DE69926061T2

DE69926061T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur peptidsynthese (t-20)

Info

Publication number: DE69926061T2
Application number: DE69926061T
Authority: DE
Inventors: Myung-Chol Kang; Brian Bray; Maynard Lichty; Catherine Mader; Gene Merutka
Original assignee: Trimeris Inc
Current assignee: Trimeris Inc
Priority date: 1998-03-23
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2019-03-23
Also published as: TWI233931B; CN100383158C; EP1071442B1; CA2324348C; AU751358B2; CN1303299A; NZ507083A; JP4602547B2; BR9909018A; DE69926061D1; EP1071442A1; EP1071442A4; WO1999048513A1; ES2245505T3; JP2002507576A; DK1071442T3; AU3109799A; EP1071442B9; ATE299029T1; CA2324348A1

Description

1. Einführung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich zunächst auf Verfahren zur Synthese von T-20 (auch als „DP-178" bezeichnet; SEQ ID NO: 1). Solche Verfahren bringen Fest- und Flüssigphasen-Syntheseverfahren zur Anwendung, um Gruppen spezifischer Peptidfragmente unter Erhalt des interessierenden Peptids zu synthetisieren und zu kombinieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf individuelle Peptidfragmente, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese des Peptids fungieren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf Gruppen solcher Peptidzwischenproduktfragmente, welche zusammen verwendet werden können, um Volllängen-T-20-Peptide herzustellen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf einzelne Peptidfragmente, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese des betreffenden Peptids fungieren.
2. Hintergrund
Kürzlich wurde eine große Anzahl von Peptiden identifiziert, welche die Fähigkeit aufzeigen, Fusions-zugehörige Ereignisse zu inhibieren, und die, was wichtig ist, auch eine starke antivirale Aktivität zeigen. Siehe zum Beispiel US-Patent 5,464,933; 5,656,480 und PCT-Veröffentlichung WO 96/19495T-20. Um die Peptide umfangreich zu verwenden, beispielsweise als Therapeutika, entsteht der Bedarf nach einer Möglichkeit, sie in Großmaßstabsmengen zu synthetisieren. Es existieren Techniken zur Peptidsynthese, (siehe z.B. Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29: 4005–4008; Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29: 4009–4012; Kamber et al. (Hrsg.), „Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden, 1992, 525–526; and Riniker et al., 1993, Tetrahedron), die zur wirtschaftlichen Großmaßstabsproduktion einfach gereinigter Peptide wie T-20 verwendet werden können.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die folgende Erfindung bezieht sich zunächst auf Verfahren zur Synthese von T-20 (auch als „DP-178" bezeichnet; SEQ ID NO: 1). Solche Verfahren bringen Fest- und Flüssigphasen-Syntheseverfahren zur Anwendung, um Gruppen von spezifischen Peptidfragmenten unter Erhalt des interessierenden Peptids zu synthetisieren und zu kombinieren. Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren das Synthetisieren spezifischer Seitenketten-geschützter Peptidfragment-Zwischenprodukte von T-20 auf einem festen Trägermaterial, das Verbinden der geschützten Fragmente in Lösung unter Bildung eines geschützten T-20-Peptids, gefolgt vom Entschützen der Seitenketten unter Erhalt des Endproduktes T-20-Peptid. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen die Synthese eines T-20-Peptids mit einer Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung einzelner Peptidfragmente, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese des Peptids fungieren. Die erfindungsgemäßen Peptidfragmente umfassen jene mit den in Tabelle 1 unten dargestellten Aminosäuresequenzen:
Tabelle 1
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf besondere Gruppen von Peptidfragmenten, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese des interessierenden Peptid fungieren. Die Gruppen von Peptidfragmenten entsprechend der Erfindung umfassen Gruppen 1–20, wie in Tabelle 2 unten dargestellt.
Tabelle 2
Die Erfindung basiert zum Teil auf der unerwarteten Entdeckung der Erfinder, dass bestimmte Kombinationen synthetischer Festphasen-Fltissigphasen-Reaktionen zum ersten Mal eine hohe Reinheit von T-20 und herzustellenden Peptiden im großen Maßstab mit hohem Durchsatz und hoher Ausbeute ermöglichen. Insbesondere können T-20-Peptide entsprechend den Verfahren der Erfindung in einem Maßstab von 1 oder mehr Kilogramm synthetisiert werden. Man hat herausgefunden, dass durch Auswählen der spezifischen T-20-Peptidfragmente entsprechend der Erfindung für die Festphasensynthese die hoch effiziente Kopplung von Festphasen-Techniken ausgenutzt werden kann, ohne dass der 3-, 4- oder sogar 5-fache Überschuss an Aminosäuren und Reagenzien verwendet werden muss, der normalerweise bei der Festphasen-Synthese erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden lediglich ungefähr ein 1,5-Faches der Aminosäuren in der Festphasensynthese des erfindungsgemäßen Peptidfragments. Diese kostensparende Reduktion der Menge an Aminosäuren und Reagenzien macht die erfindungsgemäßen Verfahren für die Synthese im Großmaßstab von T-20-Peptiden geeignet.
Zusätzlich haben die Erfinder überraschenderweise herausgefunden, dass bestimmte Peptidfragmente in der Festphase mit einer Beladung von ungefähr 0,8 bis 1 mmol pro Gramm Festphasenharz synthetisiert werden können. Diese Beladung ist signifikant höher als der Beladungsbereich von 0,25 bis 0,4 mmol pro Gramm Harz, der typischerweise bei der Festphasen-Peptidsynthese erreicht wird. Außerdem haben die Erfinder herausgefunden, dass das Synthetisieren von ausgewählten Peptidfragmenten in der festen Phase unter Verwendung von Harz, das gegenüber Supersäuren sensitiv ist, Peptidfragmente von ungewöhnlich hoher Reinheit hervorbringt. Chromatographische Techniken sind nicht notwendig, um die Peptidfragmente, die erfindungsgemäß hergestellt werden, zu reinigen. Die Fragmente werden einfach vor der Verwendung durch Präzipitations- und/oder Pulverisierungsschritte geführt, oder wie erhalten direkt von der Säule verwendet. Die Verwendung eines Supersäure-sensitiven Harzes ermöglicht es, die synthetisierten, geschützten erfindungsgemäßen Peptide ohne gleichzeitige Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen von dem Harz zu trennen. Dies reduziert Unreinheiten und ermöglicht es, Peptide mit 10 Aminosäuren oder größer in hoher Reinheit zu synthetisieren. Das Verunreinigungsprofil von T-20-Peptiden, welche in der Lösungsphase entsprechend erfindungsgemäßen Verfahren synthetisiert wurden, und zwar durch Verbinden der hochreinen Peptidfragmente, die entsprechend der Erfindung produziert wurden, besteht vornehmlich aus Fragmenten, die nicht verbunden wurden, und nicht aus nahe verwandten Analoga. Dementsprechend sind T-20-Peptide, die entsprechend der Erfindung hergestellt wurden, viel einfacher zu reinigen als jene, die entsprechend herkömmlicher Techniken hergestellt wurden. Die Beispiele, die in Abschnitten 9 und 11 unten dargestellt sind, zeigen solche kombinatorischen Synthesen von T-20-Volllängen-Peptiden. Die Beispiele, die in Abschnitt 11 vorliegen, zeigen die Großmaßstabs-Synthese und -Reinigung von T-20- und T-20-Zwischenprodukt-Peptiden. Entsprechend den Verfahren der Erfindung können T-20-Peptide und T-20-Peptidzwischenprodukte hergestellt werden, und zwar in einem Maßstab von einem oder mehreren Kilogramm.
Die Erfinder haben auch unerwarteterweise herausgefunden, dass Peptide wie T-20 und bestimmte Peptidfragmente, die hierin beschrieben sind, unter Verwendung von Materialien mit hoher Kapazität gereinigt werden können, welche als eine besondere Ausführungsform in basischen pH-Bereichen verwendet werden können. Zusammengefasst bietet die vorliegende Erfindung viele Vorteile und innovative Lösungen für Probleme, die sich im Bereich der skalierbaren Synthese der vorliegenden Peptide und der Identifizierung individueller Peptidfragmente, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese der vorliegende Peptide fungieren, stellten.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
1: T-20 Vier-Fragment-Ansatz. Diese Figur stellt das Schema dar, dem in dem Beispiel gefolgt wurde, das unten in Abschnitt 9.1 gezeigt ist, für die Synthese von Volllängen-T-20, beginnend mit Zwischenproduktpeptidfragment-Gruppe 6, wie in Tabelle 2 oben gezeigt.
2: T-20 Vier-Fragment-Ansatz, Weg 2. Diese Figur stellt ein zusätzliches Vier-Fragment-Schema dar, welches die Peptid-Zwischenprodukt-Gruppe 6 verbindet, wie in Tabelle 2 oben gezeigt, für die Synthese von Volllängen-T-20.
3: T-20 Drei-Fragment-Ansatz. Diese Figur stellt das Schema dar, dem in dem Beispiel gefolgt wurde, das in Abschnitt 9.1 unten dargestellt ist, für die Synthese von Volllängen-T-20.
4: T-20 Drei-Fragment-Ansatz, Weg 2. Diese Figur stellt das Schema dar, dem in dem Beispiel gefolgt wurde, das in Abschnitt 9.2, 9.3, 9.4 und 9.5 unten dargestellt ist, für die Synthese von Volllängen-T-20.
5: T-20 Zwei-Fragment-Ansatz. Diese Figur stellt ein Schema dar, welches Peptid-Zwischenprodukt-Gruppe 18 verbindet, wie in Tabelle 2 oben gezeigt, für die Synthese von Volllängen-T-20.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
5.1 Volllängen-Peptide
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Peptide, Fragmente, Gruppen von Peptidfragmenten, welche verwendet werden können, um das Peptid zu synthetisieren, das als T-20, oder alternativ dazu DP-178, bekannt ist. T-20 ist ein Peptid, welches den Aminosäureresten 638 bis 673 des Transmembranproteins gp41 von dem HIV-1-_LAI-Isolat entspricht und besitzt die 36-Aminosäuren-Sequenz (gelesen vom Amino-, NH₂, zum Carboxy-, COOH-Terminus):
NH₂-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH
Es versteht sich, dass die Verfahren, Fragmente und Gruppen von Fragmenten und Techniken, die zur Auswahl der Fragmente und Gruppen von Fragmenten der vorliegenden Erfindung verwendet werden, verwendet werden können, um T-20-ähnliche Fragmente zusätzlich zu T-20 zu synthetisieren. Zusätzlich zu den oben beschriebenen T-20-Peptiden können die erfindungsgemäßen Verfahren, Fragmente und Gruppen von Fragmenten verwendet werden, um Peptide zu synthetisieren, die modifizierte aminoterminale und/oder carboxyterminale Enden aufweisen. Wenn man T-20 als Beispiel nimmt, können solche Peptide die Formel haben:
X-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-Z
worin X eine Aminogruppe; eine hydrophobe Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbobenzoxyl, Dansyl, und t-Butyloxycarbonyl; eine Acetylgruppe; eine 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl(FMOC)gruppe; oder eine makromolekulare Trägergruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipid-Fettsäure-Konjugaten, Polyethylenglykol und Kohlenhydraten, darstellt; und Z eine Carboxygruppe; eine Amidogruppe; eine t-Butyloxycarbonyl-Gruppe; eine para-Nitrobenzylester-Gruppe; oder eine makromolekulare Trägergruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipid-Fettsäure-Konjugaten, Polyethylenglykol, und Kohlenhydraten, darstellt. Techniken zur Addition solcher „X"- und „Z"-Gruppen sind dem Fachmann wohl bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, um das Peptide zu synthetisieren, das die obige Formel aufweist, in der X eine Acetylgruppe und Z eine Amidgruppe ist. Die Beispiele, die im Abschnitt 9 unten dargestellt sind, zeigen die erfolgreiche Synthese von T-20-Peptiden über die Verbindung von den Peptid-Zwischenprodukten, die unten in Abschnitt 5.2 beschrieben sind. In einem bevorzugten Verfahren können T-20-Peptide und -Zwischenprodukte gereinigt werden, indem irgendeine nicht-silica-basierte Säulenfüllung (zur Maximierung der Beladungs-Kapazität) verwendet wird, einschließlich Zirconium-basierter Füllungen, Polystyrol, Polyacryl oder anderer Polymer-basierter Füllungen; welchen bei hohen pH-Bereichen (größer als 7) stabil sind. Es werden zum Beispiel nicht-silica-beladene Säulenfüllungen mit einem breiten pH-Bereich, der pH-Werte größer als diese umfasst, von Tosohaus (Montgomeryville, PA) verkauft. Säulen, die mit solchem Material beladen sind, können in der Niedrig-, Mittel- oder Hochdruck-Chromatographie verwendet werden. Siehe zum Beispiel das Reinigungsverfahren, das unten in Abschnitt 10 dargestellt ist.
5.2 Peptidzwischenprodukte
Die vorliegende Erfindung umfasst Gruppen von Peptidfragmentzwischenprodukten von T-20 und umfasst jene Peptide mit spezifischen Aminosäuresequenzen, wie sie oben in Tabelle 1 aufgelistet sind, und insbesondere in Gruppen, wie sie in Tabelle 2 unten aufgelistet sind, können verwendet werden, um T-20 herzustellen.
Jeweils eine oder mehrere der Seitenketten der Aminosäurereste der Peptidfragmente, die in Tabelle 1 oder 2 aufgelistet sind, können mit Standard-Schutzgruppen wie t-Butyl (tBu), Trityl (trt) und t-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützt sein. Die t-Bu-Gruppe ist die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Aminosäurereste Tyr (Y), Thr (T), Ser (S) und Asp (D); die trt-Gruppe ist die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Aminosäurereste His (H), Gln (Q) und Asn (N); und die Boc-Gruppe ist die bevorzugte Seitenketten-Schutzgruppe für Aminosäurereste Lys (K) und Trp (W).
Während der Synthese von Fragmenten 1, 2, 3 und 4, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, muss die Seitenkette des Histidin-Restes geschützt sein, bevorzugt mit einer Trityl(trt)-Schutzgruppe. Wenn sie nicht geschützt ist, wird die Säure, die verwendet wird, um das Peptidfragment von dem Harz zu trennen, zerstörerisch mit dem Histidin-Rest reagieren, was einen Abbau des Peptidfragments verursacht.
Bevorzugt werden die Glutaminreste der Peptidfragmente der Erfindung mit Trityl (trt)-Gruppen geschützt. Es ist jedoch bevorzugt, den Glutaminrest am carboxyterminalen Ende der Fragmente 1–16 und 9–16 nicht zu schützen. Man hat herausgefunden, dass die Abwesenheit einer Schutzgruppe vom Glutaminrest am carboxyterminalen Ende der Fragmente 1–16 die Reaktion der Fragmente 1–16 mit den Fragmenten 17–36 erleichtert, was eine Verbindung der Fragmente mit nur ungefähr 2% Racemisierung erlaubt. Zusätzlich können die Trityl-Schutzgruppen von einem oder mehreren der anderen Glutamin-Reste der Fragmente eliminiert werden, wenn eine niedrigere Löslichkeit von irgendeinem der Peptidfragmente der Erfindung in organischen Lösungsmitteln erwünscht ist.
Es ist bevorzugt, dass der Tryptophanrest mit einer Boc-Gruppe geschützt ist.
Geschützte Peptidfragmente entsprechend der Peptidformeln 1–18, die in Tabelle 1 oben aufgelistet sind, umfassen die Verbindungen, die unten in Tabelle 3 aufgelistet sind.
Tabelle 3
Jede einzelne oder jeweils mehrere der Seitenketten der in Tabelle 3 oben aufgelisteten Aminosäurereste der Peptide können mit Standard-Seitenketten-Schutzgruppe wie tBu, trt und Boc, wie oben beschrieben, geschützt sein. Beispielhafte Synthesen von Peptiden aus Tabelle 3 sind in Abschnitten 7 und 8 unten dargestellt, welche die allgemeinen Techniken verwenden, die in Abschnitt 5.4 unten beschrieben sind.
5.3 Peptidsynthese
Wie oben diskutiert, werden einige der einzelnen Peptidfragmente der Erfindung bevorzugt unter Verwendung von Festphasen-Synthesetechniken hergestellt, während andere Peptide der Erfindung bevorzugt unter Verwendung einer Kombination aus Festphasen- und Flüssigphasen-Synthesetechniken hergestellt werden, wobei die Synthesen in der Herstellung von T-20-Peptiden gipfeln, wie hierin beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass die Peptidfragmente der Erfindung mittels Techniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, synthetisiert oder präpariert werden können. Siehe zum Beispiel Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY.
Die erfindungsgemäßen Peptide können alternativ dazu so synthetisiert werden, dass ein oder mehrere der Bindungen, welche die Aminosäurereste der Peptide verknüpfen, Nicht-Peptid-Bindungen sind. Diese alternativen Nicht-Peptid-Bindungen können unter Verwendung von Reaktionen gebildet werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind, und sie können Imino-, Ester-, Hydrazid-, Semicarbazid-, und Azo-Bindungen umfassen, um nur einige zu nennen.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können T-20-Peptide, die die oben beschriebenen Sequenzen umfassen, mit zusätzlichen chemischen Gruppen synthetisiert werden, die an deren Amino- und/oder Carboxy-Termini vorhanden sind, so dass zum Beispiel die Stabilität, Reaktivität und/oder Löslichkeit der Peptide verstärkt wird. Zum Beispiel können hydrophobe Gruppen wie beispielsweise Carbobenzoxyl-, Dansyl-, Acetyl- oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Amino-Termini der Peptide angehängt werden. Ebenso kann eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an den Amino-Termini der Peptide platziert werden. (Siehe „X"-Modifikation zur Einführung solcher Modifikationen, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
Außerdem können T-20-Peptide so synthetisiert werden, dass ihre sterische Konfiguration verändert ist. Zum Beispiel kann anstelle des gewöhnlichen L-Isomers das D-Isomer von einem oder mehreren der Aminosäurereste des Peptids verwendet werden.
Außerdem kann mindestens einer der Aminosäurereste der erfindungsgemäßen Peptide durch einen der wohl bekannten nicht-natürlichen Aminosäurereste ersetzt werden. Veränderungen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Reaktivität und/oder Löslichkeit der erfindungsgemäßen Peptide zu erhöhen.
Jedes der T-20-Peptide kann so synthetisiert werden, dass es zusätzlich eine makromolekulare Trägergruppe kovalent verbunden mit ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini aufweist. Solche makromolekularen Trägergruppen können zum Beispiel Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol, Kohlenhydrate oder zusätzliche Peptide umfassen. Die „X"-Modifikation von T-20, die oben beschrieben ist, kann daher zusätzlich irgendeine der oben beschriebenen makromolekularen Trägergruppen, kovalent verbunden mit dem Aminoterminus eines Peptids, darstellen, wobei eine zusätzliche Peptidgruppe bevorzugt ist. Ebenso kann die „Z"-Modifikation von T-20, die oben beschrieben ist, zusätzlich irgendeine der makromolekularen Trägergruppen, die oben beschrieben sind, darstellen.
Bevorzugt werden die Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung mittels Festphasen-Peptidsynthese (SPPS)-Techniken unter Verwendung von Standard-FMOC-Protokollen synthetisiert. Siehe z.B. Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19): 5748–5749; Carpino et al., 1972, J. Org. Chem. 37(22): 3404–3409. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Festphasensynthese der Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung auf Supersäuren-sensitiven festen Trägermaterialien durchgeführt, welche 2-Chlortritylchlorid-Harz (siehe z.B. Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters 30(30: 3943–3946) und 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybuttersäure-Harz (siehe z.B. Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28(49): 6147–6150 und Richter et al., 1994, Tetrahedron Letters 35(27): 4705–4706) umfassen. Sowohl das 2-Chlortritylchlorid-, als auch das 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybuttersäure-Harz kann von Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA, bezogen werden.
Allgemeine Verfahren zur Herstellung von Beladung von Harzen, welche in der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden können, sind hierin beschrieben. Die Beladung des Harzes kann zum Beispiel über die folgenden Techniken durchgeführt werden. Das Harz, bevorzugt ein Supersäure-sensitives Harz wie 2-Chlortrityl-Harz, wird in die Reaktionskammer gegeben. Das Harz wird mit einem chlorierten Lösungsmittel wie Dichlormethan (DCM) gewaschen. Man lässt das Bett ablaufen und es wird eine Lösung aus 1,5 Äquivalenten einer Aminosäure und 2,7 Äquivalenten Diisopropylethylamin (DIEA) in ungefähr 8 bis 10 Volumen Dichlorethan (DCE) hinzugegeben. Der N-Terminus der Aminosäure sollte geschützt sein, bevorzugt mit Fmoc, und die Seitenkette der Aminosäure sollte, wo dies notwendig oder angebracht ist, geschützt sein. Das Gemisch wird unter Stickstoffbegasung für 2 Stunden geschüttelt.
Es sollte erwähnt werden, dass ein chloriertes Lösungsmittel für eine angemessene Quellung des 2-Chlortrityl-Harzes erforderlich ist. Obwohl DCE entsprechend der Literaturquellen eine größere Ladungseffizienz herstellt, kann es durch DCM mit geringer oder ohne Verminderung der Beladung ersetzt werden.
Nach dem Schütteln lässt man das Bett ablaufen und wäscht es mit DCM. Die aktiven Stellen auf dem Harz werden mit einer 9:1-Lösung MeOH:DIEA für ungefähr 20 bis 30 Minuten endversiegelt. Man lässt das Bett ablaufen, es wird 4 × mit DCM gewaschen und unter Erhalt der beladenen Säule mit einer Stickstoffspülung getrocknet.
Fmoc ist die bevorzugte Schutzgruppe für den N-Terminus der Aminosäure. Abhängig davon, welche Aminosäure aufgeladen wird, kann dessen Seitenkette geschützt sein oder auch nicht. Wenn beispielsweise Trp aufgeladen wird, sollte dessen Seitenkette mit Boc geschützt sein. Ganz ähnlich dazu kann die Seitenkette von Gln mit trt geschützt sein. Wenn jedoch Gln aufgeladen wird, in Vorbereitung auf die Synthese des 1–16-Peptidfragments, sollte dessen Seitenkette nicht geschützt sein. Es ist nicht notwendig, die Seitenkette von Leu zu schützen.
Die Fmoc-geschützten Aminosäuren, die bei der Beladung des Harzes und in der Peptidsynthese verwendet werden, sind mit oder ohne Seitenketten-Schutzgruppen, je nachdem, was erforderlich ist, von Sean oder Genzyme erhältlich. Als Alternative zu den oben erläuterten Verfahren kann das Harz auch fertig beladen mit den geeigneten Aminosäuren bezogen werden.
Die in Abschnitt 6 unten dargestellten Beispiele beschreiben beispielhafte Präparationen von Harzen.
Festphasen-Peptidsynthesetechniken können zum Beispiel durchgeführt werden entsprechend den folgenden Techniken: Das beladene Harz wird in die Reaktionskammer gegeben und mit einem Lösungsmittel konditioniert, bevorzugt Methylenchlorid (DCM; vorzugsweise ungefähr 10 Vol.) mit Stickstoff-Umwälzung für ungefähr 15 Minuten, um die Harzkügelchen zu quellen. DCM ist für eine angemessene Quellung des 2-Chlortrityl-Harzes erforderlich. Das Harzvolumen verdoppelt oder verdreifacht sich in der Reaktionskammer, während die Kügelchen quellen, und die aktiven Stellen entfalten sich und werden für eine Reaktion zugänglich. Nachdem das Harz gequollen ist, lässt man das Lösungsmittel aus der Reaktionskammer ablaufen.
Die Entfernung der Fmoc (9-Fluoroenylmethyloxycarbonyl)-Schutzgruppe vom terminalen Amin oder vom Harz wird erreicht, indem das Harz mit zwei Aliquots einer 20%igen Lösung Piperidin in N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für jeweils ungefähr 10 Minuten behandelt wird. Das Volumen der 20%igen Lösung von Piperidin in NMP, das für jedes Aliquot erforderlich ist, hängt von dem Maßstab der durchzuführenden Reaktion ab. Das Harz wird dann 5–7 mal mit Aliquots aus NMP (ungefähr 10 Vol.) gewaschen, um die Fmoc-Nebenprodukte (d.h. Dibenzofulven und sein Piperidin-Adduct) und übriges Piperidin zu entfernen. Ein Chloranil-Test kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Entfernen von Fmoc-Nebenprodukten und restlichem Pyridin vollständig ist. Die Chloranil-Testlösung wird hergestellt, indem ein Tropfen einer gesättigten Lösung aus Chloranil in Toluol zu ungefähr 1 ml Aceton gegeben wird. Die NMP-Waschfraktionen können überprüft werden, indem ein Tropfen der Waschfraktion zu der Chloranil-Testlösung gegeben wird. Eine blaue oder violette Färbung ist ein positiver Indikator für die Anwesenheit eines sekundären Amins, was anzeigt, dass Fmoc-Nebenprodukte und/oder restliches Piperidin noch immer vorhanden ist. Das Waschen mit NMP wird wiederholt, bis die blaue oder violette Färbung nicht mehr beobachtet wird.
Indessen wird die in der Sequenz nachfolgende Aminosäure, die an das Harz anzufügen ist, für die Reaktion am Carboxyterminus aktiviert. Der Aminoterminus von jeder Aminosäure sollte mit Fmoc geschützt sein. Abhängig davon, welche Aminosäure angehängt wird, kann dessen Seitenkette geschützt sein oder nicht. Bevorzugt sind die Seitenketten von Tyr (Y), Thr (T), Ser (S) und Asp (P) mit t-Bu geschützt, die Seitenketten von His (H), Gln (Q) und Asn (N) mit trt geschützt, und die Seitenketten von Lys (K) und Trp (W) sind mit Boc geschützt. Wie oben diskutiert muss jedoch die Seitenkette von His geschützt sein. Außerdem ist es bevorzugt, die Seitenkette von dem Gln-Rest am carboxyterminalen Ende von Fragmenten 1–16 und 9–16 nicht zu schützen. Es ist nicht notwendig, dass die Seitenketten von Len oder Ile geschützt werden.
Die Aminosäure wird wie folgt aktiviert. Die Fmoc-geschützte Aminosäure (1,5 Äqu.), 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBT) (1,5 Äqu.), und Diisopropylethylamin (DIEA) (1,5 Äqu.) werden in NMP (ungefähr 7,5 Vol.) bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird auf 0–5°C abgekühlt, und dann wird O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) (1,5 Äqu.) hinzugegeben, danach wird mittels Rühren für 5–15 Minuten gelöst. Es ist wichtig, dass die Aktivierung bei niedriger Temperatur durchgeführt wird, um Racemisierung der Aminosäure zu vermindern. HBTU ist das letzte Reagenz, das zur kalten Lösung hinzugegeben wird, da die Aktivierung und Racemisierung in seiner Abwesenheit nicht stattfinden kann.
Die Lösung der aktivierten Aminosäure wird auf die Säule, die man ablaufen ließ, geladen, und mit DCM eingewaschen (ungefähr 2,5 Vol.). Es ist anzumerken, dass die Aktivierung der Aminosäure in NMP durchgeführt wird, aufgrund der Unlöslichkeit von HBTU in DCM. DCM wird jedoch an diesem Punkt zur Reaktion hinzugegeben, um eine adäquate Quellung der Harzkügelchen aufrecht zu erhalten. Die Reaktion wird mit N₂-Begasung für ungefähr 1 Stunde umgewälzt. Die Vervollständigung der Verbindung kann mittels eines qualitativen Ninhydrintestes überwacht werden, wie er unten beschrieben ist.
Um die Vervollständigung der Reaktion unter Verwendung des qualitativen Ninhydrintestes zu überprüfen, wird eine 2–20 mg Probe des Harzes abgenommen und mit Methanol sauber gewaschen. Zu der Probe werden 3 Tropfen einer 76%igen Lösung aus Phenol in Ethanol, 4 oder 5 Tropfen einer 0,2 mM KCN-Lösung in Pyridin, und 3 Tropfen einer 0,28 M Lösung von Ninhydrin in Ethanol gegeben. Die Probe wird mit Ethanol auf ein Volumen von ungefähr 0,5 ml verdünnt und bei ungefähr 75°C für 5–10 Minuten in einen Heizblock gesetzt. Eine blaue oder violette Färbung ist ein positiver Indikator für die Anwesenheit freier Amine, was anzeigt, dass die Reaktion noch nicht beendet ist. Die Probe kann weiter auf ein Volumen von ungefähr 3 ml verdünnt werden, um den Grad der Farbveränderung in der konzentrierten Probe einfacher beurteilen zu können.
Wenn ein positiver Ninhydrin-Test nach 1 Stunde beobachtet wird, führt man die Verbindungsreaktion für eine zusätzliche Stunde weiterhin durch. Wenn der positive Ninhydrin-Test nach 2 Stunden weiter besteht, lässt man die Säule ablaufen, wäscht dreimal in ungefähr 10 Volumen NMP, und die Verbindungsreaktion wird unter Verwendung von 1 Äquivalent aktivierter Aminosäure wiederholt.
Wenn das Harz über Nacht zwischen den Verbindungszyklen gelagert werden muss, lässt man das Harzbett ablaufen und bedeckt es unter einer Stickstoffdecke mit DCM. Alternativ dazu kann man das Bett ablaufen lassen und unter einer Stickstoffdecke lagern, wobei dann vor dem Fortfahren mit dem nächsten Verbindungszyklus mit einem DCM-Waschschritt konditioniert wird. Wenn das vollständige Fragment über Nacht vor dem Abschneiden gelagert werden muss, sollte das Harzbett mit DCM NMP-frei gewaschen werden, da eine signifikante Fmoc-Entschützung in NMP stattfinden kann.
Nachdem die Kopplung als vollständig bewertet wird, lässt man das Harz ablaufen und wäscht es mit 3 Aliquots (ungefähr 10 Vol.) NMP. Der Zyklus wird für nachfolgende Polymerteile des Peptidfragments wiederholt. Nach der letzten Kopplungsreaktion wird das Harz mit 4 Aliquots (ungefähr 10 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 Aliquots (ungefähr 10 Vol.) DCM. Das an das Harz gebundene Peptid kann mittels einer Stickstoff-Spülung getrocknet werden.
Peptide, die über Festphasen-Synthesetechniken synthetisiert werden, können abgeschnitten werden und zum Beispiel entsprechend der folgenden Techniken isoliert werden: Das Peptid kann von dem Harz unter Verwendung von Techniken abgeschnitten werden, die dem Fachmann wohl bekannt sind. Zum Beispiel können Lösungen aus 1%iger oder 2%iger Trifluoressigsäure (TFA) in DCM oder eine Kombination aus einer 1%igen und einer 2%igen Lösung aus TFA in DCM verwendet werden, um das Peptid abzuschneiden. Essigsäure (HOAC) kann ebenfalls verwendet werden, um das Peptid abzuschneiden. Das spezifische Abschneidereagenz, Lösungsmittel und die Zeit, die zum Abschneiden erforderlich ist, hängt von dem einzelnen Peptid ab, das abzuschneiden ist. Nach dem Abschneiden, werden die Abschneide-Fraktionen Standard-Aufbereitungsverfahren unterzogen, um das Peptid zu isolieren. Typischerweise werden die kombinierten Abschneidefraktionen unter Vakuum aufkonzentriert, gefolgt von Wiederlösen mit einem Lösungsmittel wie Ethanol, Methanol oder Heptan. Im Allgemeinen wird das Peptid durch Zugabe von Wasser präzipitiert, und mittels Vakuumfiltration abgenommen. Alternativ dazu kann das Produkt vor der Isolierung des Peptids pulverisiert werden.
Die Beispiele, die in Abschnitten 7.1–7.6 unten dargestellt sind, zeigen Festphasen-Synthesen von Peptidzwischenprodukten, wie sie in Tabellen 1, 2 und/oder 3 gezeigt sind.
Zur Synthese von Volllängen-T-20-Peptiden können die Peptid-Zwischenprodukte aus der obigen Tabelle 1 miteinander verbunden werden, um das T-20-Peptid zu erhalten. Zum Beispiel können die Gruppen aus Peptidzwischenprodukten, die in Tabelle 2 oben aufgelistet sind, miteinander verbunden werden, um das T-20-Volllängen-Peptid herzustellen. Anschauliche Beispiele einer solchen Synthese von Volllängen-T-20 aus Zwischenprodukt-Peptidfragmenten sind in Abschnitt 9 unten dargestellt, und sie sind schematisch in 1–5 abgebildet.
In bestimmten Ausführungsformen kann einem Vier-Fragment-Ansatz zur Synthese von T-20 gefolgt werden. Ein „Vier-Fragment-Ansatz" zur Synthese bezieht sich auf ein T-20-Syntheseschema, welches mit vier T-20-Zwischenprodukt-Peptidfragmenten startet, die unter Verwendung von Fest- und Flüssigphasen-Synthesetechniken zu einem Volllängen-T-20-Peptid synthetisiert und verbunden werden. Zwischenprodukt-Peptidfragmentgruppen 5, 6, 8, 9 und 12–15, die in Tabelle 2 oben gezeigt sind, stellen bevorzugte Gruppen dar. 1 und 2 stellen zwei Vier-Fragment-Ansätze dar, welche die Peptid-Zwischenprodukt-Gruppe 6 verwenden, um Volllängen-T-20 zu synthetisieren. Zu dieser Gruppe wird angemerkt, dass Aminosäurerest 36 (der carboxyterminale Aminosäurerest von T-20) einzeln während des Fragment-Verbindungs-Prozesses eingefügt wird. Die Kulmination des T-20-Syntheseschemas, das in 1 gezeigt ist, wird in dem Beispiel, das in Abschnitt 9.1 dargestellt ist, gezeigt.
Zusätzlich dazu kann in Ausführungsformen einem Drei-Fragment-Ansatz zur Synthese von T-20 gefolgt werden. Ein „Drei-Fragment-Ansatz" zur Synthese bezieht sich auf ein T-20-Syntheseschema, welches mit drei T-20-Zwischenprodukt-Peptidfragmenten beginnt, die unter Verwendung von Fest- und Flüssigphasen-Synthesetechniken zu einem Volllängen-T-20 Peptid synthetisiert und verbunden werden. Zwischenprodukt-Fragmentgruppen 2–4, 7, 10 und 11, die in Tabelle 2 oben gezeigt sind, stellen bevorzugte Drei-Fragment-Gruppen dar. 3 und 4 zeigen zwei Drei-Fragment-Ansätze, welche die Peptid-Zwischenprodukt-Gruppe 3 verwenden, um Volllängen-T-20 zu synthetisieren. Zu dieser Gruppe wird angemerkt, dass Aminosäurerest 36 (der carboxyterminale Aminosäurerest von T-20) einzeln während des Fragment-Verbindungs-Prozesses eingefügt wird. Die Kulmination des T-20-Syntheseschemas, das in 3 gezeigt ist, wird in dem Beispiel, das in Abschnitt 9.1 unten dargestellt ist, demonstriert. Die Kulmination des T-20-Sytheseschemas, das in 4 gezeigt ist, wird in den Beispielen, die in Abschnitten 9.2–9.5 unten gezeigt sind, demonstriert.
In zusätzlichen Ausführungsformen kann einem Zwei-Fragment-Ansatz zur Synthese von T-20 gefolgt werden. Ein „Zwei-Fragment-Ansatz" zur Synthese bezieht sich auf ein T-20-Syntheseschema, welches mit zwei T-20-Zwischenprodukt-Peptidfragmenten startet, die unter Verwendung von Fest- und Flüssigphasen-Synthesetechniken zu einem Volllängen-T-20-Peptid synthetisiert und verbunden werden. Zwischenprodukt-Fragmentgruppen 1 und 16–20, die in Tabelle 2 oben gezeigt sind, stellen bevorzugte Fragmentgruppen dar. 5 stellt einen Zwei-Fragment-Ansatz dar, welcher die Peptid-Zwischenprodukt-Gruppe 20 aus Tabelle 2 verwendet, um Volllängen-T-20 zu synthetisieren. Zu dieser Gruppe wird angemerkt, dass Aminosäurerest (der T-20-carboxyterminale Aminosäurerest) einzeln während des Fragment-Verbindungs-Prozesses eingefügt wird.
Lösungsphasen-Peptidsynthesetechniken, die dem Fachmann wohl bekannt sind, können zur Synthese der erfindungsgemäßen Peptid-Zwischenproduktfragmente verwendet werden. Die Beispiele, die in Abschnitten 8.1–8.11 dargestellt sind, beschreiben beispielhafte Lösungsphasen-Peptidsynthesen von Peptidzwischenprodukten, die in Tabellen 1, 2 und/oder 3 aufgelistet sind. Zum Beispiel unter den nicht-silica-beladenen Säulenpackungen, die einen breiten pH-Bereich aufweisen, der pH-Bereiche umfasst, die größer sind als der, welche von Tosohaus (Montgomeryville, PA) vertrieben werden [Anm: Ist auch im englischen Text nicht sinnig].
6. Harzsynthesen
Hierin beschrieben, in Abschnitten 6.1–6.3, sind Beispiele, in denen Chlortritylharze synthetisiert werden, welche in Verbindung mit Festphasensynthesen der hierin beschriebenen Peptide und Peptidzwischenprodukte verwendet werden können.
6.1 Herstellung von Fmoc-Trp(Boc)-2-Chlortritylharz
Verfahren:
Das 2-Chlortritylchloridharz (25 g, 1 Äqu.) wurde in eine 500 ml Peptidkammer geladen und mit 250 ml DCM gewaschen. Man ließ das Bett leer laufen und es wurde eine Lösung des Fmoc-Trp(Boc)-OH (1,5 Äqu.) und DIEA (1,7 Äqu.) in 10 Volumenteile DCE hinzugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoffbegasung für 2 Stunden geschüttelt.
Das Bett ließ man leer laufen und man wusch mit 250 ml DCM. Die aktiven Stellen des Harzes wurden mit 200 ml einer 9:1 Lösung MeOH:DIEA für 20 Minuten endversiegelt. Das Bett ließ man leer laufen und es wurde mit 4 × 250 ml DCM gewaschen, und mit einer Stickstoffspülung unter Erhalt von 34,3 g beladenem Harz getrocknet.
Eine quantitative HPLC-Analyse wurde durchgeführt, indem die Fmoc-Aminosäure von dem Harz abgeschnitten wurde und gegen einen Standard untersucht wurde. Der HPLC-Assay des Materials zeigte eine Beladung der Säule bei 0,68 mmol/g.
Säule: Phenomenox Jupiter C18; 300 Å; 5 μ
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässriges TFA
B: 0,1% TFA in Acetonitril
65% B isokratisch
Retentionszeit: ~14 Minuten
6.2 Herstellung von Fmoc-Gln-2-Chlortritylharz
Verfahren:
Das Verfahren, das in dem Beispiel, das in 6.1 oben dargestellt ist, verwendet wurde, wurde unter Verwendung einer Lösung aus FmocGlnOH (1,5 Äqu.) und DIEA (1,7 Äqu.) in einem Gemisch aus 75 ml DCE und 200 ml DMF wiederholt. Die Zugabe von DMF stabilisiert FmocGlnOH. Die Reaktion führte zu einer Ausbeute von 33,8 g beladenem Harz. Eine theoretische Beladung des Harzes bei 0,74 mmol/g wurde angenommen und das Material wurde übertragen.
6.3 Herstellung von Fmoc-Leu-2-Chlortritylharz
Verfahren:
Das Harz wurde in eine 3 l Peptidkammer geladen und mit 1,5 DCM gewaschen. Man ließ das Bett ablaufen und eine Lösung aus FmocLeuOH (1,5 Äqu.) und DIEA (1,7 Äqu.) in 8 Volumenteilen DCE wurde hinzugegeben. Das Gemisch wurde unter Stickstoffbegasung für 2 Stunden umgewälzt. Man ließ das Bett ablaufen und es wurde mit 1,5 l DCM gewaschen. Die aktiven Stellen auf dem Harz wurden mit 1,5 l einer 9:1 Lösung MeOH:DIEA für 30 Minuten endversiegelt. Dann ließ man das Bett ablaufen, es wurde mit 4 × 1,5 l DCM gewaschen, und mit einer Stickstoffspülung getrocknet, unter Erhalt von 345 g beladenem Harz.
Es wurde eine quantitative HPLC-Analyse durchgeführt, indem die Fmoc-Aminosäure vom Harz abgeschnitten wurde und gegenüber einem Standard untersucht wurde. Der HPLC-Assay des Materials zeigte eine Beladung des Harzes bei 0,72 mmol/g.
Säule: Phenomenox Jupiter C18; 300 Å; 5 μ
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA
B: 0,1% TFA in Acetonitril
65% B isokratisch
Retentionszeit: ~8 Minuten
7. Beispiel: Festphasensynthese von Peptiden
Unten dargestellt, in Abschnitten 7.1–7.6, sind Beispiele der Festphasensynthese von Peptidzwischenprodukten, wie sie in Tabellen 1, 2 und/oder 3 aufgelistet sind.
7.1 Herstellung von Fragment Fmoc-AA(1–8)-OH (Fragment 1b)
Struktur:

Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO: 2)
C₉₃H₁₂₁N₁₀O₁₅
MW 1619,06

* pro Kopplungs- bzw. Verbindungszyklus
Theoretische Ausbeute: 25,3 g Erwartete Ausbeute: 80–90%
Tatsächliche Ausbeute: 20,0 g

Verfahren:
In eine 1 l Peptidreaktionskammer wurden 20 g Fmoc-Leu-2-Chlortritylharz geladen. Das Harz wurde in 200 ml (~10 Vol.) DCM unter Stickstoffumwälzung für ungefähr 15 Minuten konditioniert, um die Kügelchen quellen zu lassen, dann wurde ablaufen gelassen.
Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Entfernung vom terminalen Amin wurde unter Verwendung von 2 × 200 ml einer 20%igen Lösung Piperidin in NMP für jeweils 10 Minuten erreicht. Das Harz wurde dann 5–7 mal mit 200 ml (~10 Vol.) NMP gewaschen, um Fmoc-Nebenprodukte (Dibenzofulven und sein Piperidin-Adduct) und übriges Piperidin zu entfernen, was mittels eines negativen Chloraniltestes bestätigt wurde.
Indessen wurde die nachfolgende Aminosäure in der Sequenz, Fmoc-Ser(tBu), zur Reaktion am Carboxyterminus aktiviert. Die Fmoc-geschützte Aminosäure (1,5 Äqu.), HOBT (1,5 Äqu.), und DIEA (1,5 Äqu.) wurden in 150 ml (~7,5 Vol.) NMP bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wurde auf 0–5°C abgekühlt, dann wurde das HBTU (1,5 Äqu.) hinzugegeben und es wurde 5–15 Minuten gerührt, um zu lösen. Die Lösung der aktivierten Säure wurde auf das drainierte Harz geladen, und mit 50 ml DCM (~2,5 Vol.) eingewaschen. Die Reaktion wurde unter N²-Begasung für 1 Stunde umgewälzt. Die Beendigung der Verbindung wurde mittels des qualitativen Ninhydrintestes überwacht. Nachdem die Verbindungsreaktion als beendet beurteilt wurde, ließ man das Harz ablaufen und es wurde mit 3 × 200 ml (1 Vol.) NMP gewaschen.
Der Zyklus wurde für nachfolgende Polymereinheiten des Peptidfragments unter Verwendung von jeweils 1,5 Äquivalenten Fmoc-geschützten Aminosäuren His(trt), Ile, Leu, Ser(tBu), Thr(tBu) und Tyr (tBu) wiederholt. Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 200 ml (10 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 200 ml (10 Vol.) DCM. Das Harz wurde mit einer Stickstoffspülung getrocknet, unter Erhalt von 42 g harz-gebundenem Peptid.
Das Peptid wurde von einer 21 g Menge des Harzes unter Verwendung von 300 ml 1%igem TFA in DCM für ungefähr 2 Minuten abgeschnitten, gefolgt von 200 ml 0,5%igem TFA in DCM. Die Abschneidefraktionen wurden auf Pyridin aufgefangen (1:1 Volumenverhältnis zu TFA). Die Abschneide-Waschfraktionen wurden kombiniert und unter Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 50 ml aufkonzentriert, dann mit 110 ml Ethanol wieder gelöst, wobei das Aufkonzentrieren bis zu einem Endvolumen von ~250 ml fortgesetzt wurde, um restliches DCM zu entfernen. Das Produkt wurde durch Zugabe von 200 ml Wasser präzipitiert. Die schlammige Masse wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten gerührt. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und mit ~100 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 20,0 g (79%) Fmoc-AA(1–8)-OH von 95%iger HPLC-Reinheit.
Säule: Phenomenox Jupiter C18
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA
B: 0,1% TFA im Acetonitril-Gradienten von 80% B bis 99% B in 20 Minuten
Retentionszeit: ungefähr 23 Minuten
7.2 Herstellung von Fragment Fmoc-AA(9–15)-OH (Fragment 5b)
Struktur:

Fmoc-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-OH (SEQ ID NO: 6)
C₁₁₇H₁₂₉N₁₀O₁₈
MW 1963,39

* pro Kopplungs- bzw. Verbindungszyklus
Theoretische Ausbeute: 23,6 g Erwartete Ausbeute: 89–95%
Tatsächliche Ausbeute: 21,1 g

Verfahren:
Das Verfahren, das in dem Beispiel verwendet wurde, das in Abschnitt 7.1 oben dargestellt ist, wurde unter Verwendung von 20,0 g Fmoc-Gln(trt)-2-Chlortritylharz, und Fmoc-geschützten Aminosäuren Asn(trt), Gln(trt), Ser(tBu), Glu(tBu), Glu(tBu) und Ile wiederholt.
Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 200 ml (10 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 200 ml (10 Vol.) DCM.
Das Peptid wurde unter Verwendung von 200 ml 8:1:1 DCM:TFE:HOAc für 2 Stunden abgeschnitten, gefolgt von Waschschritten mittels 2 × 100 ml DCM. Die kombinierten Eluate wurden unter Vakuum auf ein Volumen von ~100 ml aufkonzentriert, dann mit 250 ml Heptan wieder gelöst, während das Aufkonzentrieren bis auf ein Endvolumen ~250 ml fortgeführt wurde, um restliches DCM zu entfernen. Die Heptanlage wurde von dem biphasischen Gemisch, welches sich bildete, abgetrennt. Das Produkt wurde durch Zugabe von 250 ml Heptan und 100 ml MTBE präzipitiert, dann über Nacht bei Raumtemperatur wieder gelöst, unter Erhalt eines Materials der gewünschten Konsistenz. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und mit ungefähr 100 ml Heptan gewaschen. Das Produkt wurde nachbearbeitet, um restliche Essigsäure zu entfernen. Die abgefilterten Feststoffe wurden in 60 ml Isopropanol bei 50°C gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0–5°C abgekühlt, dann wurden schnell tropfenweise 60 ml Wasser hinzugegeben. Die schlammige Produktmasse wurde durch Rühren über ~1 Stunde in dem Eisbad zerrieben. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration isoliert und mit ~50 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 21,1 g (90%) Fmoc-AA(9–15)-OH von 95%iger HPLC-Reinheit.
Säule: Phenomenox Jupiter C18
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA
B: 0,1% TFA im Acetonitril-Gradienten von 80% B bis 99% B in 20 Minuten
Retentionszeit: ~23 Minuten
7.3 Herstellung von Fragment Fmoc-AA(1–16)-OH (Fragment 3d)
Struktur:

Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C₁₉₉H₂₄₅N₂₂O₃₂
MW 3457,30

* pro Kopplungs- bzw. Verbindungszyklus
Theoretische Ausbeute: 48,9 g Erwartete Ausbeute: 85–90%

Verfahren:
Das in dem Beispiel, das in Abschnitt 7.1 dargestellt ist, verwendete Verfahren wurde unter Verwendung von 32,5 g Fmoc-Gln-2-Chlortritylharz und den erforderlichen Fmoc- geschützten Aminosäuren wiederholt. Die Reaktion wurde wie in dem Beispiel, das in Abschnitt 6.1 oben dargestellt ist, beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme von leicht unterschiedlichen Volumenteilen Lösungsmitteln, die verwendet wurden, wie in dem Abschnitt Materialien oben angegeben.
Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 250 ml (8 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 250 ml (8 Vol.) DCM. Das Harz wurde unter einer Stickstoffspülung getrocknet, unter Erhalt von 97,4 g gebundenem Peptid.
Im 17,7 g Maßstab wurde das Harz-gebundene Peptid von dem Harz abgeschnitten unter Verwendung von 2 × 190 ml 1% TFA in DCM über 1–2 Minuten, gefolgt von 1 × 120 ml mit DCM. Die Abschneidefraktionen wurden auf Pyridin (1:1 Volumenverhältnis zu TFA) gesammelt. Die Fraktionen und Waschfraktionen wurden kombiniert und unter Vakuum auf ein Volumen auf ~50 ml aufkonzentriert, dann mit 200 ml wieder gelöst. Das Aufkonzentrieren wurde bis zu einem Endvolumen von ~50 ml fortgesetzt, um restliches DCM zu entfernen. Das Produkt wurde durch Zugabe von 250 ml Wasser präzipitiert und bei Raumtemperatur für ~30 Minuten gerührt. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und mit ~50 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 12,8 g (84%). Das Produkt wurde nachbearbeitet, um Pyridinsalze zu entfernen. Die gefilterten Feststoffe wurden in 150 ml Methanol bei Raumtemperatur gelöst. Die Zugabe von 200 ml Wasser bei Raumtemperatur führte zur Präzipitation des Produktes. Das Produkt wurde mittels Vakuumfiltration isoliert und mit ungefähr 50 ml Wasser gewaschen. Das Material wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 12,8 g (84%) Fmoc-AA(1–16)-OH.
Säule: Phenomenox Jupiter C18
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA
B: 0,1% TFA im Acetonitril-Gradienten von 75% B bis 99% B in 20 Minuten
Retentionszeit: ~25 Minuten
7.4 Herstellung von Fragment Ac-AA(1–16)-OH (Fragment 3c)
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-lle-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C₁₈₆H₂₃₇N₂₂O₃₁
MW 3274,76

Verfahren:
Das Verfahren, das in dem Beispiel verwendet wurde, das in Abschnitt 7.1 oben dargestellt ist, wurde unter Verwendung von 32,5 g Fmoc-Gln-2-Chlortritylharz und den erforder lichen Fmoc-geschützten Aminosäuren, und den Lösungsmittelvolumenteilen, die in dem Abschnitt Materialien oben angegeben sind, wiederholt.
Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 250 ml (8 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 250 ml (8 Vol.) DCM. Das Harz wurde unter einer Stickstoffspülung getrocknet, unter Erhalt von 97,4 g gebundenem Peptid.
Im 10 g-Maßstab wurde das Harz-gebundene Peptid mit Essigsäureanhydrid und Pyridin (je 5 Äqu.) in 100 ml 3:1 NMP:DCM für 30 Minuten acetyliert, dann mit 2 × 25 ml DCM gewaschen. Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 3 × 50 ml 1%igem TFA in DCM abgeschnitten, gefolgt von 2 × 50 ml-Waschschritten mit DCM. Die Abschneidefraktionen wurden auf Pyridin (1:1 Volumenverhältnis zu TFA) gesammelt. Die Fraktionen und Waschfraktionen wurden kombiniert und unter Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 100 ml aufkonzentriert, dann mit 3 × 50 ml Heptan, das portionsweise zugegeben wurde, wieder gelöst, während das Aufkonzentrieren bis zu einem Endvolumen von ~150 ml fortgesetzt wurde, um restliches DCM zu entfernen. Das Produkt präzipitierte anfänglich mit einer irgendwie klebrigen Konsistenz, wurde aber durch Rühren über ~30 Minuten in einem Eisbad bei 0–5° zu einem filtrierbaren Feststoff vermahlen. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und mit ~50 ml Heptan gewaschen. Das Produkt wurde nachbearbeitet, um Pyridinsalze zu entfernen. Die filtrierten Feststoffe wurden in 50 ml Methanol bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0–5°C abgekühlt, dann wurden schnell 50 ml Wasser tropfenweise hinzugegeben. Das Material präzipitierte anfänglich als ein klebriger Feststoff, welcher durch Rühren über ~1 Stunde im Eisbad zu einer filtrierbaren Konsistenz pulverisiert wurde. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltration isoliert und mit ~25 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 7,0 g (90%) AcAA(1–16)-OH. Das Produkt wurde anschließend nachbearbeitet, wie oben beschrieben, unter Erhalt von 6,3 g (89% Wiedergewinnung) Material von 96% HPLC-Reinheit.
Säule: Zorbax LP C8; 100 Å; 20 μ
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 220 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässriges TFA
B: 1:1 ACN:IPA mit 0,05% TFA-Gradienten von 80% B bis 99% B in 20 Minuten
Retentionszeit: ~15 Minuten
7.5 Herstellung von Fragment Fmoc-AA(17–26)-OH (Fragment 10b)
Struktur:

Fmoc-Glu(tBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(tBu)-Gln(trt)-Glu(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Leu-OH (SEQ ID NO: 11)
C₁₂₇H₁₆₇N₁₃O₂₅
MW 2275,82

* pro Kopplungs- bzw. Verbindungszyklus
Theoretische Ausbeute: 44,4 g Erwartete Ausbeute: 90–105%
Tatsächliche Ausbeute: 46,9 g (105%)

Verfahren:
Das Verfahren, das in dem Beispiel verwendet wurde, das in dem Abschnitt 7.1 oben dargestellt ist, wurde unter Verwendung von 25,0 g Fmoc-Leu-2-Chlortritylharz, den erforderlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren und den Lösungsmittelvolumenteilen, die in dem Abschnitt Materialien oben angegeben sind, wiederholt.
Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 250 ml (10 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 250 ml (10 Vol.) DCM.
Das Peptid wurde vom Harz unter Verwendung von 3 × 400 ml (~15 Vol.) 1%igem TFA in DCM abgeschnitten, gefolgt von 1 × 200 ml (7,5 Vol.) DCM. Die Abschneidefraktionen wurden auf Pyridin (1:1 Volumenverhältnis zu TFA) gesammelt, dann wurden die Fraktionen und Waschfraktionen im Hinblick auf den Produktgehalt untersucht. Die Fraktionen, die Produkt enthielten, wurden kombiniert und unter Vakuum auf ein Volumen von ~100 ml aufkonzentriert, dann mit 300 ml Ethanol wieder gelöst. Das Aufkonzentrieren wurde bis zu einem Endvolumen von ~250 ml fortgeführt, um restliches DCM zu entfernen. Zur gerührten Lösung wurden 300 ml Wasser gegeben, um das Produkt zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und mit ~50 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 46,4 g (105%) Fmoc-AA(17–26)-OH von 97%iger HPLC-Reinheit.
Säule: Phenomenox Jupiter C18
Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA
B: 0,1% TFA im Acetonitril-Gradienten von 75% B bis 99% B in 20 Minuten
Retentionszeit: ~25 Minuten
7.6 Herstellung von Fragment Fmoc AA(27–35)-OH (Fragment 16b)
Struktur:

Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-OH (SEQ ID NO: 17)
C₁₂₁H₁₄₈N₁₄O₂₄
MW 2182,61

Verfahren:
Das in dem Beispiel, das in Abschnitt 7.1 oben dargestellt ist, verwendete Verfahren wurde unter Verwendung von 33,0 g Fmoc-Trp(Boc)-2-Chlortritylharz, den erforderlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren, und den Materialien, die in dem Abschnitt Materialien oben angegeben sind, wiederholt.
Nach der letzten Verbindungsreaktion wurde das Harz mit 4 × 250 ml (7,5 Vol.) NMP gewaschen, dann mit 4 × 250 ml (7,5 Vol.) DCM.
Das Peptid wurde durch Behandlung mit 300 ml (~10 Vol.) einer Lösung aus 8:1:1 DCM:TFE:HOAc über 2 Stunden von dem Harz abgeschnitten. Man ließ das Harz ablaufen und es wurde mit 2 × 250 ml DCM gewaschen. Die Abschneidelösung und die Waschfraktionen wurden kombiniert und auf ein Volumen von ~50 ml aufkonzentriert, dann wurde mit 250 ml Ethanol wieder gelöst. Die Lösung wurde unter Rühren in einem Eisbad auf 0–5°C abgekühlt. Zur gerührten Lösung wurden 125 ml Wasser gegeben, um das Produkt zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und mit ~50 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 32,0 g (65,4%) Fmoc-AA(27–35)-OH von 95%iger HPLC-Reinheit.
Das Harz wurde mit 2 × 250 ml einer 1%igen Lösung aus TFA in DCM behandelt, gefolgt von einem Waschschritt mit 100 ml DCM. Die Abschneidefraktionen wurden auf Pyridin in einem 1:1 Volumenverhältnis zu TFA gesammelt. Die kombinierten Eluate und Waschfraktionen wurden auf ein Volumen von ~50 ml aufkonzentriert. Zu der Lösung wurden 100 ml Ethanol gegeben, dann 150 ml Wasser. Die schlammige Produktmasse wurde vakuumfiltriert, unter Erhalt von einem zweiten Ertrag von 10,7 g (21,9%) (95% HPLC-Reinheit), was eine kombinierte Ausbeute von 87,3% ergab. Das Abschneiden mit 1% TFA/DCM ist bevorzugt, und zwar aufgrund seiner größeren Effektivität und der geringeren Volumina.
Säule: Phenomenox Jupiter C5, 300 Å, 5 μ
Fließgeschwindigkeit: 0,75 ml/min
Detektion: UV bei 260 nm
Mobile Phase: A: 0,05% wässrige TFA
B: 0,1% TFA in 1:1 IPA:MeOH-Gradient von 70% B bis 97% B in 10 Minuten
Retentionszeit: ~25 Minuten
8. Beispiel: Lösungsphasensynthese von Peptidfragmenten
Unten dargestellt, in Abschnitten 8.1–8.11 sind Beispiele für die Lösungsphasensynthese von Peptidzwischenprodukten, wie sie in Tabellen 1, 2 und/oder 3 aufgelistet sind.
8.1 Herstellung von Fragment Fmoc-AA9–16OPNB durch Verbinden von Paranitrobenzylester (OPNB) von Glutamin an Fmoc-AA9–15OH
Struktur:

Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)
C₁₂₉H₁₄₁N₁₃O₂₂
MW 2227,65

Theoretische Ausbeute: 21,5 g Erwartete Ausbeute: 90–105%

Verfahren:
FmocAA9–150H (synthetisiert wie oben in Abschnitt 7.2), HBrGlnOPNB, HOAT und EtPr₂N wurden in einem 1 l Rundkolben, der einen Magnetrührer enthielt, zusammengegeben, und es wurde NMP (200 ml) hinzugegeben. Die daraus hervorgehende Lösung wurde in eine Stickstoffatmosphäre gebracht und auf 0–5°C unter Rühren abgekühlt. Zur kalten Lösung wurde HBTU gegeben. Die Lösung wurde für 15 Minuten bei 0–5°C gerührt, das Eisbad wurde entfernt und das Rühren wurde für 2,5 Stunden fortgesetzt (Anmerkung 1).
Das Reaktionsgemisch wurde auf 0–5°C abgekühlt, und 0,5 N wässriges HCl (250 ml) wurde hinzugegeben, um das geschützte Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und in der Filterflasche getrocknet, unter Erhalt von 24 g rohem FmocAA9–16OPNB. Der Feststoff wurde in Ethylacetat (250 ml) gelöst, über Magnesiumsulfat getrocknet (10 g), filtriert und auf ein Volumen von 100 ml aufkonzentriert. Die Lösung wurde auf 0–5°C abgekühlt und es wurde Hexan (250 ml) hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Der Feststoff wurde mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, wodurch 21,5 g FmocAA9–16OPNB mit 100% Ausbeute und 91–94%iger HPLC-Reinheit bereitgestellt wurden (Anmerkung 2).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle (IPC) mittels Dünnschichtchromatographie (TLC). 90/10 Chloroform/Ethanol UV, Ioddetektion Rt FmocAA9–15OH 0,46 Rt FmocAA9–16OPNB 0,57
2. Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 70–97% B über 10 Minuten, 97% B für 8 min. Retentionszeit: 13,3 Minuten

8.2 Herstellung von Fragment HCl HAA9–16OPNB
Struktur:

HCl H-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 7)
C₁₄₄H₁₃₁ClN₁₃O₂₀
ME 2041,02

Theoretische Ausbeute: 19,2 g Erwartete Ausbeute: 85–105%

Verfahren:
Ein 1 l Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit FmocAA9–16OPNB (wie in Abschnitt 8.1 oben synthetisiert) und 20:1 Tetrahydrofuran/Piperidin beschickt. Die daraus hervorgehende Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 60 Minuten gerührt (Anmerkung 1). Es wurde Hexan (350 ml) hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Das Lösungsmittel wurde vom klebrigen Feststoff dekantiert. Der Feststoff wurde mit MTBE (200 ml) bei Raumtemperatur über 18 Stunden pulverisiert. Der Feststoff wurde mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 18,9 g HAA9–16OPNB (Anmerkung 2).
Der Feststoff wurde in Methanol (150 ml) gelöst, auf 0–5°C unter Rühren abgekühlt. 0,5 N wässrige Salzsäure (100 ml) wurde hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (50 ml) und dann mit 2-Propanol (50 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 17,7 g HCl HAA9–16OPBN, mit 92%iger Ausbeute und einer HPLC-Reinheit von 92A% (Anmerkung 3).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 70–97% B über 10 min, 97% über 8 min. Retentionszeit: FmocAA9–16OPNB, 13,3 Minuten; HAA9–16OPNB, 10,7 Minuten
2. HAA9–16OPNB, das an diesem Punkt isoliert wurde, enthält Spurenmengen von Piperidin und dem Benzylfulven-Piperidin-Adduct. Beide werden vor der Verbindung mit RAA1–8OH entfernt.
3. Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min, 100% B für 5 min. Retentionszeit: HAA9–16OPNB, 7,2 Minuten TLC-Bedingungen: 90/10 Dichlormethan/Ethanol UV, Ioddetektion Rf: HAA9–16OPNB, 0,64

8.3 Herstellung von Fragment AcAA1–16OPNB mittels Lösungsphasen-Verbindung von Fragmenten AcAA1–8OH und HAA9–16OPNB
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID No: 4)
C₁₉₄H₂₄₆N₂₃O₃₄
MW 3427,43

Theoretische Ausbeute: 0,38 Erwartete Ausbeute: 85–105%

Verfahren:
Ein 25 ml Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit AA1–8OH (wie in Abschnitt 7.1 oben synthetisiert), HCl HAA9–16OPNB (wie in Abschnitt 8.2 oben synthetisiert) und HOAT beschickt. Die Feststoffe wurden in 9:1 DMF:DMSO (5 ml), das EtPr₂N enthielt, gelöst, dann auf 0–5°C unter einer Stickstoffatmosphäre abgekühlt (Anmerkung 1). Zur kalten Lösung wurde HBTU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0–5°C für 15 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 60 Minuten gerührt (Anmerkung 2). Das Peptid wurde aus der Lösung durch Zugabe von Wasser (7 ml) präzipitiert. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (10 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 0,36 g rohem AcAA1–16OPNB. Der Feststoff wurde mit MTBE (3,5 ml) über 1,5 Stunden bei Raumtemperatur pulverisiert, mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,335 g AcAA1–16OPNB mit einer Ausbeute von 88% und 82A%iger HPLC-Reinheit (Anmerkung 3).
Anmerkungen:

1. Es ist wichtig, dass alle Feststoffe in Lösung vorliegen, bevor auf 0–5°C abgekühlt wird und HBTU hinzugegeben wird.
2. Prozessinterne Kontrolle, TLC, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min., 100% B für 5 min. Retentionszeit: HAA9–16OPNB, 7,2 Minuten (Ac1–8OH weist bei 160 nm keine Absorption auf.) Retentionszeit: AcAA1–16OPBN, 12,45 TLC-Bedingungen 90/10 Chloroform/Ethanol UV, Ioddetektion Rf: HAA9–16OPNB, 0,64 Rf: Ac1–8OH, 0,35 Rf: Ac1–16OH, 0,48
3. Phenomenex Jupiter, C5 5 μ, 300A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 70–97% B über 10 min., 97% B für 8 min. Retentionszeit: Ac1–16OPBN, 16,4

8.4 Herstellung von Fragment FmocAA1–16OPNB mittels Lösungsphasen-Verbindung von Fragmenten FmocAA1–8OH und HCl HAA9–16OPNB
Struktur:

Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C₂₀₇H₂₅₃N₂₃O₃₄
MW 3607,49

Theoretische Ausbeute: 28,3 g Erwartete Ausbeute: 85–100%

Verfahren:
Ein 1 l Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit FmocAA1–8OH (wie in Abschnitt 7.1 oben synthetisiert), HCl HAA9–16OPNB (wie in Abschnitt 8.2 oben synthetisiert), HOAT und DMF (250 ml) beschickt. Zur Lösung wurde EtPr₂N hinzugegeben. Die Lösung wurde auf 0–5°C abgekühlt und HBTU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0–5°C für 15 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 70 Minuten gerührt (Anmerkung 1). Das Reaktionsgemisch wurde auf 0–5°C abgekühlt und es wurde 10% Natriumchlorid/Wasser (200 ml) hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (50 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 27 g rohem FmocAA1–16OPNB. Der Feststoff wurde in Methanol (200 ml) gelöst und zu einer gerührten Lösung aus Natriumchlorid in Wasser (10% Gewicht/Volumen, 300 ml) gegeben. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (50 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 26 g FmocAA1–16OPNB mit 92% Ausbeute und 90A%iger Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 1).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min., 100% B für 5 min. Retentionszeit: HAA9–16OPNB, 7,2 Minuten, FmocAA1–8OH, 7,9 Minuten Retentionszeit: FmocAA1–16OPBN, 14,5 Minuten

8.5 HerstellunG von Fragment H-AA1–16OPNB
Struktur:

H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID NO: 4)
C₁₉₂H₂₄₃N₂₃O₃₂
MW 3384,41

Theoretische Ausbeute: 0,94 g Erwartete Ausbeute: 90–105%

Verfahren:
Ein 50 ml Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit FmocAA1–16OPNB (wie in Abschnitt 8.4 oben synthetisiert), Dichlormethan (11,4 ml) und Piperidin (0,6 ml) beschickt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 90 Minuten gerührt (Anmerkung 1). Es wurde Hexan (45 ml) zum Reaktionsgemisch hinzugegeben und das Lösungsmittelvolumen wurde mittels Vakuumdestillation auf 25 ml reduziert. Die daraus hervorgehenden Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und unter Erhalt von 0,96 g HAA1–16OPNB mit einer Ausbeute von 102% abgenommen. Eine HPLC-Analyse des Feststoffes zeigte 72A% HAA1–16OPNB und 18A% Fulven und Piperidin-Fulven-Adduct an.
Anmerkungen:

1. Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0–05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min., 100% B für 5 min. Retentionszeit: FmocAA1–16OPNB, 14,1 min. Retentionszeit: HAA1–16OPNB, 11,6 min. Retentionszeit: Fulven und Piperidin-Fulven-Adduct, 5,5 und 4,8 min.

8.6 Herstellung von Fragment Ac-AA1–16OPNB mittels Acetylierung des N-Terminus von HAA1–16OPNB
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OPNB (SEQ ID No: 4)
C₁₉₄H₂₄₆N₂₃O₃₄
MW 3427,43

Theoretische Ausbeute: 0,96 g Erwartete Ausbeute: 80–100%

Verfahren:
Ein 50 ml Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, wurde mit HAA1–16OPNB (wie in Abschnitt 8.5 oben synthetisiert), DMF (10 ml), Essigsäureanhydrid und Pyridin beschickt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur unter einer Stickstoff atmosphäre für 60 min. gerührt (Anmerkung 1). Wasser (20 ml) wurde hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfitration abgenommen, mit Wasser (10 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 0,87 g AcAA1–16OPNB. Um restliches Fulven und Piperidin-Fulven-Adduct zu entfernen, wurde der Feststoff mit 1:1 MTBE/Hexan (20 ml) für 4,5 Stunden bei Raumtemperatur vermahlen. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,82 g AcAA1–16OPNB, mit 85%iger Ausbeute und 90A%iger Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 1).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min., 100% B für 15 min. Retentionszeit: HAA1–16OPNB, 11,6 min. Retentionszeit: AcAA1–16OPBN, 12,1 min. TLC, 10% Ethanol in Dichlormethan UV, Ioddetektion Rf AcAA1–16OPNB, 0,69

8.7 Herstellung von Fragment AcAA1–16OH durch selektives Entfernen einer Paranitrobenzyl-Schutzgruppe von AcAA1–16OPNB in Anwesenheit von His(trt).
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-OH (SEQ ID NO: 4)
C₁₈₇H₂₄₁N₂₂O₃₂
MW 3276,4

Theoretische Ausbeute: 0,76 g Erwartete Ausbeute: 70–85%

Verfahren:
Ein 25 ml Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit AcAA1–16OPNB (wie in Abschnitt 8.6 oben synthetisiert) und DMF (10 ml) beschickt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus Ammoniumformiat in Wasser (0,5 ml) gegeben, dann nasses Palladium auf Kohlenstoff (Degussa, 10%, 50% Wasser). Die schlammige Masse wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 120 Minuten gerührt (Anmerkung 1). Die schlammige Masse wurde durch ein dicht gepacktes Celitebett in 90 ml Wasser filtriert. Der Filterkuchen wurde mit DMF (5 ml) gewaschen. Die wässrige Suspension wurde mit Ethylacetat (100 ml) gewaschen. Das Ethylacetat wurde dann auf ein Volumen von 20 ml aufkonzentriert (Anmerkung 2). Es wurde Hexan (40 ml) hinzugegeben, um die Präzipitation zu vervollständigen, und das Lösungsmittel wurde von den Feststoffen dekantiert. Die Feststoffe wurden in Methanol (10 ml) gelöst und 4:1 Wasser/gesättigtes wässriges Natriumchlorid (25 ml) wurde hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (10 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 0,62 g AcAA1–16OH. Die Feststoffe wurden mit 50% MTBE/Hexan (8 ml) bei Raumtemperatur für 15 Stunden pulverisiert, abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,59 g AcAA1–16OH mit 77% Ausbeute und 90A% Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 3).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, TLC 80/20 Dichlormethan/Ethanol UV, Ioddetektion Rf: ACAA1–16OPNB, 0,90 Rf: Ac1–16OH, 69
2. Das AcAA1–16OH kann zu präzipitieren beginnen, wenn das Lösungsmittelvolumen vermindert wird.
3. Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 Minuten, 100% B für 5 Minuten Retentionszeit: AcAA1–16OH, 10,73 Minuten.

8.8 Herstellung von Fragment FmocAA27–36NH₂ mittels Lösungsphasen-Verbindung von FmocAA27–35OH mit HPheNH₂
Struktur:

Fmoc-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID No: 18)
C₁₃₀H₁₅₉N₁₆O₂₄
MW 2329,64

Theoretische Ausbeute: 42,8 g Erwartete Ausbeute: 90–105%

Verfahren:
Ein 2 l Rundkolben, der einen magnetischen Rührstab enthielt, wurde mit FmocAA27–35OH (wie in Abschnitt 7.6 oben synthetisiert), HOAT, HPheNH₂ und DMF (500 ml) beschickt. Es wurde EtPr₂N hinzugegeben und die Lösung wurde auf 0–5°C abgekühlt, dann wurde HBTU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für 15 Minuten bei 0–5°C gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 70 Minuten gerührt (Anmerkung 1). Die Lösung wurde auf 0–5°C abgekühlt und es wurde Wasser (500 ml) hinzu gegeben, das Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (100 ml) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 43 g FmocAA27–36NH₂ mit 100% Ausbeute und 93A%iger Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 2).
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, TLC 88/12 Dichlormethan/Methanol UV, Ioddetektion Rf: FmocAA27–35OH, 0,49 Rf: FmocAA27–36NH₂, 0,63
2. Phenomenex Jupiter, C18, 5 μ, 300 A 1,0 ml/min, 260 nm A H₂O/0,1% TFA B ACN 75–99% B über 20 min., 99% B für 5 min. Retentionszeit: 29,4 Minuten

8.9 Herstellung von Fragment H-AA(27–36)-NH₂
Struktur:

H-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH₂ (SEQ ID No: 17)
C₁₁₅H₁₄₈N₁₆O₂₂
MW 2106,56

Theoretische Ausbeute: 19,6 g Erwartete Ausbeute: 85–95%

Verfahren:
Ein 250 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührer und einer Stickstoffdecke versehen war, wurde mit dem Fmoc-Fragment, synthetisiert wie in Abschnitt 8.8 oben, dem Methylenchlorid (~5 Vol) und dem Piperidin beschickt. Es wurde eine Lösung erhalten und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt (Anmerkung 1).
Die Lösung wurde mit 2 × 100 ml Wasser gewaschen, die Lagen wurden getrennt und die organische Lage wurde unter Vakuum bis auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert. MTBE wurde portionsweise hinzugegeben, 2 × 50 ml, während das Aufkonzentrieren fortgeführt wurde, um DCM bis zu einem Punkt starker Präzipitation und einem Endvolumen von ungefähr 150 ml zu entfernen.
Die schlammige Produktmasse wurde gerührt und in einem Eisbad bei 0–5°C für ungefähr 1 Stunde abgekühlt. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration isoliert und mit 2 × 15 ml MTBE gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet unter Erhalt von 17,6 g (89,6%) H-AA(27–36)-NH₂ von 95%iger HPLC-Reinheit (Anmerkung 2).
Anmerkungen:

1) Die Vervollständigung der Reaktion wird mittels HPLC überwacht: Säule: Phenomenox Jupiter C18; 300 Å; 5 μ Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min Detektion: UV bei 260 nm Mobile Phase: A: 0,1% wässriges TFA B: 0,1% TFA in Acetonitril Gradient von 75% B bis 99% B in 20 Minuten Retentionszeit: ungefähr 18 Minuten
2) Sowohl die Fmoc-Nebenprodukte, als auch das Dibenzofulven und sein Piperidinaddukt werden effektiv in der Aufbereitung entfernt; es sollte jedoch ein Verwendungstest durchgeführt werden, bevor das Material weiterverarbeitet wird. Wenn das Material den Verwendungstest nicht besteht, wird das Aufbereitungsverfahren wiederholt, indem der Feststoff in DCM (5 Vol.) gelöst wird und dann mit dem oben beschriebenen Prozess fortgefahren wird.

8.10 Herstellung von Fragment FmocAA17–36NH₂ durch Lösungsphasen-Verbindung von FmocAA17–26OH mit HAA27–36NH₂
Struktur:

Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 12)
C₂₄₂H₃₁₃N₂₉O₄₆
MW 4364,38

Theoretische Ausbeute: 41,5 g Erwartete Ausbeute: 80–85%

Verfahren:
Ein 2 l Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, wurde mit FmocAA17–26OH (synthetisiert wie in Abschnitt 7.5 oben), HAA27–36NH₂ (synthetisiert wie in Abschnitt 8.9 oben), HOAT und DMF (400 ml) beschickt. EtPr₂N wurde hinzugegeben, die gerührte Lösung wurde auf 0–5°C unter Stickstoffatmosphäre abgekühlt und HBTU wurde hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0–5°C für 15 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 2,5 Stunden gerührt (Anmerkung 1). Wasser (500 ml) wurde zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, um das Peptid zu präzipitieren (Anmerkung 2). Die daraus hervorgehende schlammige Masse wurde für 45 Minuten gerührt, die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (100 ml) gewaschen und getrocknet. Die Feststoffe wurden in den 2 l Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, zurückgegeben, und 60°C 2-Propanol (1,1 l) wurde hinzugegeben. Die schlammige Masse wurde unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt, während sie auf Raumtemperatur abkühlte (über Nacht). Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 37,5 g FmocAA17–36NH₂, mit 90% Ausbeute und 95,5A%iger Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 1).
Anmerkungen:

1. Verfahrensinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,75 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 min., 100% B für 25 min. Retentionszeit: FmocAA17–26OH, 8,2 Minuten, HAA26–36NH₂, 8,4 Minuten Retentionszeit: FmocAA17–36NH₂, 13,3 Minuten
2. Das Reaktionsgemisch wurde nach Zugabe des Wassers auf 38°C erwärmt.

8.11 Herstellung von Fragment H-AA(17–36)-NH₂
Struktur:

H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-NH₂ (SEQ ID NO: 19)
C₂₂₇H₃₀₃N₂₉O₄₄ HCl

Theoretische Ausbeute: 21,6 g Erwartete Ausbeute: 95–100%

Verfahren:
In einen 250 ml Rundkolben, der mit einem Luftrührer und einer Stickstoffdecke ausgerüstet war, wurde das Fmoc-Fragment, synthetisiert wie in Abschnitt 8.10 oben, das THF (ungefähr 7,5 Vol.) und die 5 N NaOH (~2,5 Vol.) gegeben. Eine zweiphasige Lösung wurde erhalten und bei Raumtemperatur für 10–15 Minuten gerührt (Anmerkung 1).
Die Lagen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 2–3 eingestellt. Die Lösung wurde dann mit 2 × 55 ml (2,5 Vol.) gesättigter Salzlauge gewaschen (Anmerkung 2). Die Lagen wurden getrennt, und die organische Lage wurde unter Vakuum bei 15–20°C ungefähr auf ein halbes Ursprungsvolumen aufkonzentriert. Heptan wurde portionsweise hinzugegeben, 3 × 25 ml, während das Aufkonzentrieren fortgeführt wurde, um bis zu einem Punkt der starken Präzipitation und einem Endvolumen von ungefähr 100 ml THF zu entfernen (Anmerkung 2).
Die schlammige Produktmasse wurde bei Raumtemperatur für ungefähr 2 Stunden gerührt. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration isoliert und mit ungefähr 50 ml Heptan gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, unter Erhalt von 21,0 g (97,5%) H-AA(17–36)NH₂.
Eine Nachbearbeitung kann durchgeführt werden, um restliches Dibenzofulven-Nebenprodukt zu entfernen. Das Produkt wurde bei Raumtemperatur in 200 ml Heptan für 3 Stunden aufgeschlämmt. Das Material wurde gefiltert, mit ungefähr 50 ml Heptan gewaschen, und luftgetrocknet, was zu einem Ertrag von 20,8 g (96,6%) Produkt mit über 95%iger HPLC-Reinheit führte.
Anmerkungen:

1) Die Vervollständigung der Reaktion wird mittels HPLC beobachtet: Säule: Zorbax LP C8; 1 OOA; 2011 Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. Detektion: UV bei 260 nm Mobile Phase: A: 0,1% wässriges TFA B: 0,05% TFA in 1:1 ACN:IPA Gradient von 80% B bis 99% B in 20 Minuten Retentionszeit: ungefähr 18 Minuten
2) Die Feststoffe präzipitieren anfänglich als wachsartige Gummimasse, welche rührbar bleibt und unter weiterem Aufkonzentrieren zu einem filtrierbaren Feststoff verrieben wird.

9. Beispiel: Synthese von Volllängen T-20-Peptiden
Unten in Abschnitten 9.1–9.5 sind Beispiele für die Verwendung der Peptid-Zwischenproduktfragmente zur Herstellung von Volllängen T-20-Peptiden dargestellt.
Das Beispiel, das in diesem Abschnitt dargestellt ist, zeigt die erfolgreiche Verbindung von Festphasen- und Lösungsphasen-Synthesetechniken zur Herstellung von Volllängen T-20-Peptid aus Peptidzwischenproduktfragmenten.
9.1 Herstellung von Fragment AcAA1–36NH₂ mittels Lösungs-Phasenverbindung von AcAA1–16OH mit HAA17–36NH₂
Der hier beschriebene Syntheseweg stellt die Kombination der T-20-Vier-Fragment-Ansätze dar, die schematisch in 1 und 3 dargestellt sind. In Beispielen, in denen AcAA1–16OH über Festphasen-Techniken synthetisiert wird, wird dem Ansatz in 1 gefolgt, und in Beispielen, in denen AcAA1–16OH über Lösungsphasentechniken synthetisiert wird, wird dem Ansatz in 3 gefolgt. Es ist zu bemerken, dass das T-20-Volllängen-Peptid, das hier synthetisiert wird, die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, mit einer Acetyl-Modifizierung am Aminoterminus (d.h. „X") und einer Amido-Modifikation am Carboxyterminus (d.h. „Z").
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 1)
C₄₁₄H₅₄₃N₅₁O₇₄
MW 7411,95

Theoretische Ausbeute: 1,77 g Erwartete Ausbeute: 85–100%

Verfahren:
Ein 100 ml Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, wurde mit AcAA1–16OH (wie entweder in Abschnitt 7.4 oben über Festphasentechniken synthetisiert, oder über Lösungsphasentechniken wie in Abschnitt 8.7 oben), HOAT, DMF (20 ml) und dann EtPr₂N (0,074 ml) beschickt. Die Lösung wurde auf 0–5°C unter Stickstoffatmosphäre abgekühlt und HBTU hinzugegeben. Die Lösung wurde für 15 Minuten bei 0–5°C gerührt und es wurde HClHAA17–36NH₂ (wie in Abschnitt 8.11 oben synthetisiert) hinzugegeben, gefolgt von zusätzlichen 0,041 ml EtPr₂N. Das Kühlbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch wurde für 2 Stunden gerührt (Anmerkung 1). Um das Peptid zu präzipitieren wurden Wasser (25 ml) und gesättigtes wässriges Natriumchlorid (5 ml) hinzugegeben. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser gewaschen (10 ml) und getrocknet, unter Erhalt von 1,74 g rohem AcAA1–36NH₂ (Anmerkung 2). Die Feststoffe wurden mit 50% MTBE/Hexan bei Raumtemperatur über 2,5 Stunden vermahlen, mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 1,70 g bei 96%iger Ausbeute und 92A%iger Reinheit mittels HPLC.
Anmerkungen:

1) Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% EPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 Minuten, 100% B für 15 Minuten Retentionszeit: AcAA1–16OH, 11,8 Minuten. Retentionszeit: HCl HAA17–36NH₂, 12,7 Minuten. Retentionszeit: AcAA1–36NH₂, 22,9 Minuten
2) Der Wasserausfall führt zu einem sehr feinen Präzipitat. Es kann eine doppelte Filtration erforderlich sein.

9.2 Herstellung von Fragment FmocAA1–36NH₂ (T-20) durch Lösungsphasen-Verbindung von FmocAA1–16OH mit HAA17–36NH2
Das Beispiel, das in diesem Abschnitt dargestellt ist, zeigt die erfolgreiche Verbindung von Fest- und Flüssigphasensynthesetechniken zur Herstellung eines T-20-Peptids aus Peptid-Zwischenproduktfragmenten. Insbesondere zeigt der hier beschriebene Syntheseweg den T-20-Drei-Fragment-Ansatz, der schematisch in 4 dargestellt ist, bis zu dem Punkt in der Figur, an dem FmocAA1–36NH₂ synthetisiert wird.
Struktur:

Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 1)
C₄₂₇H₅₅₁N₅₁O₇₅
MW 7593,01

Theoretische Ausbeute: 0,91 g Erwartete Ausbeute: 85–100%

Verfahren:
Ein 25 ml Rundkolben mit einem Magnetrührstab wurde mit FmocAA1–16OH (wie in Abschnitt 7.3 oben synthetisiert), HCl HAA17–36NH₂ (wie in Abschnitt 8.11 oben synthetisiert), HOAT, DMF (10 ml) beschickt, das EtPr₂N wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde auf 0–5°C unter Stickstoffatmosphäre abgekühlt und HBTU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0–5°C für 15 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und für 1,5 Stunden gerührt (Anmerkung 1). Wasser wurde hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren, und die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet. Die Feststoffe wurden mit 2-Propanol (14 ml) für 15 Stunden bei Raumtemperatur pulverisiert, dann wurde Wasser (3 ml) hinzugegeben, um das gewünschte Produkt aus der Lösung zu treiben. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,80 g FmocAA1–36NH₂ mit 88%iger Ausbeute und 85A%iger HPLC-Reinheit.
Anmerkungen:

1) Verfahrensinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 Minuten, 100% B für 15 Minuten Retentionszeit: FmocAA1–16OH, 11,4 Minuten. Retentionszeit: HCl HAA17–36NH₂, 12 Minuten. Retentionszeit: FmocAA1–36NH₂, 20,4 Minuten. TLC, 9/1 Dichlormethan/Ethanol UV, Ioddetektion Rft: FmocAA1–36NH₂, 0,71.

9.3 Herstellung von Fragment HAA1–36NH₂ (T-20)
Das Beispiel, das in diesem Abschnitt dargestellt ist, zeigt die erfolgreiche Verbindung von Fest- und Flüssigphasensynthesetechniken zur Herstellung eines T-20-Peptids aus Peptid-Zwischenproduktfragmenten. Insbesondere stellt der hier beschriebene Syntheseweg den T-20-Drei-Fragment-Ansatz dar, der schematisch in 4 dargestellt ist, bis zu dem Punkt in der Figur, an dem H-AA1–36-NH₂ synthetisiert wird.
Struktur:

H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 1)
C₄₁₂H₅₄₁N₅₁O₇₃
MW 7370,94

Theoretische Ausbeute: 0,77 g Erwartete Ausbeute: 85–95%

Verfahren:
Ein 25 ml Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, wurde mit FmocAA1–36NH₂ (wie in Abschnitt 9.2 oben synthetisiert), DMF (9,5 ml) und Piperidin (0,5 ml) beschickt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 2 Stunden gerührt (Anmerkungen 1, 2). Wasser (20 ml) und gesättigtes wässriges Natriumchlorid (5 ml) wurden hinzugefügt, um das geschützte Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden mittels Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,77 g HAA1–36NH₂, das mit Fulven und dem Piperidin-Fulven-Adduct kontaminiert war. Die Feststoffe wurden mit 50% MTBE/Hexan bei Raumtemperatur für 15 Stunden verrieben, um das Fulven und das Piperidin-Fulven-Adduct zu entfernen. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen und getrocknet, unter Erhalt von 0,73 g HAA1–36NH₂ mit 95%iger Ausbeute und 90A%iger Reinheit mittels HPLC.
Anmerkungen:

1) Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 Minuten, 100% B für 15 Minuten Retentionszeit: FmocAA1–16OH, 20,4 Minuten. Retentionszeit: HCl HAA1–36NH₂, 19,9 Minuten. Retentionszeit: Fulven und Piperidin-Fulven-Adduct, 5 Minuten. TLC, 9/1 Dichlormethan/Ethanol UV, Ioddetektion Rt: FmocAA1–36NH₂, 0,71.
2) Das Produkt und das Ausgangsmaterial trennen sich auf TLC oder in der Umkehrphasen-HPLC nicht gut. Die Produktbildung wurde verfolgt, indem das Fulven und das Piperidin-Fulven-Adduct beobachtet wurden.

9.4 Herstellung von Fragment AcAA1–36NH₂ (T-20) mittels N-terminaler Acetylierung von HAA1–36NH₂
Das in diesem Abschnitt dargestellte Beispiel zeigt die erfolgreiche Verbindung von Fest- und Flüssigphasensynthesetechniken zur Herstellung eines T-20-Peptids aus Peptid-Zwischenproduktfragmenten. Insbesondere stellt der hier beschriebene Syntheseweg den T-20-Drei-Fragment-Ansatz dar, der schematisch in 4 dargestellt ist, bis zu dem Punkt in der Figur, an dem Ac-AA1–36-NH₂ synthetisiert wird.
Struktur:

Ac-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Ile-His(trt)-Ser(tBu)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Glu-(OtBu)-Glu-(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Asn(trt)-Gln(trt)-Gln-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Asn(trt)-Glu(OtBu)-Gln(trt)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Leu-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Trp(Boc)-Asn(trt)-Trp(Boc)-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 1)
C₄₁₄H₅₄₃N₅₁O₇₄
MW 7411,95

Theoretische Ausbeute: 0,71 g Erwartete Ausbeute: 85–100%

Verfahren:
Ein 25 ml Rundkolben, der einen Magnetrührstab enthielt, wurde mit HAA1–36NH₂ (wie in Abschnitt 9.3 oben synthetisiert), DMF (10 ml), Pyridin (0,046 ml) und Essigsäureanhydrid (0,027 ml) beschickt (Anmerkung 1). Die Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 4 Stunden gerührt (Anmerkung 2). Wasser (7,5 ml) und gesättigtes wässriges Natriumchlorid (7,5 ml) wurden hinzugefügt, um das geschützte Peptid zu präzipitieren. Die Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser gewaschen (10 ml) und getrocknet, unter Erhalt von 0,65 g AcAA1–36NH₂, mit 91%iger Ausbeute und 90A%iger Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 3).
Anmerkunegn:

1) Dichlormethan kann auch als Lösungsmittel für diese Reaktion verwendet werden.
2) Prozessinterne Kontrolle, HPLC Phenomenex Jupiter, C5, 5 μ, 300 A 0,8 ml/min, 260 nm A H₂O/0,05% TFA B 50% IPA/MeOH/0,05% TFA 80–100% B über 10 Minuten, 100% B für 15 Minuten Retentionszeit: HAA1–36OH, 23,3 Minuten. Retentionszeit: AcAA1–36NH₂, 22,7 Minuten.
3) Das Produkt und das Ausgangsmaterial trennten sich nicht gut auf TLC oder Umkehrphasen-HPLC.

9.5 Herstellung von T-20 durch Entschützen der Seitenketten von AcAA1–36NH₂
Das in diesem Abschnitt gezeigte Beispiel zeigt die erfolgreiche Verbindung von Fest- und Flüssigphasen-Synthesetechniken zur Herstellung eines T-20-Peptids aus Peptid-Zwischenprodukt-Fragmenten. Insbesondere stellt der hier gezeigte Syntheseweg den T-20-Drei-Fragment-Ansatz dar, der in 4 gezeigt ist.
Struktur:

Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-LeuGlu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH₂ (SEQ ID NO: 1)
C₄₁₄H₅₄₃N₅₁O₇₄
MW 4492,1

Theoretische Ausbeute: 157 mg Erwartete Ausbeute: 25–50%

Verfahren:
Eine Lösung aus 90:5:5 (Volumen/Volumen/Gew.-%) Trifluoressigsäure/Wasser/Dithiothreitol wurde mit Stickstoff entgast und auf 0–5°C abgekühlt. Zur gekühlten Lösung wurde AcAA1–36NH₂ (wie in Abschnitt 9.4 oben synthetisiert) gegeben. Die schlammige Masse wurde bei 0–5°C gerührt, bis sich die Feststoffe lösten (~5 Minuten), dann auf Raumtemperatur erwärmt und für 2,5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde zu 0–5°C MTBE (70 ml) hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die schlammige Masse wurde in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei 2200 Upm zentrifugiert und das MTBE von den Feststoffen dekantiert. Die Feststoffe wurden wiederum in MTBE (50 ml) in einer Zentrifuge für 5 Minuten bei Upm zentrifugiert und das MTBE dekantiert. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt, dann wurden die Feststoffe in 1:1 Wasser/Acetonitril (30 ml), welches 1 Vol-% Essigsäure enthielt, gelöst, und bei Raumtemperatur für 24 Stunden gelagert (Anmerkung 1). Die Lösung wurde gefroren, dann unter Verwendung eines Lyophilisators gefriergetrocknet, unter Erhalt von 155 mg rohem T-20. Die Reinigung mittels präparativer HPLC stellt 55 mg des Volllängen-T-20-Peptids mit 95A%iger Reinheit mittels HPLC bereit (Anmerkung 2).
Anmerkungen:

1) Die tBu-Seitenkette von Trp(Boc) wird schnell entfernt, was TrpCOOH zurücklässt. Die Decarboxylierung des TrpCOOH erfordert mindestens 24 Stunden bei Umgebungstemperatur in wässriger Essigsäure.
2) Präparative HPLC 2'' YMC, 120 A, 10 μ, C18 220 nm, 50 ml/min A H₂O/0–1% TFA B ACN/0,1% TFA 39–49% B/40 Minuten

10. Beispiel: Reinigung von T-20-Peptid
Das hierin gezeigte Beispiel beschreibt Verfahren, mittels deren T-20-Peptide unter Bedingungen gereinigt werden können, welche die Peptidaufreinigung durchwegs erhöhen.
Materialien
Verwendete Säule: 20 × 30 cm, gepackt mit Amberchrom CG-300S (Tosohaus; Montgomeryville, PA) 35 μm Partikel.
Herstellung von Puffern

Puffer A = 100 mM Ammoniumacetat, mit NH₄OH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt.
Puffer B = Acetonitril

1. Säule mit ungefähr 6 Säulenvolumen 20%B.
2. T-20 wird in 50–100 ml 85% A/15% B pro Gramm des Peptids gelöst. Der pH-Wert wird mit 2 M K₂CO₃ auf 8–10 eingestellt. Die Acetonitril-Konzentration in der T-20-Probe überschreitet 15–20% nicht.
3. T-20-Lösung wird mit 500 ml/min geladen, mit Überwachung des Säulendrucks.
5. Säuleneluat wird bei 303 nm überwacht, und das Eluat wird während des gesamten Beladungsprozesses gesammelt. Die Wellenlänge oder Abschwächung wird während des Laufs eingestellt, um den Peak auf der Skala zu halten. Absorption ist eine Funktion von Wellenlänge und Elementweglänge.
6. Mit der Gradientenfunktion wird wie unten angegeben begonnen (1,6% Veränderung von B/Stunde), wobei der Druck während des gesamten Laufs überwacht wird.
7. Es werden 10 Minuten-Fraktionen gesammelt (3,3 l), sobald der Hauptpeak beginnt zu eluieren. Alle T-20 sollten bei 35% B eluieren. Im Durchschnitt werden 35–40 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden bei 0–5°C gelagert, bis die Bestimmung vorgenommen wird, welche Fraktionen zu vereinigen sind.
8. Die Fraktionen werden gesammelt, bis die Detektorabsorption bei weniger als 0,1 AU liegt oder bis ein Haupt-Wendepunkt erreicht ist, nachdem der Hauptpeak eluiert.
9. Die Reinheit von jeder Fraktion wird mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC überwacht.

Ergebnisse
T-20-Peptid ist viel stärker löslich bei pH-Bereichen größer als 7. Säulenhilfsmittel, die für gewöhnlich verwendet werden, um Peptide zu reinigen, sind Kieselsäure-basierend, und sie können daher nur bei pH-Bereichen verwendet werden, da Kieselsäure-Hilfsmittel dazu tendieren, sich bei höheren pH-Bereichen zu lösen.
Das hierin beschriebene Verfahren verwendet Polystyren-basierte Harzgrundstoffe, die bei einem breiten pH-Bereich (pH 1–14) stabil sind. Dieses Verfahren erhöht die Kapazität der Säule stark, indem der T-20-Durchsatz von 10 g bis zu 250–450 g erhöht wird (für eine 8'' Durchmesser × 30 cm-Säule).
11. Beispiel: Großmaßstabsynthese und -reinigung von T-20 Peptidharz-Beladung.
FmocTrp(Boc)OH kann auf sehr aktives 2-CTC-Harz geladen werden, und zwar mit Beladungshöhen von 1,2 mmol/g Anfangsharz oder höher. Bei Beladungshöhen über 1,1 mmol FmocTrp(Boc)OH pro Gramm Anfangsharz (über 0,72 mmol/g beladenem Harz) ist es schwierig, negative Ninhydrin-Tests für die letzten drei Aminosäuren des Fragmentes zu erlangen. Ebenso wird es schwierig, FmocAA17–260-Harz herzustellen, wenn das FmocLeuO-Harz mit mehr als 0,85 mmol/g beladen ist, und AcAA1–160-Harz, wenn FmocGlnOH-Harz mit mehr als 0,75 mmol/g beladen ist.
Nach Erhalt des Harzes vom Vertrieb wird ein Verwendungstest mit ungefähr 1 g 2-CTC-Harz durchgeführt, und zwar mit jeder Aminosäure, die zu laden ist. Der Zweck des Verwendungstestes ist es, die während der Beladung zu verwendende Menge an Aminosäuren zu bestimmen, um die gewünschten Beladungsbereiche zu erreichen. Zu verwenden sind 0,8, 1,0 und 1,5 Äquivalente FmocGlnOH, 1,0, 1,2 und 1,5 Äquivalente FmocTrp(Boc)OH und 0,8, 1,0 und 1,5 Äquivalente FmocLeuOH, mit jeweils 0,5 Äquivalenten Überschuss DIEA (im Verhältnis zur berichteten Aktivität der Säule). Wenn ein Mol FmocLeuOH nicht auf 1 kg 2-CTC-Harz geladen werden kann, sollte das 2-CTC vom Vertrieb nicht angenommen werden. Unten findet sich eine Beschreibung der angestrebten Harzbeladung für FmocLeuOH, FmocGlnOH und FmocTrp(Boc)OH.
1,0 bis 1,1 mol FmocLeuOH können auf jedes kg 2-CTC-Harz geladen werden. Wenn man den Verlust an HCl in Betracht zieht, sollte das Trockengewicht des Harzes nach der Beladung mit FmocLeuOH 1,32 bis 1,35-mal das Gewicht des Ausgangsharzes betragen, und die gemessene Beladung sollte bei 0,75 bis 0,81 mmol/g liegen.
0,8 bis 1,0 mol FmocGlnOH können auf jedes kg 2-CTC-Harz geladen werden. Wenn man den Verlust an HCl in Betracht zieht, sollte das Trockengewicht des Harzes nach der Beladung mit FmocGlnOH 1,27 bis 1,33-mal das Gewicht des Ausgangsharzes betragen, und die gemessene Beladung sollte 0,63 bis 0,75 sein.
0,9 bis 1,1 mol FmocTrp(Boc)OH können auf jedes kg 2-CTC-Harz geladen werden. Zieht man den Verlust an HCl in Betracht, sollte das Trockengewicht des Harzes nach der Beladung mit FmocTrp(Boc)OH 1,44 bis 1,54-mal das Gewicht des Ausgangsharzes betragen, und die gemessene Beladung sollte 0,63 bis 0,72 sein.
Zur genauen Bestimmung der Gewichtszunahme muss der Verlust beim Trocknen („loss on drying") (LOD) des Anfangsharzes bestimmt werden. Er sollte 1% nicht überschreiten. Wenn restliches Lösungsmittel (oder DIEA/HCl) nicht vollständig während des Trocknens vom Harz entfernt wird (nach der Beladung), dann wird die isolierte Masse größer sein und die gemessene Beladung niedriger. Die gesamte molare Beladung (Masse × gemessene Beladung) sollte aber in die oben erwähnten Bereiche fallen. Wenn der obere Beladungsspiegel überschritten wird (oder die Gesamtmolanzahl, die pro kg Ausgangsharz beladen wird) bei irgendeiner der erwähnten Aminosäuren, und zwar über 10%, ist ein Verwendungstest unter Verwendung von weniger Aminosäuren durchzuführen. Dies ist besonders wichtig für FmocGlnOH.
11.1 Großmaßstabsherstellung von Fmoc-AA(Boc)-2-Chlortrityl-Harz
Der Zweck des folgenden Abschnitts ist es, eine Beladung von Harzen im Großmaßstab durchzuführen, die zur Herstellung von großen Mengen von Peptiden zur Festphasen-Peptidsynthese („solid phase peptide synthesis" (SPPS)) geeignet sind. Das Harz wird jeweils mit den folgenden Verbindungen beladen. FmocTrp(Boc)OH, und FmocGln(Boc)OH, und FmocLeu(Boc)OH. Jeder Ausgangsrest wurde auf ungefähr 4 kg 2-CTC-Harz geladen.

1. Die erste Zahl wurde aus einem Gewicht-basierten HPLC-Assay gegenüber einem Fmoc-AA-Standard errechnet. Der Wert in Klammern wurde errechnet aus der Gewichtszunahme, wobei 12% LOD des Ausgangs-2-CTC-Harzes einbezogen wurden.

Das Ausgangs-2-CTC-Harz wurde von Colorado BioTech mit einer berichteten Beladung von 1,4 mÄqu./g bezogen. Das Standardbeladungsverfahren, 1,5 Äqu. FmocTrp(Boc)OH, 1,7 Äqu. DIEA in DCM (5 Vol.), mit Umgebungstemperatur für 2 Stunden wurde verwendet, wobei mit 3,7 kg 2-CTC begonnen wurde. Dies führte zu 4,493 kg FmocTrp(Boc)O-Harz, das eine Beladung aufwies, die mittels Gewicht-basiertem HPLC- Assay von FmocTrp(Boc)OH nach Abschneiden von dem Harz errechnet wurde und bei 0,56 mmol/g (2,52 Mol insgesamt) lag. Mittels der Gewichtszunahme des Harzes wird die Beladung auf 0,36 mmol/g für eine Gesamtheit von 1,62 hergestellten Mol errechnet. Wenn jedoch 12% LOD des Ausgangs-2-CTC-Harzes in Betracht gezogen wird, beträgt die mittels Gewichtszunahme errechnete Beladung dieselben 0,56 mmol/g für eine Gesamtheit von 2,52 Mol, was deutlich weniger ist als die angestrebte Beladung von 4 Mol FmocTrp(Boc)OH pro 4 kg Harz.
Insgesamt wurden 4,59 kg FmocLeuO-Harz aus 3,9 kg 2-CTC in zwei Durchgängen unter Verwendung von Standard-Beladungsverfahren hergestellt.
Es wurde jedoch eine wesentlich geringere Beladung als erwartet erreicht. Die erste Charge hatte eine errechnete Beladung von 1,07 mmol/g bei Gewichts-basierter HPLC-Analyse von FmocLeuOH nach Abschneiden von dem Harz. Dies ist eindeutig unmöglich, da die mittels Gewichtszunahme errechnete Beladung, die 12% LOD des Ausgangs-2-CTC-Harzes in Betracht zieht, (500 g) 0,647 mmol/g beträgt. Die tatsächliche Beladung ist wahrscheinlich nahe bei 0,647 mmol/g für eine Gesamtheit von 1,577 geladenen Mol.
Eine zweite Charge FmocLeu-O-Harz, die aus 1,7 kg 2-CTC hergestellt wurde (2,154 kg), wies eine errechnete Beladung von 0,68 mmol/g gegenüber einer Gewichtszunahmen-Beladung von 0,66 mmol/g auf.
Insgesamt 3,856 kg FmocGlnO-Harz wurden in einer einzigen Charge hergestellt, beginnend mit 3,65 kg 2-CTC, unter Verwendung von 0,8 Äqu. FmocGlnOH und 1 Äqu. DIEA in 7 Volumenteilen 5/2 DMF/DCM. Der Austausch, der mittels Gewichts-basiertem HPLC-Assay errechnet wurde, betrug 0,55 mmol/g für eine Gesamtheit von 2,12 Mol FmocGlnO-Harz. Die mittels Gewichtszunahme errechnete Beladung, die 12% LOD des Ausgangs-2-CTC-Harzes in Betracht zog, betrug 0,52 mmol/g für eine Gesamtheit von 2,0 Mol FmocGlnO-Harz.
Allgemein sollte die Beladung, errechnet durch Gewichtszunahme, größer oder gleich der Beladung sein, die mittels Gewichts-basiertem HPLC-Assay gegenüber dem AS-beladenen oder von Fulven befreiten errechnet wurde. Das Ausgangs-2-CTC sollte weniger als 1% LOD aufweisen und das isolierte FmocAAO-Harz wird wahrscheinlich eine geringe Menge NMP, Salz und/oder restlichem FmocAAOH aufweisen.
11.1.1 Bevorzugtes Verfahren zur Großmaßstabs-Herstelluns von Fmoc-AA(Boc)-2-Chlortritylharz
FmocTrp(Boc)OH und FmocLeuOH
Das Luft-sensitive 2-Chlortritylchloridharz (1 Äqu., 3,7 kg, 5,18 Mol) wird in eine SPPS-Kammer gegeben und mit 5 Volumenteilen DCM gewaschen. Das Lösungsmittel lässt man ablaufen, und es wird eine Lösung entweder von FmocTrp(Boc)OH oder FmocLeu(Boc)OH (1,5 Äqu.) und DIEA (1,7 Äqu) in DTM (5 Vol.) hinzugegeben (Anmerkung 1). Die schlammige Masse wird durch Rühren über 2 Stunden bewegt. Man lässt das Lösungsmittel ablaufen und die übrigen aktiven Stellen auf dem Harz werden mit 9:1 MeOH:DIEA (5 Vol.) über 30 Minuten endversiegelt. Das Lösungsmittel lässt man ablaufen, und das Harz wird mit 6 × 5 Volumenteilen DCM gewaschen. Das Harz wird bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, dann werden Proben genommen und im Hinblick auf die Beladung untersucht (Anmerkung 2). Dasselbe Verfahren wird zur Beladung von FmocLeuOH verwendet.
FmocGluOH
Das Luft-sensitive 2-CTC-Harz (3,65 kg, 1,4 mmol/g) wird in eine 40 l SPPS-Kammer unter Stickstoffatmosphäre geladen und mit DCM (5 Vol.) gewaschen. Ein 20 l Reaktor wird mit FmocGlnOH (1,506 kg, 0,8 Äqu.), DMF (5 Vol.) und DIEA (1,0 Äqu.) beschickt. Man lässt die SPPS-Kammer ablaufen und dann wird die DMF-Lösung hinzugegeben. Der Reaktor wird DCM (2 Vol.) gespült und die Spülung wird zur SPPS-Kammer hinzugegeben. Das Harz wird in der SPPS-Kammer unter Stickstoffatmosphäre für 2 Stunden gerührt, dann lässt man ablaufen. Jede übrige aktive Stelle des Harzes wird mit 9:1 Methanol/DIEA (5 Vol.) über 30 Minuten versiegelt. Das Harz lässt man ablaufen, wascht dann mit DCM (6 × 5 Vol.) und trocknet bis zu einem konstanten Gewicht (3,856 kg). Vom Harz werden Proben genommen und es wird auf die Höhe der Beladung hin getestet (Anmerkung 2).
Aumerkungen:

1. Das 2-Chlortritylchloridharz ist gegenüber Feuchtigkeit sehr sensitiv. Wasser verschließt das Harz und führt zu HCl. Solange das Lösungsmittel trocken ist besteht wenig Unterschied zwischen DCE und DCM.
2. Die Harz-Beladung wird bestimmt, indem die Fmoc-Aminosäure vom Harz abgeschnitten wird und gegen einen Standard mittels quantitativer Gewicht/Gewicht-HPLC-Analyse untersucht wird. Phenomenex Jupiter C18, 300 A, Sm 1 ml/min, 260 nm A: 0,1% wässrige TFA B: 0,1% TFA in Acetonitril 65% B, isokratisch Retentionszeit: ungefähr 8 Minuten

Die Bestimmung der Beladung mittels Gewichtszunahme des Harzes kann ungenau sein, da die Anzahl der Waschschritte, die vor dem Trocknen des Harzes verwendet wird, nicht ausreichend sein kann, um NMP aus dem Harz zu entfernen. Die Berechnung ist:
Es wurde beobachtet, dass die Lagerung der Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung über längere Zeiträume (Tage) in DCM zum Abschneiden von dem Harz in beträchtlichem Ausmaß führt. Zum Beispiel wurde das zum Teil aufgebaute Fragment während der Herstellung von FmocAA17–26OH zweimal über das Wochenende in DCM gelagert. Nach Vervollständigung der Synthese und Entfernen von dem Harz wurde eine 8%ige Ausbeute FmocAA17–26OH erreicht. Es wird vermutet, dass Spuren-HCl im DCM langsam das zum Teil aufgebaute Fragment vom Harz während der Lagerung über das Wochenende abschneidet.
Proben von FmocAA17–216-Harz, AcAA1–160-Harz und FrmoAA27–350-Harz ließ man in DCM und IPA bei Raumtemperatur für 1 Woche stehen. Der Überstand von diesen beiden wurde mittels HPLC untersucht. Obwohl quantitative Ergebnisse nicht erlangt wurden, waren alle die Fragmente von dem Harz zu einem signifikanten Ausmaß in DCM abgeschnitten, während Abschneiden in IPA nicht beobachtet wurde. Wenn teilweise aufgebaute Fragmente über einige Tage (über das Wochenende) gelagert werden müssen, ist es besser, den Feststoff mit NMP zu spülen, das Bett ablaufen zu lassen und es gesättigt unter NMP unter einer Stickstoffatmosphäre stehen zu lassen.
DCM wurde für die letzten Waschschritte von FmocLeuO-Harz, FmocGlnO-Harz, FmocTrp(Boc)O-Harz, FmocAA17–260-Harz, AcAA1–160-Harz und FrmoAA27–350-Harz durch IPA ersetzt. Das IPA-gesättigte FmocLeuO-Harz, FmocGlnO-Harz und FmocTrp(Boc)O-Harz wurden bei 40°C getrocknet. FmocAA17–260-Harz, AcAA1–160-Harz und FrmoAA27–350-Harz wurden aus den beladenen Harzen aufgebaut, die bei 4°C getrocknet wurden. Nach Vervollständigung der Synthese wurden die an das Harz gebundenen Fragmente mit DOM, gefolgt von IPA, sauber gewaschen. Die IPA-gesättigten, an das Harz gebundenen Fragmente wurden aufgeteilt und bei Umgebungstemperatur und 40°C getrocknet. Die Fragmente wurden von dem Harz abgeschnitten und mittels HPLC untersucht. Es wurden keine Unterschiede beobachtet im Hinblick auf die Fragmentreinheit. Das Trocknen von IPA-gesättigten, an das Harz gebundenen Fragmenten bei 40°C beeinflusst die Qualität oder Quantität des isolierten Fragments nicht.
SPPS der Fragmente in DMF, verglichen mit NMP/DCM, wurden untersucht (1 g gequollenes Harz auf 5 ml in jedem Lösungsmittelsystem). Fragment FmocAA27–35OH wurde unter Verwendung von DMF als Lösungsmittel und TPTU gegenüber HBTU als Verbindungsreagenz synthetisiert. FmocAA27–35OH wurde mit 77%iger Ausbeute und 89,5A%iger Reinheit isoliert.
Das Aufbereitungsprotokoll für Fragmente FmocAA17–36NH₂ und AcAA1–36NH₂ entfernt die unverbundenen Fragmente. Die Acetylierung (Endversiegelung) dieser Fragmente an zerstörten Stellen während der Festphasensynthese stellt sicher, dass die zerstörten Fragmente in den Lösungsphasenverbindungen sich nicht weiter verbinden. Die nicht verbundenen Fragmente bei der Synthese von sowohl FmocAA17–36NH₂ als auch AcAA1–36NH₂ sollten in den IPA- und ACN-Aufbereitungen entfernt werden.
11.2 Großmaßstabsherstellung von Fragment Ac-AA(1–16)-OH (Fragment 3c)
Die Herstellung im Großmaßstab mittels SPPS von Fragment AcAA1–16OH wurde in zwei Durchgängen durchgeführt, was zu einer Gesamtheit von 7,941 kg Harz-gebundenem Fragment aus 3,53 kg FmocGlnOH-Harz führte. Der Beladungswert für das Ausgangs-FmocGlnOH-Harz in beiden Durchläufen war der etwas überschätzte 0,55 mmol/g-Wert, der aus einem Gewicht-basierten HPLC-Assay erhalten wurde, und nicht der genauere 0,52 mmol/g-Wert, der mittels Gewichtszunahme erhalten wurde, wobei 12% LOD beim Ausgangs-2-CTC in Betracht gezogen wurden. Zusätzlich dazu, dass die Harzbeladung niedriger war als gewünscht, wurde ein 6%iger Überschuss von jeder Aminosäure während der SPPS verwendet.
Die SPPS verwendete 2,5 Äquivalente des ersten FmocGln(trt)OH für das Harz, und 1,7 Äquivalente von jeder der nachfolgenden Aminosäuren in dem Fragment (in Relation zur 0,55 mmol/g-Beladung). Die Verbindungsreaktionen wurden in 8 Volumenteilen 3:1 NMP:DCM durchgeführt, und alle mit Ausnahme von zweien der 32 Verbindungsreaktionen (Acetylierung eingeschlossen) waren innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen. Alle Waschschritte wurden mit 5 Volumenteilen NMP durchgeführt.
Das Harz-gebundene Fragment wird mit 5–6 mal 3,4 Volumenteilen (im Verhältnis zum Gewicht des trockenen AcAA1–160-Harzes) 1% TFA/DCM bei 0–5°C gewaschen, 5 Minuten pro Waschschritt. Jede Waschfraktion wird auf 1,36 Volumenteile 0,33 M aq NaHCO₃ gewaschen, um das TFA zu neutralisieren. Die dreiphasigen Waschfraktionen werden kombiniert, und es wird Wasser (2 Vol.) hinzugegeben. Das DCM wird durch Destillation entfernt, wodurch ein filtrierbares Präzipitat im wässrigen Natriumdicarbonat zurückgelassen wird. Während der Destillation wird die vielphasige schlammige Masse viskos und cremeartig, bevor sie in eine filtrierbare schlammige Masse zusammenfällt, wenn das letzte DCM entfernt ist. Die schlammige Masse wird auf 0–5°C abgekühlt und der pH-Wert wird mit 0,1 N HCl auf 3,0 eingestellt. Die schlammige Masse wird bei 0–5°C für 1–2 Stunden gerührt, mittels Filtration abgenommen, gewaschen und getrocknet. In den übrigen Durchläufen werden die Feststoffe abgenommen, zum Reaktor zurückgegeben und mit Wasser für 1–2 Stunden verrieben, dann abgenommen und getrocknet.
Das Abschneiden von AcAA1–16OH von dem Harz wurde in vier Durchläufen unter Verwendung von 1% TFA in DCM erreicht. Insgesamt 4,814 kg AcAA1–16OH wurde aus 3,53 kg FmocGlnO-Harz mit 93–96A%iger Reinheit hergestellt. Die Gesamtausbeute, basierend auf der 0,52 mmol/g-Beladung, die mittels Gewichtszunahme berechnet wurde und wobei die 12% LOD des Ausgangs-2-CTC in Betracht zog, (5,83 kg theoretisch) beträgt 83%.
Das Natriumsalz von AcAA1–16OH ist in DMF und in NMP unlöslich, daher ist die pH-Einstellung notwendig, um den Carboxyterminus zu protonieren. Der Waschschritt mit Wasser sorgt für ein Entfernen des Natriumtrifluoracetats aus dem Produkt. Eine sehr kleine Menge Natriumtrifluoracetat auf Gewicht/Gewicht-Basis wird die Lösungs-Phasen-Verbindung mit HAA17–36NH₂ stören.
Dieses Fragment sollte bei Raumtemperatur getrocknet werden. Eine Stabilitätsstudie, die das Trocknen von AcAA1–16OH bei 40°C beleuchtete, zeigte ungefähr 4% Abbau über 3 Tage. Interessanterweise ist der trockene Feststoff bei 80° über 24 Stunden stabil.
11.2.1 Bevorzugtes Verfahren zur Großmaßstabsherstellung von Fragment AcAA(1–16)-OH (Fragment 3c)
In eine 40 l Peptidkammer wird das Harz-gebundene FmocGlnOH (1,53 kg, 0,55 mmol/g, 0,84 Mol) gegeben. Das Harz wird unter Stickstoff und unter Bewegung für 15 Minuten mit DCM (5 Vol.) konditioniert, dann lässt man es ablaufen. Eine 20%ige Piperidin in NMP-Lösung (5 Vol.) wird hinzugegeben und die Suspension wird unter Stickstoff für 20 Minuten gerührt. Man lässt die Lösung ablaufen und der Prozess wird wiederholt. Das Harz wird 5 mal mit 5 Volumenteilen NMP gewaschen, um Dibenzofulven und Piperidin zu entfernen, was mittels eines Chloranil-Tests bestimmt wird (Anmerkung 1).
Während das Harz von Piperidin saubergewaschen wird, wird die nächste Aminosäure in der Sequenz (1,5 Äqu.), HOBT (1,5 Äqu.) und DIEA (1,5 Äqu.) in NMP (6–7 Vol.) kombiniert und auf 0°C abgekühlt. Zur kalten Lösung wird HBTU (1,5 Äqu.) hinzugegeben und die Lösung wird für 10–15 Minuten gerührt, um das HBTU zu lösen. Die gekühlte Lösung aktivierter Aminosäure wird zum Harz gegeben, danach folgt eine Spülung mit DCM (2,5 Vol.) (Anmerkung 2). Die Suspension wird unter Stickstoff begasung für 2 Stunden gerührt, dann wird eine Probe des Harzes für einen qualitativen Ninhydrin-Test entfernt (Anmerkung 3). Wenn der Ninhydrin-Test negativ ist, lässt man das Gefäß ablaufen, wäscht dreimal mit 5 Volumenteilen NMP (Anmerkung 4) und der Zyklus wird mit der nächsten Aminosäure in der Sequenz wiederholt. Wenn der Test positiv ist, wird die Suspension für eine zusätzliche Stunde bewegt und wieder getestet. Wenn Ninhydrin negativ ist, wird zum nächsten Zyklus übergegangen. Wenn das Ninhydrin positiv bleibt, ist mit einem Äqu. der Aminosäure und der Reagenzien die Verbindungsreaktion zu wiederholen. Wenn das Ninhydrin nach einer Stunde positiv ist, wird mit 5 Äqu. Essigsäureanhydrid und 5 Äqu. Pyridin in NMP (10 Vol.) für eine Stunde endversiegelt.
Zum Zeitpunkt der Vervollständigung der Fragmentsynthese wird Fmoc von der letzten Aminosäure entfernt, wie beschrieben, und das Harz wird in einer Lösung aus Essigsäureanhydrid und Pyridin (jeweils 5 Äqu.) in 3:1 NMP:DCM (10 Vol.) für 20–30 Minuten gerührt, oder bis ein negativer Ninhydrin-Test erhalten wird. Man lässt die Flüssigkeit vom Harz ablaufen, wäscht mit 2 × 5 Volumenteilen NMP, 5 mal mit 5 Volumenteilen DCM und trocknet, was zu einem Erhalt von 3,49 kg AcAA1–160-Harz führt.
Die 40 l SPPS-Kammer wird mit dem getrockneten Harz-gebundenen AcAA1–16 (3,49 kg) beschickt. Das Harz-gebundene Peptid wird unter Verwendung von 6 × 3,4 Volumenteilen 1% TFA/DCM abgeschnitten (Anmerkung 7). Jede Abschneide-Waschfraktion wird auf 1,36 Volumenteilen 0,33 M wässrigem Natriumdicarbonat gesammelt, die biphasischen Fraktionen werden kombiniert und mit 2 Volumenteilen Wasser verdünnt. Das biphasische Gemisch wird unter reduziertem Druck (15 Hg, 20°C) aufkonzentriert, um DCM zu entfernen. Zusätzliches Wasser (2 Volumenteile) wird während der Destillation hinzugefügt, wie es benötigt wird, um das Rühren fortzuführen (Anmerkung 6). Wenn DCM entfernt ist (mehrere Stunden), wird die Suspension auf 0°C abgekühlt und der pH-Wert wird mit 1 N HClaq auf 3 eingestellt. Die schlammige Masse wird bei 0°C über 1 Stunde gerührt und abgenommen. Der noch immer feuchte Feststoff wird in das Reaktionsgefäß gegeben und mit Wasser (7 Volumenteile) gemahlen, um restliches TFA und Natriumtrifluoracetat zu entfernen. Die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen und bis zu einem konstanten Gewicht (1,12 kg, 95A%) getrocknet. Die Ausbeute von AcAA1–16OH, basierend auf 0,52 mmol/g Beladung, beträgt 86% (Anmerkung 7).
Anmerkungen:

1. Zu ungefähr 1 ml Aceton wird 1 Tropfen einer gesättigten Lösung aus Chloranil in Toluol, gefolgt von einem Tropfen Eluat, hinzugegeben. Eine blaue oder violette Färbung ist ein positives Anzeichen für die Anwesenheit von Piperidin. Mit Zunahme der Höhe des Bettes werden größere Volumenteile NMP benötigt, um das Piperidin herauszuwaschen.
2. DCM wird hinzugegeben, um ein adäquates Quellen des Harzes sicherzustellen.
3. Der quantitative Ninhydrin-Test ist adäquat zur Beobachtung der Verbindungseffizienz. Eine 2–20 mg Probe des Harzes wird abgenommen und mit Methanol saubergewaschen. Zur Probe werden 3 Tropfen 76% Phenol in Ethanol hinzugegeben, 4 Tropfen 0,2 mM KCN in Pyridin und 3 Tropfen 0,28 M Ninhydrin in Ethanol. Die Lösung wird auf 0,5–1 ml mit Ethanol verdünnt und für 5–10 Minuten bei 75°C in einen Heizblock gegeben. Eine blaue oder violette Farbe zeigt freie Amine an (positiv). Durchsichtig klar oder leicht blau ist ein negatives Ergebnis. Protokoll für den quantitativen Ninhydrin-Test, Verweisungen: Sarin, V. K., Kent, S. B. H., Tam, J. P., und Merrifield, R. B. (1981) Analytical Biochem. iii, 147–157.
4. Wenn das Harz über Nacht gelagert werden soll, ist es 2 mal mit 5 Volumenteilen NMP zu waschen, man lässt es ablaufen und lagert es unter Stickstoff Nicht unter DCM lagern. Dies kann zum Abschneiden des Peptids vom Harz führen und zu einem beträchtlichen Mengenverlust.
5. Jede Fraktion wird auf den Produktgehalt getestet und zwar mittels TLC und Sichtbarmachen bei 254 nm. Der größte Anteil des Produkts wird innerhalb der ersten 5 Waschschritte entfernt.
6. Wenn das DCM entfernt ist, findet die Reaktion mit der Konsistenz von Marshmallow-Creme statt. Wenn die Destillation fortschreitet, geht die Suspension allmählich zu einer festen schlammigen Masse über. Es ist wichtig, das DCM langsam zu entfernen, um das Auskochen des Produktes zu verhindern.
7. Vydac C8, 5 μ, 300 A 1 ml/min, 30°C, 230 nm A 1000:1 Wasser/TFA B 800:200:1 IPA:ACN:TFA 60–95% B/30 min Retentionszeit: 13,1 Minuten

11.3 Großmaßstabs-Präparation von Fragment FmocAA(17–26)-OH (Fragment 10b)
Insgesamt 5,3 kg FmocAA17–260-Harz wurden aus 2,4 kg FmocLeuO-Harz in zwei Durchgängen gleicher Größe präpariert. Die 5,3 kg FmocLeuO-Harz wurden von dem Harz in vier Durchgängen gleicher Größe abgeschnitten, was zu einem Ertrag von 3,184 kg FmocAA17–26OH führte, mit durchschnittlich 94,4A% Reinheit und 90% Ausbeute.
Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 1,5 Äquivalenten von jeder Aminosäure, im Verhältnis zum Beladungsfaktor, durchgeführt, was zur Verwendung eines 65%igen Überschusses an Aminosäure bei jedem Verbindungszyklus führte. Alle Verbindungsreaktionen wurden innerhalb von 2 Stunden (negativer Ninhydrin-Test) vollständig.
Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mit 20% Piperidin in NMP (5 Volumenteile) über 20 Minuten entfernt und dieses wurde wiederholt. Aas Piperidin wurde mit 5 × 5 Volumenteilen NMP-Waschschritten aus dem Harz ausgewaschen. Die Verbindungsreaktionen wurden in 8 Volumenteilen 3:1 NMP:DPM durchgeführt. Die Verbindungsreaktion ließ man dann ablaufen und die Feststoffe wurden mit drei Waschschritten mit 5 Volumenteilen NMP saubergewaschen. Der Zyklus wurde mit der nächsten Aminosäure in der Sequenz wiederholt. Nach Vervollständigung des Fragmentes wurde das Harzbett mit 2 × 5 Volumenteilen NMP, 5 × 5 Volumenteilen DCM gewaschen und getrocknet bis zu einem konstanten Gewicht.
Mehrere Waschschritte mit 1% TFA in DCM werden verwendet, um das Fragment aus dem Harz zu entfernen. Das Abkühlen der 1% TFA in DCM-Lösung ist nicht notwendig, da die Stabilität dieses Fragmentes in 1% TFA/DCM (1%/Tag) viel größer ist als bei AcAA1–16OH. Wenn die Produkt-enthaltenden sauren DCM-Waschfraktionen gesammelt werden, werden sie mit Pyridin neutralisiert. Die kombinierten Waschfraktionen werden destilliert, um DCM zu entfernen, und es wird Ethanol hinzugegeben, um eine Lösung aufrecht zu erhalten, sowie um das übrigen DCM während der Destillation auszutreiben. Nachdem DCM entfernt wurde (was durch eine Erhöhung der Temperatur des entfernten Destillats bestimmt wird), wurde Wasser hinzugegeben, um das Fragment zu präzipitieren. Der Feststoff wurde durch Vakuumfiltration abgenommen (weniger als 60 Minuten). Der noch feuchte Feststoff wird zurück in den Reaktor gebracht und mit 80/20 Ethanol/Wasser (5 Vol.) bei 0–5°C für 60 Minuten gemahlen. Das präzipitierte FmocAA17–26OH wurde mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit einer minimalen Menge 80/20 Ethanol/Wasser gewaschen und getrocknet (Vakuum, keine Hitze, 10 Tage).
11.3.1 Bevorzugtes Verfahren zur Großmaßstabs-Präparation von FmocAA(17–26)OH (Fragment 10b)
Eine 40 l SPPS-Kammer wird mit FmocLeuO-Harz (1,2 kg, 0,776 mol) beschickt, gefolgt von DCM (5 Vol.), um das Harz zu quellen. DCM wird benötigt, um eine vollständige Quellung des getrockneten Ausgangsharzes sicherzustellen. Die Suspension wird über 20–30 Minuten gerührt, dann lässt man ablaufen. 20% Piperidin in NMP-Lösung wird hinzugegeben (5 Vol.) und die Lösung wird für 20 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel lässt man ablaufen, und der Prozess wird wiederholt. Das Lösungsmittel lässt man ablaufen, und das Harzbett wird mit 5 × 5 Volumenteilen NMP gewaschen, um Piperidin zu entfernen (Anmerkung 1).
Während entschützt wird, wird ein 20 l Rundkolben mit mechanischem Rührer mit der nächsten Aminosäure in der Sequenz (1,95 Äqu.), HOBT (1,95 Äqu.), DIEA (1,95 Äqu.) und NMP (6 Vol.) beschickt. Die Lösung wird gerührt, bis sich die Feststoffe lösen, dann auf 0–5°C abgekühlt und es wird HBTU (1,95 Äqu.) hinzugegeben. Die Lösung wird gerührt, bis sich das HBTU löst oder das Harz frei von Piperidin ist (was immer auch zuerst eintritt), dann wird das Harz hinzugegeben. Der Reaktor wird mit DCM (2 Vol.) gewaschen, und dieses wird in den SPPS-Reaktor überführt. Anmerkung: Die Stöchiometrie der Aminosäuren und Reagenzien sollte 1,5 Äquivalente sein.
Das Harz wird in der Verbindungslösung durch sanftes Rühren suspendiert. Nach zwei Stunden wird eine Probe des Harzes aus der SPPS-Kammer entnommen und ein qualitativer Ninhydrin-Test wird durchgeführt (Anmerkung 2). Wenn der Ninhydrin-Test negativ ist, lässt man das Gefäß ablaufen, wäscht 3 mal mit 5 Volumenteilen NMP, und der Zyklus wird mit der nächsten Aminosäure in der Sequenz wiederholt (DCM-Quellen wird nur für die erste beladene Aminosäure zur Anwendung gebracht).
Wenn der Test positiv ist, wird die Suspension für eine zusätzliche Stunde in Bewegung gehalten und es wird wieder getestet. Wenn Ninhydrin negativ ist, wird zum nächsten Zyklus übergegangen. Wenn Ninhydrin positiv bleibt, ist mit einem Äqu. der Aminosäure und der Reagenzien die Verbindungsreaktion zu wiederholen. Wenn Ninhydrin nach einer Stunde positiv ist, wird mit 5 Äqu. Essigsäureanhydrid und 5 Äqu. Pyridin in NMP (10 Vol.) für eine Stunde endversiegelt.
Nach der Vervollständigung der Fragmentsynthese lässt man das Harz ablaufen, wäscht mit 2 × 5 Volumenteilen NMP, 5 × 5 Volumenteilen DCM und trocknet, was zu einem Ertrag von 2,67 kg FmocAA17–260-Harz führt.
FmocAA17–26OH wird vom Harz abgeschnitten (1,33 kg), und zwar unter Verwendung von 5–6 × 1,7 Volumenteilen 1% TFA in DCM für jeweils 5 Minuten. Die 1% TFA/DCM-Waschfraktionen werden in einer Flasche gesammelt, die Pyridin enthält (1:1 Volumenverhältnis mit TFA in der Waschfraktion). Die Produkt-enthaltenden Waschfraktionen werden kombiniert (ungefähr 14 l) und DCM wird durch Destillation bis zu einem minimalen Gefäßvolumen (ungefähr ein Drittel des Ausgangsvolumens) entfernt. Das Vakuum wird so eingestellt, dass eine Gefäßtemperatur von 15–25°C aufrechterhalten wird. Es wird Ethanol (6,5 Vol.) hinzugegeben und die Destillation wird fortgeführt, bis das DCM entfernt ist (bestimmt mittels der Temperatur des Destillats, Anmerkung 3). Wiederum wird das Vakuum so eingestellt, dass eine Gefäßtemperatur von 15–20°C aufrecht erhalten wird. Das Endgefäßvolumen sollte ungefähr 8–10 Volumenteile betragen. Die Lösung wird auf 5–10°C abgekühlt und es wird Wasser (6,5 Vol.) über 30 Minuten hinzugegeben, um das FmocAA17–26-OH zu präzipitieren. Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration abgenommen und mit Wasser (2–3 Vol.) gewaschen. Um restliches Pyridin und/oder Salze zu entfernen, wird der noch feuchte Feststoff zurück in den Reaktor gegeben und 80/20 Ethanol/Wasser (5 Vol.), vorgekühlt auf 0°C wird hinzugegeben. Diese Suspension wird bei 0°C für 60 Minuten gerührt, die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit einer minimalen Menge 80/20 Ethanol/Wasser gewaschen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, unter Erhalt von 0,806 kg FmocAA17–26 OH mit 90,6% Ertrag und 96A% Reinheit (Anmerkung 4).
Anmerkungen:

1. Zu 1 ml Aceton wird 1 Tropfen gesättigter Lösung aus Chloranil in Toluol hinzugegeben, gefolgt von 1 Tropfen Eluat. Eine blaue oder violette Farbe zeigt die Anwesenheit von Piperidin an.
2. Quantitativer Ninhydrin-Test ist angemessen zur Beobachtung der Verbindungseffizienz. Eine 2–20 mg Probe des Harzes wird abgenommen und mit Methanol saubergewaschen. Zur Probe werden 3 Tropfen 76% Phenol in Ethanol, 4 Tropfen 0,2 mM KCN in Pyridin und 3 Tropfen 0,28 M Ninhydrin in Ethanol gegeben. Die Lösung wird auf 0,5–1 ml mit Ethanol verdünnt und für 5–10 Minuten bei 75°C in einen Heizblock gegeben. Eine blaue oder violette Farbe zeigt freie Amine an (positiv). Klar durchsichtig oder leicht blau ist ein negatives Ergebnis.
3. Die Kopftemperatur während der Vakuumdestillation von DCM betrug 10–15°C. Die Kopftemperatur stieg auf 3500 an, wenn DCM entfernt wurde.
4. Vydac, C8, 5 μ, 300 A 1 ml/min, 262 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B ACN/0,1% TFA 80–99% B/20 min. Retentionszeit: 15,2 Minuten

11.4 Großmaßstabs-Präparation von Fragment Fmoc-AA(27–35)-OH (Fragment 16b)
Insgesamt 4,694 kg FmocAA27–35OH wurden aus 4,45 kg FmocTrp(Boc)O-Harz synthetisiert. Die Festphasensynthese wurde in zwei Chargen durchgeführt und das Abschneiden vom Harz in vier Chargen. FmocAA27–35OH, das aus einer Charge hervorging, war ungefähr 5% weniger rein als Material aus der anderen Charge. Dies war begründet in einer nicht-identifizierten 5A%-igen Unreinheit, die während der Verarbeitung von FmocAA17–36NH₂ entfernt wurde. Die Gesamtmenge an FmocTrp(Boc)OH, mit der das Harz beladen wurde, betrug 2,5 Mol. Die Festphasensynthese fand so statt, wie es für ein Harz, das mit ungefähr 63% Kapazität beladen war, erwartet wurde. Alle Verbindungsreaktionen waren beim ersten Überprüfungspunkt bei 2 Stunden vollendet. Die Reaktion- und Spül-Volumenteile, die für SPPS und Abschneiden verwendet wurden, waren dieselben, wie jene, die in der Synthese von Fmoc AA17–26OH verwendet wurden. Das Abschneiden vom Harz war so, wie oben beschrieben. Die Filtration war schnell (15 min.). Das Trocknen des Feststoffes nach der 90/10 Ethanol/Wasser-Pulverisierung benötigte 3 Tage (Vakuum, keine Hitze). Das Fragment ist bei der Trocknung bei 40°C stabil.
11.4.1 Bevorzugtes Verfahren der Großmaßstabs-Präparation von Fragment Ac-AA(27–35)-OH (Fragment 16b)
Eine SPPS-Kammer, die FmocTrp(Boc)-Harz (1 Äqu., 2,2 kg, 1,23 Mol) enthält, wird mit DCM (5 Vol.) beschickt. Die Suspension wird für 15 Minuten gerührt und dann lässt man ablaufen. Eine Lösung aus 20% Piperidin in NMP (5 Volumenteile) wird hinzugegeben und die Suspension wird für 10–15 Minuten gerührt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Dieses Verfahren wird wiederholt und das Harz wird mit 5–7 × NMP (5 Vol.) gewaschen, bis zu einem negativen Chloranil-Test (Anmerkung 1).
Die nachfolgende Aminosäure (1,5 Äqu.), HOBT (1,5 Äqu.) und DIEA (1,7 Äqu.) werden in NMP (6 Vol.) kombiniert, dann auf 0–5°C abgekühlt (Anmerkung 2). Es wird HBTU hinzugegeben und die Lösung wird für 10–15 Minuten gerührt, um zu lösen. Die Lösung aktivierter Aminosäure wird zum Harz hinzugegeben. DCM (2 Vol.) wird verwendet, um den Reaktor zu waschen, dieses wird dann zum Harz hinzugegeben (Anmerkung 3). Die Suspension wird unter Stickstoffatmosphäre für 1–2 Stunden gerührt. Die Vervollständigung der Verbindung wird mit einem qualitativen Ninhydrin-Test überwacht (Anmerkung 4). Wenn der Ninhydrin-Test negativ ist, lässt man das Gefäß ablaufen, wäscht 3 mal mit 5 Vol. NMP, und der Zyklus wird mit der nächsten Aminosäure in der Sequenz wiederholt (DCM-Quellen wird nur für die erste beladene Aminosäure verwendet).
Wenn der Test positiv ist, wird die Suspension für eine zusätzliche Stunde in Bewegung gehalten und wieder getestet. Wenn das Ninhydrin negativ ist, wird zum nächsten Zyklus übergegangen. Wenn das Ninhydrin positiv bleibt, wird mit 1 Äqu. der Aminosäure und der Reagenzien die Verbindungsreaktion wiederholt. Wenn der Ninhydrin nach einer Stunde positiv ist, wird mit 5 Äqu. Essigsäureanhydrid und 5 Äqu. Pyridin in NMP (10 Vol.) für eine Stunde endversiegelt.
Bei der Vervollständigung der Fragmentsynthese lässt man das Harz ablaufen, wäscht mit 2 × 5 Volumenteilen NMP, 5 × 5 Volumenteilen DCM, und trocknet, was zu einem Ertrag von 4,11 kg FmocAA27–350-Harz führt.
Das Fragment wird vom Harz abgeschnitten (2,05 kg), unter Verwendung von 6 × 1,7 Volumenteilen 1% TFA in DCM, für jeweils 5 Minuten. Die 1% TFA/DCM Waschfraktionen werden in einer Flasche aufgefangen, die Pyridin enthält (1:1 Volumenverhältnis mit dem TFA in dem Waschschritt). Die Produkt-enthaltenden Waschfraktionen werden kombiniert und das DCM wird durch Destillation entfernt (Vakuum so eingestellt, dass eine Gefäßtemperatur von ungefähr 15°C beibehalten bleibt) und zwar ungefähr bis zur Hälfte des ursprünglichen Gefäßvolumens. Ethanol (5 Vol.) wird allmählich hinzugegeben und die Destillation (Vakuum so eingestellt, dass eine Gefäßtemperatur von ungefähr 20°C aufrecht erhalten bleibt) wird fortgeführt, bis DCM entfernt ist (bestimmt durch die Temperatur des Destillats, Anmerkung 5). Das Gefäßvolumen sollte 6–7 Volumenteile betragen. Die trübe Lösung wird auf 10–14°C abgekühlt und es wird über 30 Minuten Wasser (3,5 Vol.) mit starkem Bewegen hinzugegeben, um FmocAA27–35OH zu präzipitieren. Die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration (15 Minuten) abgenommen, und mit Wasser (1 Vol.) gewaschen. Um restliches Pyridin zu entfernen, wird der feuchte Feststoff in den Reaktor zurückgegeben und 90/10 Ethanol/Wasser, vorgekühlt auf 0–5°C, wird hinzugegeben (10 Vol.). Die schlammige Masse wird bei 0–5°C für 60 Minuten gerührt, der Feststoff wird durch Vakuumfiltration abgenommen, mit 90/10 Ethanol/Wasser (0,5 Vol.) gewaschen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, was 1,19 kg FmocAA27–35OH ergibt, mit 89% Ausbeute und 89,2A% Reinheit (Anmerkung 6).
Dieses Protokoll kann nachbearbeitet werden, indem der Feststoff mit 15 Volumenteilen 9:1 Ethanol/Wasser unter Rühren für 12 Stunden zerrieben wird, gefolgt von dem Abnehmen und Trocknen.
Anmerkungen:

1. Zu 1 ml Aceton wird 1 Tropfen einer gesättigten Lösung aus Chloranil in Toluol hinzugegeben, gefolgt von 1 Tropfen Eluat. Eine blaue oder violette Färbung zeigt die Anwesenheit von Piperidin an.
2. Die Reagenzien mit Ausnahme von HBTU werden bei Raumtemperatur hinzugegeben, um das Lösen zu unterstützen. HBTU wird zur gekühlten Lösung hinzugegeben, um Racemisierung zu minimieren.
3. Die Aktivierung wird in NMP durchgeführt, da HBTU nicht in DCM löslich ist. DCM wird verwendet, um den Reaktor zu waschen, und zum Harz hinzugegeben, um eine angemessene Harzquellung aufrecht zu erhalten.
4. Quantitativer Ninhydrin-Test ist angemessen zur Beobachtung der Verbindungseffizienz. Eine 2–20 mg Probe des Harzes wird abgenommen und mit Methanol saubergewaschen. Zur Probe werden 3 Tropfen 76% Phenol in Ethanol, 4 Tropfen 0,2 mM KCN in Pyridin und 3 Tropfen 0,28 M Ninhydrin in Ethanol hinzugegeben. Die Lösung wird auf 0,5–1 ml mit Ethanol verdünnt und für 5–10 Minuten bei 75°C in einen Heizblock gegeben. Eine blaue oder violette Farbe zeigt freie Amine an (positiv). Klar durchsichtig oder leicht blau ist ein negatives Ergebnis.
5. Die Kopftemperatur während der Vakuumdestillation von DCM betrug 10–15°C. Die Kopftemperatur stieg auf 35°C an, wenn DCM entfernt wurde.
6. Vydac, C8, 5 μ, 300 A 1 ml/min, 262 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B ACN/0,1% TFA 80–99% B/20 min. Retentionszeit: 15,3 Minuten

11.5 Großmaßstabs-Präparation von Fragment FmocAA(27–36)-OH durch Lösungsphasen-Verbindung von FmocAA(27–35)-OH mit HPheNH₂
Ingesamt 5,226 kg FmocAA27–36NH₂ wurden in 4 Durchläufen aus 4,676 kg FmocAA27–35OH präpariert. Restliche Verbindungsreagenzien oder Lösungsmittel machen die Ausbeute, die größer als 100% ist, aus. Diese werden in der nächsten Stufe entfernt.
Feststoff, der nach Wasserausfall an der Reaktorwand klebte, wurde als signifikantes Problem in dieser Stufe bezeichnet. Die Isolierung des rohen Feststoffes durch Vakuumfiltration benötigte 30 Minuten. Die durchschnittliche Trocknungszeit (Vakuum, keine Hitze) für die Durchgänge betrug 8 Tage. Der Feststoff muss auf dem Filter komprimiert werden, um überschüssiges Wasser zu entfernen, bevor er in den Ofen geht. Das Fragment ist gegenüber einer Trocknung bei 40°C stabil und die Vakuumöfen mussten angeheizt werden.
Ein Verwendungstest wird im 0,5 bis 1 Gramm-Rahmen mit der Charge/der Abfüllcharge (lot) von zu verwendenden Ausgangsmaterialien durchgeführt, um dabei zu helfen, Qualität und Identität zu etablieren. Dünnschichtchromatographie (TCL) und HPLC werden verwendet, um die Umwandlung von Ausgangsmaterialien zum Produkt zu beobachten. Die primäre Verunreinigung, nach der in Fragment FmocAA27–35OH zu schauen ist, ist Trifluoressigsäure (oder ein Salz von dieser). Die Aktivierung und Reaktion von Trifluoressigsäure, die mit FmocAA27–35OH vorliegt, mit dem Phenylalaninamid ist ein schneller Prozess. Ein kleiner Überschuss Phenylalaninamid kann verwendet werden, um irgendwelche vorhandene Triofluoressigsäure zu verbrauchen. Ein signifikanteres Qualitätsproblem liegt beim vertriebenen Phenylalaninamid. Die meisten Verkäufer verkaufen dieses als HCl-Salz. Mehrere Abfüllchargen des HCl-Salzes von Phenylalaninamid haben eine Unreinheit produziert (5–15A%), die mit dem Ausgangsmaterial auf HPLC co-eluiert. Die Unreinheit kann vom Ausgangsfragment und -produkt durch TLC abgetrennt werden. Die Unreinheit ist FmocAA27–35NH₂, welches aus Ammoniumchlorid resultiert, das im HCl-Salz von Phenylalaninamid vorliegt.
11.5.1 Großmaßstabs-Präparation von Fragment FmocAA(27–36)-OH durch Lösungsphasenverbindung von FmocAA(27–35)-OH mit HPheNH₂
Ein doppelwandiger 40 l Reaktor mit einem mechanischen Rührer wird mit FmocAA27–35OH (1 Äqu., 1,185 kg), HOAT (1,1 Äqu.), HCl·HPheNH₂ (1,15 Äqu.) und DMF (12,5 Vol.) beschickt. DIEA (2,1 Äqu.) wird hinzugegeben, die Lösung wird auf 0–5°C abgekühlt und HBTU (1,2 Äqu.) wird hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 15 Minuten bei 0–5°C gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 70 Minuten gerührt (Anmerkung 1, HPLC wird zur prozessinternen Überprüfung verwendet). Nachdem die Reaktion mittels HPLC als vollständig beurteilt wurde, wird über 15–30 Minuten Wasser (12,5 Vol.) hinzugegeben, um das Peptid zu präzipitieren. Die schlammige Masse wird für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Wasser (3 Vol.) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von FmocAA27–36NH₂ (1,357 kg mit 107% Ausbeute und 87.IA% Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 2)).
Die Reaktion kann nachbearbeitet werden, indem der Feststoff mit 15 Volumenteilen 9:1 Acetonitril/Wasser unter Rühren für 12 Stunden zerrieben wird, indem danach abgenommen wird und getrocknet wird.
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle, TLC: 88/12 Dichlormethan/Methanol UV, Ioddetektion Rf: FmocAA27–35OH, 0,49 Rf: FmocAA27–36NH₂, 0,63 Vydac C8, 5 m, 300 A 30°C, 1 ml/min, 262 nm A Wasser/0,1% TFA B ACN/0,15 TFA 80–99% B/20 Minuten Retentionszeit: FmocAA27–35OH, 15,8 Retentionszeit: FmocAA27–36NH₂, 17,12
2. Im Allgemeinen wird eine größere als die theoretische Ausbeute erreicht, bis der isolierte Feststoff in den Reaktor zurückgegeben wird und mit Wasser zerrieben wird.

11.6 Großmaßstabs-Präparation von Fragment Haa(27–36)-OH aus FmocAA(27–36)-OH
Insgesamt 3,897 kg HAA27–36NH₂ wurden aus 5,221 kg FmocAA27–36NH₂ in vier Durchläufen mit einer durchschnittlichen zweistufigen Ausbeute von 86,4%. Der Ausbeutebereich, der für die Durchläufe beobachtet wurde, 74–97%, spiegelt vermutlich eine Übertragung von einem Durchlauf in den nächsten wider. Die Aufbereitung und Produktisolierung in dieser Stufe funktioniert sehr gut. Die Reinheit des Produktes wird erhöht, wenn die korrekte Menge DCM im MTBE gelassen wird und die physikalischen Eigenschaften des Feststoffes zu einer schnellen Filtration und Trocknung führen. Dieser Produkt-Isolations-Prozess wurde in die neue Stufe, die in Abschnitt 11.6.2 unten beschrieben ist, eingearbeitet.
DCM ist das Lösungsmittel, das während des Entschützens von FmocAA27–36NH₂ verwendet wird. Zum Zeitpunkt der Vervollständigung des Entschützens wird die organische Lösung zweimal mit Wasser gewaschen, um das meiste des überschüssigen Piperidins zu entfernen, dann wird auf ungefähr ein Drittel des Ursprungsvolumens aufkonzentriert. MTBE wird hinzugegeben, um das Fragment zu präzipitieren. Die Destillation wird fortgesetzt, um die Mehrheit des übrigen DCM zu entfernen und um die Präzipitation des Fragments zu vervollständigen. Es ist wichtig, das meiste des DCM zu entfernen, um Masseverlust bei der Präzipitation zu verhindern. Es ist auch wichtig, ein wenig DCM im MTB zu belassen, um die Aufreinigung des Produktes sicherzustellen. Dibenzofulven, Piperidin/Fulven-Adduct und restliches Piperidin sind in MTBE löslich. HAA27–36NH₂ wird abgenommen und getrocknet. Wenn nötig wird ein zweites Verreiben des Feststoffes (12 Stunden) mit MTBE übriges Dibenzofulven und wichtiger das Piperidin/Fulven-Adduct, das im HAA27–36NH₂ vorhanden ist, entfernen. Ein Verreiben mit Hexan wird Dibenzofulven entfernen, aber nicht das Piperidin/Fulven-Adduct. Die Trocknungszeit des aus MTBE isolierten Feststoffes beträgt 1 Tag.
Aufgrund der hohen Löslichkeit von HAA27–36NH₂ und verwandter Verunreinigungen in DCM/MTBE war ein analytisches Verfahren wünschenswert, um den Endpunkt des Lösungsmittelaustausches akkurat zu bestimmen. Es wurde ein GC-Verfahren entwickelt, um im Hinblick auf DCM in MTBE zu untersuchen. Die Destillation ist vollständig, wenn der DCM-Gehalt im MTBE unter 6% liegt.
11.6.1 Großmaßstabs-Präparation von Fragment HAA(27–36)-OH aus FmocAA(27–36)-OH
Ein doppelwandiger 40 l Glasreaktor, der mit einem mechanischen Rührer und Thermometer ausgerüstet ist, wird mit FmocAA27–36NH₂ (1 Äqu., 1,35b kg), DCM (5 Vol.) und Piperidin (0,2 Vol.) beschickt. Die Lösung wird bei Umgebungstemperatur für 1,5 Stunden gerührt (Anmerkung 1). Die organische Lösung wird mit Wasser (2 × 5 Vol.) gewaschen. Das Volumen der organischen Lage wird ungefähr auf ein Drittel des Ausgangsvolumens durch Destillation (ungefähr 25 mm Hg, Außenmanteltemperatur geringer als 45°C, um Schmelzen des Feststoffes zu vermeiden) reduziert. MTBE (5 Vol.) wird allmählich in das Reaktionsgefäß gegeben, während das Aufkonzentrieren bis zu einem Punkt der starken Präzipitation und bis das Gefäßvolumen ungefähr 5 Volumenteile beträgt, fortgesetzt. Der Lösungsmittelaustausch wird gestoppt, wenn der DCM-Gehalt unter 6% liegt. Die schlammige Masse wird auf 0–5°C abgekühlt, für 60 Minuten gerührt, dann mittels Vakuumfiltration (schnell) abgenommen. Die Feststoffe werden mit MTBE gewaschen (2 × 0,5 Vol.) und bis zum Erreichen eines konstanten Gewichtes getrocknet, unter Erhalt von 1,022 kg HAA27–36NH₂ mit 89,2% Ausbeute (2 Schritte) und 91,1A% Reinheit (Anmerkung 1).
Die Reaktion kann durch Verreiben mit MTBE (12,5 Vol.) bei 23°C über 13 Stunden, Abnehmen mittels Vakuumfiltration und Trocknen nachbearbeitet werden.
Anmerkungen:

1. IPC und Reinheit gemessen mittels HPLC: Vydac, C8, 5, 300 A 1 ml/min, 262 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B ACN/0,1% TFA 80–99% B/20 Minuten Retentionszeit: FmocAA27–36NH₂, 16,5. HAA27–36NH₂, 8,4

11.6.2 Verbesserte Präparation von Fragment HAA(27–36)-OH durch Lösungsphasenverbindung von FmocAA(27–36)-OH mit HPheNH₂
Ein neues Verfahren, das Abschnitte 11.5 bis 11.6.1 verbindet, das FmocAA27–35OH direkt in HAA27–36NH₂ umwandelt, wurde entwickelt. Dieses neue Verfahren hebt Probleme auf, die mit der Isolierung von FmocAA27–36NH₂ und einer langen Trocknungszeit in Verbindung stehen. Eine detaillierte Beschreibung wird unten wiedergegeben. Das neue Verfahren entfernt eine lange Trocknungszeit und eine Stufe aus dem Syntheseweg.
FmocAA27–35OH (5,0 g, 1 Äqu.), HOAT (0,459, 1,2 Äqu.) und Phe-NH₂ (0,389, 1,2 Äqu.) werden in einen 100 ml Rundkolben, der mit einem Magnetrührer und einem Stickstoffeinlass ausgerüstet ist, gegeben. 10 Volumen NMP (50 ml) und DIEA (0,45 g, 1,5 Äqu.) werden in die Flasche gegeben und unter Stickstoffatmosphäre gerührt, bis sich die Feststoffe lösen. Die Lösung wird auf 0–5°C abgekühlt, dann wird HBTU (1,04 g, 1,2 Äqu.) hinzugegeben. Es wird unter Stickstoffatmosphäre bei 0–5°C über 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf 20°C erwärmt und das Rühren wird fortgesetzt. Es wird eine Prozesskontrolle (IPC) 90 Minuten nachdem HBTU zugegeben wurde, durchgeführt (Anmerkung 1).
Nachdem die prozessinterne Kontrolle (IPC) anzeigt, dass die Reaktion vervollständigt ist, wird Piperidin (1,379, 7 Äqu.) zum Reaktionsgemisch hinzugegeben und es wird unter Stickstoffatmosphäre für 1,5 Stunden gerührt. Es wird eine IPC durchgeführt (Anmerkung 1). Wenn das Entfernen des Fmoc nicht vollständig ist, wird zusätzliche 30 Minuten gerührt und die IPC durchgeführt.
Wenn sie vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch zu 5% wässriger Essigsäure gegeben, und zwar mit einer solchen Geschwindigkeit, dass eine Temperatur von 35°C nicht überschritten wird (30 Vol.). Die daraus hervorgehende schlammige Masse wird für 1 bis 2 Stunden gerührt und mittels Vakuumfiltration abgenommen (Anmerkung 2). Der Feststoff wird mit 10 Volumenteilen (50 ml) Wasser gewaschen.
Der feuchte Feststoff wird in den Reaktor zurückgegeben, 20 Volumenteile Wasser (100 ml) werden hinzugegeben und es wird bei Umgebungstemperatur für 1 bis 2 Stunden gerührt. Die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen, es wird mit 10 Volumenteilen Wasser (50 ml) gewaschen und getrocknet (Anmerkung 3).
Der trockene Feststoff (Anmerkung 4) wird mit MTBE (20 Vol.) bei Umgebungstemperatur für 2 bis 5 Stunden verrieben, um Dibenzofulven und Dibenzofulven-Piperidin-Adduct zu entfernen. Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration abgenommen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, was zu einem Ertrag von 4,55 Gramm (94,3%) HAA27–36NH₂ mit 85–90A%iger Reinheit führt (Anmerkung 1).
Fmoc-Nebenprodukte (Dibenzofulven und sein Piperidin-Adduct) werden im Allgemeinen in diesem Protokoll entfernt, wenn jedoch eine Nacharbeitung notwendig ist, ist der Feststoff in 10 Volumenteilen MTBE bei 20°C für 2 bis 3 Stunden zu rühren, abzunehmen und zu trocknen.
Anmerkungen:

1. Prozessinterne Kontrolle (IPC) mittels Umkehrphasen-HPLC: Säule Vydac C8, 300 A, 5 μ, 30°C Fließgeschwindigkeit 1 ml/min Detektion UV bei 262 nm Mobile Phase A. Wasser/0,1% TFA B. Acetonitril/0,1% TFA Verfahren 80 bis 99% B über 20 Minuten Retentionszeiten: FmocAA27–36NH₂ (16,5 min.) HAA27–36NH₂ (8,4 min)
2. Die gesamte Filtrationszeit betrug 10 Minuten.
3. Der feuchte Filterkuchen muss für einen Waschschritt mit Wasser unmittelbar in den Reaktor zurückgegeben werden, um Schmieren oder Verharzung der Feststoffe zu vermeiden.
4. Das Rohprodukt muss vollständig getrocknet sein, um sicherzustellen, dass durch das Verreiben des MTBE die Dibenzofulven-Nebenprodukte entfernt werden.

11.7 Großmaßstabs-Präparation von Fragment FmocAA(17–36)-OH mittels Lösungsphasensynthesefusion von FmocAA(17–26)-OH mit HAA(27–36)-OH
Insgesamt 5,115 kg FmocAA17–36NH₂ wurden aus 2,993 kg HAA27–36NH₂ und 3,167 kg aus FmocAA17–26OH in vier Durchgängen präpariert. Die durchschnittliche Ausbeute betrug 84,3%. Das Filtern des Feststoffs nach dem Wasserausfall aus dem Reaktionsgemisch benötigte durchschnittlich 40–50 Minuten.
Ein Verwendungstest wird durchgeführt im 1–2 g Maßstab, der sowohl die Fragmente, als auch das zu verwendende HBTU vor Durchführung der Verbindungsreaktion testet. Die Stöchiometrie der Ausgangsmaterialien und -reagenzien wird aus dem Verwendungstest heraus bestimmt. Die Löslichkeit des Ausgangsmaterials wird in dem Verwendungstest ebenfalls beobachtet. Eine trübe Lösung kann die Anwesenheit von Salzen in FmocAA17–26OH anzeigen und einen Waschschritt des Fragmentes mit Wasser rechtfertigen. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Komponenten des Reaktionsgemisches vor Zugabe des HBTU in Lösung vorliegen, um eine vollständige Umwandlung der Ausgangsmaterialien zu Produkt mit minimaler Racemisierung und Nebenprodukt-Bildung sicherzustellen.
Die Reinheit von rohem FmocAA17–36NH₂, welches aus dem Wasserausfall isoliert wurde, wird signifikant durch Präzipitieren aus IPA erhöht. FmocAA17–36NH₂ ist teilweise in IPA löslich. Das Verreiben von FmocAA17–36NH₂ mit ungefähr 15 Volumenteilen 95/5 IPA/Wasser, vorgewärmt auf 60–70°C, gefolgt von Rühren, während es über mehrere Stunden auf Raumtemperatur abkühlt, erhöht die Reinheit des Fragments. Beide Ausgangsmaterialien sowie das Piperidinamid von FmocAA17–26OH und das Enamid-Harnstoff-Adduct von HAA27–36 NH₂ sind im 95%igen IPA löslich. Die Trituration des rohen FmocAA17–36NH₂ mit 95%igem IPA bei Raumtemperatur über verlängerte Zeitspannen ist beim Entfernen von Unreinheiten nicht so effektiv. Eine Stabilitätsuntersuchung bei 60–70°C wurde durchgeführt. Der Fehler, die IPA-Lösung auf über 52°C zu erwärmen, scheint minimale Auswirkungen auf die Qualität des isolierten Produkts zu haben.
11.7.1 Bevorzugtes Verfahren zur verbesserten Großmaßstabs-Präparation von Fragment FmocAA(17–36)-OH mittels Lösungsphasensynthesefusion von FmocAA(17–26)-OH mit HAA(27–36)-OH
Ein doppelwandiger 40 l Reaktor, der mit einem mechanischen Rührer und Stickstoffeinlass ausgerüstet ist, wird mit FmocAA17–26OH (1 Äqu., 0,770 kg), HAA27–36NH₂ (1 Äqu., 0,720 kg), HOAT (1,5 Äqu.) und DMF (12,5 Volumenteile in Bezug auf FmocAA17–26OH) beschickt. EtPr₂N (1,5 Äqu.) werden hinzugegeben und die Suspension wird bei Raumtemperatur gerührt, bis sich die Feststoffe (optisch) gelöst haben. Die Lösung wird auf 0–5°C unter Stickstoffatmosphäre abgekühlt und HBTU (1–1,05 Äqu.) wird hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 0–5°C gerührt, bis HBTU sich löst (optisch, ungefähr 15 Minuten). Das Reaktionsgemisch wird auf 25°C erwärmt und für 2 Stunden gerührt (Anmerkung 1). Die DMF-Lösung wird auf 0–5°C abgekühlt und Prozesswasser (12,5 Vol.) wird mit solch einer Geschwindigkeit zugegeben, dass 25°C nicht überschritten werden. Die daraus hervorgehende schlammige Masse wird für 1–24 Stunden gerührt, die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen und mit Wasser (3 × 4 Vol.) gewaschen. Die Feststoffe werden auf dem Filter für 16–24 Stunden getrocknet, bis ungefähr zweimal der theoretischen Masse. Der 40 l Reaktor wird mit 95/5 Isopropanol/Wasser (25 Vol.) beschickt und auf 45°C erwärmt. Das semi-trockene FmocAA17–36NH₂ wird unter schneller Bewegung zur IPA-Lösung gegeben. Die Suspension wird auf 52°C erwärmt, dann für 12–16 Stunden gerührt, während sie auf Raumtemperatur abkühlt (Anmerkung 2). Die Feststoffe werden mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit einer minimalen Menge IPA gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 1,261 kg FmocAA17–36NH₂ mit 85%iger Ausbeute und 90,5A% Reinheit mittels HPLC (Anmerkung 1). Die Reaktion kann nachbearbeitet werden, indem die 95/5 IPA/Wasser Trituration wiederholt wird.
Anmerkungen

1. Prozessinterne Kontrolle und Reinheit, HPLC Vydac, C8, 5 μ, 300 A 1 ml/min, 262 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B 80/20 IPA ACN/0,1% TFA 60–95% B/20 Minuten Retentionszeit: HAA27–36NH₂, 6,73 Minuten FmocAA17–26OH, 10,67 Minuten FmocAA17–36NH₂, 20,2 Minuten
2. Das FmocAA17–36NH₂ wird sich in diesem Volumen bei dieser Temperatur nicht vollständig lösen. Vor der Abnahme der Feststoffe ist das Schütteln beziehungsweise die Bewegung zu stoppen und es ist den Feststoffen zu ermöglichen, sich abzusetzen. Es ist eine Probe aus dem Filtrat abzunehmen und mittels HPLC zu analysieren. Wenn das Filtrat eine signifikante Menge FmocAA17–36NH₂ enthält ist auf 0°C abzukühlen, bevor die Feststoffe abgenommen werden.

11.8 Großmaßstabs-Präparation von Fragment HAA(17–36)-OH aus FmocAA(17–36)-OH
Insgesamt 4,965 kg HAA17–36NH₂ wurden aus 5,112 kg FmocAA17–36NH₂ in vier Durchläufen präpariert. Sowohl die isolierte Ausbeute als auch HPLC-Spuren deuten auf die Anwesenheit von Dibenzofulven und vielleicht Lösungsmittel hin. Das vorhandene Dibenzofulven wird die nächste Verbindungsreaktion nicht spüren, da es mit Kaliumcarbonat, nicht Piperidin, entfernt wurde, und daher das Piperidin-Adduct von Dibenzofulven chemisch kein Problem ist.
Es hängen mehrere Probleme mit diesem Prozess zusammen. Die Reaktion wird in 12 Volumenteilen DMF durchgeführt. Die Base, die die Fmoc-Gruppe entfernt, ist 1 Volumenteil 1,1 M Kaliumcarbonat, welches nicht in der Lage ist, ein schwierig zu entfernendes basisches Adduct mit Dibenzofulven zu bilden. Das Entschützen findet in ungefähr 90 Minuten bei Raumtemperatur statt.
Eine gesättigte 1:1 wässrige Natriumchlorid:Wasser-Lösung, vorgekühlt auf 0°C wird hinzugegeben, und das Fragment und Dibenzofulven zu copräzipitieren. Dies erzeugt einen feinen, milchigen Feststoff, welcher Stunden benötigt (5–8), um filtriert zu werden. Einmal isoliert, muss der feuchte Feststoff vollständig getrocknet werden (bis zu weniger als 1% LOD), um Dibenzofulven-Verunreinigung zu entfernen. Das Trocknen benötigte 10 Tage (Vakuum, keine Hitze). Einmal getrocknet, wird der Feststoff in den Reaktor zurückgegeben und mit 3:1 Heptan:MTBE (20 Vol.) bei Umgebungstemperatur über 18 Stunden verrieben, um das Dibenzofulven zu entfernen. Eine kürzere Triturationszeit entfernt es nicht vollständig, und wenn irgendwelches Wasser auf den Feststoffen ist, wird es nicht entfernt. Eine Nachbearbeitung mit 3:1 Heptan:NTBE (20 Vol.) kann angewandt werden, wenn Dibenzofulven persistiert.
Um diese Probleme zu lösen, wurde das folgende neue Verfahren entwickelt. FmocAA17–36NH₂ (2,0 g, 1 Äqu.) und Heptan (8 Vol.) werden in einen 100 ml Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührer, einer Temperaturkontrolle und einem Refluxkondensator ausgerüstet ist, gegeben. 2 Volumenteile MTBE (4 ml) werden hinzugegeben und die schlammige Masse wird auf 45–50°C erhitzt (Anmerkung 1). Piperidin (10 Äqu.) wird hinzugegeben. Es wird unter Stickstoffatmosphäre bei 45–50°C für 24–36 Stunden gerührt (Anmerkung 2). Das Reaktionsgemisch wird bei 45–50°C heiß filtriert (Anmerkung 3), dann wird der Kuchen mit 5 Volumenteilen (10 ml) 60:40 Heptan:MTBE gewaschen.
Anmerkungen:

1. Eine langsamere Reaktion ergibt sich, wenn man es dem MTBE erlaubt, aus dem Reaktor zu entkommen, wobei das Heptan:NTBE-Verhältnis verändert wird. Reaktionstemperaturen größer als 50°C können zur Verharzung der Reaktionsfeststoffe führen. Fmoc wird größtenteils in 5 Stunden entfernt.
2. Die Vervollständigung der Reaktion wird mittels RP-HPLC überwacht: Säule Vydac C8, 300 A, 5, 30°C Fließgeschwindigkeit 1 ml/min Detektion UV bei 262 nm Mobile Phase A. Wasser/0,1% TFA B. 80:20 IPA:CAN 0,1% TFA Verfahren 60 bis 95% B über 30 Minuten
3. Heizfiltration hilft beim Entfernen des Piperidin-Adducts von Dibenzofulven.

11.8.1 Großmaßstabs-Präparation von Fragment HAA(17–36)-OH aus FmocAA(17–36)-OH
Ein doppelwandiger 40 l Reaktor wird mit FmocAA17–36NH₂ (1 Äqu., 1,26 kg) und DMF (12 Vol.) bei Raumtemperatur beschickt. Eine 1,11 M wässrige Kaliumcarbonat-Lösung (1 Vol., 5 Äqu.) wird sofort hinzugegeben (Anmerkung 1). Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur für 3,5 Stunden gerührt (Anmerkung 2). Das Reaktionsgemisch wird langsam zu einer 1:1 Lösung aus gesättigtem wässrigen Natriumchlorid/Wasser (10 Volumenteile), vorgekühlt auf 0°C, mit einer solchen Geschwindigkeit hinzugegeben, dass eine Temperatur von 10°C nicht überschritten wird (ungefähr 1–2 Stunden). Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration unter Verwendung eines Kunststoffdamms, um Wasser aus dem Filterkuchen zu pressen, abgenommen (Anmerkung 3). Der nasse Kuchen wird zurück ins Reaktionsgefäß transferiert und mit Wasser (10 Vol.) für 1–2 Stunden trituriert (geschüttelt), um restliche anorganische Salze zu entfernen. Der Feststoff wird durch Vakuumfiltration abgenommen, mit einem Kunststoffdamm komprimiert, dann in einen Vakuumofen transferiert und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Der trockene Feststoff (Anmerkung 4) wird trituriert (geschüttelt), mit 3:1 Heptan:MTBE (20 Vol.), und zwar über mindestens 14 Stunden bei Raumtemperatur, um Dibenzofulven zu entfernen. Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration abgenommen, mit Heptan (2 Vol.) gewaschen und getrocknet, unter Erhalt von 1,20 kg HAA17–36NH₂ in 99,5%iger Ausbeute und 75A%iger Reinheit. Das HAA17–36NH₂ enthält 5A% Dibenzofulven. Die Reaktion ist durch Wiederholung der Heptan:MTBE-Trituration nachzubearbeiten.
Anmerkungen:

1. Die Lösung wird trübe, wenn das wässrige Kaliumcarbonat hinzugegeben wird, aber klart unter fOrtgesetzten Rühren auf. Eine Exotherme von 4–5°C wurde beobachtet.
2. HPLC wurde zu IPC und Reinheit verwendet. Vydac, C8, 260 nm 1 ml/min 262 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B 80:20 IPA/Acetonitril/0,1% TFA 60–95% B/30 Minuten
3. Das Produkt präzipitiert mit einer feinen Fartikelgröße, was zu einer langsamen Filtration führt.
4. Das Material muss wasserfrei sein, damit das Heptan das Dibenzylfulven effektiv entfernt.

11.9 Großmaßstabs-Herstellung von Fragment AcAA(1–36)-OH durch Lösungsphasensynthese aus AcAA(1–16)-OH und FmocAA17–36-OH
Das AcAA1–16OH wurde mit HOAT und DIEA in DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und HBTU wurde hinzugegeben. Dieses wurde für 15 Minuten gerührt, oder bis HBTU gelöst war, dann wurde HAA17–36HN₂ hinzugegeben. Die Voraktivierung von AcAA1–16OH in Abwesenheit von HAA17–36-NH₂ war eine Vorsichtsmaßnahme, die sich später als nicht notwendig herausstellte. Zusätzlich stellte sich heraus, dass die Lösung von HAA17–36NH₂ in 0°C DMF-Lösung, die das aktivierte AcAA1–16OH enthielt, in größerem Maßstab langsam war.
Insgesamt 6,972 kg AcAA1–36NH₂ wurden aus 3,92 kg AcAA1–16OH und 4,96 kg HAA17–36NH₂ in vier Durchgängen hergestellt, mit einer durchschnittlichen Ausbeute von 80,1%. Zwei Durchgänge in diesem Stadium hatten durchschnittlich 87% Ausbeute und zwei Durchgänge hatten durchschnittlich 73% Ausbeute.
Ein Verwendungstest wird in einem Maßstab von 1–2 g durchgeführt, der sowohl die Fragmente, als auch das zu verwendende HBTU vor der Durchführung der Verbindungsreaktion überprüft. Die Stöchiometrie der Ausgangsmaterialien und -reagenzien wird aus dem Verwendungstest bestimmt. Die Löslichkeit der Ausgangsmaterialien wird ebenfalls in dem Verwendungstest beobachtet. Eine trübe Lösung kann auf die Anwesenheit von Salzen im AcAA1–16OH hindeuten und einen Waschschritt mit Wasser in Bezug auf das Fragment rechtfertigen. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Komponenten des Reaktionsgemisches klar in Lösung vorliegen, und zwar vor der Zugabe von HBTU, um eine vollständige Umwandlung der Ausgangsmaterialien im Produkt mit minimaler Racemisierung und Nebenprodukt-Bildung sicherzustellen.
Die Fragmente, AcAA1–16OH und HAA17–36NH₂, und die Reagenzien HOAT und DIEA wurden in DMF gelöst, auf 0°C abgekühlt und HBTU wurde hinzugegeben. Einer der Durchläufe erforderte ein zusätzliches Äquivalent DIEA, um das HCl auf HAA17–36NH₂ aufzunehmen. Das rohe Produkt wird aus dem Reaktionsgemisch mit einer Wasserfällung isoliert (Filtrationszeit 10 Minuten). Der noch feuchte Feststoff wurde in einen Reaktor zurückgegeben, der Acetonitril enthielt, vorgewärmt auf 55°C, dann wurde schnell gerührt, während auf 35°C über 3 Stunden abgekühlt wurde, und dann auf 20°C über Nacht. Die schlammige Masse wird auf 0–5°C abgekühlt, zusätzliche 1–2 Stunden gerührt und der Feststoff wird mittels Filtration abgenommen. Während dieses Verfahrens geht AcAA1–36NH₂ bei 55°C beinahe in Lösung. Wenn die Lösung abkühlt, präzipitiert (ölt) AcAA1–36NH₂ aus der Lösung aus. Wenn die Lösung abkühlt, verfestigt sich das Öl und wird schließlich in einen schönen weißen Feststoff umgewandelt. Während dieser Transformation kann eine beachtliche Anlagerung von Feststoff auf der Reaktorwand und dem Rührschaft stattfinden. Das meiste davon fällt ab, wenn die schlammige Masse über Nacht bei 20°C gerührt wird. Nach Abnahme des Feststoffes wird der Reaktor mit genügend Wasser gefüllt, um jeden Feststoff zu bedecken, der an der Reaktorwand oder dem Schaft klebt. Die schlammige Masse wird gerührt, bis jeglicher übriger Feststoff von den Wänden und vom Schaft abgefallen ist (ungefähr 1 Stunde), und dann als Waschfraktion für den Filterkuchen verwendet. Der Acetonitril-Waschschritt entfernt nicht-reagierte Ausgangsmaterialien und jedwede verkürzte Fragmente mit weniger als 20 Aminosäuren.
11.9.1 Bevorzugte Großmaßstabs-Präparation von Fragment AcAA(1–36)-OH mittels Lösungsphasensynthese aus AcAA(1–16)-OH und FmocAA(17–36)-OH
Ein 40 l Reaktor wird mit AcAA1–16OH (983 g, 1 Äqu.), HAA17–36NH₂ (1,19 kg, 1 Äqu.), HOAT (1 Äqu.), DMF (19 Vol., in Bezug auf AcAA1–16OH) und DIEA (1 Äqu.) beschickt. Die schlammige Masse wird gerührt, bis die Feststoffe sich lösen, dann auf 0–5°C abgekühlt und es wird HBTU (1,03 Äqu.) hinzugegeben. Die Lösung wird bei 0–5°C für 15 Minuten oder bis der Feststoff sich löst gerührt, auf 20°C erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Von dem Reaktionsgemisch wird eine Probe für eine IPC abgenommen (Anmerkung 1). Wenn die Reaktion als beendet eingeschätzt wird, wird Wasser (19 Vol.) hinzugegeben, und zwar mit solch einer Geschwindigkeit, dass 35°C nicht überschritten werden (Anmerkung 2).
Die schlammige Masse wird für 1–24 Stunden gerührt, dann werden die Feststoffe durch Vakuumfiltration (10 Minuten) abgenommen und es wird mit Wasser (2 × 3 Vol.) gewaschen. Der Filterkuchen wird komprimiert, um soviel Wasser wie möglich zu entfernen. Währenddessen wird der Reaktor mit 95% Acetonitril/Wasser (30 Volumenteile in Bezug auf die AcAA1–16OH-Beladung) beschickt und unter Rühren auf 55°C erwärmt.
Der feuchte Feststoff wird in Portionen zum Reaktor hinzugegeben, um Verklumpen zu vermeiden. Die schlammige Masse wird gerührt, während auf 35°C über 3 Stunden abgekühlt wird, dann auf 20°C über Nacht. Es wird auf 0–5°C abgekühlt, für 2 Stunden gerührt, das Rühren wird gestoppt und es wird eine Probe von der Lösung abgenommen.
Der Feststoff wird durch Vakuumfiltration abgenommen. Der Reaktor und die Leitungen werden mit 90% Acetonitril/Wasser (3,6 Vol.) gewaschen.
Der Reaktor wird mit einer ausreichenden Menge Wasser beschickt, um jedwede Feststoffe, die an den Reaktorwänden oder dem Rührschaft kleben, zu bedecken (ungefähr 30 Vol.). Es wird bei Umgebungstemperatur gerührt, bis die Feststoffe nicht mehr an die Reaktorwände und den Schaft anhängen (ungefähr 1 Stunde). Der Feststoff wird mit dem Rest abgenommen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet (1,83 kg, 86% Ausbeute).
Die Trituration des trockenen Feststoffs unter Verwendung von 90/10 Acetonitril/Wasser ist zu wiederholen.
Anmerkungen:

1. IPC und Reinheit, HPLC YMC ODS-A, 150 × 4,6 mm, 5 μ, 120 A 1 ml/min, 260 nm, 30°C A Wasser/0,1% TFA B THF/0,1% TFA 60–90% B/30 min., 90–95% B/1 min., 95% B/5 min. AcAA1–16OH 6,37 Minuten HAA17–36NH₂ 8,91 Minuten AcAA1–36HN₂ 18,07 Minuten
2. Wenn die Temperatur während der Zugabe von Wasser 35°C überschreitet, können die Feststoffe, die präzipitieren, verschmelzen, was zu Klumpen und/oder der Anlagerung an die Reaktorwände führt.

11.10 Entschützen von Seitenketen von AcAA(1–36)-OH
Es war eine Aufgabe dieses Experiments, die Zugabegeschwindigkeit von MTBE in der Präzipitation zu verändern, um die Temperatur bei weniger als 20°C zu halten, und auch rohen T-20-Feststoff zu isolieren und zu decarboxylieren (d.h. die Lösungs-Decarboxylierung herauszunehmen).
Das rohe T-20 wurde mittels Präzipitation aus ACN/Wasser als Feststoff isoliert, bevor es auf eine HPLC-Säule geladen wurde. Der prozentuale T-20-Gehalt des Feststoffs wurde mittels eines Gewichts-basierten HPLC-Assays bestimmt.
Nachdem die Seitenketten-Schutzgruppen im 90/5/5 TFA/Wasser/Dithiothreitol entfernt wurden, wird die Lösung auf 0°C abgekühlt und es wird MTBE (45 Vol. in Bezug auf AcAA1–36NH₂-Beladung) hinzugegeben. Dies ist die minimale Menge an MTBE, die erforderlich ist, um eine vollständige Präzipitation von T-20 sicherzustellen. Es gibt eine Exothermie beim Mischen, und die ersten 5 Volumenteile müssen langsam hinzugegeben werden, um die Temperatur unter 20°C zu halten (ungefähr 60 Minuten). Wenn mehr MTBE hinzugegeben wird, kann die Zugabegeschwindigkeit erhöht werden. Das Halten der Temperatur unter 20°C während der Präzipitation verhindert das Klumpen des Feststoffes, während es aus der Lösung präzipitiert.
Die folgenden Abschneide/Aufreinigungs-Protokolle umfassen die Durchführung des Entschützens in einem Maßstab, der einer chromatographischen Aufreinigung entgegen kommt. Das rohe T-20, das als TFA-Salz aus dem Entschützungscocktail isoliert wurde, wird in Acetonitril/Wasser bei pH 5 gelöst, filtriert und für 15 Stunden stehen gelassen, um Decarboxylierung der Tryptophanidole zu bewirken. Nachdem die Decarboxylierung vollständig war, wurde die Lösung verdünnt und zum Aufreinigungsgerät übertragen, um auf die Säule geladen zu werden. Während der Verdünnung wird die Lösung immer trübe und die aufgewirbelte Lösung wird auf die Säule gepumpt. Dies führt zur Ablagerung von Feststoff auf dem Kopf der Säule und zu einer allmählichen Aushöhlung der Säulenperformance während die Aufreinigung läuft. Die Decarboxylierung von T-20 in Acetonitril/Wasser bei pH 5 über mehrere Stunden führt zur Bildung von stark unlöslichen Aggregaten.
Ein Verfahren, um die Decarboxylierung in Lösung zu vermeiden, wurde entwickelt. Das rohe T-20, das als TFA-Salz aus der MTBE-Präzipitation isoliert wurde, decarboxyliert unter Vakuum bei Raumtemperatur über ungefähr 5–7 Tage. Man fand heraus, dass die Decarboxylierung in 3 Tagen bei 40°C unter Vakuum beendet war. Der TFA-Gehalt des isolierten Feststoffs betrug 9%. Das Material kann bis zu 1 Monat bei 0°C mit 1% Gew./Gew. Verlust gelagert werden.
Ein Salzaustausch in Ethanol/Wasser (1:9)HOAc kann nach Isolieren von T-20-TFA aus MTBE durchgeführt werden. Das Acetatsalz von rohem T-20 ist signifikant stabiler und könnte bevorzugt sein. Jedes der beiden Isolationsverfahren erlaubt es, dass das Entschützen der Seitenketten in größerem Maßstab durchgeführt wird und das T-20 wird den Acetonitril/Wasser/HOAc-Bedingungen, die zur Decarboxylierung verwendet werden, nicht ausgesetzt sein, welche dafür bekannt sind, dass sie die Aggregation verursachen.
Neues Verfahren zum Entschützen von Seitenketten von AcAA(1–36)-OH:
Es ist eine 90/5/5 TFA/Wasser/Dithiothreitol-Lösung (13 Vol.) herzustellen und für 3 Minuten mit Stickstoff zu spülen. AcAA1–36NH₂ wird in Portionen zu 90/5/5 TFA/Wasser/Dithiothreitol (13 Vol.) bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre hinzugegeben. Einmal in Lösung ist bei Umgebungstemperatur für 4 Stunden zu rühren, und dann auf 0°C abzukühlen. Um T-20 zu präzipitieren, wird MTBE (45 Vol.), abgekühlt auf 0–5°C, tropfenweise mit einer niedrigen Geschwindigkeit hinzugegeben, wobei anfänglich eine Temperatur unter 20°C beibehalten wird (ungefähr 1–2 Stunden Zugabezeit). Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration abgenommen (Anmerkung 1). Der Reaktor, die Leitungen und der Filterkuchen werden sofort mit 3 × 5 Volumenteilen MTBE gewaschen. Der Feststoff wird entfernt, es wird eine Probe für t = 0 IPC abgenommen (Anmerkung 2), und es wird unter Vakuum für 5 Tage getrocknet, oder bis die HPLC keine Veränderung mehr zeigt.
Anmerkungen:

1. Es ist zu vermeiden, während der Filtration Luft durch den Feststoff hindurchzuziehen, da die Entschützungslösung hygroskopisch ist. Das Durchziehen von Luft durch den Feststoff, bevor die TFA-Lösung ausgewaschen wurde, kann zu einem klebrigen oder öligen Feststoff führen.
2. Das HPLC-Verfahren TM2-0003-01 (TFA-Verfahren) ist zu verwenden. Das Ammoniumacetat-Verfahren (TM2-0006-01) trennt die verschiedenen carboxylierten Zwischenprodukte nicht auf.

Entschützen von Seitenketten von AcAA(1–36)OH
Insgesamt 7,226 kg AcAA1–36NH₂ wurden in 12 Durchgängen entschützt. Nur 6,972 kg AcAA1–36NH₂ wurden hergestellt, was nahe legt, dass das Zwischenprodukt hygroskopisch sein könnte. Der Feststoff, der aus dem MTBE-Ausfall isoliert wurde, wurde in 10 Volumenteilen 1:1 ACN/Wasser gelöst, filtriert, und mit Natriumbicarbonat auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Essigsäure (1,5 Volumenprozent) wurde hinzugegeben (pH-Wert 4,5–5) und die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur für 15 Stunden gerührt, um die Decarboxylierung zu bewirken. Die Lösung wurde mit 25 Volumina Wasser verdünnt, unter Erhalt von insgesamt 40 Volumenteilen einer 85/15 Wasser/ACN-Lösung. Die Lösung war in allen Fällen trübe und wies in einigen einen feinen Feststoff (aggregiertes T-20) auf. Eine Probe wurde zur IPC abgenommen und die Lösung wurde zum Aufreinigungsgerät transferiert. Die Erträge von rohem T-20 wurden für die Durchläufe unter Verwendung eines Gewicht/Gewicht-HPLC-Assays errechnet.
Das Entschützen von AcAA1–36NH₂ ist in 90/5/5 TFA/Wasser/DTT bei Raumtemperatur nach 4–5 Stunden beendet. Nach 8 Stunden hat eine wahrnehmbare Degradierung (2%) stattgefunden. Im selben Cocktail bei 5°C ist das Entschützen nach 8 Stunden nicht beendet, aber nach 23 Stunden. Es gibt keinen Unterschied in der Reinheit des rohen T-20, das nach 5 Stunden bei Raumtemperatur gegenüber 23 Stunden bei 5°C erhalten wird. Da das Isolierungsvolumen (ungefähr 55 Vol.) viel größer ist als das Reaktionsvolumen (Entschützungsvolumen) (13 Vol.), war es notwendig, dass AcAA1–36NH₂ in der TFA-Lösung in einem 20 l Ballon zu verdünnen, und dann die Lösung in einen 40 l Reaktor zu überbringen.
Die Isolierung des rohen, carboxylierten T-20 (als TFA-Salz) aus dem Entschützungscocktail wird durch Präzipitation mit MTBE erreicht. Die Menge an MTBE, die erforderlich ist, um das Peptid zu präzipitieren beträgt 3–4 mal die Menge des Entschützungscocktails. Die Verwendung von MTBE mit dem doppelten Volumen (oder weniger) des Abschneidecocktails lässt das Peptid zurück. Die Zugabe von MTBE zum Abschneidecocktail führt zu einem leicht filtrierbaren Feststoff, während die Zugabe des Cocktails zu MTBE ein feines Präzipitat hervorbringt, welches schwierig zu filtern ist. Es gibt einen Temperaturanstieg von 5°C auf 40–45°C während der Zugabe von MTBE zur TFA-Lösung. Der Temperaturanstieg hat keine Auswirkung auf die Reinheit des rohen T-20, das isoliert wird (187/117, 119). Es gab eine Verklumpung der Feststoffe während der MTBE-Zugabe. Die schlammige Masse wurde für 1–2 Stunde gerührt, um die Klümpchen zu brechen. Das Aufrechterhalten einer Temperatur unter 20°C während der MTBE-Zugabe bringt einen einheitlicheren Feststoff hervor, der sich besser filtern lässt (196/31). Die Zugabegeschwindigkeit des MTBE wird in der Zukunft kontrolliert werden. Rohes T-20 wurde durch Filtration unter Stickstoffatmosphäre abgenommen. Der Feststoff wird klebrig werden, wenn er der feuchten Luft während der Filtration ausgesetzt wird, bevor TFA ausgewaschen wurde. Nachdem das TFA ausgewaschen ist, ist der Feststoff luftstabil.
Verfahrensdurchlauf:
Eine 90/5/5 TFA/Wasser/Dithiothreitol-Lösung (13 Vol.) wird in einem 20 l Ballon präpariert, dann für 3 Minuten mit Stickstoff gespült. AcAA1–36NH₂ (640 g) wird in Portionen hinzugegeben, um Verklumpen zu vermeiden. Ist der Feststoff einmal in Lösung übergegangen, wird die Lösung in einen 70 l Reaktor transferiert. Der Ballon und Leitungen werden mit einer minimalen Menge 90/5/5/TFA/Wasser/Dithiothreitol gewaschen. Die Lösung wird bei Umgebungstemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 4 Stunden gerührt, dann auf 0–5°C abgekühlt. MTBE (45 Vol.) wird mit einer solchen Geschwindigkeit hinzugegeben, dass die innere Temperatur bei weniger als 30°C liegt. Der Feststoff wird mittels Vakuumfiltration unter einem Stickstoffstrom abgenommen. Der Reaktor, die Leitungen und der Feststoff werden mit 2 × 2 Volumenteilen MTBE gewaschen und bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet (594 g, 70A%).
Der Feststoff (594 g) wird in 50% ACN/Wasser (8 Volumenteile in Bezug auf die AcAA1–36H₂-Beladung) gelöst und filtriert. Das Gefäß und die Leitungen werden mit 50% ACN/Wasser (2 Vol.) gewaschen. Der pH-Wert der Lösung wird mit Natriumbicarbonat auf 3,5–4,0 eingestellt, dann wird Essigsäure (0,18 Vol.) hinzugegeben, was den pH-Wert auf 4,9 bringt. Die Lösung wird bei Umgebungstemperatur für 15 Stunden gerührt (IPC, Anmerkung 1), dann wird der pH-Wert mit 1 M Kaliumcarbonat auf 9–9,5 eingestellt. Die Lösung wird durch Zugabe von Wasser (25 Vol.) auf 85/15 Wasser/ACN verdünnt. Von der daraus hervorgehenden trüben Lösung wird zur Gewicht/Gewicht-HFLC-Analyse eine Probe genommen, und sie wird zum Aufreinigungsgerät übertragen.
Anmerkungen:

1 Verfahren TM2-0003-01.
2 Verfahren TM2-0006-01.

11.11 Aufreinigung von HAA(1–36)-OH
Aufreinigung, Lyophilisierung und Verpackung werden in drei Stufen klassifiziert:
% Gewicht/Gewicht = 100 – % Verunreinigungen – % Acetat – % Wasser – % TFA. Der Acetat-Gehalt in den Chargen betrug 6.8%.
Insgesamt 2,08 kg T-20 (netto) wurden aus 6,97 kg AcAA1–36NH₂ isoliert. Dies stellt eine 49,3%ige Ausbeute aus AcAA1–36NH₂ dar. Die Durchschnittsausbeute in der chromatographischen Aufreinigung betrug 55%. Die Ausbeuten für einzelne Durchläufe variierten von 41–55%. Die niedrigsten Ausbeuten waren ein Ergebnis eines Säulen- oder Pumpen-Fehlers, was zu multiplen Durchläufen führte. Im Allgemeinen waren die Ausbeuten, wenn die Chromatographie funktionierte, im 50–55%-Bereich. Die Reinheit des isolierten T-20 lag bei 93–95A%.
Vier Gradienten wurden während der Aufreinigung für einen Verfahrensvergleich untersucht, mit dem Ziel, die Durchlaufszeit zu minimieren:

1. 15–22% ACN/60 Minuten, 22–36% ACN/525 Minuten bei 330 ml/min.
2. 16–26% ACN/60 Minuten, 26–40% ACN/525 Minuten bei 330 ml/min.
3. Zweiter Trimeris-Gradient. 15–36% ACN1788 Minuten bei 330 ml/min.
4. Original Trimeris-Gradient 20–23% ACN/112 Minuten, 23–36% ACN/488 Minuten bei 330 ml/min.

Eine Zwanzig-Zentimeter (cm)-Säule wurde mit dem Amberchrom-Harz gepackt (axiale Kompression) (35 cm Betthöhe). Chargen von 500–700 g AcAA1–36NH₂ wurden in Lösung entschützt und decarboxyliert. Dieser Maßstab bringt eine Säulenzufuhrstammlösung hervor, die ungefähr 400 Gramm Peptid enthält (ungefähr 75A% T-20). Die Stammlösung ist typischerweise trüb und kann suspendierten Feststoff enthalten. Die trübe Lösung wird bei 500 ml/min unter Verwendung von 15% B auf die Säule geladen. Während der Beladung der Säule gab es bei keinem der Durchläufe einen Druckaufbau. Die Fließgeschwindigkeit wird auf 330 ml/min reduziert und der angegebene Gradient wird für die angegebene Zeitspanne durchlaufen. Fraktionen werden gesammelt, und jene, die über 78% T-20 enthalten, werden vereinigt (100–110 l), mit Wasser verdünnt, um den Acetonitril-Gehalt auf ungefähr 15–20% zu bringen (ungefähr 140 Liter). Die Säule wird gewaschen, dann mit 15% B äquilibriert. Die T-20-enthaltende Lösung wird mit 900 ml/min auf die 8-Inch-Säule zurückgeladen. Der %-Anteil B wird auf 50% erhöht und T-20 wird in ungefähr 25 l auf die Säule aufgebracht.
Die Lösung wird in 1 l Vakuumglocken eingefroren und zu einem Pulver lyophilisiert. Das isolierte T-20 ist typischerweise 92–94%ig rein (mittels HPLC), und enthält 6–8% Acetat und 3–4% Wasser.
Bevorzugtes Verfahren:
Eine Lösung aus T-20 in 85/15 Wasser/Acetonitril (27 l) mit einem pH-Wert von 9,2 wurde auf eine 8-Inch-HPLC-Säule mit 500 ml/min gepumpt. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 330 ml/min für 30 Minuten reduziert (in Schritten von 30–40 ml/min alle 5 Minuten). Ein linearer Gradient von 20% B bis 36% B über 600 Minuten wird initiiert. Fraktionen werden gesammelt, bis die Absorption unter 0,2 AUFS fällt. Die Fraktionen werden mittels HPLC auf ihren Gehalt untersucht (Anmerkung 1). Die Säule wird mit 8% B für 10 Minuten bei 900 ml/min gewaschen, dann zurück auf 15% B gebracht und bei 900 ml/min äquilibriert. Die Fraktionen, die über 78A% T-20 enthielten, werden vereinigt (113 l) und mit Puffer (28,2 l) verdünnt, um die Acetonitril-Konzentration auf 15–20% zu bringen. Die Lösung wird mit 900 ml/min auf die Säule aufgebracht. Der prozentuale Anteil von B wird auf 50% erhöht und T-20 wird mit 900 ml/min in ungefähr 25 l von der Säule eluiert. Die Konzentration von T-20 liegt bei ungefähr 9–10 mg/ml. Die Lösung wird in Ein-Liter-Lyophilisierungsglocken transferiert, gefroren und gefriergetrocknet, unter Erhalt von 216,29 T-20 mit 54,9% Ausbeute und 94,1A% Reinheit.
Anmerkungen:

1. Die Fraktionen werden mittels HPLC auf ihren Gehalt und die Reinheit hin untersucht. YMC ODS-A, 150 × 4,6 mm, 5 μm, 120 A 1 ml/min, 220 nm, 30°C A 70/30 50 mM NH₄OAc @ pH 7 (Einstellen mit NH₄OH):ACN B 5:95 50 mM NH₄OAc @ pH 7 (Einstellen mit NH₄OH):ACN 0–15% B/50 min., 15–100% B/2 min. 100% B/2 min. T-20 Retentionszeit 29,0 Minuten.

11.12 Thermale Stabilität von Peutiden
Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um die thermale Stabilität der T-20-Zwischenprodukt-Fragmente zu charakterisieren. T-20-Fragmente wurden mit Wasser abgesättigt, gefiltert und dann in verschlossene Behältnisse platziert und erhöhten Temperaturen ausgesetzt. Bei mehreren Zeitpunkten wurden Proben abgenommen und mittels HPLC-Verfahren untersucht, um die Reinheits-Veränderungen zu untersuchen. Die Stabilität der trockenen T-20-Fragmente wurde ebenfalls mittels thermogravimetrischer Analyse (TGA) charakterisiert.
Alle Fragmente können bei 40°C über 3 Tage gelagert werden, außer AcAA1–16OH. Nur maßvolle Degradierung wird nach 24 Stunden bei 80°C bei zwei Fragmenten beobachtet, FmocAA27–35OH (3%) und FmocAA27–36NH₂ (1,4%). Fragment AcAA1–16OH war anfänglich 97A% rein. Nach 3 Tagen bei 40°C war es 93,4A% rein und trocken. Nach zusätzlichen 24 Stunden bei 80°C blieb es bei 93,9A%. Das feuchte AcAA1–16OH sollte bei Umgebungstemperatur getrocknet werden.
Der Hauptpunkt der Stabilitätsstudie war es, zu bestimmen, ob die Fragmente bei 40°C anstelle von Raumtemperatur getrocknet werden können. Die Studie deutet darauf hin, dass die Fragmente gegenüber Trocknen bei 40°C stabil sind. Das wird die Trocknungszeiten sehr stark reduzieren.
Es wurde eine Studie durchgeführt, um die Stabilität von Fragmenten Ac(1–16)-OH, Fmoc(27–35)-OH, Fmoc(17–26)-OH, Fmoc(27–36)-NH₂, Fmoc(17–36-NH₂), H(17–36)-NH₂ und Ac(1–36)-NH₂ unter verschiedenen Lösungsmittel- und Temperaturbedingungen zu untersuchen, die ihre Isolierung und Aufreinigung nachempfinden. Alle Fragmente sind stabil, Stabilität ist mit einem X markiert, in dem Lösungsmittelsystem, aus welchem sie isoliert und/oder gereinigt wurden:

X: = HPLC-Gehalt und Verunreinigungen, Sichtprüfung

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Peptids mit der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1), umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: NH₂-DKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 18) um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten; (b) entfernen der Schutzgruppe vom Aminoterminus des in (a) hergestellten Peptids; (c) reagieren des in (b) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmooc-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; (d) umwandeln des Aminoterminus des in (c) hergestellten Peptids in eine Acetylmodifikation; und (e) entfernen der Schutzgruppen der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (d), um ein Peptid mit der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1), umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11) mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: NH₂-DKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 18), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten; (b) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus des in (a) erzeugten Peptids; (c) reagieren des in (b) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; und (d) entfernen der Schutzgruppe(n) der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (c), um ein Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppen des Aminoterminus des Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12); (b) reagieren des in (a) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; (c) entfernen der Schutzgruppen des Aminoterminus des Peptids des (b) hergestellten Peptids; (d) umwandeln des Aminoterminus des in (c) hergestellten Peptids in eine Acetylmodifikation; und (e) entfernen der Schutzgruppe(n) der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (c), um ein Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Verfahren für die Herstellung eines Peptids der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppen des Aminoterminus des Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12); (b) reagieren des in (a) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; (c) entfernen der Schutzgruppen der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (b), um ein Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) durch ein Verfahren hergestellt wird, umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-DKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 17) mit HPheNH₂ um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-DKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 18) zu erhalten; (b) entfernen der Schutzgruppen des Aminoterminus des in (a) hergestellten Peptids; und (c) reagieren des in (b) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) nach einem Verfahren hergestellt wird, umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-LELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 15) mit HPheNH₂ um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-LELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 16) zu erhalten; (b) entfernen der Schutzgruppen des Aminoterminus des in (a) hergestellten Peptids; und (c) reagieren des in (b) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQEL-COOH (SEQ ID NO: 10), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel: Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) nach einem Verfahren hergestellt wird, umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus des Peptids Fmoc-DKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 18); und (b) Reagieren des in (a) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLEL-COOH (SEQ ID NO: 11), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) hergestellt wird nach einem Verfahren umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNW-COOH (SEQ ID NO: 19) mit HPheNH₂, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel: Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) hergestellt wird nach einem Verfahren, umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus des Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-IEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 7); (b) reagieren des in (a) hergestellten Seitenketten-geschützten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) hergestellt wird nach einem Verfahren umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-IEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 6) mit HGlnOPNB um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-IEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 7) zu erhalten; (b) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus des in (a) hergestellten Seitenketten-geschützten Peptids; (c) reagieren des Seitenketten-geschützten Peptids, das in (b) hergestellt wurde, mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSL-COOH (SEQ ID NO: 2), um eine Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) zu erhalten; (d) entfernen der Schutzgruppen des Carboxylterminus des in (c) hergestellten Seitenketten-geschützten Peptids, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) hergestellt wird nach einem Verfahren umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3) mit HGlnOPNB, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) zu erhalten; und (b) entfernen der Schutzgruppe des Carboxylterminus des in (a) hergestellten Peptids, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 9); (b) reagieren des in (a) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQ-COOH (SEQ ID NO: 3) um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; (c) umwandeln des Aminoterminus des in (b) hergestellten Peptids in eine Acetylmodifikation; und (d) entfernen der Schutzgruppe der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (c), um ein Peptid der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 9) hergestellt wird nach einem Verfahren umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel: Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNW-NH₂ (SEQ ID NO: 8) mit HPheNH₂, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 9) zu erhalten.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids der Formel: Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) umfassend: (a) entfernen der Schutzgruppe des Aminoterminus eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 14); (b) reagieren des in (a) hergestellten Peptids mit einem Seitenketten-geschützten Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQEK-COOH (SEQ ID NO: 5), um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten; (c) umwandeln des Aminoterminus des in (b) hergestellten Peptids in eine Acetylmodifikation; und (d) entfernen der Schutzgruppe(n) der Seitenketten des Seitenketten-geschützten Peptids aus (c), um ein Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel: Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 14) hergestellt wird nach einem Verfahren umfassend: (a) reagieren eines Seitenketten-geschützten Peptids der Formel Fmoc-NEQELLELDKWASLWNW-NH₂ (SEQ ID NO: 13) mit HPheNH₂, um ein Seitenketten-geschütztes Peptid der Formel Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 14) zu erhalten.
Das Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 12 oder 14, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 1) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 12) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-YTSLIHSLIEESQNQQ-COOH (SEQ ID NO: 4) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-QEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 9) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Seitenketten-geschützte Peptid der Formel Fmoc-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ (SEQ ID NO: 14) in einer Menge von ungefähr ein oder mehr Kilogramm hergestellt wird.
Peptidfragmente umfassend einen Satz Fragmente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Verwendung eines Peptidfragments zur Peptidsynthese gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–26, wobei das Peptidfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Ein geschütztes Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: