DE19802569A1 - Toxikologisch aktive Fragmente des lethalen Toxins von Clostridium sordellii und deren Verwendung in Immuntoxinen - Google Patents

Toxikologisch aktive Fragmente des lethalen Toxins von Clostridium sordellii und deren Verwendung in Immuntoxinen

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Description

Bei den verschiedensten Therapieansätzen werden unterschiedliche Toxine eingesetzt. Bei den Toxinen handelt es sich um Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen oder Pflanzen, die eine Giftwirkung auf den Organismus von Säugetieren und insbesondere des Menschen haben. Von bestimmten lebenden Bakterien werden die sogenannten Exotoxine, wie beispielsweise Cholera-, Diphtherie-, Tetanus-, Botulinus- oder Gasbrandtoxin abgesondert.
Die für die Therapie einsetzbaren Exotoxine wirken innerhalb der Zelle. Üblicherweise binden die Toxine zunächst an Rezeptoren an der Zelloberfläche, werden dann durch Endozytose aufgenommen und durchqueren eine intrazelluläre Membran, um das Zytosol in der Zelle zu erreichen. Im Zytosol rufen die Toxine dann die zytotoxischen Effekte hervor. Häufig stören die Toxine in dem Zytosol essentielle Stoffwechselwege. Die Störung tritt häufig bei der Proteinsynthese auf. Wenn Stoffwechselwege betroffen sind, die in jeder Zelle ablaufen, muß gewährleistet sein, daß bei der therapeutischen Anwendung das Toxin möglichst nur in die gewünschte Zielzelle gelangt, da anderenfalls die unerwünschten Nebenreaktionen überhand nehmen würden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fragment eines bakteriellen Exotoxins, nämlich des sogenannten lethalen Toxins (LT), das von Clostridium sordellii gebildet wird. Das lethale Toxin von Clostridium sordellii gehört zu der Familie der großen Clostridienzytotoxine, die morphologische Veränderungen in Zellinien hervorrufen. Diese gehen einher mit einer Zerstörung des Aktinzytoskeletts.
Das lethale Toxin ist eine Glucosyltransferase, die UDP-Glucose als Co-Substrat zur Modifikation von GTPasen mit niedrigem Molekulargewicht verwendet. LT modifiziert selektiv Rac und Rap sowie Ras. Ras ist der Prototyp einer Unterfamilie der Superfamilie der GTPasen mit niedrigem Molekulargewicht. LT modifiziert und inaktiviert Ras durch Glycosylierung eines essentiellen Threoninrestes (35). Durch die Glycosylierung wird Ras inaktiviert, was zu einer Inhibierung des EGF (Epidermal Growth Factor) stimulierten MAP-Kinaseweges führt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein biologisch aktives Fragment des lethalen Toxins von Clostridium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 oder eine hierzu homologe Sequenz aufweist, wobei die Homologie zu der Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID- Nr. 1 wenigstens 80% beträgt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das biologisch aktive Fragment des lethalen Toxins die Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 auf.
Seq.-ID-Nr. 1
Darüber hinaus kann das biologisch aktive Fragment noch am N- und/oder C-Terminus weitere Sequenzen aufweisen. Bevorzugt ist jedoch, wenn das Fragment keine weiteren Sequenzen aufweist, die von Clostridium-DNA abgeleitet sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Abwandlungen und Variationen des bevorzugt eingesetzten Fragments des lethalen Toxins. Die beanspruchten Fragmente weisen eine Homologie zu der in Seq.-ID-Nr. 1 angegebenen Aminosäuresequenz von wenigstens 80% auf. Eine Homologie von 80% bedeutet, daß jeweils 80% der Aminosäuren an der jeweiligen Position der angegebenen Sequenz entsprechen, wohingegen 20% der Aminosäuren unterschiedlich sein können. Die essentiellen Bereiche des Proteinfragments müssen dabei unverändert bleiben, jedoch ist es möglich, daß Aminosäuren in den nicht biologisch aktiven Bereichen ausgetauscht werden können, wobei bevorzugt die Aminosäuren durch ähnliche Aminosäuren ausgetauscht werden. Die Ähnlichkeit wird bedingt durch die Seitenketten, insbesondere durch die Polarität und die Ladung der Seitenketten.
Die erfindungsgemäßen Fragmente können bevorzugterweise in Immuntoxinen Verwendung finden. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Immuntoxine, die erfindungsgemäß ein biologisch aktives Fragment und eine Zellbindungskomponente aufweisen.
Die Zellbindungskomponente kann ein Antikörper oder ein Teil davon (variable Regionen) sein, der spezifisch an eine Zielzelle bindet. Alternativ hierzu kann die Zellbindungskomponente ein Ligand sein, der spezifisch an einen Rezeptor der Zielzelle binden kann.
Bei den Zielzellen handelt es sich bevorzugt um Tumorzellen.
Als weiteren Bereich können die erfindungsgemäßen Immuntoxine ein Transportsystem oder einen Translokationsbereich aufweisen, der es ermöglicht, daß das Toxin in das Zytosol der Zelle eingebracht wird. Erfindungsgemäß wird besonders das Transportsystem des Pseudomonas Exotoxin A oder des Diphtherietoxins bevorzugt eingesetzt. In einer anderen bevorzugt eingesetzten Ausführungsform wird das Transportsystem des C2-Toxin bevorzugt eingesetzt, das in der deutschen Patentanmeldung 197 35 105.0 näher beschrieben ist. Das C2- Transportsystem beinhaltet die N-terminale C2I-Domäne des C2- Toxins von C.botulinum als Interaktionsdomäne.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Verwendung eines erfindungsgemäßen Fragments als Toxin, das zur Abtötung spezifischer Zellen eingesetzt werden kann.
Die erfindungsgemäßen Immuntoxine weisen also in bevorzugter Ausführungsform wenigstens drei Bereiche auf. Der erste Bereich ist der Zellbindungsbereich. Mit Hilfe des Zellbindungsbereiches dockt das Immunotoxin an die Zielzelle an. Bei den natürlich vorkommenden Immuntoxinen bindet dieser Bereich üblicherweise an einen Rezeptor der Zielzelle. Beim Pseudomonas Exotoxin A bindet dieser Bereich beispielsweise an den α2-Makroglubolinrezeptor. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der Zellbindungskomponente um einen Antikörper oder ein Antikörperfragment handeln, das an eine bestimmte Struktur an der Zelloberfläche bindet. Es ist nicht erforderlich, daß der gesamte Antikörper beim Immuntoxin vorhanden ist. Ausreichend können beispielsweise die Fv- Fragmente sein, die die variablen Regionen aus den Fab- Fragmenten eines Antikörpers darstellen.
Alternativ hierzu kann die Zellbindungskomponente ein Ligand sein, der an einen Rezeptor auf der Zelle bindet. Liganden können beispielsweise Zytokine wie Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktor usw. sein, die an die hierfür spezifischen Rezeptoren binden. Da üblicherweise eine möglichst hohe Zellspezifität für die Immuntoxine gewünscht wird, werden erfindungsgemäß bevorzugt solche Liganden eingesetzt, die an Rezeptoren binden, die sich nur oder zumindest überwiegend auf den Zielzellen finden.
Das erfindungsgemäße Fragment des lethalen Toxins kann besonders vorteilhaft bei Tumoren verwendet werden, da das Toxinfragment zelleigene Enzyme inaktiviert, die bei der Krebsbildung außer Kontrolle geraten sind. Die Ras-Gene gehören zu den Onkogenen und werden besonders stark in Tumorzellen exprimiert. Wenn also die aufgrund des Tumors übermäßig stark exprimierten Ras-Genprodukte wieder inaktiviert werden können, ermöglicht diese eine effektive Tumortherapie.
Gegenüber dem unveränderten lethalen Toxin weisen die erfindungsgemäßen Fragmente den Vorteil auf, daß sie kleiner sind. Kleinere Proteine können aber von den Zielzellen leichter aufgenommen werden und die toxische Wirkung kann sich daher besser im Zytosol der Zielzelle entfalten.
Bei der Therapie mit Immuntoxinen hat sich die Bildung von Antikörpern gegen das Toxin als Problem herausgestellt. Da erfindungsgemäß nur ein Fragment des Holotoxins eingesetzt wird, ist die Gefahr der Bildung von (neutralisierenden) Antikörpern verringert.
Überraschenderweise wurde auch herausgefunden, daß die erfindungsgemäßen Toxinfragmente eine höhere Aktivität aufweisen als das unveränderte Holotoxin.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend beschriebenen Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion wurden zwei Fragmente des lethalen Toxins von C.sordellii, Stamm 6018 amplifiziert. Einmal wurde das erfindungsgemäße Fragment mit den Aminosäuren 1 bis 546. Weiterhin wurde als Vergleich das Fragment mit den Aminosäuren 1 bis 517 durch Verkürzung des erstgenannten Fragments hergestellt.
Die Amplifikation der Fragmente wurde mit Hilfe des PCR-Systems 2400 von Perkin Elmer gemäß den Vorschriften des Herstellers durchgeführt, wobei das Primerpaar CS1C/CS1N eingesetzt wurde. Die Primer hatten folgende Sequenzen:
Die Reaktion wurde mit 300 nmol Primern, 250 ng chromosomaler DNA in einem Gesamtvolumen von 100 µl in 30 Zyklen durchgeführt (Denaturierung, 94°C, 10 Sek.; Annealing, 48°C, 30 Sek.; Verlängerung, 68°C, 3 Min.). Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit den Restriktionsenzymen BglII/BamHI verdaut und in den Expressionsvektor pGEX2T kloniert.
Für die C-terminale Deletionsvariante 1-517 wurde zusätzlich mit den Restriktionsenzymen SpeI/EcoRI verdaut. Die verkürzten Fragmente wurden mit DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment aufgefüllt und religiert.
Nach Sequenzierung wurde die DNA-Sequenz des Fragmentes 1-546 bestimmt. Dabei wurde folgende DNA-Sequenz ermittelt:
Seq.-ID-Nr. 4
Beispiel 2
Es wurde die Glucosyltransferase-Aktivität des Holoenzyms verglichen mit der des erfindungsgemäßen Fragments (AS 1-546) und mit der des am C-Terminus deletierten Fragments mit den Aminosäuren 1-517.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 1 dargestellt. Hierzu wurde jeweils 1 µg Ras mit dem Holoenzym (schwarz ausgefülltes Dreieck [▲]), gereinigtem N-terminalen Toxinfragment mit den Aminosäuren 1-546, dargestellt als schwarz ausgefülltes Quadrat [∎], und Deletionsfragment mit den Aminosäuren 1-517 (schwarz ausgefüllte Kreise [⚫]) inkubiert. Eingesetzt wurden jeweils 1 nM des Toxins. Die Inkubation erfolgte in Gegenwart von UDP-[14C]-Glucose (10 µM) für die angegebene Zeit. Dann wurden die markierten Proteine mit SDS PAGE und Phosphorbilddarstellung analysiert. Fig. 1 zeigt, daß das erfindungsgemäße Fragment eine höhere Aktivität aufweist als das Holotoxin. Die Aktivität ist bei dem weiterdeletierten Fragment (1-517) nahezu vollständig verlorengegangen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (11)

1. Fragment des lethalen Toxins von Clostridium, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID- Nr. 1 oder eine hierzu homologe Sequenz aufweist, wobei die Homologie zu der Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 wenigstens 80% beträgt.
2. Fragment gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Homologie zu der Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 wenigstens 90% beträgt.
3. Fragment gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Homologie zu der Aminosäuresequenz gemäß Sequenz-ID-Nr. 1 wenigstens 95% beträgt.
4. Immuntoxin, dadurch gekennzeichnet, daß es
  • a) ein Fragment gemäß einem der Ansprüche 1-3 und
  • b) eine Zellbindungskomponente
    aufweist.
5. Immuntoxin gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellbindungskomponente (b) ein Antikörper oder ein Teil davon ist, der spezifisch an eine Zielzelle bindet.
6. Immuntoxin gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellbindungskomponente (b) ein Ligand ist, der spezifisch an einen Rezeptor der Zielzelle binden kann.
7. Immuntoxin gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zielzelle um eine Tumorzelle handelt.
8. Immuntoxin nach einem der Ansprüche 4-7, dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin
  • c) ein Transportsystem
    aufweist.
9. Immuntoxin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportsystem die Translokationsdomäne des Pseudomonas Exotoxins A ist.
10. Immuntoxin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportsystem die Translokationsdomäne des C2-Toxins von Clostridium ist.
11. Verwendung eines Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als zielzellspezifisches Toxin.
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