DE19632755C1 - Monoclonal antibody specific for CDw109 cell surface protein - Google Patents

Abstract

Monoclonal antibody (MAb) that binds specifically to the cell surface protein CDw109 is produced and secreted by hybridoma 40B8, deposited as DSM ACC 2279. Also claimed is the hybridoma producing the MAb.

Description

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch an das Zelloberflächenprotein CDw109 bindet.The invention relates to a monoclonal antibody which binds specifically to the cell surface protein CDw109.

Das CDw109-Protein ist ein biochemisch noch wenig charakteri­ siertes Protein, das aus den Veröffentlichungen Sutherland, D.R. und Yeo, E.L. (1995), "CDw109 Cluster Report", in: Leukocyte Typing V, Schlossmann, S. et al. (Herausgeber), Seiten 1767-1769, Oxford University Press, Oxford, U.K; sowie Sutherland, D.R. et al. (1991): "Identification of a Cell-Surface Antigen Associated with Activated T Lymphoblasts and Activated Plate­ lets", Blood, Band 77 Nr. 1, Seiten 84-93, bekannt ist.The CDw109 protein is not very biochemically characteristic protein that is from the Sutherland publications, D.R. and Yeo, E.L. (1995), "CDw109 Cluster Report", in: Leukocyte Typing V, Schlossmann, S. et al. (Editor), pages 1767-1769, Oxford University Press, Oxford, U.K; and Sutherland, D.R. et al. (1991): "Identification of a Cell-Surface Antigen  Associated with Activated T Lymphoblasts and Activated Plate lets ", Blood, Volume 77 No. 1, Pages 84-93.

Das CDw109-Protein ist ein sehr stark glycosyliertes Zell­ oberflächenprotein mit einer Molmasse von 170 kDa, das über einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) in der Zellmembran verankert ist. Proteine, die über diese spezielle Zuckerstruktur in der Zellmembran verankert sind, zeichnen sich dadurch aus, daß sie weder eine Transmembran - noch eine zyto­ plasmatische Domäne aufweisen. Da auch kleinere Formen des CDw109-Proteins von 150 bzw. 120 kDa aus zellulärem Material isoliert wurden, wird dieses Protein entweder proteolytisch degradiert, oder es liegt in unterschiedlich modifizierten Formen vor. Möglicherweise enthalten die kleineren CDw109-Varianten geringere Mengen an Kohlenhydrat-Resten.The CDw109 protein is a very strongly glycosylated cell surface protein with a molecular weight of 170 kDa, which via a glycosylphosphatidylinositol anchor (GPI anchor) in the Cell membrane is anchored. Proteins that have this particular Sugar structure anchored in the cell membrane stand out characterized by the fact that it is neither a transmembrane nor a zyto have a plasmatic domain. Because even smaller forms of 150 or 120 kDa CDw109 protein made of cellular material isolated, this protein becomes either proteolytic degraded, or it is in differently modified forms in front. The smaller CDw109 variants may be included lower amounts of carbohydrate residues.

Liganden des CDw109-Proteins sind nicht bekannt. Das Protein wird auf einigen wenig differenzierten oder undifferenzierten humanen Zellen des hämatopoetischen Systems exprimiert, nämlich auf einer kleinen Subpopulation hämatopoetischer Stammzellen, die nur ca. 10% der CD34-positiven Zellen umfaßt. Außerdem wird es auf Megakaryoblasten und Megakaryozyten exprimiert. Als Megakaryoblasten bezeichnet man die Vorläuferzellen, die zu Megakaryozyten weiter differenzieren. Aktivierte T-Lympho­ blasten produzieren das CDw109-Protein, wenn sie mit dem Cytokin IL-2 kultiviert werden.Ligands of the CDw109 protein are not known. The protein is on some little differentiated or undifferentiated expressed human cells of the hematopoietic system, namely on a small subpopulation of hematopoietic stem cells, which comprises only about 10% of the CD34 positive cells. Furthermore it is expressed on megakaryoblasts and megakaryocytes. Megakaryoblasts are the progenitor cells that differentiate further into megakaryocytes. Activated T lympho blasts produce the CDw109 protein when used with the cytokine IL-2 can be cultivated.

Auch einige ausdifferenzierte Zellen exprimieren das CDw109- Protein. Es wurde auf Thrombozyten, die mit Thrombin oder Phytohämaglutinin aktiviert wurden, sowie auf vaskulären endothelialen Zellen detektiert, also auf Zellen, die das Innere der Blutgefäßwände auskleiden, wie bspw. Nabelschnurendothel­ zellen. Some differentiated cells also express the CDw109- Protein. It was developed on platelets containing thrombin or Phytohemaglutinin were activated, as well as on vascular endothelial cells are detected, i.e. on cells that are inside lining the blood vessel walls, such as umbilical cord endothelium cells.  

Aufgrund dieses Expressionsmusters des CDw109-Antigens wird ihm eine Rolle bei der Zelladhäsion, -aktivierung und -pro­ liferation zugeschrieben.Because of this expression pattern of the CDw109 antigen a role in cell adhesion, activation and pro attributed to liferation.

Darüber hinaus wurde gezeigt, daß das CDw109-Protein auf Tumorzellen exprimiert wird. Es wurde bspw. auf wenig differen­ zierten Zellen von akuten T-Zell-Leukämien und akuten Prä-B-Zell- Leukämien gefunden, also auf Tumorzellen des hämatopoetischen Systems und Immunsystems. Außerdem wurde das CDw109-Protein auf einer Reihe epithelialer Tumorzellinien nachgewiesen. Tumoren epithelialen Ursprungs werden auch als Karzinome bezeichnet.In addition, the CDw109 protein was shown to Tumor cells is expressed. For example, there was little difference graced cells from acute T-cell leukemia and acute pre-B-cell Leukemia found, that is, on tumor cells of the hematopoietic System and immune system. In addition, the CDw109 protein detected on a series of epithelial tumor cell lines. Tumors epithelial origins are also known as carcinomas.

Karzinome und Leukämien sind die häufigsten Tumorarten. So machten im Jahr 1993 in den USA die Karzinome 85% aller neuen Tumorfälle, die Leukämien immerhin 8% aus (Daten von der American Cancer Society, Cancer Facts and Figures, 1993).Carcinomas and leukaemias are the most common types of tumors. So in 1993, 85% of all new carcinomas in the United States Tumor cases that leukemia at least 8% (data from the American Cancer Society, Cancer Facts and Figures, 1993).

Während die Expression des CDw109-Proteins auf normalen hämato­ poetischen Stammzellen sehr gering ist, wird es auf leukämischen Blasten, also entarteten Zellen, die in einem wenig differen­ zierten Stadium vorliegen, häufig überexprimiert.During expression of the CDw109 protein on normal hematoma poetic stem cells is very low, it becomes leukemic Blasts, that is, degenerate cells that differ in a little stage, often overexpressed.

Aus der Tatsache, daß das CDw109-Protein in großen Mengen auf Tumorzellen, jedoch in wesentlich geringeren Mengen auf den genannten normalen Körperzellen exprimiert wird, ergibt sich, daß das CDw109-Protein auch ein Marker für Leukämie- und Karzinomzellen und damit ein Tumormarker ist.From the fact that the CDw109 protein is found in large quantities Tumor cells, but in much smaller amounts on the expressed normal body cells, that the CDw109 protein is also a marker for leukemia and Carcinoma cells and therefore a tumor marker.

Ein solcher Tumormarker ist ein wertvolles Hilfsmittel, mit dessen Hilfe eine frühzeitige Diagnose von entarteten Zellen möglich ist. Nur bei einer frühzeitigen Diagnose der stark invasiven Leukämie- oder Karzinomzellen ist eine Heilungschance gegeben. Darüber hinaus kann ein Tumormarker Ansatzpunkt für die therapeutische Behandlung von Tumorerkrankungen sein. Such a tumor marker is a valuable tool with whose help an early diagnosis of degenerate cells is possible. Only with an early diagnosis of strong invasive leukemia or carcinoma cells are a chance of recovery given. In addition, a tumor marker can be a starting point for be the therapeutic treatment of tumor diseases.  

Um einen Tumormarker wie das CDw109-Protein bei der Diagnose und Therapie von Tumorerkrankungen einsetzen zu können, ist als Vermittler ein Antikörper notwendig. Ein solcher Antikörper kann sowohl mit einfachen Nachweisreagenzien wie Fluoreszenz­ farbstoffen oder radioaktiven Stoffen als auch mit speziellen therapeutisch wirksamen Reagenzien gekoppelt sein.To diagnose a tumor marker like the CDw109 protein and to be able to use therapy for tumor diseases an antibody is required as a mediator. Such an antibody can be done with simple detection reagents such as fluorescence dyes or radioactive substances as well as with special ones therapeutically active reagents can be coupled.

Da polyklonale Antikörper nur begrenzt verfügbar und nicht identisch reproduzierbar sind, sollte der Antikörper monoklonal sein.Because polyclonal antibodies are only available to a limited extent and not are reproducible identically, the antibody should be monoclonal be.

Aus der Veröffentlichung von Sutherland und Yeo (siehe Zitat auf Seite 1) sind bereits eine Reihe von monoklonalen Antikörpern bekannt, die gegen das CDw109-Protein gerichtet sind.From the publication by Sutherland and Yeo (see quote on page 1) are already a series of monoclonal antibodies known that are directed against the CDw109 protein.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen weiteren monoklonalen Antikörper mit anderer Epitopspezifität bereitzustellen, der spezifisch an das humane CDw109-Protein bindet.The present invention has for its object a further monoclonal antibodies with different epitope specificity to provide the specific to the human CDw109 protein binds.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gelöst, der von Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, die unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags am 17. Juli 1996 hinterlegt worden sind. Der Antikörper ist mit der Bezeich­ nung 40B8 benannt. Er weist den Isotyp IgG 1 auf und besitzt die Fähigkeit, spezifisch an das Zelloberflächenprotein CDw109 zu binden.This task is accomplished by providing a monoclonal Antibody released that is produced by hybridoma cells and released under the number DSM ACC 2279 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, according to the provisions of the Budapest Treaty on July 17th 1996 were deposited. The antibody is labeled named 40B8. It has the isotype IgG 1 and has the ability to specifically target the CDw109 cell surface protein to tie.

Mit dem erfindungsgemäßen Antikörper wurde ein weiterer mono­ klonaler Antikörper bereitgestellt, der standardisiert re­ produzierbar ist und somit potentiell unbegrenzt hergestellt werden kann, und der spezifisch an das CDw109-Protein bindet. With the antibody of the invention, another mono clonal antibody provided that standardized re is producible and thus potentially produced indefinitely which specifically binds to the CDw109 protein.  

In von dem Erfinder der vorliegenden Anmeldung durchgeführten Versuchsreihen wurde festgestellt, daß der Antikörper 40B8 mit folgenden Tumorzellinien reagiert:
Lungenkarzinomzellen:
SK-MES, Calu 1, Calu 6, SK-LU1,
Cervix-Karzinomzellen:
HELA,
Erythroblastische/megakaryoblastische Zellinien:
UT-7, TF-1, M07e, MEG-01, HEL, MOLM-1, KU. 812,
Myeloblastische Leukämiezellen:
KG-1a, OCI/AML-4,
T-lymphoblastische Leukämiezellen:
CML-T1,
Prä-B-lymphoblastische Leukämiezellen:
Reh/Km3, Nalm-1.In a series of experiments carried out by the inventor of the present application, it was found that the antibody 40B8 reacts with the following tumor cell lines:
Lung carcinoma cells:
SK-MES, Calu 1, Calu 6, SK-LU1,
Cervical carcinoma cells:
HELA,
Erythroblastic / megakaryoblastic cell lines:
UT-7, TF-1, M07e, MEG-01, HEL, MOLM-1, KU. 812,
Myeloblastic leukemia cells:
KG-1a, OCI / AML-4,
T-lymphoblastic leukemia cells:
CML-T1,
Pre-B lymphoblastic leukemia cells:
Roe deer / Km3, Nalm-1.

Der erfindungsgemäße Antikörper ermöglicht eine gezielte Erkennung und Beeinflussung der genannten Zellen sowie weiterer Zellen, die das CDw109-Protein auf ihrer Zelloberfläche tragen. Er stellt damit ein zu den bekannten Antikörpern alternatives Mittel für den Arzt und Forscher dar, um einerseits solche Zellen nachzuweisen, und zwar sowohl in der Zellkultur als auch im Patientenorganismus, und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte, spezifische Reagenzien. The antibody according to the invention enables a targeted Detection and influencing of the cells mentioned and others Cells that carry the CDw109 protein on their cell surface. He is thus an alternative to the known antibodies Means for the doctor and researcher to hand such cells to be proven, both in cell culture and in Patient organism, and on the other hand these cells if necessary manipulate, either by the antibody itself or by coupled specific reagents.  

Die Erfindung betrifft ferner die Hybridomzellen, die unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga­ nismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt sind und den Antikörper mit der Bezeichnung 40B8 produzieren.The invention further relates to the hybridoma cells which under the number DSM ACC 2279 at the German collection of Mikroorga nismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, in accordance with the Budapest Treaty are deposited and the antibody with the designation 40B8 to produce.

Die erfindungsgemäßen Hybridomzellen können durch ein Verfahren zur Herstellung von Hybridomzellen erzeugt werden, das die im Stand der Technik grundsätzlich geläufigen Schritte umfaßt, wie sie bspw. von Bühring et al. (1991) in Hybridoma, Band 10, Nr. 1, S. 77-78 beschrieben wurden:The hybridoma cells of the invention can by a method are generated for the production of hybridoma cells, which the in The prior art basically comprises steps as described by Bühring et al. (1991) in Hybridoma, volume 10, No. 1, pp. 77-78:

• 1. Immunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres, vorzugs­ weise einer Maus vom Balb/c-Stamm, mit dem Antigen bzw. Immunogen;1. Immunization or sensitization of an animal, preferably a mouse from the Balb / c strain, with the antigen or Immunogen;
• 2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen, vorzugsweise der Milzlymphozyten dieses Tieres;2. Obtaining the antibody-producing cells, preferably the splenic lymphocytes of this animal;
• 3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, immortalisierten Zellinie, vorzugsweise einer Myelomzellinie, zu Hybridomzellen; und3. Fusion of these antibody-producing cells with a stable, immortalized cell line, preferably a myeloma cell line, to hybridoma cells; and
• 4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridom­ zellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet.4. Separation and multiplication (cloning) of such hybridomas cells that secrete an antibody that binds to the antigen binds.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Hybridomzellen wird das Tier mit Zellen der myeloischen Leukämie-Zellinie KG-Ia, die von der American Type Culture Collection (ATCC, Nr. CCL 246.1) erhalten wurde, immunisiert. To produce the hybridoma cells according to the invention, the Animal with cells of the myeloid leukemia cell line KG-Ia, the from the American Type Culture Collection (ATCC, No. CCL 246.1) was immunized.  

Diese Zellinie zeigt eine starke Expression von CDw109. Außerdem ist die Zellinie KG-1a eine undifferenzierte myeloische Leukämie­ zellinie, die z. B. den Stammzellmarker CD34 exprimiert. Dadurch war es möglich, einen Antikörper gegen ein für Leukämien typisches Antigen herzustellen.This cell line shows a strong expression of CDw109. Furthermore the cell line KG-1a is an undifferentiated myeloid leukemia cell line z. B. expressed the stem cell marker CD34. Thereby it was possible to use an antibody against one for leukemia to produce typical antigen.

Wenn Hybridomzellen gesucht werden, die Antikörper produzieren, welche gegen Oberflächenproteine der Zellinie KG-1a gerichtet sind, ist es bei der Vereinzelung der Hybridomzellen vorteilhaft, wenn nur solche Hybridomzellen auf die Spezifität der von ihnen produzierten Antikörper mit KG-1a-Zellen getestet werden, bei denen zuvor nachgewiesen wurde, daß diese Antikörper eine schwache oder eine negative Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen.When looking for hybridoma cells that produce antibodies, which are directed against surface proteins of the cell line KG-1a it is advantageous when separating the hybridoma cells, if only such hybridoma cells on the specificity of them produced antibodies are tested with KG-1a cells who have previously been shown to have these antibodies weak or negative reaction with peripheral blood cells demonstrate.

Wenn nach Hybridomzellen gesucht wird, die Antikörper produ­ zieren, die gegen einen potentiellen Leukämie-Tumormarker gerichtet sind, so ist es außerdem vorteilhaft, wenn der von den Hybridomzellen sezernierte Antikörper nur Leukämiezellen erkennt.If you are looking for hybridoma cells that produce antibody produ grace that against a potential leukemia tumor marker are directed, it is also advantageous if the of Antibodies secreted the hybridoma cells only leukemia cells recognizes.

Durch dieses Screeningschema werden solche Hybridomzellen ausge­ sucht, die Antikörper produzieren, die gegen Antigene gerichtet sind, welche nur auf der myeloischen Leukämie-Zellinie KG-1a, nicht aber auf peripheren Blutzellen oder normalen Knochenmarks­ zellen exprimiert werden. Damit erhöht sich die Wahrscheinlich­ keit, eine Hybridomzellen zu selektionieren, welche einen Tumormarker-spezifischen Antikörper herstellt. Such hybridoma cells are produced by this screening scheme seeks to produce antibodies that are directed against antigens which are only on the myeloid leukemia cell line KG-1a, but not on peripheral blood cells or normal bone marrow cells are expressed. This increases the probability ability to select a hybridoma cells that have a Produces tumor marker-specific antibodies.  

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des monoklonalen Antikörpers mit der Bezeichnung 40B8, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga­ nismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, gemaß dem Budapester Vertrag hinterlegten Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, zur Diagnose von malignen Blutzellen, d. h.. von Blutkrebs, insbesondere von Leukämien, sowie von epithelialen Tumoren, insbesondere Lungenkarzinomen.The invention also relates to the use of the monoclonal Antibody labeled 40B8, such as that of the under the Number DSM ACC 2279 at the German microorga collection nismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, in accordance with the Budapest Treaty deposited hybridoma cells is produced and released, for the diagnosis of malignant blood cells, d. h .. of blood cancer, especially of leukaemias, as well as epithelial tumors, especially lung cancer.

Wie oben aufgeführt, wurde festgestellt, daß der Antikörper 40B8 eine Reihe von epithelialen Tumorzellinien erkennt, vor allem Lungenkarzinomzellinien. Hier wird also ausgenutzt, daß die Tumorzellen sich von den gesunden Körperzellen durch die Expressionsdichte des CDw109-Proteins in der Zellmembran unterscheiden. Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der mit einem Nachweismittel, beispielsweise einem radioaktiven Marker gekoppelt ist, bindet dieses Nachweismittel indirekt an diese Zellen und ermöglicht damit die direkte Identifizierung dieser Zellen, beispielsweise mit röntgendiagnostischen/szintigraphi­ schen Methoden. Damit ist eine sehr frühe Tumordiagnose unter Umständen sogar in vivo möglich.As stated above, it was found that the antibody 40B8 detects a series of epithelial tumor cell lines all lung carcinoma cell lines. So here is exploited that the tumor cells differ from the healthy body cells through the Expression density of the CDw109 protein in the cell membrane differentiate. An antibody according to the invention, which with a Detection means, for example a radioactive marker coupled, this means of proof is indirectly linked to them Cells and thus enables the direct identification of these Cells, for example with X-ray diagnostic / scintigraphi methods. This means that a very early diagnosis of tumors is under Possibly even possible in vivo.

Da Karzinome und Leukämien die häufigsten Tumorarten darstellen, könnte ein solches Diagnoseverfahren eine breite Anwendung finden. Eine frühe Diagnose ist besonders bei Leukämien essen­ tiell, da hier häufig Heilungschancen durch die Chemotherapie bestehen.Since carcinomas and leukaemias are the most common types of tumor, Such a diagnostic procedure could be widely used Find. An early diagnosis is especially common when eating leukemia tiell, since chemotherapy often offers healing opportunities consist.

Da der erfindungsgemäße Antikörper an das CDw109-Protein und damit an ein Protein bindet, das auf Leukämiezellen und Zellen epithelialer Tumoren wie bspw. Lungenkarzinomzellen hoch­ exprimiert wird, auf normalen Zellen jedoch nur gering exprimiert wird und daher als Tumormarker bezeichnet werden kann, bietet er einen direkten Angriffspunkt für eine Manipulation der Krebs­ zellen.Since the antibody of the invention to the CDw109 protein and it binds to a protein that binds to leukemia cells and cells epithelial tumors such as lung carcinoma cells high is expressed, but only slightly expressed on normal cells is and therefore can be referred to as a tumor marker  he's a direct target for cancer manipulation cells.

Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des mono­ klonalen Antikörpers 40B8, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, zur therapeutischen Behandlung von malignen Blutzellen oder Karzinomzellen.The invention therefore also relates to the use of the mono clonal antibody 40B8, as of those under the number DSM ACC 2279 at the German Collection of Microorganisms and Zellkulturen GmbH, DSMZ, deposited hybridoma cells and is released for the therapeutic treatment of malignancies Blood cells or carcinoma cells.

Der Antikörper kann mit einem therapeutisch wirksamen Mittel gekoppelt sein und dadurch eine direkte und gezielte Beein­ flussung oder gar Eliminierung der Tumorzellen ermöglichen.The antibody can be used with a therapeutically active agent be coupled and thereby a direct and targeted leg allow flow or even elimination of the tumor cells.

Um die therapeutische bzw. die diagnostische Applikation des erfindungsgemäßen Antikörpers zu erleichtern, sollte der Anti­ körper mit entsprechend geeigneten Hilfssubstanzen in einer pharmazeutischen Zubereitung vermischt sein.To the therapeutic or the diagnostic application of the To facilitate the antibody of the invention, the anti body with correspondingly suitable auxiliary substances in one pharmaceutical preparation.

Dabei kann der Antikörper 40B8 mit einem speziellen, gegen die Leukämiezellen und/oder die Karzinomzellen gerichteten Diagno­ stikum bzw. Therapeutikum gekoppelt sein.Antibody 40B8 can be used with a special, against which Leukemia cells and / or the carcinoma cells directed diagnosis tical or therapeutic.

Da das CDw109-Protein außer auf Leukämie- und Karzinomzellen auch auf einer kleinen Subpopulation CD34-positiver hämatopoe­ tischer Stammzellen von 10% sowie auf aktivierten T-Lympho­ blasten, aktivierten Thrombozyten, Megakaryoblasten, Megakaryo­ zyten und vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers zum Nachweis und/oder zur Isolierung der genannten Zellen. Der Antikörper 40B8 kann dazu in ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Isolierung der genannten Zellen eingesetzt werden, das die Schritte umfaßt:Because the CDw109 protein except on leukemia and carcinoma cells also on a small subpopulation of CD34-positive hematopoeia table stem cells of 10% and on activated T-lympho blasts, activated platelets, megakaryoblasts, megakaryo cytic and vascular endothelial cells is expressed affects the invention also the use of an inventive Antibody for the detection and / or isolation of the above Cells. The antibody 40B8 can be used in a method for Detection and / or used to isolate the cells mentioned that includes the steps:

• 1) Inkubation einer Zellsuspension, die die genannten Zellen enthält, mit einem Antikörper, der an das CDw109-Antigen bindet, und1) Incubation of a cell suspension containing the cells mentioned contains, with an antibody to the CDw109 antigen binds, and
• 2) Abtrennung der den Antikörper bindenden Zellen von den übrigen Zellen.2) Separation of the antibody binding cells from the remaining cells.

Durch die mit diesem Verfahren mögliche Isolierung der kleinen Subpopulation an hämatopoetischen Stammzellen, die wie die Tumorzellen das CDw109-Protein exprimiert, werden diese spezi­ ischen hämatopoetischen Stammzellen weiterführenden Analysen zugänglich gemacht. Es kann bspw. untersucht werden, ob diese hellen Vorstufen für Tumorzellen darstellen. Damit können mög­ licherweise neue Erkenntnisse zur Tumorentstehung gesammelt werden.The isolation of the small ones possible with this method Subpopulation of hematopoietic stem cells like that Tumor cells expressing the CDw109 protein, these are speci hematopoietic stem cell analysis made accessible. For example, it can be examined whether this represent bright precursors for tumor cells. So that possible Certainly, new findings on tumor development were collected will.

Bei der mit diesem Isolierverfahren ermöglichten Reinigung aktivierter T-Lymphoblasten und aktivierter Thrombozyten können außerdem Analysen zum Mechanismus der Aktivierung durchgeführt werden. Darüber hinaus können solche aktivierten Zellen auch Indizien für Entzündungsreaktionen und andere Krankheiten sein und somit zu diagnostischen Zwecken eingesetzt werden.With the cleaning made possible with this insulation process activated T-lymphoblasts and activated platelets analysis of the mechanism of activation was also carried out will. In addition, such activated cells can also Indications of inflammatory reactions and other diseases and thus used for diagnostic purposes.

Die Isolierung von Megakaryoblasten und Megakaryozyten sowie von vaskulären Endothelzellen aus Geweben wie Knochenmark oder Nabelschnurgewebe ist schwierig und aufwendig. Die Isolierung mit Hilfe des spezifischen Antikörpers 40B8 stellt eine effi­ ziente und vergleichsweise einfache Methode dar, mit der diese Zellen spezifisch aus Organen oder Geweben abgetrennt werden können.Isolation of megakaryoblasts and megakaryocytes as well of vascular endothelial cells from tissues such as bone marrow or Umbilical cord tissue is difficult and expensive. The insulation with the help of the specific antibody 40B8 an effi efficient and comparatively simple method with which this Cells are specifically separated from organs or tissues can.

Die Abtrennung kann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), mittels Säulenchromatographie oder durch direkte Immun­ adhärens erfolgen. The separation can be carried out by means of fluorescence-activated cell sorting (FACS), by means of column chromatography or by direct immune adherent.  

Bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) werden Zellen, die das CDw109-Protein tragen, mit dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper 40B8 gemischt, der zuvor direkt oder indirekt mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE) gekoppelt wurde. Die auf diese Weise fluoreszenzmarkierten Zellen können dann mit bekannten Sortiertechniken nach der jeweiligen Flu­ oreszenzstrahlung sortiert werden.In fluorescence-activated cell sorting (FACS) Cells carrying the CDw109 protein with the invention monoclonal antibody 40B8 mixed previously or directly indirectly with a fluorescent dye such as Fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE) coupled has been. The cells fluorescently labeled in this way can then with known sorting techniques according to the respective flu orescence radiation can be sorted.

Um ein solches Nachweis- bzw. Isolierverfahren schnell und ohne umständliche Vorbereitungen durchführen zu können, sieht die Erfindung einen entsprechenden Kit vor, der den erfindungsgemäßen Antikörper 40B8 enthält.To such a detection or isolation process quickly and without sees the need to carry out cumbersome preparations Invention a corresponding kit before the invention Contains antibody 40B8.

Da sich viele neoplastische Zellen wie die bereits genannten Leukämie- und Karzinomzellen von normalen, d. h. gesunden Zellen unter anderem dadurch unterscheiden, daß sie das CDw109-Protein in großen Mengen auf der Zelloberfläche exprimieren, kann der erfindungsgemäße Antikörper zur Abtrennung normaler Zellen von neoplastischen Leukämie- oder Karzinomzellen verwendet werden. Dazu kann ein Verfahren mit folgenden grundsätzlichen Schritten durchgeführt werden:Because there are many neoplastic cells like those already mentioned Leukemia and carcinoma cells from normal, i.e. H. healthy cells distinguish among other things in that they contain the CDw109 protein can express in large quantities on the cell surface Antibodies according to the invention for separating normal cells from neoplastic leukemia or carcinoma cells can be used. This can be done using a procedure with the following basic steps be performed:

• 1) Inkubation einer Mischung von normalen Zellen und neoplasti­ schen Leukämie- bzw. Karzinomzellen mit dem Antikörper 40B8, und1) Incubation of a mixture of normal cells and neoplasti the leukemia or carcinoma cells with the antibody 40B8, and
• 2) Abtrennung der normalen Zellen von den neoplastischen Leu­ kämie- bzw. Karzinomzellen anhand der unterschiedlichen Anzahl von CDw109-Molekülen in der Plasmamembran der normalen Zellen einerseits und der neoplastischen Leukämie­ bzw. Karzinomzellen andererseits.2) Separation of the normal cells from the neoplastic leu comb or cancer cells based on the different Number of CDw109 molecules in the plasma membrane normal cells on the one hand and neoplastic leukemia or carcinoma cells on the other hand.

Die Abtrennung kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Zellen in der Mischung zunächst mit dem erfindungsgemäßen Antikörper markiert werden, dann mit einem gegen den Spender­ organismus des Antikörpers 40B8 gerichten, biotinylierten Antikörper gekoppelt werden und schließlich durch eine Avidin­ säule laufen gelassen werden. Zellen mit einer hohen Anzahl von CDw109-Molekülen werden in der Säule zurückgehalten, während Zellen ohne oder mit wenig CDw109-Protein durch die Säule hindurchlaufen. Alternative Abtrennverfahren sind die direkte Immunadhärenz, die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und die magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS).The separation can take place, for example, in that the Cells in the mixture first with the invention Antibodies are labeled, then with one against the donor organism of the antibody 40B8 dishes, biotinylated Antibodies are coupled and eventually through an avidin column are run. Cells with a high number of CDw109 molecules are retained in the column while Cells with little or no CDw109 protein through the column walk through. Alternative separation methods are the direct ones Immunoadherence, fluorescence-activated cell sorting (FACS) and the magnetically activated cell sorting (MACS).

Das Isolierverfahren kann insbesondere bei Knochenmarktrans­ plantationen eingesetzt werden, um gesunde hämatopoetische Stammzellen von gegebenenfalls vorhandenen Tumorzellen abzu­ trennen und auf diese Weise das zu transplantierende Knochenmark zu reinigen. Vor allem bei Eigentransplantationen (autologen Transplantationen) im Anschluß an eine Chemo- oder Strahlen­ therapie wird damit die Gefahr einer Reinfektion des Patienten deutlich vermindert.The isolation method can be used in particular for bone marrow trans Plantations are used to make healthy hematopoietic To deduct stem cells from any tumor cells that may be present separate and in this way the bone marrow to be transplanted to clean. Especially with self-transplantation (autologous Transplants) following chemotherapy or radiation Therapy thus becomes a risk of reinfection of the patient significantly reduced.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des Antikörpers 40B8 zum Nachweis des CDw109-Proteins in einer Zellprobe. Dazu kann ein Verfahren eingesetzt werden, das die grundsätzlichen Schritte umfaßt:The present invention also relates to the use of the Antibody 40B8 for the detection of the CDw109 protein in one Cell sample. For this purpose, a method can be used that the basic steps include:

• 1) Inkubation einer Zellprobe mit dem Antikörper 40B8, und1) incubation of a cell sample with the antibody 40B8, and
• 2) Erfassung des an das CDw109 gebundenen Antikörpers.2) Detection of the antibody bound to the CDw109.

Die Zellprobe kann normale Zellen und/oder Leukämiezellen und/oder Zellen von Karzinomen umfassen. Die Erkennung des gebundenen Antikörpers erfolgt beispielsweise vermittels eines an den Antikörper 40B8 gekoppelten Markers. The cell sample can be normal cells and / or leukemia cells and / or cells of carcinomas. The detection of the bound antibody takes place, for example, by means of a marker coupled to antibody 40B8.  

Mit Hilfe dieses Verfahrens ist es möglich, beispielsweise eine Blut- oder Gewebeprobe von einem Patienten mit Verdacht auf Trumorerkrankung auf das Vorhandensein von neoplastischen Leukämiezellen oder Karzinomzellen zu testen.With the help of this method it is possible, for example one Blood or tissue sample from a suspected patient Tumor disease on the presence of neoplastic To test leukemia cells or carcinoma cells.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.Further advantages result from the description below.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above and the following standing features to be explained not only in each specified combination, but also in other combinations or can be used alone, without the scope of to leave the present invention.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines konkreten Ausfüh­ rungsbeispiels näher erläutert. The invention is based on a specific embodiment example explained in more detail.  

Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen das Zelloberflächenprotein CDw109Production and characterization of monoclonal antibodies against the cell surface protein CDw109

Als Antigen werden Zellen der myeloischen Leukämie-Zellinie KG-1a (ATCC Nr. CCL 246.1) verwendet.Cells of the myeloid leukemia cell line act as antigen KG-1a (ATCC No. CCL 246.1) was used.

Acht Wochen alte Balb/c-Mäuse werden zweimal in Intervallen von 10 Tagen intraperitoneal mit 10⁷ Zellen der Zellinie KG-1a immunisiert. Vier Tage vor der Fusion werden 5 × 10⁵ Zellen direkt in die Milz appliziert, um die Immunantwort zu verstärken.Eight-week-old Balb / c mice are intervalized twice of 10 days intraperitoneally with 10⁷ cells of the cell line KG-1a immunized. Four days before the fusion, 5 × 10⁵ cells become direct applied to the spleen to strengthen the immune response.

Die Antikörper-Bildung im Mausorganismus wird dadurch überprüft, daß das Blutserum des betreffenden Tieres in dem dem Fachmann geläufigen ELISA-Test auf Bindungseigenschaften mit dem Antigen untersucht wird.The antibody formation in the mouse organism is checked by that the blood serum of the animal in question in the specialist common ELISA test for binding properties with the antigen is examined.

Nach ca. 3 Wochen werden die Lymphozyten des erfolgreich immunisierten Tieres gewonnen, indem die Milz herausoperiert und zu einer Zellsuspension zerkleinert wird.After about 3 weeks, the lymphocytes become successful immunized animal by operating out the spleen and crushed into a cell suspension.

Die suspendierten Milzzellen werden in Anwesenheit von Poly­ ethylenglykol mit Myelomzellen des bekannten Stammes SP2/0 fusio­ niert. Die Fusionskultur wird in Hypoxanthin-, Aminopterin- und Thymidin-(HAT-)haltigem Medium, hier in HAT-RPMI-1640, kultiviert, in dem sich nur Hybridzellen vermehren können, da diese sowohl die Eigenschaft der Myelomzellen zur unbegrenzten Teilungsfähigkeit als auch die Eigenschaft der antikörper­ produzierenden Lymphozyten zum Wachstum in HAT-haltigem Medium haben.The suspended spleen cells are removed in the presence of poly ethylene glycol with myeloma cells of the well-known strain SP2 / 0 fusio kidney. The fusion culture is in hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT) containing medium, here in HAT-RPMI-1640, cultivated in which only hybrid cells can reproduce, because this both the property of myeloma cells to unlimited Divisibility as well as the property of the antibodies producing lymphocytes for growth in HAT-containing medium to have.

Nach der Fusion werden die Zellen in Napfplatten ausplattiert und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. After the fusion, the cells are plated out in well plates and incubated at 37 ° C and 5% CO₂.  

Die Kulturüberstände werden nach 10-14 Tagen auf der KG-1a Zellinie im Durchflußzytometer gescreent. In einem zweiten Schritt werden die Überstände auf Reaktivität mit peripheren Blutzellen getestet, da diese keine selektiven Stammzellantigene exprimieren. Überstände, die eine negative oder schwache Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen, werden anschließend auf Reaktivität mit Knochenmarkszellen getestet. Hybridome, die Antikörper mit Spezifität für eine kleine Subpopulation von ca. 1% der Knochenmarkszellen produzieren bzw. Antikörper, die keine Knochenmarkzellen erkennen, werden ausgewählt und nach dem bekannten Grenzverdünnungsverfahren vereinzelt und kultiviert, d. h. kloniert.The culture supernatants are on the KG-1a after 10-14 days Screened cell line in flow cytometer. In a second Step the supernatants on reactivity with peripheral Blood cells tested because they are not selective stem cell antigens express. Supernatants that have a negative or weak reaction with peripheral blood cells will show up afterwards Bone marrow cell reactivity tested. Hybridomas that Antibodies specific for a small subpopulation of produce approx. 1% of the bone marrow cells or antibodies, who do not recognize bone marrow cells are selected and isolated according to the known limit dilution method and cultivated, d. H. cloned.

Positiv reagierende Hybridomzellkulturen werden weiter kulti­ viert, die Antikörper angereichert, gereinigt und charakte­ risiert.Hybridoma cell cultures reacting positively will continue to be cultivated Fourth, the antibodies are enriched, purified and characterized rized.

Nach der obigen Screening-Strategie wurde der monoklonale Anti­ körper 40B8 erhalten. Der Isotyp wurde über PE-konjugierte anti- Isotyp-spezifische Antiseren durch indirekte Immunfluoreszenz zu IgG1 bestimmt.According to the screening strategy above, the monoclonal anti body 40B8 received. The isotype was determined using PE-conjugated anti Isotype-specific antisera through indirect immunofluorescence determined to be IgG1.

Die Produktion, Reinigung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte mit den in Fachkreisen allgemein bekannten Methoden.The production, purification and characterization of the antibodies was carried out using the methods generally known in specialist circles.

Der Antikörper 40B8 der von den unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, weist die folgenden charakteristischen Merkmale auf:
Immunglobulinklasse: IgG1
spezifische Bindungsaffinität an: CDw109.The antibody 40B8, which is generated by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2279 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, has the following characteristic features:
Immunoglobulin class: IgG1
specific binding affinity to: CDw109.

Claims (10)

1. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das Zellober­ flächenprotein CDw109 bindet, dadurch gekennzeichnet, daß er von Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, die unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt sind und die Bezeichnung 40B8 tragen.1. Monoclonal antibody that binds specifically to the cell surface protein CDw109, characterized in that it is produced and released by hybridoma cells, which are deposited under the number DSM ACC 2279 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ, in accordance with the Budapest Treaty and are labeled 40B8. 2. Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter der Nummer DSM ACC 2279 bei der Deutschen Sammlung von Mikro­ organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt sind und die Bezeichnung 40B8 tragen.2. Hybridoma cells, characterized in that they are under the Number DSM ACC 2279 at the German Micro Collection organismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, according to the Budapest Contract are stored and bear the designation 40B8. 3. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zur diagnostischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Leukämien und Karzinomen.3. Use of an antibody according to claim 1 for diagnostic treatment of tumors, especially of Leukaemias and carcinomas. 4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an ein zellulär zielgerichtetes Diagnostikum gekoppelt ist.4. Use according to claim 3, characterized in that the antibody to a cellular targeted diagnostic is coupled. 5. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zur therapeu­ tischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Leukämien und Karzinomen. 5. Use of an antibody according to claim 1 for therapy table treatment of tumors, especially leukaemias and carcinomas.   6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mit einer wirksamen Menge eines Therapeu­ tikums gekoppelt ist, das gegen die Leukämiezellen oder Karzinomzellen gerichtet ist.6. Use according to claim 5, characterized in that the antibody with an effective amount of Therapeu tikums that is coupled to the leukemia cells or Carcinoma cells. 7. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Leukämiezellen, Karzinomzellen, hämatopoetischen Stammzellen, aktivierten T-Lymphoblasten, aktivierten Thrombozyten, Megakaryoblasten, Megakaryozyten oder vaskulären Endothelzellen.7. Use of an antibody according to claim 1 for detection and / or for the isolation of leukemia cells, carcinoma cells, hematopoietic stem cells, activated T-lymphoblasts, activated platelets, megakaryoblasts, megakaryocytes or vascular endothelial cells. 8. Kit zum Nachweis von Leukämiezellen, Karzinomzellen, hämato­ poetischen Stammzellen, aktivierten T-Lymphoblasten, aktivierten Thrombozyten, Megakaryoblasten, Megakaryozyten oder vaskulären Endothelzellen, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Antikörper nach Anspruch 1 enthält.8. Kit for the detection of leukemia cells, carcinoma cells, hematoma poetic stem cells, activated T lymphoblasts, activated platelets, megakaryoblasts, megakaryocytes or vascular endothelial cells, characterized in that that it contains an antibody according to claim 1. 9. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zur Abtrennung normaler Zellen von neoplastischen Leukämie- oder Karzinom­ zellen.9. Use of an antibody according to claim 1 for separation normal cells from neoplastic leukemia or carcinoma cells. 10. Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 1 zum Nachweis des CDw109-Proteins in einer Zellprobe.10. Use of an antibody according to claim 1 for detection of the CDw109 protein in a cell sample.