DE19829944A1

DE19829944A1 - Verfahren und Anordnung zur Gerätekonfiguration von konfokalen Mikroskopen

Info

Publication number: DE19829944A1
Application number: DE19829944A
Authority: DE
Inventors: Holger Wiederhoeft
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 1998-07-04
Filing date: 1998-07-04
Publication date: 2000-01-05
Anticipated expiration: 2018-07-05
Also published as: DE19829944C2; JP4145421B2; JP2000039563A; US6300639B1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gerätekonfiguration von konfokalen Mikroskopen, vorzugsweise von Laser-Scan-Mikroskopen, bei denen Laserlicht mit einer oder mehreren Spektrallinien erzeugt und auf eine Probe (16) gerichtet wird, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält oder auf die ein Fluoreszenzfarbstoff aufgebracht ist. DOLLAR A Dabei werden die Excitationswellenlängen und die Emissionswellenlängen verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in getrennten Datensätzen erfaßt und diese in einem Datenspeicher (34) abgelegt. Ebenso werden die mit dem Mikroskop einstellbaren Laserspektren, die auf die Probe (16) zu richten sind, und die mit den vorhandenen Filtern erzielbaren Transmissionsspektren in Datensätzen erfaßt und diese Datensätze gespeichert. DOLLAR A Aus einer rechnerischen Verknüpfung dieser Datensätze werden Vorgaben für die Konfiguration des Mikroskops ermittelt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gerätekon figuration von konfokalen Mikroskopen, vorzugsweise von La ser-Scan-Mikroskopen, bei denen Laserlicht mit einer oder mehreren Spektrallinien erzeugt und auf eine Probe gerich tet wird, die einen Fluoreszenzfarbstoff enthält oder auf die ein Fluoreszenzfarbstoff aufgebracht ist, wobei das von der Probe reflektierte und/oder emittierte Licht einer Bildauswertung zugrunde gelegt und die Qualität der Bild auswertung beeinflußt wird, indem Filter oder Filterkombi nationen in den Mikroskopstrahlengang eingebracht werden, die der Emissionswellenlänge des Fluoreszenzfarbstoffes entsprechen. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Anordnung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Die Konfokalmikroskopie bietet als spezielle Weiterentwick lung der Lichtmikroskopie die Möglichkeit, nicht nur Mi krostrukturen höher aufzulösen, sondern diese auch in der Z-Koordinate des Raumes abzubilden und zu vermessen. Das hat dazu geführt, daß neben den klassischen Kontrastierver fahren Hellfeld, Phasenkontrast und Interferenzkontrast zu nehmend die Fluoreszenztechnik in den Mittelpunkt des In teresses des optischen Feingerätebaues und der Wissenschaft gerückt ist.

Bei der Fluoreszenztechnik wird davon ausgegangen, daß un terschiedliche Fluorochrome, deren Anregungs- und Emissi onswellenlängen in verschiedenen spektralen Bändern liegen, die Darstellung von Strukturen gleichzeitig in mehreren Farben erlauben. So können in Abhängigkeit von den spektra len Eigenschaften verschiedener Farbstoffmoleküle neben morphologischen Informationen auch Aussagen über physiolo gische Parameter gewonnen werden.

Wird das Konfokalmikroskop für fluorometrische Verfahren genutzt, lassen sich Aufschlüsse über Veränderungen der Konzentration von Ionen und Molekülen ableiten. Dabei sind auch Indikatoren von Bedeutung, die zusätzlich zur Intensi tätsabhängigkeit eine Verschiebung des Anregungs- oder Emissionsspektrums zeigen und insofern eine Quantifizierung von Ionenkonzentrationen ermöglichen. Als Beleuchtungsquel len werden einzelne Laser mit jeweils einer Wellenlänge oder auch "Multi-Line"-Mischgaslaser mit mehreren nutzbaren Wellenlängen verwendet.

Eine derartige Verfahrensweise einschließlich der zugehöri gen Gerätetechnik ist in den "Mitteilungen für Wissenschaft und Technik", Band II, Nr. 1, Seiten 9-19, Juni 1995 be schrieben. Hier ist ausführlich dargelegt, daß entsprechend den im Beleuchtungspfad durchgeführten Maßnahmen zur punkt genauen Objektbeleuchtung mit verschiedenen Anregungswel lenlängen in umgekehrter Richtung auch das Design des De tektionssystems der Emissionswellenlänge angepaßt sein muß. Dabei kommt es darauf an, die spektral unterschiedlichen Informationen aus genau demselben Bereich einer Probe zu detektieren und diese pixelgenau zu registrieren und für die Bildauswertung bereit zustellen. Nur dadurch ist die Aufnahme von 3D-Datensätzen möglich, die z. B. eine zuver lässige Zuordnung von räumlichen Zell- oder Gewebestruktu ren innerhalb der Mikroarchitektur oder die Lokalisation mehrerer Genorte in Chromosomen erlauben.

Für sequenzielle Detektionen, beispielsweise bei der Aus wertung von Reflexionen und emittierter Strahlung beim Fluoreszenzverfahren, werden als Anregungsstrahlteiler im konfokalen Strahlengang Neutralteiler und einfach dichroitische Teilerspiegel verwendet, wobei ein Teiler wechsel zwischen aufeinanderfolgenden Aufnahmen erforder lich ist. Zur Begrenzung der detektierten Emissionsbänder werden beispielsweise Sperrfilter genutzt, wobei wahlweise Langpass- und Bandpassfilter zur Feinabstimmung der spek tralen Trennung eingesetzt werden können.

Alle Filterkomponenten sind dabei in motorisierten Filter rädern montiert und stehen bei entsprechender Ansteuerung durch Austausch gegeneinander bereit.

Die Aufzweigung des Emissionslichtes in mehrere Detektions kanäle hat zwar den Vorteil, daß für alle Detektoren Be leuchtung- und Detektionslochblenden exakt konfokal ange ordnet sind, jedoch erhöht sich mit der Anzahl der Detekti onskanäle die Anzahl der möglichen Filterkombinationen. Das hat zur Folge, daß ein Anwender des Konfokalmikroskops von einem Fluoreszenzfarbstoff exakt die Anregungs- und Emissi onswellenlänge kennen muß, um mit dem Mikroskop ein Bild der Probe bzw. das Bild einer ausgewählten Ebene der Probe erstellen zu können.

Die Erfindung nutzt beispielsweise den Effekt, demzufolge die mit der Anregungswellenlänge in den Farbstoff einge strahlte Energie in der Folge in eine Wellenlänge niedrige rer Energie transformiert und wieder vom Farbstoff abge strahlt wird. Dabei gelangen die Emissionsphotonen über die bereits beschriebenen Spiegel, Filter und Farbteiler in den jeweiligen Detektionskanal und dort zu einem Photo- Multiplier (PMT), der sie detektiert, registriert und einer Bildverarbeitung zur Verfügung stellt.

Dabei ist der Weg, den jedes Photon von der Probe zu einem der Detektoren nimmt, von der Geräteeinstellung abhängig, die der Anwender gewählt hat. So ist es aufgrund des sub jektiven Einflusses möglich, daß der mit der gewählten Ge rätekonfiguration für die Photonen vorgegebene Weg richtig, ungünstig oder falsch sein kann.

Eine richtige Einstellung der Gerätekonfiguration ist dann gegeben, wenn Laserlicht mit einer spektralen Zusammenset zung gewählt wurde, die der Anregungsstrahlung für einen in der Probe enthaltenen Farbstoff entspricht, und wenn emis sionsseitig die Farbteiler und Filter in den Mikro skopstrahlengang eingeschwenkt worden sind, deren Transmis sionsspektrum der Emissionswellenlänge des Farbstoffes ent spricht.

Eine ungünstige, d. h. zwar funktionsfähige, aber nicht op timale Einstellung ist beispielsweise dann gegeben, wenn eine Laserkonfiguration gewählt wurde, die zwar der Anre gungsstrahlung des Farbstoffes entspricht, jedoch Farbtei ler oder Filter in den Emissionsstrahlengang eingeschwenkt worden sind, die nur für einen Teil des Emissionsspektrums durchlässig sind. Die Folge ist, daß den jeweiligen Detek tor nur schwächere Signale als optimal möglich erreichen. Einen ähnlichen Effekt hat die Auswahl einer Laserwellen länge, die nicht exakt der Anregungswellenlänge des gewähl ten Farbstoffes entspricht.

Eine ganz und gar falsche Einstellung ergibt sich dann, wenn entweder anregungsseitig ein falscher Laser und/oder auf der Emissionsseite eine Spiegel- oder Filterkombination mit Transmissionsspektrum neben dem Emissionsspektrum ge wählt worden ist. Das hat zur Folge, daß das gesamte System kein Bild erzeugen kann.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein Verfahren der vorbeschriebenen Art derart weiterzubil den, daß für den Anwender ohne Vorkenntnisse der optischen Zusammenhänge bei geringem Zeitaufwand die Einstellung ei ner optimalen Gerätekonfiguration für einen ausgewählten Farbstoff möglich ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die Excitationswellenlängen und die Emissionswellenlängen ver schiedener Fluoreszenzfarbstoffe in getrennten Datensätzen erfaßt und diese in einem Datenspeicher abgelegt werden. Ebenso werden die mit dem Mikroskop einstellbaren Laser spektren, die auf die Probe zu richten sind, und die mit den vorhandenen Filtern und/oder Spektralteilern erzielba ren Transmissionsspektren in Datensätzen erfaßt und diese Datensätze gespeichert.

Erfindungsgemäß werden aus einer rechnerischen Verknüpfung dieser Datensätze Vorgaben für die Konfiguration des Mikro skops ermittelt, indem durch die Verknüpfung des Datensat zes für die Excitationswellenlänge eines vorgegebenen Fluo reszenzfarbstoffes mit allen auswählbaren Laserspektren mindestens ein Laserspektrum ausgewählt wird, das der Exci tationswellenlänge des vorgegebenen Fluoreszenzfarbstoffes entspricht. In dieser Weise wird auch durch Verknüpfung der Daten für die Emissionswellenlänge dieses Fluoreszenzfarb stoffes mit den Daten der möglichen Filterkombinationen das Transmissionsspektrum ermittelt, welches der Emissionswel lenlänge des vorgegebenen Fluoreszenzfarbstoffes ent spricht.

Damit wird das aus dem Stand der Technik bekannte subjekti ve Auswählen von Laser- und Transmissionsspektren durch Verfahrensschritte ersetzt, die für jeden Fluoreszenzfarb stoff, dessen Excitations- und Emissionswellenlängen in den betreffenden Datensätzen abgelegt sind, eine objektive Be stimmung und Vorgabe der zugehörigen Mikroskopkonfiguration ermöglichen. Darüber hinaus wird auf diese Weise nicht nur die optimale, sondern auch eine schnellere aufgabenbezogene Einstellung des Mikroskops erzielt, als dies bei einer ma nuellen Verfahrensweise der Fall sein kann.

In einer Ausgestaltungsvariante der Erfindung werden die Excitationswellenlängen verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe in einem ersten Datensatz, die einstellbaren Laserspektren in einem zweiten Datensatz, die Emissionswellenlängen der Fluoreszenzfarbfoffe in einem dritten Datensatz und die einstellbaren Filter-Transmissionsspektren in einem vierten Datensatz erfaßt und gespeichert.

Im Ergebnis der rechnerischen Verknüpfung des ersten und des zweiten Datensatzes wird mindestens eine Einstellkonfi guration für das Spektrum der Laserstrahlung ermittelt, die der Excitationwellenlänge eines vorgegebenen Fluoreszenz farbstoffes entspricht. In gleicher Weise wird im Ergebnis der rechnerischen Verknüpfung des dritten und des vierten Datensatzes mindestens eine Einstellkonfiguration für das Filter-Transmissionsspektrum ermittelt, die der Emissions wellenlänge des vorgegebenen Fluoreszenzfarbstoffes ent spricht.

Die einzelnen Datensätze können zu jeder Zeit ergänzt bzw. berichtigt werden. Zwischen dem ersten und dritten Daten satz besteht insoweit eine Beziehung, als die gespeicherten Daten über die Excitationswellenlängen und die Emissions wellenlängen jeweils demselben Fluoreszenzfarbstoff zuzu ordnen sind und jeweils bei Aufruf des Fluoreszenzfarbstof fes zwecks Verknüpfung zur Verfügung stehen.

Eine sehr bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß die Daten aller Datensätze jeweils als Kette von Binär daten erfaßt werden und daß jeder Binärwert einer solchen Kette einem bestimmten Abschnitt Δλ in ein und demselben Wellenlängenbereich λ₁ bis λ₂ zugeordnet wird. Dabei wird ein Abschnitt Δλ immer dann durch einen Binärwert "0" defi niert, wenn die in diesem Abschnitt Δλ zu messende Strah lungsintensität unter einem Schwellwert y liegt. Anderer seits wird ein Abschnitt Δλ, in dem die Strahlungsintensi tät über dem Schwellwert y liegt, mit einem Binärwert "1" definiert.

Für die Daten eines zur Beleuchtung der Probe dienenden La serspektrums bedeutet das, daß alle innerhalb des Wellen längenbereiches λ₁ bis λ₂ liegenden Abschnitt Δλ mit einem Binärwert "1" bewertet werden, in denen die Laserstrahlung mit einer über dem Schwellwert y liegenden Intensität auf die Probe gestrahlt wird. Allen anderen Δλ innerhalb des Wellenlängenbereiches λ₁ bis λ₂, bei denen die Intensität unter dem Schwellwert y liegt, wird der Binärwert "0" zuge ordnet.

Für die Daten der Excitationswellenlängen der Fluoreszenz farbstoffe bedeutet das, daß lediglich die Δλ innerhalb des Wellenlängenbereiches λ₁ bis λ₂ mit einem Binärwert "1" be wertet werden, bei denen die Intensität des auf die Probe gerichteten Laserlichtes über dem Schwellwert y liegt, bei dem mit Sicherheit eine Anregung des betreffenden Fluores zenzfarbstoffes erfolgt. Alle weiteren Teilbereiche Δλ, bei denen die Intensität unter dem Schwellwert y liegt und in sofern nicht mit Sicherheit zur Anregung ausreicht, werden mit dem Binärwert "0" bewertet.

Für die Daten der Emissionswellenlängen werden lediglich die Δλ des Wellenlängenbereiches λ₁ bis λ₂ mit "1" bewer tet, für die bei angeregtem Farbstoff eine Intensität zu messen ist, die über dem Schwellwert y liegt.

Bei der Bewertung von Filtern bzw. Filterkombinationen wird nur dem Teilbereich Δλ ein Binärwert "1" zugeordnet, für den bei einer Strahlungsintensität, die über dem Schwell wert y liegt, die betreffenden Filter bzw. Filterkombina tionen transparent sind. Dagegen werden alle anderen Teil bereiche Δλ mit dem Binärwert "0" bewertet.

Mit dieser Art der Datenerfassung entstehen für alle zu speichernden Informationen Binärwertketten aus einer stets gleich großen Anzahl von Binärwerten. Innerhalb einer jeden Kette ist die Anzahl der nebeneinander liegenden Binärwerte "1" ein Maß für die jeweilige Bandbreite. Der Ort eines Bi närwertes "1" bzw. mehrerer nebeneinander liegender Binär werte " 1" ist ein Maß für die Wellenlängen

- die zur Anregung des Farbstoffes geeignet sind (im ersten Datensatz D1),
- mit denen eine Strahlung auf die Probe trifft (im zweiten Datensatz D2),
- mit denen eine Strahlung von der Probe emittiert wird (im dritten Datensatz D3) und
- für die ein Filter bzw. eine Filterkombination durchläs sig ist (im vierten Datensatz D4).

Somit sind alle Binärwertketten dahingehend miteinander vergleichbar, ob die in ihnen enthaltenen Binärwerte "1" gleiche oder verschiedene Wellenlängen bzw. gleiche oder verschiedene Spektralbänder repräsentieren.

Wird beispielsweise die Binärwertkette der Excitationswel lenlänge eines ausgewählten Fluoreszenzfarbstoffes (erster Datensatz) mit der Binärwertkette einer ausgewählten Ein stellkonfiguration für ein Laserspektrum (zweiter Daten satz) verglichen, so läßt sich aus den Orten der Binärwerte "1" in beiden Binärwertketten erkennen, ob die Bandbreite des Laserspektrums die Bandbreite des Excitationsspektrums teilweise, vollständig oder gar nicht überdeckt.

Für die Konfiguration des Mikroskops ist dann lediglich ei ne Zuordnung der Binärwertketten der beiden Datensätze sinnvoll, in denen sich die Orte der Binärwerte "1" minde stens teilweise, nach Möglichkeit jedoch vollständig über decken.

Als Bewertungskriterium, ob ein Teilbereich Δλ mit einem Binärwert "0" oder ein Binärwert "1" bewertet wird, dient die Strahlungsintensität der auf die Probe treffenden La serstrahlung, wobei bevorzugt der Schwellwert y bei 50% dieser Strahlungsintensität vorgegeben wird.

In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß der Wellenlängenbereich, der der Er mittlung aller Binärwertketten zugrunde zu legen ist, bei λ₁=300nm beginnt und bei λ₂=700nm endet. Weiterhin ist be vorzugt vorgesehen, daß jedem Binärwert "0" oder "1" ein Teilbereich Δλ zugeordnet wird, der einer Bandbreite von 0,1nm entspricht.

Zur rechnerischen Auswahl eines geeigneten Laserspektrums ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß die Binärwertkette aus dem ersten Datensatz, die der Excitationswellenlänge eines vorgegebenen Fluoreszenzfarbstoffes entspricht, nacheinan der mit allen Binärwertketten des zweiten Datensatzes durch eine "AND"-Funktion logisch verknüpft wird. Aus dieser Ver knüpfung entstehen wiederum Binärwertketten, von denen die Binärwertkette ermittelt und als Ergebnis registriert wird, in der die meisten nebeneinander liegenden Binärwerte "1" auftreten. Zur Konfiguration des Mikroskops wird nun das Laserspektrum vorgegeben, dessen Binärwertkette (aus dem zweiten Datensatz) zu dem registrierten Ergebnis, d. h. zu der Ergebnis-Binärwertkette mit den meisten nebeneinander liegenden Binärwerten "1" geführt hat.

Zur Auswahl eines geeigneten Filter-Transmissionsspektrums wird die Binärwertkette aus dem dritten Datensatz, die der Emissionswellenlänge des vorgegebenen Fluoreszenzfarbstof fes entspricht, nacheinander mit allen Binärwertketten des vierten Datensatzes durch "AND"-Funktion verknüpft. Auch hierbei entstehen im Ergebnis wieder Binärwertketten, von denen diejenigen ausgewählt werden, in denen mindestens ein Binärwert "1" auftritt. Von diesen Binärwertketten wird diejenige bestimmt und als Ergebnis registriert, bei der die meisten nebeneinander liegenden Binärwerte "1" auftre ten. Zur Konfigurationseinstellung des Mikroskops wird nun die Filterkombination vorgegeben, deren Binärwertkette (aus dem vierten Datensatz) zu der registrierten Ergebnis- Binärwertkette geführt hat.

Alternativ zur Erfassung der Daten in Form von Binärwert ketten und zur Ermittlung einer optimalen Konfiguration des Mikroskops durch "AND"-Verknüpfung dieser Binärwertketten ist es denkbar, analog zur Berechnung von Schwingkreisen in der Elektrotechnik das Laserlicht mit einer diskreten Wel lenlänge als Eingangsgröße für einen Schwingkreis zu wer ten. Dabei können die Filter beispielsweise durch RC- Glieder simuliert werden. Durch Variationen von R (dem "Wi derstandswert") und C (der "Kapazität") wird die Qualität einer Fotoemission für jede Konfiguration des Laser-Scan- Mikroskops errechnet und bewertet. Das Ergebnis mit der höchsten Qualität wird dann als Konfiguration für die Gerä teeinstellung vorgegeben. Auf diese Weise können alle Kom binationen von Lichtwegen erfaßt und als Ergebnis die ent sprechenden Filter bzw. Farbteiler in den Mikroskopstrah lengang eingeschwenkt werden.

Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin gelöst durch ein konfokales Lasermikroskop mit einem Lasermodul zur Erzeu gung einer Laserstrahlung, die auf eine Probe mit minde stens einem Fluoreszenzfarbstoff gerichtet ist und deren Spektrum veränderbar ist und das über Filter unterschiedli cher Transmissionsspektren verfügt, die wahlweise in dem Strahlengang des von der Probe reflektierten und/oder emit tierten Lichtes einschwenkbar sind.

Dabei ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß das Lasermodul und die Filter mit ansteuerbaren Stelleinrichtungen verbun den sind, daß ein Datenspeicher für Datensätze von Excita tions- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe, für einen Datensatz von verschiedenen einstellbaren Laser spektren und für einen Datensatz von verschiedenen ein stellbaren Transmissionsspektren vorgesehen ist und daß weiterhin eine Rechenschaltung zur Verknüpfung dieser Da tensätze vorhanden ist, deren Ausgang über eine Ansteuer einrichtung mit den Stelleinrichtungen verbunden ist.

In der Rechenschaltung ist eine "AND"-Verknüpfung der Daten für die Excitationswellenlängen mit den Daten der möglichen Laserspektren und eine "AND"-Verknüpfung der Daten der Emissionswellenlängen mit den Daten der möglichen Transmis sionsspektren vorgesehen.

In Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Lasermikroskops kann das Lasermodul mehrere Ein- oder Mehrlinienlaser auf weisen, die separat ansteuerbar sind und/oder denen ein an steuerbarer und durchstimmbarer Spektralfilter (AOTF) und/oder ein ansteuerbarer akusto-optischer Modulator (AOM) nachgeschaltet sind, die als Stelleinrichtungen dienen und durch deren Ansteuerung verschiedene Laserspektren auswähl bar sind.

Weiterhin ist vorgesehen, daß mehrere Linienfilter und/oder Spektralteiler auf Filterrädern angeordnet und durch Dre hung dieser Räder gegeneinander austauschbar sind.

Die Erfindung soll nachfolgend an Hand eines Ausführungs beispieles näher erläutert werden. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen

Fig. 1 ein Beispiel für die Bandbreite einer auf die Probe gerichteten Laserstrahlung einschließlich der zuge hörigen Binärwertkette,

Fig. 2 das Beispiel einer Binärwertkette für einen ausge wählten Fluoreszenzfarbstoff sowohl für die Excita tionswellenlänge als auch für die Emissionswellen länge,

Fig. 3 ein Beispiel für das Transmissionsspektrum eines Filters mit zugehöriger Binärwertkette,

Fig. 4 ein Beispiel für die logische Verknüpfung der Spek tren aus Fig. 1 und Fig. 2,

Fig. 5 ein Beispiel für die logische Verknüpfung der Spek tren aus Fig. 2 und Fig. 3.

Fig. 6 die prinzipielle Darstellung einer Mikroskopanord nung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah rens.

In Fig. 1 ist ein Diagramm dargestellt, auf dessen Abszisse der Wellenlängenbereich λ₁=300nm bis λ₂=700nm abgetragen ist. Diesem Bereich ist eine Binärwertkette zugeordnet, in der jeweils ein Binärwert "0" oder "1" einem Teilbereich Δλ entspricht.

Auf der Ordinate dieses Diagramms ist die Strahlungsinten sität in Prozent angegeben. Von den den einzelnen Teilbe reichen Δλ zugeordneten Binärwerten werden nur die Binär werte mit "1" definiert, bei denen eine Strahlung vorhanden ist und diese Strahlung eine Intensität aufweist, die über einen Schwellwert y hinausgeht, wobei der Schwellwert y mit 50% der auf die Probe treffenden Intensität vorgegeben ist.

Im Ausführungsbeispiel handelt es sich um die Strahlung ei nes Einlinienlasers mit einer Bandbreite, die einem Teilbe reich Δλ entspricht, so daß hier lediglich ein Teilbereich Δλ mit dem Binärwert "1" zu bewerten ist.

In Fig. 2 ist für denselben Wellenlängenbereich λ₁ bis λ₂ eine Bewertung der Excitations- und Emissionswellenlängen eines ausgewählten, nicht näher bezeichneten Fluoreszenz farbstoffes dargestellt.

Hier ist ebenfalls jedem Teilbereich Δλ ein Binärwert "0" oder "1" zugeordnet. Die Teilbereiche Δλ, in denen die Strahlungsintensität, die erforderlich ist, um den Farb stoff zur Fluoreszenz anzuregen, unter dem Schwellwert y liegt, wird dabei stets mit dem Binärwert "0" definiert, während jeder Teilbereich Δλ, bei dem die zur Anregung des Farbstoffes erforderliche Strahlungsintensität über dem Schwellwert y liegt, mit einem Binärwert "1" bewertet wird. Die Anzahl der nebeneinander liegenden Binärwerte "1" ist dabei ein Maß für die Bandbreite, innerhalb derer, die vor gegebene Strahlungsintensität vorausgesetzt, eine Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes möglich ist.

Analog hierzu ist ebenfalls in Fig. 2 die Emissionsbandbrei te desselben Fluoreszenzfarbstoffes bewertet worden. Wie bei der Anregungsstrahlung ist auch hier die Anzahl der ne beneinanderliegenden Binärwerte "1", die der Emissions strahlung zugeordnet sind, ein Maß für die Bandbreite der Emissionsstrahlung.

In gleicher Weise ist in Fig. 3 das Transmissionsspektrum eines Filters, ebenfalls wieder für denselben Wellenlängen bereich λ₁ bis λ₂, dargestellt. Hier sind die Teilbereiche Δλ mit einem Binärwert "1" definiert, bei denen die Strah lung mit einer Intensität den Filter passiert, die über dem Schwellwert y liegt. Die Anzahl der nebeneinander liegenden Binärwerte "1" ist ein Maß für die Filterbandbreite.

In jedem dieser Diagramme nach den Fig. 1 bis Fig. 3 ent spricht der Ort des ersten Binärwertes der Wellenlänge λ₁=300nm, der Ort des letzten Binärwertes der Wellenlänge λ₂=700nm. Da alle Binärwertketten die gleiche Anzahl Teil bereiche Δλ haben, sind auch die Orte aller dazwischen lie genden Binärwerte definiert, woraus sich die Vergleichbar keit der Daten für das Laserspektrum, für die Excitations- und Emissionswellenlänge eines Fluoreszenzfarbstoffes sowie für die Filtertransmissionsspektren ergibt.

Ein Beispiel für einen solchen Vergleich und die erfin dungsgemäße rechnerische Verknüpfung der für die einzelnen Wellenlängen bzw. Einstellkonfigurationen gespeicherten Da ten ist in Fig. 4 dargestellt.

In Fig. 4 sind das Diagramm nach Fig. 1 und das Diagramm mit der Excitationswellenlänge aus Fig. 2 übereinander gelegt. Unterhalb des Diagramms sind die zugehörigen Binärwertket ten aus Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt und miteinander durch eine "AND"-Funktion verknüpft. Das Ergebnis der Verknüpfung ist ebenfalls eine Binärwertkette, die jedoch nur an den Positionen für Teilbereiche Δλ einen Binärwert "1" auf weist, für die sowohl in der Binärwertkette nach Fig. 1 als auch in der Binärwertkette nach Fig. 2 ein Binärwert "1" de finiert ist.

Damit ist dem Ergebnis zu entnehmen, daß mit der ausgewähl ten Spektraleigenschaft der Laserstrahlung eine Anregung des vorgegebenen Fluoreszenzfarbstoffes bei ausreichender Strahlungsintensität erfolgen kann. Diese Konfiguration wird zur Vorgabe vorgesehen, womit eine wesentliche Voraus setzung für eine erfolgreiche Mikroskopie der Probe erfüllt ist.

Alle Einstellkonfigurationen im Hinblick auf Laserspektren, die im Ergebnis der Verknüpfung ihrer Binärwertkette mit der Binärwertkette eines Fluoreszenzfarbstoffes eine Kette ergeben, in der kein Binärwert "1" enthalten ist, sind für die Konfiguration des Mikroskopes nicht geeignet.

Fig. 5 zeigt die analoge Verfahrensweise bei der Ermittlung einer Einstellkonfiguration für ein Filter-Transmissions spektrum, das auf die Emissionswellenlänge eines Fluores zenzfarbstoffes nach Fig. 2 abgestimmt ist. Es ist zu erken nen, daß die Verknüpfung der Binärdaten für das Emissions spektrum eines ausgewählten Farbstoffes mit den Binärdaten eines Filters A zum Ergebnis führt, daß Filter A nicht ge eignet ist, da in der als Ergebnis der Verknüpfung darge stellten Binärwertkette kein Binärwert "1" auftritt und so mit die Emissionsstrahlung den Filter nicht passieren kann. Anders dagegen bei der Verknüpfung der Binärdaten des aus gewählten Farbstoffes mit den Daten für den Filter B; Die nebeneinanderliegenden Binärwerte "1" in der Ergebniskette der Verknüpfung weisen aus, daß diese Konfiguration geeig net ist.

In Fig. 6 ist beispielhaft ein konfokales Lasermikroskop zur Ausübung des erfindungsgemaßen Verfahrens dargestellt. Darin ist ein Lasermodul 1 vorgesehen, das mit den Lasern 2, 3 und 4 zur Erzeugung von Laserlicht der Wellenlängen 633 nm, 543 nm und 488 nm für den sichtbaren Bereich ausgestattet ist. Die von den Lasern 2, 3 und 4 ausgehende Strahlung wird über mehrere Strahlvereiniger 5, ein AOTF 6 und eine Faser 7 in eine Scan-Einrichtung 8 eingekoppelt, die mit einer in den Koordinaten x und y strahlablenkenden Einheit 9 ausgestat tet ist.

In einem zweiten Lasermodul 10 ist ein UV-Laser vorgesehen, dessen Licht über ein AOTF 11 und eine Lichtleitfaser 12 in die Scan-Einrichtung 8 eingekoppelt wird.

In beiden Strahlengängen sind den Lichtleitfasern 7 und 12 Kollimationsoptiken 13 nachgeordnet, deren Abstände zum je weiligen Faserende veränderbar sind und die zu diesem Zweck mit einer ansteuerbaren Stelleinrichtung (zeichnerisch nicht dargestellt) gekoppelt sind.

Von der strahlablenkenden Einrichtung 9 wird die Laser strahlung durch ein Scan-Objektiv 14 in den Strahlengang des vereinfacht dargestellten Mikroskops 15 eingekoppelt und hier auf eine Probe 16 gerichtet, die einen fluoreszie renden Farbstoff enthält oder auf die ein solcher Farbstoff aufgebracht worden ist. Auf dem Weg zur Probe passiert die Laserstrahlung eine Tubuslinse 17, einen Strahlteiler 18 und das Mikroskopobjektiv 19.

Das von dem jeweils beaufschlagten Ort der Probe reflek tierte und/oder emittierte Licht gelangt durch das Mikro skopobjektiv 19 zurück zur strahlablenkenden Einrichtung 9, passiert danach einen Strahlteiler 20 und wird mit Hilfe der Abbildungsoptik 21 nach Aufzweigung in mehrere Detekti onskanäle 22 auf Photomultiplier 23 gerichtet, von denen jeweils einer einem der Detektionskanäle 22 zugeordnet ist. Zum Zweck der Aufzweigung in die einzelnen Detektionskanäle 22 wird das Licht beispielhaft von einem Umlenkprisma 24 auf dichroitische Strahlteiler 25 gerichtet. In jedem De tektionskanal 22 sind sowohl in Richtung als auch senkrecht zur Strahlungsrichtung verstellbare und in ihren Durchmes sern veränderbare Pinholes 26 sowie Emissionsfilter 27 vor gesehen.

Die Ausgänge der Photomultiplier 23 führen zu den Si gnaleingängen einer Auswerteschaltung 28, die ihrerseits mit einer Ansteuereinrichtung 29 verbunden ist. Die Ausgän ge der Ansteuereinrichtung 29 sind mit den Signaleingängen der Lasermodule 1 und 10 sowie mit Signaleingängen der Stelleinrichtungen zur Beeinflussung der Position von opti schen Elementen bzw. Baugruppen, wie beispielsweise der Po sition der Kollimationsoptiken 13, der Pinholes 26 u. a. verbunden (im Detail nicht dargestellt).

Beispielhaft ist die in die Scan-Einrichtung B eingekoppel te Laserstrahlung durch einen Strahlteiler 30 verzweigt, wobei einer der Zweige auf einen optoelektronischen Empfän ger 31 gerichtet ist, dem mehrere auf Filterrädern angeord nete und durch Drehung der Filterräder gegeneinander aus tauschbare Linienfilter 32 und ebenso gegeneinander aus tauschbare Neutralfilter 33 vorgeordnet sind. Der Ausgang des Empfängers 31 liegt ebenfalls an einem Signaleingang der Auswerteschaltung 28. Die Filterräder, auf denen die Linienfilter 32 und die Neutralfilter 33 angeordnet sind, sind mit Stelleinrichtungen gekoppelt, deren Steuereingänge mit Signalausgängen der Ansteuereinrichtung 29 verbunden sind (zeichnerisch nicht dargestellt).

Die Auswerteschaltung ist außerdem mit einem Datenspeicher 34 verbunden, in welchem die Datensätze D1 bis D4 von Exci tations- und Emissionswellenlängen verschiedener Fluores zenzfarbstoffe, von Laserspektren und von einstellbaren Transmissionsspektren in jeweils einem gesonderten Daten satz abrufbar gespeichert sind.

In der Auswerteschaltung 28 ist eine Rechenschaltung zu der weiter oben bereits dargestellten erfindungsgemäßen Ver knüpfung der Daten des ersten Datensatzes D1 mit dem zwei ten Datensatz D2 und der Daten des dritten Datensatzes D3 mit dem vierten Datensatz D4 vorgesehen. Das jeweilige Re chenergebnis wird in der ebenfalls bereits beschriebenen Weise in Form von Stellbefehlen über die Ansteuereinrich tung 29 an die beiden AOTF 6 und 11 sowie an die Stellein richtungen, mit denen die Emissionsfilter 27 und beispiel haft auch die in Lage und Durchmesser veränderbaren Pinho les 26 verbunden sind.

Bezugszeichenliste

1

Lasermodul

2-4

Laser

5

Strahlvereiniger

6

AOTF

7

Lichtleitfaser

8

Scan-Einrichtung

9

strahlablenkende Einrichtung

10

Lasermodul

11

AOTF

12

Fasern

13

Kollimationsoptik

14

Scanobjektiv

15

Mikroskop

16

Probe

17

Tubuslinse

18

,

20

Strahlteiler

19

Mikroskopobjektiv

21

Abbildungsoptik

22

Detektionskanäle

23

Photo-Multiplier (PMT)

24

Umlenkprisma

25

dichroitische Strahlteiler

26

Pinholes

27

Emissionsfilter

28

Auswerteeinheit

29

Ansteuereinrichtung

30

Strahlteiler

31

optoelektronischer Empfänger

32

Linienfilter

33

Neutralfilter

34

Datenspeicher

Claims

1. Verfahren zur Konfiguration eines konfokalen Lasermi kroskops vor oder während der Untersuchung einer Pro be, die mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff enthält oder auf die mindestens ein Fluoreszenzfarbstoff auf gebracht ist, wobei ein Laserspektrum ausgewählt und auf die Probe gerichtet wird, das der Excitationswel lenlänge des jeweiligen Fluoreszenzfarbstoffes ent spricht und optische Filter zum Einschwenken in den Mikroskopstrahlengang ausgewählt werden, deren Trans missionsspektren der Emissionswellenlänge des Fluores zenzfarbstoffes entsprechen, dadurch gekennzeichnet, daß die Excitationswellenlängen und die Emissionswel lenlängen verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, die einstellbaren Laserspektren und die einstellbaren Fil ter-Transmissionsspektren in getrennten Datensätzen erfaßt und in einem Datenspeicher abgelegt werden und aus einer rechnerischen Verknüpfungen der Datensätze Vorgaben für die Konfiguration des Mikroskopes ermit telt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Excitationswellenlängen von Fluoreszenzfarbstoffen in einem ersten Datensatz (D1), die einstellbaren La serspektren in einem zweiten Datensatz (D2), die Emis sionswellenlängen der Fluoreszenzfarbstoffe in einem dritten Datensatz (D3) und die einstellbaren Filter- Transmissionsspektren in einem vierten Datensatz (D4) erfaßt und gespeichert werden,

- daß durch rechnerische Verknüpfung des ersten und des zweiten Datensatzes (D2) mindestens eine Einstellkon figuration für das Spektrum der Laserstrahlung ermit telt wird, die der Excitationswellenlänge eines vorge gebenen Fluoreszenzfarbstoffes entspricht und
- daß durch rechnerische Verknüpfung des dritten und des vierten Datensatzes (D4) mindestens eine Einstellkon figuration für das Filter-Transmissionsspektrum ermit telt wird, die der Emissionswellenlänge des vorgegebe nen Fluoreszenzfarbstoffes entspricht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß die Daten aller Datensätze jeweils als Kette von Binärwerten erfaßt werden und jeder Binärwert ei ner Kette einem bestimmten Abschnitt Δλ eines Wellen längenbereiches λ₁ bis X₂ zugeordnet wird, wobei ein Binärwert "0" stets einem Abschnitt Δλ zugeordnet wird, bei dem eine vorgegebene Strahlungsintensität unter einem Schwellwert y liegt und ein Binärwert "1" stets einem Abschnitt Δλ zugeordnet wird, bei dem die se Strahlungsintensität über dem Schwellwert y liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsintensität der auf die Probe treffenden Laserstrahlung zugrunde gelegt und der Schwellwert y bei 50% dieser Strahlungsintensität vorgegeben wird.

5. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß der Wellenlängenbereich λ₁=300nm bis λ₂=700nm beträgt und jeder Binärwert einem Δλ=0,1nm entspricht.

6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß zur Auswahl eines Laserspek trums

- die Binärwertkette aus dem ersten Datensatz (D1), die der Excitationswellenlänge eines vorgegebenen Fluores zenzfarbstoff entspricht, nacheinander mit allen Bi närwertketten des zweiten Datensatzes (D2) durch eine "AND"-Funktion verknüpft wird,
- daß aus den dabei entstehenden Binärwertketten die Bi närwertketten ermittelt werden, in denen mindestens einmal ein Binärwert "1" auftritt,
- daß davon die Binärwertkette bestimmt und als Ergebnis registriert wird, in der die meisten nebeneinanderlie genden Binärwerte "1" auftreten und
- daß das Laserspektrum zur Konfiguration des Mikroskops vorgegeben wird, dessen Binärwertkette zu dem regi strierten Ergebnis geführt hat.

7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, da durch gekennzeichnet, daß zur Auswahl eines Filter- Transmissionsspektrums

- die Binärwertkette aus dem dritten Datensatz (D3), die der Emissionswellenlänge eines vorgegebenen Fluores zenzfarbstoff entspricht, nacheinander mit allen Bi närwertketten des vierten Datensatzes (D4) durch eine "AND"-Funktion verknüpft wird,
- daß aus den dabei entstehenden Binärwertketten die Bi närwertketten ermittelt werden, bei denen mindestens ein Binärwert "1" auftritt,
- daß davon die Binärwertkette bestimmt und als Ergebnis registriert wird, bei der die meisten nebeneinander liegenden Binärwerte "1" auftreten und
- daß das Filtertransmissionsspektrum zur Konfiguration des Mikroskops vorgegeben wird, dessen Binärwertkette zu dem registrierten Ergebnis geführt hat.

8. Konfokales Lasermikroskop mit einem Lasermodul (1) zur Erzeugung einer Laserstrahlung, die auf eine Probe (16) mit mindestens einem Fluoreszenzfarbstoff gerich tet und deren Spektrum veränderbar ist und mit Filtern unterschiedlicher Transmissionsspektren, die wahlweise in den Strahlengang des von der Probe (16) reflektier ten und/oder emittierten Lichtes einschwenkbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß das Lasermodul (1) und die Filter mit ansteuerbaren Stelleinrichtungen verbunden sind, daß ein Datenspeicher (34) für Datensätze (D1, D2, D3, D4) von Excitations- und Emissionswellenlängen verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe, von Laserspektren und von einstellbaren Transmissionsspektren vorgesehen ist und daß eine Rechenschaltung zur Verknüpfung der Datensätze vorhanden ist, deren Ausgang über eine An steuereinrichtung (29) mit den Stelleinrichtungen ver bunden ist.

9. Konfokales Lasermikroskop nach Anspruch 8, dadurch ge kennzeichnet, daß in der Rechenschaltung eine Verknüp fung der Datensätze der Exzitationswellenlängen mit den Datensätzen der einstellbaren Laserspektren und eine Verknüpfung der Datensätze der Emissionswellenlängen mit den Datensätzen der einstellbaren Transmissions spektren, jeweils nach einer "AND"-Funktion, vorgesehen sind.

10. Konfokales Lasermikroskop nach Anspruch 8 oder 9, da durch gekennzeichnet, daß im Lasermodul (1) mehrere Ein- oder Mehrlinienlaser (2, 3, 4) vorgesehen sind, de nen ein abstimmbarer optischer Filter (6, 11) und/oder ein ansteuerbarer optischer Modulator zur Einstellung verschiedener Laserspektren nachgeschaltet sind.

11. Konfokales Lasermikroskop nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere auf Filter rädern angeordnete und durch Drehung der Filterräder gegeneinander austauschbare Linienfilter und/oder meh rere auf Teilerrädern angeordnete und durch Drehung der Teilerräder gegeneinander austauschbare Spektralteiler vorgesehen sind, wobei die Filterräder und die Teiler räder jeweils mit elektro-mechanisch ansteuerbaren Stelleinrichtungen gekoppelt sind.