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γ-Alkylthiolysine und Verfahren zu ihrer Herstellung Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft t-Alkylthiolysine und ein Verfahren zu ihrer Herstellung,
bei dem man t-Chlorlysin oder ein Säuresalz davon mit einem Alkylmercaptan oder
einem Alkali-oder Erdalkalisalz eines solchen umsetzt. Die Reaktion wird vorzugsweise
unter Erwärmen in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt. Die erhaltenen Lysinderivate
sind als Antioxydationsmittel, als örtliche Mittel zur Behandlung von Wunden und
Verbrennungen sowie als Antitumormittel brauchbar.
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Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Lysinderivate, genauer:
-Alkylthiolysine. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
von neuartigen Lysinderiva ten mit der Formel
worin R eine niedere Alkylgruppe bedeutet. Speziell betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Herstellung dieser Lysinderivate durch TJmsetzung von y-Chlorlysin oder einem
Säuresalz davon mit Mercaptanderivaten oder Salzen davon.
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Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuartiger Lysinderivate.
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t:in weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von
X-Alkylthiolysinen, das auf wirksame und einfache Art und Weise durchgeführt werden
kann.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Produktion von t-Alkylthiolysinen,
die neuartige und brauchbare Lysinderivate sind.
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Diese und weitere Ziele und Vorteile der Erfindung gehen für den Fachmann
aus der Beschreibung und den Anspruchen hervor.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß neuartige
und brauchbare Lysinderivate, d,h, γ-Alkylthiolysine, hergestellt werden können,
indem man t-Chlorlysin oder ein Säuresalz davon mit Mercaptanderivaten oder Salzen
davon, dargestellt durch die Formel R-SH , worin » eine niedere Alkylgruppe ist,
in einem geeigneten flüssigen Medium behandelt. Geeignete Flüssigkeiten, di@ verwendet
werden können, sind z.B. Wasser, Alkohole,wie Methanol oder Äthanol, oder andere
organische Lösungsmittel, wie z.B. Äther. Gemisch derselben können verwendet werden
Das erhaltene Produkt ist ein γ-Alkylth@@lysin mit der oben gezeigten Formel.
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In d@@ @eigefügten Zeichnung, in der die Beziehung zwischen der Adsorption
und der Zeit mit Bezug auf verschiedene Proben gezeigt werden, bedeuten: Kurve (1)
eine Blindprobe, Kurve (2) Blindprobe plus Ascorbinsäure, Kurve (3) Blindprobe plus
ethylmercapt-L-lysin, und Kurve (4) Blindprobe plus Butylhydroxyanisol.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen γ-Alkylthiolysine
sind neuartige Äninosäuren, die als Antioxydationsmittel oder als besohleunigendes
Mittel zur Heilung von Wunden oder Verbrennungen verwendet werden können. Diese
Verbindungen zeigen außerdem eine Antitumoraktivität. Es ist daher ersichtlich,
daß die neuartigen erfindungsgemäßen Lysinderivate brauchbare und leicht anzuwendende
Substanzen sind.
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Das als s Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete
t-Chlorlysin kann leicht durch Hindurchleiten von Chlorgas unter Lichteinwirkung
durch eine konzentrierte saure Lösung von Lysin erhalten werden. Erfindungsgemäß
wird t-Chlorlysin oder ein Säuresalz von t-Chlorlysin in Wasser, einem Alkohol,
einem anderen organischen Lösungsmittel, wie z.B.
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einem Äther, oder einem Gemisch davon gelöst, und ein Alkali-oder
Erdalkalisalz (z.fl. das Natriumsalz, Kaliumsalz, Calciumsalz usw.) eines Alkylmercaptans
oder ein Alkylmercaptan wird hinzugefügt und damit umgesetzt. Das Reaktionsgemisch
wird vorzugsweise erhitst, so daß die Umsetzu@g innerhalb eines kurzen Zeitraums
abgeschlossen ist. Die @esseren Ergebnisse werden erhalten, indem man die Reaktion
bei einer Temperatur zwischen 20 und 1200C durchführt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen
ist, wird das Lösungsmittel, wenn anstelle von Wasser organische Lösungsmittel verwendet
werden, durch Destillation entfernt, und das Reaktionsprodukt wird in Wasser gelöst.
Das γ-Alkylthiolysin wird aus der wäßrigen Lösung mit Hilfe eines der üblichen
Verfahren gewonnen, s.B. durch Adsorption des Reaktionsproduktes an einem basischen
oder sauren Ionenaustauscherharz und anschließende Desorption desselben mittels
Säure oder Alkali, oder durch Kristallisierung des Reaktionsproduktes unter Ausnutzung
des isoelektrischen Punktes.
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Einzelheiten hinsichtlich dieser Arbeitsweisen sind in den Ausführung@beispielen
angegeben.
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Das als Ausgangsmaterial verwendete 7-Chlorlysin kann optisch aktiv
oder inaktiv sein. Verschiedene organische Lösungsmittel können als Reaktionsaedium
verwendet werden, wie z0B. Alkohole, z.B. Methanol, Äthanol, n-Propanol und dessen
Isomer, n-Butanol und Isomere davon, n-Amylalkohol und Isomere davon, oder n-Hexanol
und Isomere davon, sowie Äther, s.B. Äthyläther, Propyläther, Methyläthyläther,
Methylpropylithert Äthylpropyläther, Äthylbutyläther oder Butylpropyläther. Wenn
organische Lösungsmittel verwendet werden, kann die Reaktionsdauer jedoch verlängert
werden. da die Löslichkeit von 1-Ohlorlysin darin gering ist. Ein einfaches Herfahren
zur Bestimmung der Zeit bis
zum Abschluß der Reaktion besteht in
der Messung der Chlorionen. Alternativ kann die Bestimmung durch Papierchromatographie
oder Dünnschichtchromatographie erfolgen.
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Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern,
Jedoch nicht begrenzen.
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Beispiel 1 50 g -Chlor-L-lysin werden in 100 ml Wasser und 200 ml
Äthanol gelöst; 25 g des Natriumsalzes von Nethylmercaptan werden hinzugefügt, und
das Gemisch wird unter Rühren 7 Stunden lang in einem Wasserbad erhitzt. Der Abschluß
der Reaktion wird durch quantitative Bestimmung der Chlorionen ermittelt. Nach Beendigung
der Reaktion wird das Äthanol durch Destillation unter vermindertem Druck entfernt,
und 400 ml Wasser werden erneut hinzugesetzt, um das Gesamtvolumen auf 500 ml zu
bringen. Die Lösung wird durch eine Säule von IRC-50-Harz (H+-Form) geschickt, um
das überschüssige Natriumsalz des Methylmercaptans zu zersetzen.
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Die Abflußlösung wird durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes,
d.h. Dowex 50 x 8 (Handelsbezeichnung) (NH4+-Form) geschickt. um das gewünschte
γ-Methylthio-L-lysin zu adsorbieren. Nachdem mit Wasser gewaschen worden ist,
wird das γ-Methylthio-L-lysin durch Elution mit 2n NH40H abgetrennt, und das
Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert. Sodann wird absolutes Äthanol
in das Konzentrat gegossen, wobei das II γ-Methylthio-L-lysin ausfällt. Nach
dem Trocknen werden 42 g γ-Methylthio-L-lysin erhalten. Die Werte der Elementaranalyse
sind nachstehend angegeben: Theoretische Werte: C=43,74; H=8,39; N=14,58; S=16,65
Gemessene Werte: C=43,22; H=8,30; N=14,70; S=15,92 Beispiel 2 50 g -Ohlor-B-lysin
werden in 300 ml Methanol suspendiert und unter lebhaftem Rühren ei flokfluß erhitzt.
25 g des Natriumsalzes von Methylmeroaptan werden zu der Rückflußlösung hin zu
gesetzt,
und die Mischung wird 12 Stunden lang kontinuierlich unter Rühren erhitzt. Nach
Abschluß der Reaktion wird das Methanol durch Destillation unter vermindertem Druck
entfernt, und der Rückstand wird in 500 ml Wasser gelöst. Nachdem mit 6n HCl neutralisiert
worden ist, wird die Lösung durch eine Säule eines stark sauren Ionenaustauscherharzes
(H+-Form) geschickt, die dann mit Wasser gewaschen wird, bis die Reaktion auf Ohlorionen
negativ ist. Danach wird das Reaktionsprodukt durch Elution mit 2n NH40H entfernt.
Das Eluat wird einmal bis zu einem leimartigen Festkörper konzentriert, der wiederum
in 100 ml Wasser gelöst wird. Durch Gefriertrocknung der Lösung werden 39 g -Methyl-L-lysin
erhalten.
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Beispiel 3 50 g γ-Chlor-D-lysin werden in 200 ml Wasser gelöst.
32 g des Kaliumsalzes von Methylmercaptan werden hinzugegeben, und das Gemisch wird
3 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion werden 200 ml Wasser
hinzugefügt, und die Lösung wird durch eine Säule eines stark basischen lonenaustauschharzes
geschickt. Nach ausreichendem Waschen mit Wasser wird das Reaktionsprodukt durch
Elution mit 2n HC1 abgetrennt. Das Eluat wird bis zu einem Feststoff konzentriert,
und der erhaltene Feststoff wird in 200 ml Methanol gelöst. Zur Neutralisierung
der Lösung wird Pyridin hinzugefügt, bis die Lösung bei der Prüfung mit Kongorot-Papier
keine saure Reaktion mehr zeigt. γ-Methylthio-D-lysin.HCl fällt sofort aus.
Nach Abfiltrierung des Niederschlages werden 45 g y-Methylthio-D lysinHCl erhalten.
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Beispiel 4 50 g y0hlor-DL-lysindihydrochlorid werden in 300 ml Äthanol
suspendiert, in welchem 30 g Nethylmercaptan gelöst sind, und nach Verschließen
des Reaktionsgefässes wird das Gemisch 3 Stunden lang bei 1000C gerührt. Äthanol
wird durch Destillation entfernt, und der Rückstand wird in 300 ml Wasser gelöst.
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Nach dem Trocknen der Lösung unter vermindertem Druck werden 52 g
zerfließendes rohes γ-Methylthio-DL-lysindihydrochlorid
erhalten.
Das Produkt wird in Wasser gelöst, mit wäßrigem Ammoniak neutralisiert und dann
durch eine Säule eines atark sauren Ionenaustauscherharzes (H+-Form) geschickt,
um das Reaktionsprodukt zu adsorbieren. Nachdem das Harz mit Wasser gewaschen worden
ist, bis -keine Chlorionen mehr vorhanden waren, wird das Reaktionsprodukt durch
Elution mit 2n NH4OH abgetrennt, und das Eluat wird unter vermindertem Druck konzentriert.
Durch Zugabe von absolutem Äthanol werden 29 g γ-Methylthio-DL-lysin als Niederschlag
erhalten.
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Beispiel 5 50 g γ-Chlor-L-lysin werden zu 100 ml wasser und
200 ml Äthanol hinzugefügt; 30 g des Natriumsalzes von Äthylmercaptan werden zugegeben,
und die Umsetzung wird unter Erwen am Rückfluß durchgeführt. Nach Abschluß der reaktion
wird das Reaktionsgemisch unter verminderten Druck konzentriert und d mit 200 ml
Wasser verdünnt. Nach der Neutralisierung mit 6n 1101 wird die Lösung durch ein
stark saures Ionenaustauscherharz (H+-Form) geschickt; die weitere Behandlung erfolgt
wie in Beispiel 2. 39 g γ-Äthylthio-L-lysin werden erhalten.
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Die Elementaran@ysc ergab folgonde Werte: Theoretisch@ @@@o: C=46,59;
H=8,80; N=13,58; S=15,50 Gemess@@ Werte: C=46,72; H=8,40; N=13,06; S=15,12.
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die bezeichnung "niedere Alkylgruppe", wie sie in der vorliegenden
Beschreibung verwendet wird, soll Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen umfassen,
z.B. Methyl, Äthyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, sec-Butyl, i-Butyl, tert-Butyl,
Amyl, Hexyl und dgl.
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Aus dieser Beschreibung geht hervor, daß die Erfindung in vielfacher
Hinsicht variiert werden kann. Solche Variationen sind nicht als Abweichungen von
Grundgedanken und Geltungsbereich der Erfindung anzusehen, sondern alle derartigen
Modifikationen, wie sie für den Fachmann auf der Hand liegen, sollen einbezogen
werden.
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Beispiel 6 50 g x -Chlor-L-lysin und 35 g des Natriumsalzes von Isopropylmeroaptan
werden in einer gemischten Flüssigkeit aus 100 ml Wasser und 200 il Äthanol gelöst,
und das Gemisch wird unter Rühren 7 Stunden lang am Rüokfluß erhitzt. Nach Abschluß
der Reaktion wird der Überschuß an Isopropylmercaptan mit 6n HCl zersetzt. Danach
wird die Arbeitsweise von Beispiel 2 wiederholt, wobei 42 g γ-Isopropylthio-L-lysin
erhalten werden. Die Elementaranalyse ergab folgende Werte: Theoretische Werte:
C=49,09; H=9,09; N=12,73; S=14,55 Gemessene Werte: C=48,92; H=9,15; N=12,67; S=14,23.
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Beispiel 7 50 g γ-Chlor-L-lysin und 40 g des Natriumsalzes von
Amylmercaptan werden in 300 11 Wasser gelöst, und das Gemisch wird unter Rühr@n
8 Stunden lang am Rtlckfluß erhitzt. Nach Abschluß der Reaktion wird der Überschuß
des Natriumsalzes von Amylmercaptan zwecks Zersetzung mit eine schwach sauren Ionenaustauscherharz
(H+-Form) behandelt. Nach der Abtrennung des Harzes durch Filtration wird das Filtrat
an einem stark basischen Ionenaustauscherharz (OHI -Form) adsorbiert. Nachdem mit
Wasser gewaschen worden ist, wird du Reaktionsprodukt durch Elution mit In HCl abgetrennt.
Das Eluat wird unter vermindert Druck konzentriert1 wobei ein sirupsrtiger Festkörper
erhalten wird, der in 150 ml Methanol gelöst wird. Die erhaltene Lösung wird in
eine gemischte Flüssigkeit aus 600 ml Äthanol und 100 ml Äther eingegossen, wobei
γ-(n-Amylthio)-L-lysin.2HCl ausfällt. Nach des Trocknen werden 49 g γ-(n-Amylthio)-L-lysin
erhalten. Die El@@@ntaran@lyse ergab folgende Wert es Theoretische Werte: C=41,12;
H=8,10; N=8,72; S=9,97 Gemessene Werte: C=41,30; H=8,13; N=8,79; S=8,88.
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Vergleiohsbeispi@l 1 Die erfindugsg@@@@ erhaltenen Substansen besitzen
eine Antitumoraktivität. Die Ergebnisse, die bei Ver@uchen sur Bestimmung der Antitumeraktivität
erhalten wurden, sind unten angegeben. γ-Methylmercapto-L-lysin wurde al@
Versuchsprobe verwendet.
Unter dem Gesichtspunkt des akuten toxischen
Wertes bei Mäusen wurden die Versuchsmäuse in zwei Gruppen eingeteilt, d.h. in eine
Gruppe, der eine große Dosis von 800 mg/kg, und in eine Gruppe, der eine kleine
Dosis von 870 mg/kg verabreicht werden sollte. Jeder Maus vom dd-Typ # mit einem
Gewicht von 20 g wurde an der Axilla subcutan Sa-180 (Burgaria-Stamm) injiziert.
Vom 5. Tage nach der Injektion an wurde eine kontinuierliche Verabreichung in die
Bauchhöhle vorgenommen, und zwar jeweils einmal am Tage während 5 Tagen entsprechend
den oben angegebenen Dosierungeng 15 Tage nach der Injektion von Sa-180 wurde der
Tumor herausgenommen, um sein Gewicht festzustellen. Um die dabei erhaltenen Ergebnisse
zu bestätigen, wurden die Versuche in der gleichen Weise wiederholt und somit insgesamt
zweimal durchgeführt. Die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse sind unten
angegeben. Zu Vergleichs zwecken wurde das zur Zeit üblicherweise angewendete Mytomycin
C ebenfalls verwendet.
| γ -Methylmercapto-L-lysin Mitomycin Kontrollgruppe |
| C |
| 800 mg/kg 270 mg/kg 1,5mg/kg |
| Vers.1 Vers.2 Vers.1 Vers.2 Vers.1 Vers.2 |
| Mittleres |
| Gewicht 0,80 0,61 0,86 0,52 0,25 1,25 0,98 |
| Standard- |
| abwei- |
| chung 0,46 0,86 0,43 0,26 0,23 1,21 0,48 |
| Inhibi- |
| tion(%) 36 38 31 47 75 |
Vergleichsbeispiel 2 Die @rfindungsgemäß erhaltenen Substanzen können eine ausreichende
Antioxydationswirkung zeigen, wenn sie als Zusätze in M@ngen von 0,01 bis 0,1% angew@ndet
werden. Die Ergebnisse,die bei den zur Bestimmung der Antioxydationsaktivität durchgeführt@n
Antioxydationsversuchen erhalten wurden, sind unten angegeb@n.
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909834/ 1556
In diesen Versuchen wurde Natriumlinoleat
als Substrat verwendet, und Linolensäure wurde durch Behandlung derselben bei einer
vorbestimmten Temperatur in einer wäßrigen Lösung, zu der eine Versucheprobe hinzugegeben
worden war, oxydiertg,die erhaltene Peroxidmenge wurde mit fortschreitender Zeit
gemessen, um die Antioxydationswirkung der Versuchaproben zu ermitteln.
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1,4 g Linolsäure wurden in 5 ml In Natriumhydroxid gelöst und mit
500 ml einer Boratpufferlösung vom pH-Wert 9,0 weiter verdünnt, um ein Linolensäure-Substrat
herzustellen. 200 ml des Substrats (0,2 mMol Linolsäure) werden in ein Reageneglas
gegossen, in das 10 ml (0,1 mMol der Versuchaprobe) einer 0,01m Versuchelösung,
die dem Oxydationstest unterworfen werden soll, gegeben werden, dann werden weiterhin
10 ml der Pufferlösung unter Mischen hinzugefügt. Als Proben, die dem Antioxydationstest
unterworfen werden sollen, werden Ascorbinsäure, Butylhydroxyanisol und ethylmercapt
o-L-lys in verwendet. Das Reaktionegemisch wird in einen bei 370C gehaltenen Thermostaten
eingebracht, und jeweils 2 ml werden im Verlaufe der Zeit entnommen. Die auf diese
Weise jeweils entnommenen Proben werden mit 2 ml 75%iger Thiobarbitursäure versetzt,
und das Gemisch wird in siedendem Wasser 15 Minuten lang wärmebehandelt, wobei eine
rote Farbe entsteht. Die Absorption dieser roten Farbe bei 353 m u wird gemessen.
Die Oxydationskurven der Linolsäure bei den jeweiligen Proben, die dem Antioxydationstest
unterworfen wurden, sind in der beigefügten Zeichnung gezeigt. Wie aus der Zeichnung
hervorgeht, zeigt -Methylmercapto-L-lysin eine stärkere Antioxydationsaktivität
als Ascorbinsäure, und nahezu die gleiche Wirkung wie Butylhydroxyanisol, welches
das z.Zt. am meisten verwendete Antioxydationsmittel darstellt.
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Patentansprüche: