweisreagenz-Trägerkomplex bindet.
4. Teststreifen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in dem zweiten abgegrenzten Bereich 13 Antikörper gebunden sind, die an die Nachweisreagenzien in dem farbigen Nachweisreagenz-Trägerkomplex binden.
5. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein dritter abgegrenzter Bereich (14) vorgesehen ist, in dem ein Kontrollreagenz immobilisiert ist, mit dem der Erfolg einer eventuellen Verdauung des Prionproteins überprüft werden kann.
6. Teststreifen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in dem dritten abgegrenzten Bereich (14) ein Nachweisreagenz immobilisiert ist, das den N-Terminus des Prionproteins erkennt.
7. Teststreifen nach einem der Ansprüche Ibis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der erste abgegrenzte Bereich (12) zwischen dem zweiten (13) und dritten (14) abgegrenzten Bereich angeordnet ist.
8. Teststreifen mit einem oder mehreren der in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebenen abgegrenzten Bereichen, dadurch gekennzeichnet, daß die abgegrenzten Bereiche in einem Abschnitt des Teststreifen vorgesehen sind, der bei Kontakt mit der Probe direkt mit Probeflüssigkeit benetzt wird.
9. Einrichtung zum gleichzeitigen Testen mehrerer Proben in Probegefäßen, die in definierter geometrischer Anordnung in einem Verbund zusammengefaßt sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung einen Halter (21) aufweist, in dem mehrere Teststreifen (10, 10') in einer der definierten geometrischen Anordnung der Probengefäße entsprechenden Anordnung dergestalt gehalten sind, daß ihre unteren Abschnitte 11 gleichzeitig in jeweils eines der Probengefäße einsetzbar sind.
10. Einrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Halter (21) in Form eines querverlaufenden Streifens ausgebildet ist, an dem die Teststreifen in rechtem Winkel angeordnet sind.
11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rahmen (30) vorgesehen ist, der auf eine übliche Mikrotiterplatte aufsetzbar ist und bei dem im Bereich gegenüberliegender Kanten gegenüberliegende Aufnahmen (31, 31') vorgesehen sind, in die der streifenförmige Halter (21) einsetzbar ist.
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