DE19648209A1 - Procedure for tumor cell depletion of CD34-positive cells - Google Patents

Procedure for tumor cell depletion of CD34-positive cells

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Abstract

A process for selectively eliminating (purging) tumour cells from preparations containing CD34-positive cells using CD44-specific antibodies is disclosed. The invention is based on the surprising discovery that CD34-positive cells, unlike many tumour cells, do not express the variant exons CD44v5 and CD44vt, or only to a very minor extent. A new molecular marker is thus provided by means of which tumour cells that contaminate strain cell preparations can be selectively destroyed. To destroy tumour cells, CD44v-specific antibody molecules can be linked to a cytotoxic agent, for example the exotoxin of the species pseudomonas.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Entfernung (purging) von Tumorzellen aus Präparationen, die CD34-positive Zellen enthalten, mit Hilfe CD44- spezifischer Antikörper.The present invention relates to a method for selective removal (purging) tumor cells from preparations containing CD34-positive cells using CD44- specific antibody.

Autologe Knochenmarkstransplantation ist nicht nur bei Therapie von Leukämie, son­ dern auch in der Therapie solider Tumoren von steigender Wichtigkeit. Der Nutzen autolo­ ger Knochenmarkstransplantationen wird durch ein erhöhtes Rezidivrisiko im Verlauf der Knochenmarksrekonstitution beeinträchtigt. Dieser Rückfall könnte von malignen Zellen herstammen, die die Knochenmarksfraktion in unterschiedlichem Maße kontaminieren (1, 2, 3).Autologous bone marrow transplantation is of increasing importance not only in the treatment of leukemia, but also in the therapy of solid tumors. The benefit of autonomous bone marrow transplantation is impaired by an increased risk of recurrence during the course of bone marrow reconstitution. This relapse could originate from malignant cells that contaminate the bone marrow fraction to different degrees ( 1 , 2 , 3 ).

Es existieren verschiedene Strategien, die Kotransplantation maligner Tumorzellen bei der autologen Transplantation zu verhindern. Die gebräuchlichste Methode, die Tumormas­ se zu reduzieren, ist Knochenmarksreinigung (bone marrow purging). Knochenmarkszellen werden mechanischen oder chemischen Verfahren unterworfen (4). Damit kann eine Ver­ ringerung der malignen Zellen um Werte von 3 bis mehr als 5 log erreicht werden (5, 4, 6), jedoch werden die malignen Zellen nicht in jedem Falle ausgerottet. Eine kürzlich ange­ wandte Methode ist die Anreicherung und Reinfusion von hämatopoetischen Stammzellen. Im Menschen exprimieren hämatopoetische Stammzellen CD34. Es wurden verschiedene Ansätze entwickelt, CD34-positive Zellen erfolgreich zu isolieren, wobei Immunoabsor­ bens-, immunomagnetische oder Zentrifigationsverfahren verwendet werden (7). Bis heute ist es kaum möglich, die gewünschte Zellpopulation im klinischen Maßstab bis zur Homo­ genität anzureichern. Dieses Erfordernis sollte erfüllt werden, um das Risiko kontaminieren­ der Zellen auszuschließen. Obwohl also Reinigungsverfahren und Stammzellanreicherungs­ strategien verwendet werden, besteht immer noch das Risiko minimaler übrigbleibender Erkrankung (minimal residual disease) bei autologer Transplantation.There are various strategies to prevent the co-transplantation of malignant tumor cells in the autologous transplantation. The most common method of reducing tumor size is bone marrow purging. Bone marrow cells are subjected to mechanical or chemical processes ( 4 ). A reduction of the malignant cells by values of 3 to more than 5 log can thus be achieved ( 5 , 4 , 6 ), but the malignant cells are not always eradicated. A recently used method is the enrichment and reinfusion of hematopoietic stem cells. In humans, hematopoietic stem cells express CD34. Various approaches have been developed to successfully isolate CD34-positive cells, using immunoabsorbent, immunomagnetic or centrifugation methods ( 7 ). To date, it is hardly possible to enrich the desired cell population on a clinical scale to the point of homogeneity. This requirement should be met to avoid the risk of cell contamination. So although cleaning procedures and stem enrichment strategies are used, there is still a risk of minimal residual disease in autologous transplantation.

Eine vielversprechende neue Strategie der Eliminierung oder Minimierung residualer maligner Zellen könnte aus der Kombination von Reinigungsmethoden und Stammzellanreicherung resultieren. Jedoch fehlt es dafür an tumorspezifischen Markern, d. h. Antigenen, die auf Tumorzellen, jedoch nicht auf hämatopoetischen Stammzellen exprimiert werden.A promising new strategy of eliminating or minimizing residual malignant cells could result from the combination of cleaning methods and stem cell enrichment result. However, there is a lack of tumor-specific markers, i.e. H. Antigens that on tumor cells, but not on hematopoietic stem cells.

CD44 ist ein verbreitetes Antigen, das von verschiedenen Zellen exprimiert wird (8), darunter T-Zellen, Granulozyten und Thymozyten. CD44 ist als Hyaluronsäurerezeptor bekannt (9). Eine komplexe genomische Organisation mit wenigsten 20 Exons ist für die Erzeugung verschiedener Spleißvarianten verantwortlich (10, 8). Bis heute sind 15 ver­ schiedene Spleißtypen von CD44 bekannt. Um zwischen dem Standardrezeptorphänotyp und den gespleißten Phänotypen zu unterscheiden, wurde der gewöhnlich exprimierte Hya­ luronsäurerezeptor CD44s benannt, während alle Spleißvarianten mit CD44v bezeichnet wurden (8, 11). Alle Spleißvarianten sind länger und tragen zusätzliche extrazelluläre Prote­ indomänen. Die Erzeugung von CD44-Spleißvarianten scheint mit Prozessen der Aktivie­ rung, Entzündung und Tumorprogression korreliert zu sein (12, 13, 14, 15). Möglicherwei­ se in Analogie zu ihrer Funktion bei der Lymphozytenmigration wurde für variante CD44- Moleküle gezeigt, daß sie metastatische Fähigkeiten in Rattentumorzellinien hervorrufen können (16). Homologe dieser Varianten, insbesondere CD44v5 und CD44v6 wurden in verschiedenen menschlichen malignen Erkrankungen detektiert, darunter Non-Hodgkin's Lymphom (17), Brust (18), Magen (19) und Kolon (20), wo sie sowohl mit Tumorprogres­ sion und Tumorausbreitung als auch mit einer schlechten Prognose der Patienten in Verbin­ dung gebracht werden.CD44 is a common antigen that is expressed by various cells ( 8 ), including T cells, granulocytes and thymocytes. CD44 is known as a hyaluronic acid receptor ( 9 ). A complex genomic organization with at least 20 exons is responsible for the generation of different splice variants ( 10 , 8 ). To date, 15 different types of CD44 splices are known. In order to differentiate between the standard receptor phenotype and the spliced phenotypes, the usually expressed hyaluronic acid receptor was named CD44s, while all splice variants were designated CD44v ( 8 , 11 ). All splice variants are longer and carry additional extracellular protein domains. The generation of CD44 splice variants appears to be correlated with processes of activation, inflammation and tumor progression ( 12 , 13 , 14 , 15 ). Possibly in analogy to their function in lymphocyte migration, variant CD44 molecules were shown to be able to produce metastatic abilities in rat tumor cell lines ( 16 ). Homologs of these variants, particularly CD44v5 and CD44v6, have been detected in various human malignancies, including non-Hodgkin's lymphoma ( 17 ), breast ( 18 ), stomach ( 19 ) and colon ( 20 ), where they are associated with tumor progression and spread as well associated with poor patient prognosis.

Die Erzeugung von CD44v5 und CD44v6 ist nicht auf metastasierende Zellen be­ schränkt, sondern die Expression dieser Spleißvarianten scheint ein allgemeines Muster der Immunabwehr zu sein (21). CD44v5 und CD44v6 sind einerseits für die Metastasenbildung verantwortlich (8, 22) und werden auf der anderen Seite von immunokompetenten Zellen exprimiert.The generation of CD44v5 and CD44v6 is not limited to metastatic cells, but the expression of these splice variants appears to be a general pattern of immune defense ( 21 ). CD44v5 and CD44v6 are on the one hand responsible for the formation of metastases ( 8 , 22 ) and on the other hand they are expressed by immunocompetent cells.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Immunreinigung CD34-positiver Zellen (CD34+) bereitzustellen.The object of the present invention was to provide improved methods for Provide immunological purification of CD34 positive cells (CD34 +).

Diese Aufgabe konnte auf Grundlage des überraschenden Befundes gelöst werden, daß CD34-positive Zellen im Gegensatz zu vielen Tumorzellen die varianten Exons CD44v5 und CD44v6 nicht oder in sehr geringem Maße exprimieren. Damit wird ein neuer moleku­ larer Marker bereitgestellt, mit dessen Hilfe kontaminierende Tumorzellen in Stammzellprä­ parationen selektiv zerstört werden können.This task could be solved based on the surprising finding that CD34-positive cells, in contrast to many tumor cells, have the variant exons CD44v5 and CD44v6 do not or only to a very limited extent. This will create a new molecule Larer marker provided, with the help of contaminating tumor cells in stem cell prep parations can be selectively destroyed.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines für variantes CD44 spezifischen Antikörpermoleküls zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zell­ präparation, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält. Insbesondere betrifft dies Zellpräparationen, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen ent­ halten, die CD34 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Solche Zellpräparation können aus Kno­ chenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial erhalten werden. Bei der Herstellung der Zellpräparation können CD34+-Zellen selektiv angereichert wer­ den, etwa durch immunoabsorbierende, immunomagnetische oder Zentrifugationstechniken, beispielsweise durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder magnetische Zellseparation (MACS).The present invention relates to the use of a variant for CD44 specific antibody molecule for the selective removal of tumor cells from a cell preparation containing hematopoietic stem and / or progenitor cells. Especially this relates to cell preparations that ent hematopoietic stem and / or progenitor cells hold that express CD34 on their surface. Such cell preparation can from Kno Chenmark, peripheral blood, umbilical cord blood or leukapheresis material can be obtained. CD34 + cells can be selectively enriched in the preparation of the cell preparation such as by immunoabsorbing, immunomagnetic or centrifugation techniques,  for example by fluorescence activated cell sorting (FACS) or magnetic Cell separation (MACS).

Insbesondere kann für die erfindungsgemäße Verwendung ein Antikörpermolekül verwendet werden, das spezifisch für ein Epitop ist, das durch das variante Exon v5 und/oder das variante Exon v6 des CD44 Gens kodiert wird. Ein solches Antikörpermolekül kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein, ein komplettes Immunoglobulin oder aber auch ein Fragment davon, z. B. ein Fab-Fragment. Es kann sich dabei auch um ein hybrides oder chimäres ein- oder mehrkettiges und/oder durch Expression rekombinanter DNA hergestelltes Antikörpermolekül handeln, das die angegebene Spezifität aufweist. Besonders bevorzugt ist der monoklonale Antikörper VFF-18, der von einer Hybridoma­ zellinie sezerniert wird, die am 07.06.1994 unter dem Aktenzeichen DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde (WO 95/33771).In particular, an antibody molecule can be used for the use according to the invention can be used which is specific for an epitope which is caused by the variant exon v5 and / or the variant exon v6 of the CD44 gene is encoded. Such an antibody molecule can be a monoclonal or polyclonal antibody, a complete immunoglobulin or a fragment of it, e.g. B. a Fab fragment. It can also be a hybrid or chimeric single or multi-chain and / or by expression recombinant Act DNA-produced antibody molecule that has the specified specificity. The monoclonal antibody VFF-18 is particularly preferred, that of a hybridoma cell line is secreted on 07.06.1994 under the file number DSM ACC2174 at the DSM-German Collection for Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany, has been deposited (WO 95/33771).

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörpermoleküle mit der beschriebenen Spezifität, die mit einem zytotoxischen Agens verknüpft sind, beispielsweise mit einem Toxin, vorzugsweise einem bakteriellen Toxin. Besonders bevorzugt ist dabei das Exotoxin der Gattung Pseudomonas. Das Toxin kann mit dem Antikörpermolekül kovalent verknüpft sein oder durch rekombinante Expression eines Antikörper-Toxin Fusionsproteins herge­ stellt werden.The present invention further relates to antibody molecules with the one described Specificity associated with a cytotoxic agent, for example with a Toxin, preferably a bacterial toxin. The exotoxin is particularly preferred of the genus Pseudomonas. The toxin can be covalently linked to the antibody molecule or by recombinant expression of an antibody-toxin fusion protein be put.

Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen Verwendungen von Antikörpermolekülen mit der beschriebenen Spezifität zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthält, indem die Tumorzellen selektiv auf einem festem Träger, der beispielsweise magnetisch sein kann, immobilisiert werden.The present invention equally relates to uses of antibody molecules with the specificity described for the selective removal of tumor cells a cell preparation that contains hematopoietic progenitor cells by the tumor cells selectively immobilized on a solid support, which can be magnetic, for example will.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zellpräparation mit einem für variantes CD44 spezifi­ schen Antikörpermolekül in Kontakt gebracht wird.Another aspect of the present invention is a method for removing Tumor cells from a cell preparation that contains hematopoietic progenitor cells, the characterized in that the cell preparation with a specific for variant CD44 antibody molecule is brought into contact.

Ein solches Verfahren kann beispielsweise dadurch gekennzeichnet sein, daß das An­ tikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.Such a method can for example be characterized in that the An antibody molecule is linked to a cytotoxic agent.

Ein solches Verfahren kann auch dadurch gekennzeichnet sein, daß zur Entfernung der Tumorzellen ein fester Träger verwendet wird. Such a method can also be characterized in that for removal a solid carrier is used for the tumor cells.  

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Zellpräparation, die nach ei­ nem der beschriebenen Verfahren erhältlich ist.Another aspect of the present invention is a cell preparation which according to ei nem of the methods described is available.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer wie vorste­ hend beschrieben gereinigten Zellpräparation zur Transplantation, insbesondere zur autolo­ gen Knochenmarkstransplantation.Another aspect of the present invention is the use of one as before hend described purified cell preparation for transplantation, especially for autolo gene marrow transplant.

Die Nuklein- und Aminosäuresequenz der varianten Exons des CD44-Gens ist be­ kannt (13, 29, 30). Die Existenz degenerierter oder alleler Varianten ist für die Ausführung der Erfindung nicht von Bedeutung; solche Varianten sind daher ausdrücklich mit ein­ geschlossen.The nucleic acid and amino acid sequence of the variant exons of the CD44 gene is known ( 13 , 29 , 30 ). The existence of degenerate or allelic variants is not important for the implementation of the invention; such variants are therefore expressly included.

Die Sequenz von Exon v5 des menschlichen CD44-Gens ist:
The sequence of exon v5 of the human CD44 gene is:

Die Sequenz von Exon v6 des menschlichen CD44-Gens ist:
The sequence of exon v6 of the human CD44 gene is:

Die Herstellung von Antikörpern gegen bekannte Aminosäuresequenzen kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen (28). Beispielsweise kann ein Peptid dieser Sequenz synthetisch hergestellt und als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt wer­ den. Ein anderer Weg ist die Herstellung eines Fusionsproteins, das die gewünschte Ami­ nosäuresequenz enthält, indem eine Nukleinsäure (die synthetisch oder z. B. durch Polyme­ rase-Kettenreaktion (PCR) aus einer geeigneten Probe hergestellt werden kann), die für diese Sequenz kodiert, in einen Expressionsvektor integriert und das Fusionsprotein in ei­ nem Wirtsorganismus exprimiert wird. Das gegebenenfalls gereinigte Fusionsprotein kann dann als Antigen in einem Immunisierungsprotokoll eingesetzt und Insert-spezifische Anti­ körper oder, im Falle monoklonaler Antikörper, Hybridome, die insertspezifische Antikör­ per exprimieren, mit geeigneten Verfahren selektiert werden. Solche Verfahren sind Stand der Technik. Heider et al. (27) und Koopman et al. (17) beschreiben die Herstellung von Antikörpern gegen variante Epitope von CD44. Antikörper gegen Epitope, die durch die Exons v5 und v6 kodiert werden, werden insbesondere in den Patentanmeldungen WO 95/00851 und WO 95/33771 beschrieben.Antibodies against known amino acid sequences can be produced by methods known per se ( 28 ). For example, a peptide of this sequence can be synthesized and used as an antigen in an immunization protocol. Another way is to produce a fusion protein which contains the desired amino acid sequence by using a nucleic acid (which can be prepared synthetically or, for example, from a suitable sample by means of polymer chain reaction (PCR)) which codes for this sequence, integrated into an expression vector and the fusion protein is expressed in a host organism. The optionally purified fusion protein can then be used as an antigen in an immunization protocol and insert-specific antibodies or, in the case of monoclonal antibodies, hybridomas which express insert-specific antibodies by selected by suitable methods. Such methods are state of the art. Heider et al. ( 27 ) and Koopman et al. ( 17 ) describe the production of antibodies against variant epitopes of CD44. Antibodies against epitopes encoded by exons v5 and v6 are described in particular in patent applications WO 95/00851 and WO 95/33771.

Antikörper, die für CD44v5 und/oder CD44v6 spezifisch sind, können mit einem zytotoxischem Agens, beispielsweise einem Toxin verknüpft werden. Geeignet sind bei­ spielsweise Ricin, insbesondere rekombinante Ricin-A-Kette oder Abrin A. Besonders ge­ eignet ist das Pseudomonas-Exotoxin. Das Toxin kann mit dem Antikörpermolekül kova­ lent verknüpft sein, beispielsweise über eine Thioetherbindung unter Verwendung des Kopp­ lungsagens Sulfo-sucinimidyl-4(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat (vgl. Beispiel 2).Antibodies specific for CD44v5 and / or CD44v6 can be labeled with a cytotoxic agent, for example a toxin. Are suitable for for example ricin, in particular recombinant ricin A chain or abrin A. Especially ge Pseudomonas exotoxin is suitable. The toxin can with the antibody molecule kova lent linked, for example via a thioether bond using the Kopp lungs agent sulfo-sucinimidyl-4 (N-maleimidomethyl) cyclo-hexane-1-carboxylate (see example 2).

Es kann aber auch beispielsweise ein Antikörper/Toxin-Fusionsprotein verwendet werden. Verfahren zur Herstellung solcher Fusionsproteine sind im Stand der Technik be­ schrieben (31, 32).However, an antibody / toxin fusion protein can also be used, for example. Methods for producing such fusion proteins are described in the prior art ( 31 , 32 ).

Auch die Verwendung eines Antikörper-Zytostatikum-Konjugats ist möglich. Verfah­ ren zur Herstellung von Antikörper-Zytostatikum-Konjugaten sind im Stand der Technik beschrieben (33).The use of an antibody-cytostatic conjugate is also possible. Methods for producing antibody-cytostatic conjugates are described in the prior art ( 33 ).

Zellpräparationen, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthalten, können beispiels­ weise in einem geeigneten Zellkulturmedium in einer Konzentration von 106-108 Zellen/ml bei einer Temperatur von 37°C suspendiert, mit 0.01-10 µg/ml Antikörper-Pseudomonas- Exotoxin-Konjugat versetzt und 0.5 bis 20 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, bei 37°C inkubiert werden. Vorzugsweise beträgt die Antikörper-Toxin-Konzentration 0.1-5 µg/ml, besonders bevorzugt 0.5-1 µg/ml. Anschließend können die Zellen mit Kultur­ medium gewaschen werden. Das Vorhandensein überlebender Tumorzellen kann in einem Koloniebildungsversuch (vgl. Beispiel 3) getestet und die Prozedur gegebenenfalls wieder­ holt werden. Die Überlebensrate klonogener hämatopoetischer Vorläuferzellen kann eben­ falls in einem entsprechenden Assay getestet werden (vgl. Beispiel 3).Cell preparations containing hematopoietic progenitor cells can, for example, be suspended in a suitable cell culture medium in a concentration of 10 6 -10 8 cells / ml at a temperature of 37 ° C, mixed with 0.01-10 µg / ml antibody-Pseudomonas-exotoxin conjugate and incubated at 37 ° C for 0.5 to 20 hours, preferably 1 to 2 hours. The antibody toxin concentration is preferably 0.1-5 ug / ml, particularly preferably 0.5-1 ug / ml. The cells can then be washed with culture medium. The presence of surviving tumor cells can be tested in a colony formation experiment (see Example 3) and the procedure can be repeated if necessary. The survival rate of clonogenic hematopoietic progenitor cells can also be tested in an appropriate assay (see Example 3).

Ein anderer Weg, die Erfindung auszuführen, besteht in einer immunomagnetischen Reinigung. Zellpräparationen, die hämatopoetische Vorläuferzellen enthalten, können bei­ spielsweise in einem geeigneten Zellkulturmedium in einer Konzentration von 106-108 Zellen/ml suspendiert, mit 0.1-20 µg/ml eines entsprechenden CD44-Antikörpers und un­ ter leichter Bewegung (Rollen oder Schütteln) beispielsweise für 10 bis 90 min, vorzugs­ weise für 30 min. unter Kühlung, z. B. bei 4°C inkubiert werden. Anschließend können die Zellen gewaschen und dann mit einem magnetischen sphärischen Trägermaterial versetzt werden, das mit einem Antikörper, der den verwendeten CD44-Antikörper binden kann, beschichtet ist. Solche Trägermaterialen sind im Handel erhältlich (vgl. Beispiel 3). Es schließt sich daran eine erneute Inkubation an, beispielsweise wieder für 30 min bei 4°C un­ ter leichter Bewegung. Dabei binden die Tumorzellen über die Antikörper-Antikörper- Wechselwirkung an den Träger. Der Träger mitsamt den spezifisch gebundenen Tumorzel­ len kann dann mit Hilfe eines Magneten entfernt werden.Another way to practice the invention is by immunomagnetic purification. Cell preparations containing hematopoietic progenitor cells can, for example, be suspended in a suitable cell culture medium in a concentration of 10 6 -10 8 cells / ml, with 0.1-20 µg / ml of a corresponding CD44 antibody and with gentle agitation (rolling or shaking) for example for 10 to 90 min, preferably for 30 min. with cooling, e.g. B. incubated at 4 ° C. The cells can then be washed and then mixed with a magnetic spherical carrier material which is coated with an antibody which can bind the CD44 antibody used. Such carrier materials are commercially available (cf. Example 3). This is followed by another incubation, for example again for 30 min at 4 ° C with gentle agitation. The tumor cells bind to the carrier via the antibody-antibody interaction. The carrier together with the specifically bound tumor cells can then be removed with the aid of a magnet.

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die beschriebenen Ausführungsformen be­ schränkt. Sie schließt weitere Ausführungsformen von Verfahren zur Abtrennung von Tu­ morzellen aus den genannten Zellpräparationen ein, deren Kernelement die spezifische Wechselwirkung von CD44v5/CD44v6-Antikörpermolekülen mit Tumorzellen ist. The present invention is not limited to the described embodiments limits. It includes other embodiments of methods for separating Tu mor cells from the cell preparations mentioned, the core element of which is the specific one Interaction of CD44v5 / CD44v6 antibody molecules with tumor cells.  

AbbildungenIllustrations

Fig. 1a-e: Durchflußzytometrische Analyse angereicherter CD34+-Zellen, isoliert aus Na­ belschnurblut. Die Analyse wurde mit einem FACScan (Becton Dickinson) durchgeführt. 5000 Zellen wurden untersucht. Gezeigt ist ein Punktdiagramm (dot blot) der Fluoreszenz­ intensitäten (Fluoreszenz 1 (grün) gegen Fluoreszenz 2 (rot)). Fig. 1a-e: Flow cytometric analysis of enriched CD34 + cells isolated from cord blood. The analysis was carried out with a FACScan (Becton Dickinson). 5000 cells were examined. A dot diagram (dot blot) of the fluorescence intensities (fluorescence 1 (green) versus fluorescence 2 (red)) is shown.

Fig. 1a: Kontrollfärbung angereicherter Zellen mit nichtspezifischen Fluorochrom-markier­ ten Antikörpern (IgG1-FITC und IgG2a-PE). Fig. 1a: Control staining of enriched cells with non-specific fluorochrome-labeled antibodies (IgG1-FITC and IgG2a-PE).

Fig. 1b: Färbung angereicherter Zellen mit dem CD34-spezifischen Antikörper HPCA-2- FITC (grün). Fig. 1b: Staining of enriched cells with the CD34-specific antibody HPCA-2-FITC (green).

Fig. 1c: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44s-spezifischem SFF-2-Biotin-Streptavidin-PE (rot). Fig. 1c: Coloring enriched cells with CD34-specific HPCA-2-FITC (green) and CD44s-specific SFF-2-biotin-streptavidin-PE (red).

Fig. 1d: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44v5-spezifischem VFF-8-Biotin-Streptavidin-PE (rot). FIG. 1d: Coloring enriched cells with CD34-specific HPCA-2-FITC (green) and CD44v5-specific VFF-8-biotin-streptavidin-PE (red).

Fig. 1e: Färbung angereicherter Zellen mit CD34-spezifischem HPCA-2-FITC (grün) und CD44v6-spezifischem VFF-18-Biotin-Streptavidin-PE (rot). Fig. 1e: Staining of enriched cells with CD34-specific HPCA-2-FITC (green) and CD44v6-specific VFF-18-biotin-streptavidin-PE (red).

Fig. 2: Durchflußzytometrische Analyse angereicherter CD34+-Zellen, isoliert aus Nabel­ schnurblut. Die Analyse wurde mit einem FACScan (Becton Dickinson) durchgeführt. 5000 Zellen wurden analysiert. Gezeigt ist ein Punktdiagramm der Lichtstreuungseigenschaften (Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung). Fig. 2: Flow cytometric analysis of enriched CD34 + cells isolated from cord blood. The analysis was carried out with a FACScan (Becton Dickinson). 5000 cells were analyzed. A scatter plot of the light scattering properties (forward scatter versus side scatter) is shown.

Fig. 3: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Leuka­ pheresematerial. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben. Fig. 3: Expression of CD44s, CD44v5 and CD44v6 in CD34 + cells, isolated from Leuka pheresematerial. The antigen expression of individual samples is shown.

Fig. 4: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Nabel­ schnurblut. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben. Fig. 4: Expression of CD44s, CD44v5 and CD44v6 in CD34 + cells isolated from umbilical cord blood. The antigen expression of individual samples is shown.

Fig. 5: Expression von CD44s, CD44v5 und CD44v6 in CD34+-Zellen, isoliert aus Kno­ chenmark. Gezeigt ist die Antigenexpression individueller Proben. Fig. 5: Expression of CD44s, CD44v5 and CD44v6 in CD34 + cells, isolated from bone marrow. The antigen expression of individual samples is shown.

BeispieleExamples Beispiel 1: Expression von CD44s uni CD44v auf CD34+-ZellenExample 1: Expression of CD44s and CD44v on CD34 + cells Gewinnung von Nabelschnurblut und Isolierung mononukleärer ZellenCollection of umbilical cord blood and isolation of mononuclear cells

Bis zu 50 ml frisch erhaltenes Nabelschnurblut wurde mit 300 I.U. Heparin-Natrium (Promonta, Hamburg, Deutschland) vermischt. Mononukleäre Zellen wurden angereichert, wobei eine modifizierte Methode der Dichte-Sedimentation verwendet wurde. Blut, das nicht älter als 6 Stunden war, wurde 1 : 2 mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, PBS (Gibco, Renfrewshire, UK), verdünnt, die 5 mM EDTA enthielt. Als Trennmedium wurde Lympho­ prep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen) mit einer Dichte d=1.077 verwendet. Die Zentrifugation wurde bei 800 × g für 15 Min. ausgeführt. Die Fraktion der mononukleären Zellen wurde zweimal mit PBS/EDTA gewaschen.Up to 50 ml of freshly received umbilical cord blood was mixed with 300 I.U. Heparin sodium (Promonta, Hamburg, Germany) mixed. Mononuclear cells were enriched using a modified method of density sedimentation. Blood that was not older than 6 hours, 1: 2 with phosphate buffered saline, PBS (Gibco, Renfrewshire, UK), containing 5 mM EDTA. Lympho was used as the separation medium prep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway) with a density d = 1,077. The Centrifugation was carried out at 800 x g for 15 min. The fraction of the mononuclear Cells were washed twice with PBS / EDTA.

Probenherstellung von Leukapheresematerial und KnochenmarkSample preparation of leukapheresis material and bone marrow

Cryokonserviertes Leukapheresematerial wurde schnell bei 37°C getaut und sofort in RPMI 1640/10% FCS (Hyclone, Cramlington, UK) resuspendiert. RPMI1640 (Biochrom, Berlin, Deutschland) wurde ohne Indikatorfarbstoff verwendet. Die Zellen wurden zweimal mit RPMI 1640 gewaschen. Frisch erhaltenes Leukapheresematerial und Knochenmarkspro­ ben wurden einmal mit RPMI1640 gewaschen. Um Klumpen zu entfernen, wurde das Ma­ terial mit 0.02% Kollagenase (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), Typ V, und 200 U/ml DNAse (Calbiochem, Bad Soden, Deutschland) verdaut. Der Verdau wurde für 45-90 Min. bei Raumtemperatur ausgeführt, wobei die Zellsuspension sanft geschüttelt wurde. Zellen wurden durch ein 40 µm Nylonzellenfilter (Becton, Dickinson, San Jose, California) filtriert. Weitere Informationen zum benutzten Leukapheresematerial können Tabelle I ent­ nommen werden. Knochenmarksproben wurden von gesunden Donoren erhalten.Cryopreserved leukapheresis material was quickly thawed at 37 ° C and immediately in RPMI 1640/10% FCS (Hyclone, Cramlington, UK) resuspended. RPMI1640 (biochrome, Berlin, Germany) was used without indicator dye. The cells were cut twice washed with RPMI 1640. Freshly received leukapheresis material and bone marrow specimen ben were washed once with RPMI1640. To remove lumps, the Ma material with 0.02% collagenase (Sigma, Deisenhofen, Germany), type V, and 200 U / ml DNAse (Calbiochem, Bad Soden, Germany) digested. The digestion was for 45-90 Min. At room temperature, the cell suspension was gently shaken. Cells were passed through a 40 µm nylon cell filter (Becton, Dickinson, San Jose, California) filtered. Further information on the leukapheresis material used can be found in Table I be taken. Bone marrow samples were obtained from healthy donors.

CD34-spezifische Färbung mononukleärer ZellenCD34-specific staining of mononuclear cells

Isolierte mononukleäre Zellen aus Nabelschnurblut sowie enzymatisch behandelte Zellen (Leukapherese/Knochenmarksproben) wurden in Markierungspuffer resuspendiert, der PBS/5 mM EDTA/0.5% BSA (Gibco) enthielt. CD34-Markierung wurde mit einem CD34 Progenitor Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) durchgeführt. CD34-spezifische Markierung von Zellen wurde gemäß der Herstellerangaben durchgeführt (23). Isolated mononuclear cells from umbilical cord blood and enzymatically treated cells (leukapheresis / bone marrow samples) were resuspended in labeling buffer containing PBS / 5 mM EDTA / 0.5% BSA (Gibco). CD34 labeling was performed using a CD34 progenitor cell isolation kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). CD34-specific labeling of cells was carried out according to the manufacturer's instructions ( 23 ).

Magnetische positive Selektion von CD34+-ZellenMagnetic positive selection of CD34 + cells

Antikörpermarkierte Zellen wurden in entgastem Markierungspuffer resuspendiert. Die Trennung wurde durchgeführt, wobei ein magnetisches Trennungssystem (23, 24) ver­ wendet wurde, magnetische Zellseparation MACS (Miltenyi Biotec). Zellen wurden in der Anwesenheit eines starken Magnetfeldes auf MiniMACS-Säulen, Typ MS, gegeben. Die Säulen wurden viermal mit Markierungspuffer gewaschen, gefolgt von der Elution mit Markierungspuffer in Abwesenheit eines Magnetfeldes. Zur Elution wurde ein Spritzen­ stempel benutzt. Mit einer zweiten Säule wurden die Zielzellen weiter gereinigt, wobei zwei Waschschritte angewendet wurden. Die Reinheit der isolierten Zellen wurde durch Durch­ flußzytometrie bestimmt. Fluorochrom-markierte Antikörper (alle von Becton Dickinson) wurden wie folgt appliziert: Unspezifische Kontrollantikörper (IgG1-FITC und IgG2a-PE), CD34-FITC (HPCA-2-FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)) und CD34-PE (HPCA-2-PE).Antibody-labeled cells were resuspended in degassed labeling buffer. The separation was carried out using a magnetic separation system ( 23 , 24 ), magnetic cell separation MACS (Miltenyi Biotec). Cells were placed on MiniMACS columns, type MS, in the presence of a strong magnetic field. The columns were washed four times with labeling buffer, followed by elution with labeling buffer in the absence of a magnetic field. A syringe stamp was used for elution. The target cells were further cleaned using a second column, using two washing steps. The purity of the isolated cells was determined by flow cytometry. Fluorochrome-labeled antibodies (all from Becton Dickinson) were applied as follows: non-specific control antibodies (IgG1-FITC and IgG2a-PE), CD34-FITC (HPCA-2-FITC (fluorescein isothiocyanate)) and CD34-PE (HPCA-2 -PE).

Färbung von CD34+-Zellen mit CD44-spezifischen AntikörpernStaining of CD34 + cells with CD44-specific antibodies

Angereicherte Zielzellen aus Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial wurden mit kaltem PBS (Gibco) gewaschen. Zellen wurden in Immunofluoreszenzpuffer, der 5% Po­ lyglobin N (Troponwerke, Köln, Deutschland) und 0.05% NaN3 enthielt, resuspendiert. CD44-spezifische Antikörper (Tabelle II) wurden von Bender & Co. GesmbH (Wien, Österreich) bezogen. CD34-/CD44-Doppelfluoreszenzfärbung (FITC/PE- oder FITC/Bio­ tin-markierte Antikörper) wurde gleichzeitig durchgeführt, wobei ein CD34-spezifischer Antikörper und ein CD44-Antikörper der Wahl benutzt wurde. Die Inkubation erfolgte bei 4°C für 30 Min. in der Dunkelheit. Zellen wurden zweimal mit PBS (4°C) gewaschen. Pro­ ben, die mit Biotin markiertem CD44-Antikörper gefärbt wurden, wurden in Immunofluo­ reszenzpuffer resuspendiert und mit Streptavidin-PE (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) bei einer Konzentration von 5 µg/ml inkubiert. Die Inkubation wurde bei 4°C für 30 Min. in der Dunkelheit ausgeführt. Zellen wurden zweimal mit PBS (4°C) gewaschen und bis zur durchflußzytometrischen Analyse auf Eis gehalten.Enriched target cells from umbilical cord blood or leukapheresis material were washed with cold PBS (Gibco). Cells were resuspended in immunofluorescence buffer containing 5% polyglobin N (Troponwerke, Cologne, Germany) and 0.05% NaN 3 . CD44-specific antibodies (Table II) were obtained from Bender & Co. GesmbH (Vienna, Austria). CD34 / CD44 double fluorescence staining (FITC / PE or FITC / Biotin labeled antibodies) was performed simultaneously using a CD34 specific antibody and a CD44 antibody of choice. Incubation was at 4 ° C for 30 min in the dark. Cells were washed twice with PBS (4 ° C). Samples that were stained with CD44 antibody labeled with biotin were resuspended in immunofluorescence buffer and incubated with streptavidin-PE (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) at a concentration of 5 μg / ml. Incubation was carried out at 4 ° C for 30 min in the dark. Cells were washed twice with PBS (4 ° C) and kept on ice until flow cytometric analysis.

Um die Leistung und Verläßlichkeit des Färbungssystems zu testen, wurden die Zel­ linien CCRF CEM (ATCC CLL 119), Jurkat (ATCC TIB 152) und MOLT-4 (ATCC CRL 1582) sowie Phytohämagglutinin-stimulierte Lymphozyten eines gesunden Freiwilligen be­ nutzt. To test the performance and reliability of the staining system, the Zel lines CCRF CEM (ATCC CLL 119), Jurkat (ATCC TIB 152) and MOLT-4 (ATCC CRL 1582) and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes from a healthy volunteer uses.  

Durchflußzytometrische AnalyseFlow cytometric analysis

Die Erhebung der Daten erfolgte unter Benutzung eines Single-Argon-Laser-Durch­ flußzytometers, FACScan (Becton Dickinson), das Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm. emittierte. Die Analyse wurde mit einem PC-Lysys (Becton Dickinson), Software Version 1.0 und 1.1, auf einem IBM-kompatiblen Personalcomputer durchgeführt. Verschiedene Populationen von CD44-positiven und CD44-negativen Zellen wurden unter Verwendung von Dual Parameter Statistics in einem Punktdiagramm von grüner Fluoreszenz gegen rote Fluoreszenz unterschieden (Fig. 1a-e).The data were collected using a single argon laser flow cytometer, FACScan (Becton Dickinson), which emitted light with a wavelength of 488 nm. The analysis was carried out with a PC-Lysys (Becton Dickinson), software version 1.0 and 1.1, on an IBM-compatible personal computer. Different populations of CD44-positive and CD44-negative cells were distinguished from green fluorescence against red fluorescence in a scatter plot using Dual Parameter Statistics ( FIGS. 1a-e).

Reinheit von CD34+-Zellen, angereichert aus Nabelschnurblut, Leukapheresematerial und KnochenmarksprobenPurity of CD34 + cells, enriched from umbilical cord blood, leukapheresis material and Bone marrow samples

8 Nabelschnurblutproben, 7 Proben aus Leukapheresen und 4 Knochenmarksproben wurden prozessiert. Im Vergleich mit nichtseparierten mononukleären Zellen zeigten iso­ lierte Zellen ein anderes Lichtstreuungssignal (Fig. 2): Zellen, die der magnetischen Zellsor­ tierung unterworfen worden waren, zeigten höhere Werte der Vorwärtsstreuungssignale. Die Reinheit wurde durch FACS-Analyse untersucht. Die Prozentsätze von CD34+-Zellen wurden bestimmt. Mittelwerte (mittel ± SD) waren wie folgt Nabelschnurblut 96.1 ± 2.4%, Leukapherese 98.6 ± 0.9% und Knochenmarksproben 96.2 ± 0.5%.8 umbilical cord blood samples, 7 samples from leukapheresis and 4 bone marrow samples were processed. In comparison with non-separated mononuclear cells, isolated cells showed a different light scattering signal ( FIG. 2): cells which had been subjected to magnetic cell sorting showed higher values of the forward scattering signals. The purity was examined by FACS analysis. The percentages of CD34 + cells were determined. Mean values (mean ± SD) were as follows: cord blood 96.1 ± 2.4%, leukapheresis 98.6 ± 0.9% and bone marrow samples 96.2 ± 0.5%.

Expression von CD44-Antigenen durch CD34-positive hämatopoetische StammzellenExpression of CD44 antigens by CD34-positive hematopoietic stem cells

Durch Benutzung logischer Gates wurde die durchflußzytometrische Analyse der CD44-Expression auf CD34-positive Zellen beschränkt. Individuelle Proben von CD34+-Zellen aus Nabelschnurblut (Fig. 3), Leukapherese (Fig. 4) und Knochenmark (Fig. 5) zeig­ ten schwache Expression der untersuchten CD44-Varianten CD44v5 und CD44v6. Mit mittleren Werten von 0.6% in Proben von Knochenmark (Bereich 0.1-0.9%) zeigte die­ ses Gewebe nur eine marginale Expression der Spleißvariante CD44v5, und nur leicht er­ höhte Werte wurden in Proben aus Leukapheresen (Mittel 1.3%, Bereich 0.3-2.7%) und Nabelschnurblut (Mittel 1.4%, Bereich bis zu 3.2%) getunden. Im Vergleich mit der CD44v5-Expression wurde eine höhere Expression von CD44v6 in allen Typen von Proben gefunden, mit einer moderaten Zunahme in Proben aus Leukapiferesen (1.4mal höhere CD44v6-Expression), und einer größeren Zunahme in Knochenmark und Nabelschnurblut­ proben (2.5mal höher). Höhere Mittelwerte der CD44v6-Expression wurden von einem breiten Bereich der Proben von Knochenmark (Mittel 1.5%, Bereich 0.3-2.4), Leukaphe­ rese (Mittel 1.8%, Bereich 1.1-2.7), und Nabelschnurblut (Mittel 3.6%, Bereich 1.9-8.1) begleitet.Using logic gates, the flow cytometric analysis of CD44 expression was restricted to CD34 positive cells. Individual samples of CD34 + cells from umbilical cord blood ( FIG. 3), leukapheresis ( FIG. 4) and bone marrow ( FIG. 5) showed weak expression of the CD44 variants CD44v5 and CD44v6 examined. With mean values of 0.6% in bone marrow samples (range 0.1-0.9%), this tissue showed only a marginal expression of the splice variant CD44v5, and only slightly increased values were obtained in samples from leukapheresis (mean 1.3%, range 0.3-2.7% ) and umbilical cord blood (mean 1.4%, range up to 3.2%). Compared to CD44v5 expression, higher expression of CD44v6 was found in all types of samples, with a moderate increase in leukapiferesis samples (1.4 times higher CD44v6 expression), and a larger increase in bone marrow and umbilical cord blood samples (2.5 times higher ). Higher means of CD44v6 expression were obtained from a wide range of bone marrow samples (mean 1.5%, range 0.3-2.4), leukaphe rese (mean 1.8%, range 1.1-2.7), and umbilical cord blood (mean 3.6%, range 1.9-8.1 ) accompanied.

Im Gegensatz zur schwachen Expression von CD44-Spleißvarianten gab es eine star­ ke Expression der Standardform CD44s in allen untersuchten Probentypen. Mit Mittelwer­ ten von 98.6% (Leukapherese), 98.8% (Nabelschnurblut) zeigten fast alle Zellen CD44s Expression, im Knochenmark erreichte der Mittelwert das Maximum von 100%.In contrast to the weak expression of CD44 splice variants, there was one star ke Expression of the standard form CD44s in all examined sample types. With Mittelwer 98.6% (leukapheresis), 98.8% (umbilical cord blood) showed almost all cells CD44s Expression, in the bone marrow the mean reached the maximum of 100%.

Allgemein wurde die niedrige Expression von CD44v und die hohe Expression von CD44s bestätigt (Tabelle III).In general, the low expression of CD44v and the high expression of CD44s confirmed (Table III).

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere auch eine zweistufige Behandlung. In dem ersten Schritt werden CD34+-Zellen immunomagnetisch angereichert und im zweiten Schritt einer Immunreinigung (Immunopurging) unterworfen. Dabei können vorteilhaft An­ tikörper, die spezifisch für CD44v5 und CD44v6 sind bei der Immunreinigung verwendet werden.The present invention also relates in particular to a two-stage treatment. In In the first step, CD34 + cells are immunomagnetically enriched and in the second Subject to immunopurging step. It can be advantageous to Antibodies specific for CD44v5 and CD44v6 are used in immune cleansing will.

Probenbeschreibung des LeukapheresematerialsSample description of the leukapheresis material

Probenbeschreibung des LeukapheresematerialsSample description of the leukapheresis material

CD44-spezifische Antikörper, die für die durchflußzytometrische Analyse ver­ wendet wurdenCD44-specific antibodies used for flow cytometric analysis were applied

CD44-spezifische Antikörper, die für die durchflußzytometrische Analyse ver­ wendet wurdenCD44-specific antibodies used for flow cytometric analysis were applied

Expression von Standard- und variablen CD44-Antigenen auf CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen gemäß FACS-AnalyseExpression of standard and variable CD44 antigens on CD34 positive hematopoietic stem cells according to FACS analysis

Expression von Standard- und variablen CD44-Antigenen auf CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen gemäß FACS-AnalyseExpression of standard and variable CD44 antigens on CD34 positive hematopoietic stem cells according to FACS analysis

Beispiel 2Example 2 Reinigung von hämatopoetischen Stammzellen mit ImmunotoxinenPurification of hematopoietic stem cells with immunotoxins Herstellung von ImmunotoxinenManufacture of immunotoxins

Antikörper, die spezifisch für durch CD44v5 oder CD44v6 kodierte Epitope sind (WO 95/00851 und WO 95/33771), können an Pseudomonas Exotoxin über eine Thioether-Bindung mit Sulfo-sucinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclo-hexan-1-carboxylat (Pierce, Rockford, Illinois, USA) wie in der Literatur beschrieben konjugiert werden (34). In Abänderung der zitierten Methode können nach der Inkubation des reduzierten MAk und Maleimidomethylcyclohexan-1-carboxylat-(Pseudomonas-Exotoxin) bei 4°C über Nacht ein gleiches Volumen gesättigter Amoniumsulfatlösung zugesetzt und die Präparation für eine weitere Stunde inkubiert werden. Der gebildete Niederschlag kann durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 Min. gewonnen, in 1 ml PBS gelöst und der Gelfiltration unterworfen werden (35).Antibodies which are specific for epitopes encoded by CD44v5 or CD44v6 (WO 95/00851 and WO 95/33771) can be bound to Pseudomonas exotoxin via a thioether linkage with sulfo-sucinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclo-hexane-1 carboxylate (Pierce, Rockford, Illinois, USA) can be conjugated as described in the literature ( 34 ). In a modification of the cited method, an equal volume of saturated ammonium sulfate solution can be added after the incubation of the reduced MAb and maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate (Pseudomonas exotoxin) at 4 ° C. overnight and the preparation can be incubated for a further hour. The precipitate formed can be obtained by centrifugation at 10,000 × g for 10 min., Dissolved in 1 ml PBS and subjected to gel filtration ( 35 ).

Fraktionen, die gereinigtes Konjugat enthalten, wie durch Natrium-Dodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelextrophorese festgestellt werden kann, werden vereinigt und in den Ex­ perimenten verwendet. Die Proteinkonzentration kann mit einem Bio-Rad Protein-Assay be­ stimmt werden, wobei Rindergammaglobulin als Standard benutzt werden kann.Fractions containing purified conjugate, such as by sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis can be determined, are combined and in the Ex periments used. The protein concentration can be determined using a Bio-Rad protein assay be corrected, with bovine gamma globulin can be used as a standard.

ImmunotoxinbehandlungImmunotoxin treatment

Präparationen mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut, Leukapheresematerial, oder Knochenmark (s. oben) oder CD34+-angereicherte Zellen aus diesen Quellen (s. oben) können verwendet werden. Sie können in Zellkulturmedium (RPMI 1640/FCS, Antibiotika) für 1 Stunde, 2 Stunden oder 20 Stunden bei 37°C mit 0.01 µg/ml, 0.1 µg/ml, 0.5 µg/ml oder 1.0 µg/ml Immunotoxin inkubiert werden. Als Immunotoxine können CD44v5- oder CD44v6-Antikörper-Pseudomonas-Exotoxin-Konjugate oder eine Mischung beider ver­ wendet werden. Die Zellen können vor der Inkubation suspendiert und während der Inku­ bation gerollt oder leicht geschüttelt werden. Nach der Inkubation können Zellen mit PBS/1% FCS oder Zellkulturmedium 2mal gewaschen und dann weiterverwendet werden. Die Effektivität der Behandlung kann in einem Koloniebildungsversuch getestet werden (4, s. auch Beispiel 3). Gegebenenfalls kann die Prozedur ein- oder zweimal wiederholt werden. Die Überlebensrate klonogener Vorläuferzellen kann ebenfalls gemäß der Methode in der zuletzt beschriebenen Literaturstelle getestet werden (4, s. Beispiel 3).Preparations of umbilical cord blood mononuclear cells, leukapheresis material, or bone marrow (see above) or CD34 + enriched cells from these sources (see above) can be used. You can in cell culture medium (RPMI 1640 / FCS, antibiotics) for 1 hour, 2 hours or 20 hours at 37 ° C with 0.01 µg / ml, 0.1 µg / ml, 0.5 µg / ml or 1.0 µg / ml immunotoxin. CD44v5- or CD44v6 antibody-Pseudomonas exotoxin conjugates or a mixture of both ver be applied. The cells can be suspended before incubation and during the incubation bation rolled or gently shaken. After incubation, cells with PBS / 1% FCS or cell culture medium washed twice and then reused. The effectiveness of treatment can be tested in a colony formation trial (4, s. also example 3). If necessary, the procedure can be repeated once or twice. The survival rate of clonogenic progenitor cells can also be determined according to the method in the last described literature reference can be tested (4, see Example 3).

Beispiel 3Example 3 Immunomagnetische BehandlungImmunomagnetic treatment

Zur immunomagnetischen Reinigung mononukleärer Zellen aus Nabelschnurblut oder Leukapherese oder Knochenmark oder daraus angereicherter CD34+-Präparationen können immunomagnetische sphärische Träger (beads), z. B. Dynabeads SAM ST (Dynal, Oslo, Norwegen) verwendet werden. Dies sind gleichförmige, magnetische Polystyrolträger, die mit kovalent oberflächengebundenem Schaf-anti-Maus-IgG beschichtet sind. Die SAM IgG- Antikörper binden alle Maus-IgG-Unterklassen. Entsprechend werden für dieses Experi­ ment murine CD44-Antikörper verwendet (WO 95/00851, WO 95/33771). Die jeweilige Zellpräparation (z. B. 106 bis 108 Zellen) können für 30 Min. bei 4°C in Plastikröhrchen in 1 ml RPMI 1640 (mit Supplementen) mit CD44v5- und/oder CD44v6-MAKs (jeweils 10 µg jeden Antikörpers) inkubiert werden. Die Röhrchen können während der Inkubation gerollt oder geschüttelt werden. Die Zellen können zweimal mit PBS/1% FCS gewaschen werden. Dann können die immunomagnetischen Träger, suspendiert in 0.5 ml Medium, zugegeben und unter Rollen oder Schütteln für 30 Min. bei 4°C inkubiert werden. Dabei kann ein Trä­ ger/Zellverhältnis von 50 : 1 eingestellt werden. Die Tumorzellen können dann aus der Mi­ schung entfernt werden, wobei ein flacher Kobalt-Samarium-Magnet verwendet werden kann (36). Die Effektivität der Reinigungsprozedur kann durch Untersuchung der verblei­ benden klonogenen Tumorzellen oder Knochenmarksstammzellen in der Suspension durch Koloniebildungs-Assays bestimmt werden. Gegebenenfalls kann ein Wiederholungszyklus der immunomagnetischen Separation durchgeführt werden.For the immunomagnetic purification of mononuclear cells from umbilical cord blood or leukapheresis or bone marrow or CD34 + preparations enriched therefrom, immunomagnetic spherical carriers (beads), e.g. B. Dynabeads SAM ST (Dynal, Oslo, Norway) can be used. These are uniform, magnetic polystyrene supports that are coated with covalently surface-bound sheep anti-mouse IgG. The SAM IgG antibodies bind all mouse IgG subclasses. Correspondingly, murine CD44 antibodies are used for this experiment (WO 95/00851, WO 95/33771). The respective cell preparation (e.g. 106 to 108 cells) can be incubated for 30 min at 4 ° C in plastic tubes in 1 ml RPMI 1640 (with supplements) with CD44v5 and / or CD44v6 MAKs (each 10 µg of each antibody) will. The tubes can be rolled or shaken during incubation. The cells can be washed twice with PBS / 1% FCS. The immunomagnetic carriers, suspended in 0.5 ml of medium, can then be added and incubated with rolling or shaking at 4 ° C. for 30 minutes. A carrier / cell ratio of 50: 1 can be set. The tumor cells can then be removed from the mixture using a flat cobalt samarium magnet ( 36 ). The effectiveness of the cleaning procedure can be determined by examining the remaining clonogenic tumor cells or bone marrow stem cells in the suspension by colony formation assays. If necessary, a repeat cycle of the immunomagnetic separation can be carried out.

Koloniebildende Assays für Tumor- und Knochenmarksvorläufer-ZellenColony forming assays for tumor and bone marrow precursor cells

Die Zahl der koloniebildenden Tumorzellen kann in einem Softagarassay untersucht werden (37, 38). Softagar-Kulturen werden dreifach in 10-ml-Röhrchen angesetzt, in die 0.2 ml August-Rattenblutzellen (1 : 8 verdünnt), 0.2 ml entsprechend verdünnter Testzellsus­ pension, und 0.6 ml 0.5%igem Agar (Difco Laboratories, Detroit, USA) gegeben werden. Die Röhrchen können bei 37°C in 5% O2/5% CO2/90% N2 inkubiert werden. 21 Tage nach Inkubation werden Kolonien mit mehr als 50 Zellen unter Benutzung eines Zeiss Ste­ reomikroskops gezählt.The number of colony-forming tumor cells can be examined in a soft agar assay ( 37 , 38 ). Soft agar cultures are set up in triplicate in 10 ml tubes, into which 0.2 ml August rat blood cells (diluted 1: 8), 0.2 ml appropriately diluted test cell suspension, and 0.6 ml 0.5% agar (Difco Laboratories, Detroit, USA) are added will. The tubes can be incubated at 37 ° C in 5% O 2 /5% CO 2 /90% N 2 . Colonies with more than 50 cells are counted 21 days after incubation using a Zeiss stereomicroscope.

Die lebensfähigen klonogenen Vorläuferzellen können in einer modifizierten Version (36) der Methode von Burgess A.W. et al. (39) gemessen werden. Die Testzellpräparation wird in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml, in McCay's 5A Medium suspendiert, das 0.3% Agar, 15% FCS, 20 ng/ml rekombinanten menschlichen GM-CSF, 100 Einhei­ ten/ml Penicillin und 100 Einheiten Streptomycin/ml Medium enthält. Die GM-CSF-Kon­ zentration, die verwendet wird, kann auf der Basis von Titrationsexperimenten bestimmt werden. Jeweils 3 1-ml-Aliquots werden in 35-mm-Zellkulturschalen bei 37°C und 5% CO2 in Luft für 14 Tage inkubiert, und Kolonien mit mehr als 40 Zellen gezählt.The viable clonogenic progenitor cells can be modified ( 36 ) from Burgess AW et al. ( 39 ) can be measured. The test cell preparation is suspended in a concentration of 2 × 10 5 cells per ml in McCay's 5A medium, the 0.3% agar, 15% FCS, 20 ng / ml recombinant human GM-CSF, 100 units / ml penicillin and 100 units streptomycin / ml medium contains. The GM-CSF concentration used can be determined on the basis of titration experiments. In each case, 3 1 ml aliquots are incubated in 35 mm cell culture dishes at 37 ° C. and 5% CO 2 in air for 14 days, and colonies with more than 40 cells are counted.

Literaturliterature

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Claims (19)

1. Verwendung eines für variantes CD44 spezifischen Antikörpermoleküls zur selektiven Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoetische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält.1. Use of an antibody molecule specific for variant CD44 for selective Removal of tumor cells from a cell preparation that contains hematopoietic stem and / or contains precursor cells. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hämatopoetischen Stamm- und/oder Vorläuferzellen CD34 auf ihrer Oberfläche exprimieren.2. Use according to claim 1, characterized in that the hematopoietic Express stem and / or progenitor cells CD34 on their surface. 3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül spezifisch für ein Epitop ist, das durch das variante Exon v5 oder das variante Exon v6 des CD44 Gens kodiert wird.3. Use according to claim 1, characterized in that the antibody molecule is specific to an epitope caused by variant exon v5 or variant exon v6 of the CD44 gene is encoded. 4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment eines monoklonalen Antikörpers ist.4. Use according to claim 1, characterized in that the antibody molecule is a monoclonal antibody or a fragment of a monoclonal antibody. 5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül der monoklonale Antikörper VFF-18 (DSM2174) oder ein Fragment dieses Antikör­ pers ist.5. Use according to claim 4, characterized in that the antibody molecule the monoclonal antibody VFF-18 (DSM2174) or a fragment of this antibody pers is. 6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül durch rekombinante Expression hergestellt wurde.6. Use according to one of the preceding claims, characterized in that the antibody molecule was produced by recombinant expression. 7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.7. Use according to one of the preceding claims, characterized in that that the antibody molecule is linked to a cytotoxic agent. 8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das zytotoxische Agens ein Toxin ist.8. Use according to claim 7, characterized in that the cytotoxic agent is a toxin. 9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin das Pseudo­ monas-Exotoxin ist.9. Use according to claim 8, characterized in that the toxin is the pseudo is monas exotoxin. 10. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Toxin mit dem Antikörpermolekül kovalent verknüpft wird oder durch rekombinante Expression eines Antikörper-Toxin Fusionsproteins hergestellt wird. 10. Use according to one of claims 8 or 9, characterized in that the Toxin is covalently linked to the antibody molecule or by recombinant Expression of an antibody-toxin fusion protein is produced.   11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation aus Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Leukapheresematerial erhalten wird.11. Use according to one of the preceding claims, characterized in that that the cell preparation from bone marrow, peripheral blood, umbilical cord blood or Leukapheresis material is obtained. 12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation eine Zellpräparation ist, in der CD34+-Zellen angereichert wurden.12. Use according to claim 11, characterized in that the cell preparation is a Cell preparation is where CD34 + cells have been enriched. 13. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen auf einem festem Träger immobilisiert werden.13. Use according to one of the preceding claims, characterized in that that the tumor cells are immobilized on a solid support. 14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Träger magne­ tisch ist.14. Use according to claim 13, characterized in that this carrier magne is table. 15. Verfahren zur Entfernung von Tumorzellen aus einer Zellpräparation, die hämatopoe­ tische Stamm- und/oder Vorläuferzellen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellpräparation mit einem für variantes CD44 spezifischen Antikörpermolekül in Kon­ takt gebracht wird.15. Method of removing tumor cells from a cell preparation, the hematopoeic contains table stem and / or progenitor cells, characterized in that the Cell preparation with an antibody molecule specific for variant CD44 in Kon clock is brought. 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikörpermolekül mit einem zytotoxischen Agens verknüpft ist.16. The method according to claim 15, characterized in that the antibody molecule is linked to a cytotoxic agent. 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Tu­ morzellen ein fester Träger verwendet wird.17. The method according to claim 15, characterized in that for removing the Tu a solid support is used. 18. Zellpräparation erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15-17.18. Cell preparation obtainable by a method according to any one of claims 15-17. 19. Verwendung einer Zellpräparation gemäß Anspruch 18 zur Transplantation.19. Use of a cell preparation according to claim 18 for transplantation.
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