CN103245646B - 1,3,4-噁二唑类衍生物荧光探针在镉离子测定中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种1,3,4-噁二唑类衍生物作为荧光探针在镉离子测定中的应用，具体用于检测水体及细胞内的镉离子(Cd²⁺)。该类探针具有对Cd²⁺皮摩尔级的响应，这样低的响应到目前为止还未见报道。该类荧光探针在水溶液中表现出对Cd²⁺高的灵敏度和好的选择性，操作方面的简便性，可见光的激发及大的Stocks位移，成比率测量等优点；由于该类探针在结合Cd²⁺前后颜色有较大的变化，可方便地通过裸眼识别判断；此外，该类探针还可方便负载于细胞中，通过激光共聚焦显微镜在细胞水平能很好地观察其成像细胞内被Cd²⁺污染的情况。

Description

1,3,4-噁二唑类衍生物荧光探针在镉离子测定中的应用

技术领域：

本发明涉及噁唑类化合物的用途，具体是一种噁二唑类衍生物作为荧光探针在检测水体及细胞内镉离子的应用。

背景技术：

镉作为重要的过渡金属之一被广泛地应用于工业中，如：电镀、冶炼、合金、染料等。由于镉的广泛应用，导致了含镉工业废水的大量排放，引起了土壤和水体的严重污染，使有毒金属镉通过食物链进入到人体，在人体内通过生物富集引起慢性中毒，导致了许多疾病的发生，如：肺气肿、嗅觉丧失、牙釉黄色环、肾损害、骨软化症及一些癌症等。长期摄入被微量镉污染的食物和水，还会引起骨痛病，这种病曾在欧洲出现过，而日本富山县神通川流域由于镉污染引起的骨痛病更是举世皆知。因此，发展一种能够准确、简单、快速测定水体及细胞内镉离子含量的方法具有非常重要的意义。

目前测定Cd²⁺的方法有原子吸收法、电感耦合等离子发射光谱法(ICP-AES）、电化学法、荧光分析法等。在这些方法中，荧光分析法以其操作简单、高的灵敏度和选择性、快的响应速度及可在细胞水平直接、实时地观察细胞内Cd²⁺的变化而不影响细胞内正常的生理、生化过程而显示出独特的优势。

现在文献报道的Cd²⁺荧光探针，大部分存在水溶性差、需要紫外光的激发、或者存在Zn²⁺的严重干扰等问题，更为重要的是现在报道的Cd²⁺探针的检测限远远大于活体生物所能忍受的最高限度和由美国环保总署和世界贸易组织所规定的水体中Cd²⁺的最高含量(4-40nM)(a,Liu,W.M.等人,Org.Lett.,2007,9,3829-3832.b.Peng,X.J.等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129,1500-1501.c.Cheng,T.等人，J.Am.Chem.Soc.,2008,130,16160-16161.d.Taki,M.,J.Am.Chem.Soc.,2008,130,12564-12565.e.Tian,H.等人，J.Mater.Chem.,2011,21,10298-10303.),因此发展具有应用价值的Cd²⁺探针具有非常重要的实际应用价值。

发明内容：

本发明的目的是提供一种1,3,4-噁二唑衍生物的新用途，具体作为荧光探针用于检测水体及细胞内的Cd²⁺。该探针对Cd²⁺有高的灵敏度和选择性，用可见光激发，能够有效减小紫外激发光对细胞及生物样品的损伤。

本发明提供的一种1,3,4-噁二唑类衍生物作为Cd²⁺的荧光探针在检测水体及细胞内Cd²⁺的应用，所述的1,3,4-噁二唑类衍生物的结构式（I）为：

其中，R₁至R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或其锂盐；

或者结构式（II）为：

其中，R₁至R₄、R₆、R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或其锂盐。

上述结构式（I）和（II）的1,3,4-噁二唑类衍生物具体可用于检测水体及细胞内镉离子的荧光探针，例如用于地表水、自来水中Cd²⁺的检测；或者用于模拟生物体系中Cd²⁺的检测，生物活细胞和活组织内Cd²⁺的分析检测和荧光成像检测，以及与临床医学相联系的各类细胞或组织中Cd²⁺的测定。

与现有技术相比，本发明合成的1,3,4-噁二唑类衍生物作为Cd²⁺荧光探针属于比率型探针，能够有效消除因探针负染不匀、生物样品厚度不均及设备等因素引起的误差，从而得到比非比率型荧光探针更准确的测定结果。而且，该探针具有在可见光区的激发及大的Stokes位移，能够有效减小紫外激发光对细胞和生物样品的损伤及细胞或生物样品自身荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，更有利于活体的检测。本发明的荧光探针是基于分子内电荷转移(ICT)设计的。由于探针与Cd²⁺的结合导致了分子内供电子基团供电子能力的减弱，表现在吸收和发射光谱的蓝移及探针与Cd²⁺结合前后颜色的变 化，这样可凭借裸眼判断探针与Cd²⁺结合的情况。另外，该探针可孵育进入细胞，通过激光共聚焦显微成像技术可成像被Cd²⁺污染的细胞中的Cd²⁺。1,3,4-噁二唑类Cd²⁺荧光探针具有合成方法简单，成本低廉的特点，由于具有皮摩尔这样超低的对Cd²⁺响应，因此具有非常重要的实际应用价值。

附图说明

图11,3,4-噁二唑的锂盐化合物与不同浓度的Cd²⁺在HEPES缓冲溶液中的发射光谱图。

图2成比率的荧光强度F₅₃₀/F₆₇₀与Cd²⁺浓度线性图

图3自然光和紫外灯下1,3,4-噁二唑的锂盐化合物结合Cd²⁺前后的颜色变化图

图41,3,4-噁二唑的锂盐化合物与不同浓度的Cd²⁺在HEPES缓冲溶液中的吸收光谱图

图5成比率的吸收强度A₃₅₄/A₄₀₅与Cd²⁺浓度的线性图

图6自然光和紫外灯下1,3,4-噁二唑的锂盐化合物结合Cd²⁺前后的颜色变化图

图71,3,4-噁二唑酯的化合物在未结合Cd²⁺时的细胞成像

图81,3,4-噁二唑酯的化合物在结合Cd²⁺后的细胞成像

图91,3,4-噁二唑酯的化合物在未结合Cd²⁺时的细胞成像

图101,3,4-噁二唑酯的化合物在结合Cd²⁺后的细胞成像

具体实施方式

实施例1

1,3,4-噁二唑类衍生物作为Cd²⁺的荧光探针在检测水体及细胞内Cd²⁺的应用，所述的1,3,4-噁二唑类衍生物的结构式（I）为：

其中，R₁至R₇为氢原子，R₈为乙基、R₉为乙基或锂盐；

或者结构式（II）为：

其中，R₁至R₄、R₆、R₇为氢原子，R₈为乙基、R₉为乙基或锂盐。

上述化合物参照专利申请号201210317190.0的文献制备而成。

实施例2：

将含有单荧光团的1,3,4-噁二唑的锂盐化合物作为探针加入到HEPES缓冲溶液中（含10mmol/L EGTA，pH7.2），配成1.0μmol/L的溶液，将0.2mol/L的CdCl₂溶液加入到含单荧光团的1,3,4-噁二唑锂盐化合物作为探针的HEPES缓冲液中，随着溶液中游离的Cd²⁺浓度的增加(Patricia M.等人,J.Biol.Chem.1992,267,25553-25559)，荧光光谱逐渐蓝移，荧光强度显著增强，在619nm处出现了一个明显的等发射点，呈现明显的成比率发射的特点（图1）。发射的荧光强度比F₅₃₀/F₆₇₀从2.2增强到8.0，而且与Cd²⁺浓度呈现良好的线性相关性（图2），溶液的颜色也由原来的深黄色变为淡黄色；在紫外灯下，溶液颜色由原来的红色变为明亮的绿色（图3）。

实施例3

将含有双荧光团的1,3,4-噁二唑的锂盐化合物作为探针加入到HEPES缓冲溶液中（含10mmol/L EGTA，pH7.2），配成1.0μmol/L的溶液，将0.2mol/L的CdCl₂溶液加入到含双荧光团的1,3,4-噁二唑的锂盐化合物作为探针的HEPES缓冲液中，随着溶液中游离的Cd²⁺浓度的增加(Patricia M.等人,J.Biol.Chem.1992,267,25553-25559)，吸收光谱逐渐蓝移，吸收强度逐渐增强，在313nm和370nm处出现了两个明确的等吸收点（图4），而且吸收强度比A₃₅₄/A₄₀₅与Cd²⁺浓度呈现良好的线性相关性（图5），溶液的颜色也由原来的橙红色变为淡黄色；在紫外灯下，溶液颜色由原来的红色变为明亮的绿色（图6）。

实施例4

将含有单荧光团的1,3,4-噁二唑酯的化合物作为探针，在DMSO中配成浓度为5.0μmol/L的溶液，将其在37°C，5%CO₂培养箱中加入到人脐静脉内皮细胞中，孵育40分钟使其进入细胞中。之后，用HEPES缓冲溶液冲洗3次，放于共聚焦激光扫描显微镜下，固定激发波长为405nm,发射波长为570-610nm，可看到细胞成像为暗红色（图7）。然后将10.0μmol/L 的CdCl₂加入到上述细胞中，继续孵育30分钟之后，再次放于共聚焦激光扫描显微镜下，发射波长为510-550nm，这时细胞呈现明亮的绿色（图8）。

实施例5

将含有双荧光团的1,3,4-噁二唑酯的化合物作为探针，在DMSO中配成浓度为5.0μmol/L的溶液，将其在37°C，5%CO₂培养箱中加入到人脐静脉内皮细胞中，孵育40分钟使其进入细胞中。之后，用HEPES缓冲溶液冲洗3次，放于共聚焦激光扫描显微镜下，固定激发波长为405nm,发射波长为570-610nm，可看到细胞成像为暗红色（图9）。然后将10.0μmol/L的CdCl₂加入到上述细胞中，继续孵育30分钟之后，再次放于共聚焦激光扫描显微镜下，发射波长为500-550nm，这时细胞呈现明亮的绿色（图10）。

Claims (1)

1.一种1,3,4-噁二唑类衍生物作为Cd²⁺的荧光探针在检测水体及细胞内Cd²⁺的应用，所述的1,3,4-噁二唑类衍生物的结构式为：

其中，R₁至R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或其锂盐；

或者为：

其中，R₁至R₄、R₆、R₇为氢原子、卤素或甲基；R₈为甲基、乙基或丙基；R₉为甲基、乙基或其锂盐。