DE1618995A1 - New antibiotics, processes for their production by biological means, medicinal preparations and feedstuffs containing these antibiotics - Google Patents
New antibiotics, processes for their production by biological means, medicinal preparations and feedstuffs containing these antibioticsInfo
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Description
8 MDNCHEN 23 · S I E G E S 8 T R AS S E 2β · TE LEFON 345067 · TELEGRAMMADRESSE: IN V ENT/MO NCH E N8 MDNCHEN 23 S I E G E S 8 T R AS S E 2β TE LEFON 345067 TELEGRAM ADDRESS: IN V ENT / MONCH E N
UcSc: D 079 (Vo/käJ 22. Dezeajbor 1967UcSc: D 079 (Vo / käJ December 22nd, 1967
604 694 - 3
ο,, „,, OC 113b - S604 694 - 3
ο ,, ",, OC 113b - S
Yogr nf.: Yogr nf .:
SoR0 SQUIBB & SOHS, HfO.> low'fork, N.Y·, Vr-SteA'.SoR 0 SQUIBB & SOHS, HfO.>Low'fork, NY ·, Vr-SteA '.
"Neue Antibiotika, Verfahren «u ihrer Herstellung auf biologischen Wege, AraneiprSparate und Puttermittel, die die··"New antibiotics, processes and their production using biological methods, AraneiprSparate and putter, which the ··
.Antibiotika enthalten". Contains antibiotics "
Priorität: 27. Deaeetbar 1966, V.St.A. 15. Ii or ember 1967« Y. St* A. Anuelde-Nrn. ι 604· 694-Priority: 27. Deaeetbar 1966, V.St.A. 15. Ii or ember 1967 "Y. St * A. Anuelde-Nrn. ι 604 694-
und Diumycin bezelohnet werden, sowie ihre entsprechendenand diumycin as well as their respective counterparts
teile, nämlioh Urabriiionyoin A und Umbrinonyein B sowie Diuayoinparts, namely Urabriiionyoin A and Umbrinonyein B as well as Diuayoin
A und Diueyoin B. uieoe Antibiotika werden gemeinsam bei der ZUohtung des MikroorgnniiKBue Streptooyoee umbrlnue gebildet. Das Umirinciayciin und daa Diuiiyoin worden voneinander durch selektive lösungsmittelextraktion getrennt« und deren jeweilige Bestandteile worilen durch Chromatographie oder andere bekannt·A and Diueyoin B. uieoe antibiotics are used together at the Assignment of the microorganism Streptooyoee umbrlnue formed. The umirinciayciin and daa diuiiyoin have been separated from one another by selective solvent extraction and their respective constituents are known by chromatography or others.
109823/0179109823/0179
BADORlGlNAtBADORlGlNAt
Methoden getrennt. Sowohl ümbrinoinyein als auch Diumycin besitzen antibakterielle Aktivität u.a. gegenüber grampoeitiven Bakterien.Methods separated. Both ümbrinoinyein and diumycin have antibacterial activity against, among other things, gram-positive Bacteria.
Wie bereits ausgeführt, bestehen die neuen Antibiotika der Erfindung aus zwei Gruppen. Me eine Gruppe wird als Umbrinomycin bezeichnet, ein mindestens aus Umbrinomycin A und Umbrinomyoin B bestehendes Gemisch, Die andere Gruppe wird als Diumycin bezeichnet, das mindestens aus Diumycin A und Diumycin B besteht.As already stated, the new antibiotics of the invention consist of two groups. Me one group is called umbrinomycin denotes at least one of umbrinomycin A and umbrinomyoin B existing mixture, the other group is called diumycin, which consists of at least diumycin A and diumycin B.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Antibiotika durch Züchtung des Mikroorganismus Streptomyoes umbrinus in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, Abtrennen des Mycels aus der Gärbrühe und Extraktion der Antibiotika aus dem Myeel.The invention also relates to a method for production the aforementioned antibiotics by cultivating the microorganism Streptomyoes umbrinus in an aqueous nutrient medium under aerobic conditions Conditions, separation of the mycelium from the fermentation broth and extraction the antibiotics from the Myeel.
Der verwendete Stamm von Streptomyoes umbrinus wurde aus einer Bodenprobe aus North Carolina, V.St.A., isoliert. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection in Rookville, Maryland, VoSt.A., hinterlegt, ihm wurde die Nummer 15972 zugeteilt, und er wird nachstehend als Streptomyces umbrinue AICCC 13972 bezeichnet.The Streptomyoes umbrinus strain used was isolated from a soil sample from North Carolina, V.St.A. This tribe has been deposited with the American Type Culture Collection in Rookville, Maryland, VoSt.A., assigned number 15972, and is hereinafter referred to as Streptomyces umbrinue AICCC 13972 designated.
Der im erfindungegemässen Verfahren verwendete Stamm Streptomyces umbrinue wird daduroh isoliert und charakterisiert, indem man zunäohst eine Probe des Bodens in sterilem, destilliertem- Wasser aufschüttelt und damit ein Agarmedium incculitrt, das folgende Bestandteile enthält:The strain used in the process according to the invention Streptomyces umbrinue is isolated and characterized by first shaking up a sample of the soil in sterile, distilled water and using it to incculitrt an agar medium which contains the following components:
109823/0179 BAD ORKIfNAL109823/0179 BAD ORKIfNAL
3 *" 1618395 3 * "1618395
GrammGram
Agar . il5Agar. il5
Rohrzucker IOCane sugar IO
Galactose 10 Citronensäure 1.2Galactose 10 Citric Acid 1.2
(KH4)2HP04 0,4(KH 4 ) 2 HP0 4 0.4
KCl ' 0,08KCl '0.08
MgCl2.6H2O 0,41BMgCl 2 .6H 2 O 0.41B
MnCl2.4Η£0 0,036MnCl 2 .4Η £ 0 0.036
PeCl506H2O 0,023PeCl 50 6H 2 O 0.023
ZnCl5.6H2O ,0.021ZnCl 5 . 6H 2 O , 0.021
CoCl206H2O 0,004CoCl 2 06H 2 O 0.004
destilliertes Wasser auf ICOO ml distilled water to ICOO ml
Das Medium wird auf p» TrO eingestellt und 30 Minuten bei 1210C im Autoklaren sterilisiert. Naoh sieben bis zehn tagiger Inkubation bei 250C werden τοη der Nährbodenplatte Kolonien von Streptomyces iuabrinus isoliert. Diese isolierten Kolonien werden dann auf einem Medium gezüchtet, das folgende Bestandteile enthält ϊ The medium is set to p »TrO and sterilized 30 minutes at 121 0 C in the car clear. Naoh seven to ten tagiger incubation at 25 0 C are isolated τοη of agar plate colonies of Streptomyces iuabrinus. These isolated colonies are then grown on a medium containing the following components ϊ
Pepton 6,0Peptone 6.0
Glukose 1,0Glucose 1.0
de'atilliertes Wasser auf 1000 ml. de'atilled water to 1000 ml.
10 9 8 2 3/0179 BAD ORlGtNAL10 9 8 2 3/0179 BAD ORlGtNAL
Das Nährmedium wird 15 Minuten bei 1210C im Autoklaven sterilisiert.The nutrient medium is sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes.
Der Mikroorganismus kann folgende Kohlenstoffquellen in einem Basalmedium assimilierenf das Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle enthält: Glukose, Mannit, Inosit, Xylose, Arabinose, Fructose, Khamnose, Raffinose, Galactose, Trehalose, Melibiose, Rohrzucker und Lactose. Durch Sorbit wird das Wachstum nicht unterhalten·The microorganism may be the following carbon sources in a basal medium assimilate f contains ammonium sulfate as nitrogen source: glucose, mannitol, inositol, xylose, arabinose, fructose, Khamnose, raffinose, galactose, trehalose, melibiose, sucrose and lactose. Sorbitol does not support growth
Der Mikroorganismus wäohst gut und bildet Sporen auf Tomatenmark-Hafermehl-Agar, Hefe-Malzextrakt-Agar und synthetischen Saleen- £tärke~Agar. Das vegetative Wachetum verläuft rasch und unter Bildung eines charakteristisch schokoladenbraunen vegetativen Myoels, das innerhalb etwa 7 Sagen fragmentiert,The microorganism grows well and forms spores on tomato paste-oatmeal agar, yeast-malt extract agar and synthetic saline £ starch agar. The vegetative wakefulness runs rapidly and under Formation of a characteristic chocolate-brown vegetative myoel that fragments within about 7 days,
Lufthyphen wird innerhalb etwa 14 lagen erzeugt und kann der oliven-lederfarbenen Sporenfarbenrelhe von Pridham zugeordnet werden· Die farbe entspricht den Streifen 3ba bis 5ob im "Color Harmony Manual11. Die Sporophoren sind gerade (R? morphology section), und haben keine Tendenz, gebogen oder spiralig zu sein. Die Sporen sind glatt und zylindrisch bis eiförmig. Auf organischen NÄhrmedien werden melanoide Pigmente erzeugt·Aerial hyphae is generated within about 14 layers and can the olive-buff Sporenfarbenrelhe are assigned by Pridham · The color corresponding to the strip 3ba to 5OB in the "Color Harmony Manual. 11 The sporophores are straight (R? Morphology section), and have no tendency to be curved or spiral. The spores are smooth and cylindrical to ovoid. On organic nutrient media, melanoid pigments are produced.
Mit Hilfe von Streptomyoee umbrinus werden erfindungsgsmäss neue Antibiotika erzeugt, die ein breites Wirkungsspektrum gegen grampositive Bakterien, z.B. Staphylococcus aureus, Baoillus polymyxa und Myccbacterium bovis, sowie gegen Hefen und PilzeWith the help of Streptomyoee umbrinus, new ones are created according to the invention Antibiotics are produced that have a broad spectrum of activity against gram-positive bacteria, e.g. Staphylococcus aureus, Baoillus polymyxa and Myccbacterium bovis, as well as against yeasts and fungi
109823/0179 BAD ORIGINAL 109823/0179 ORIGINAL BATHROOM
besitzen.own.
Zur Herstellung der Antibiotika wird Streptomyoes umbrinue bei 25°C unter submerson aeroben Bedingungen in einem wäserigen lährmedium gezüchtet, das eine assimilierbare Kohlenhydrate und Sticket off quelle enthält» Die fermentation wird etwa 168 Stunden durchgeführt, ITaoh dieser Zeit haben sieh die Antibiotika gebildet.Streptomyoes umbrinue is used to manufacture the antibiotics Cultured at 25 ° C under submerged aerobic conditions in an aqueous culture medium containing an assimilable carbohydrate and sticket-off source. The fermentation is carried out for about 168 hours, after which time the antibiotics have formed.
Nach vollständiger Fermentation wird die Gärbriihe auf einen Wert von etwa 5 eingestellt und nach Zusatz von Piltrierhilfe filtriert. Die Antibiotika werden aus dem Myoel, d.h. dem filterkuchen, mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird auf •inen Pg-Wert von etwa 6 bis β eingestellt und unter reraindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt «ine wässrige Suspension.After fermentation is complete, the fermentation broth is poured into one Value of about 5 is set and after the addition of a pilgrim aid filtered. The antibiotics are extracted from the myoel, i.e. the filter cake, with methanol. The methanol extract is on • set a Pg value of about 6 to β and reduced it Evaporated pressure. An aqueous suspension remains behind.
Zur isolierung der Antibiotika der üabrinomyoingruppe wird die wässrige Suspension auf pg 7,0 eingestellt und hierauf mit Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird über wasserfrei·» natriumsulfat getrocknet und dann auf ein kleines Volumen eingedampft. Das KonBentrat wird mit dem 8 bis 10-faohen Volumen Aceton verdünnte Die Aoetonlusung wird auf ein kleines Volumen eingedampft und hierauf mit dem 10-faohen Volumen n-Htxan versetEt. Di· erhalten* ?ttllua^ wird abgeeohleudert» mit Hexan gtwasohen und getrocknet· Das getsOoknete Produkt wird an Ki·»·!- •äuregel ohroisatographiert» Ansohlieesenä wird das Produkt an alt Säure gewas@henem Aluminiumoxid nochmals chromatographlert· Das auf dles# Weise gereinigte üäte^ial ist ein demisoli tos. sw·! ie owe ran Antibiotika} nMislinh üsibrlnomvoin A und Ifobrino-To isolate the antibiotics of the üabrinomyoin group, the aqueous suspension adjusted to pg 7.0 and then extracted with chloroform. The chloroform extract becomes anhydrous via · » sodium sulfate dried and then evaporated to a small volume. The concentrate is with the 8 to 10 fold volume Acetone diluted The acetone solution is reduced to a small volume evaporated and then mixed with the 10-fold volume of n-Htxan. The · received *? Ttllua ^ is thrown off »with hexane, washed and dried · The product is kneaded on Ki ·» ·! - • Äuregel ohroisatographiert »Ansohlieesenä is the product old acid washed aluminum oxide again chromatographed The ule purified in this way is a demisoli tos. sw ·! ie owe ran antibiotics} nMislinh üsibrlnomvoin A and Ifobrino-
rnycin B, die hierauf durch stufenloses Auswaeohen (gradient •lution chromatography) an Bit Säure gewasohenem Alualniumoxyd voneinander getrennt werden«rnycin B, which can then be selected by stepless selection (gradient • lution chromatography) on bit acid-soaked aluminum oxide to be separated from each other «
Zur Gewinnung der Antibiotika der Diuraycingruppe wird die wässrige Suspension vorzugsweise bei p^ fe mit Butanol extrahiert. Hierbei gehen die Umbrinomycine in die Sutanolphase,während die Diumyoine in der wässrigen Xtisung verbleiben. Die wässrige Lösung wird von der organischen Läsung getrennt und die Butanollösung wird gesondert auf Umbrinomycine aufgearbeitet. Die wässrige Lösung wird mit konzentrierter Salzsäure auf Pg 3 eingestellt und mit wassergesättigtem Butanol extrahiert. Sie Butanollösung wird mit Wasser bei Pg 7 zurück extrahiert > und die wässrigen Extrakt· werden unter vermindertem Druck aur Trookene eingedampft. Der Bückst and wird in Methanol aufgenommen und das in Methanol unlösliohe Material abfiltriert. Das filtrat wird mit Aoeton verdünnt. Hierbei fallen die rohen Diumyoine aus» die getrocknet und ansohliessend durch SäulenChromatographie an Sephadex, Chromatographie an Kieselsäuregel und Oegenstromverteilung gereinigt werden· Man kann auch die Verbindungen durch Chromatographie an Sephadex, Chromatographie an Kieselsäuregel und 7er-To obtain the antibiotics of the diuraycin group, the aqueous Suspension preferably extracted with butanol at p ^ fe. Here the umbrinomycins go into the sutanol phase, while the Diumyoins remain in the aqueous solution. The aqueous solution is separated from the organic solution and the butanol solution is processed separately for umbrinomycins. The watery Solution is adjusted to Pg 3 with concentrated hydrochloric acid and extracted with water-saturated butanol. You will butanol solution extracted back with water at Pg 7> and the aqueous extracts are evaporated aur Trookene under reduced pressure. Of the The residue is taken up in methanol and the material which is insoluble in methanol is filtered off. The filtrate is diluted with Aoeton. Here, the raw diumyoine precipitate, the dried and followed by column chromatography on Sephadex, The compounds can also be purified by chromatography on Sephadex, chromatography on silica gel and 7er-
(kristalline Oelluloee)/ teilungsohromatographle an Avieel/reinigen·*zur Aurtrennung des (Crystalline Oelluloee) / Teilungsohromatographle to Avieel / clean · * to separate the Diumyolnkomplexes in Dlumyoin A und Diumycin B kann die Gegenstromverteilung oder die Yerteilungspapierohromatographie verwendet werden. . · - .Diumyolnkomplexes in Dlumyoin A and Diumycin B, countercurrent distribution or distribution paper chromatography can be used. . · -.
ist ein Gemisch aus mindestens zwei Antibiotika, nämlich Umbrinomyoin A und Umbrinomycin B. Diese Antibiotika undis a mixture of at least two antibiotics, namely umbrinomyoin A and umbrinomycin B. These antibiotics and
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ihre Bämtllohen Bestandteile haben ein breites Wirkungesptktru» gegenüber gramposi ti von Bakterien, Hefen und Pilsen. Beim Röhrohentest mit zweifacher Verdünnung unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Umbrinomyoinmaterials hat das Produkt folgende Mindesthemmkonzentration:their Bämtllohen components have a broad spectrum of effects » against gramposi ti of bacteria, yeast and pilsen. In the tube test with 2-fold dilution using the in Example 5 obtained umbrinomyoin material, the product has the following Minimum inhibitory concentration:
JT /mlJT / ml
Die einaelnen Bestandteile Umbrinomyoin A und Umbrlnomyoin B besitsen das gleiche qualitative antimikrobielle Spektrum.The constituents of umbrinomyoin A and umbrinomyoin B possess the same qualitative antimicrobial spectrum.
Umbrinoayoin und seine antibiotisohen Bestandteile kttnnen in Forschungs- und Krankenhauslaboratorien lur Isolierung gramnegativer Bakterien aus Bodenproben oder aus Abstrichen oder aus KOrperexudaten verwendet werden, in denen gemisohte Populationen von grampoeitiven und grasmegativen Bakterien vorliegen« Weiterhin können Umbrinomycin und seine antibiotischen Bestandteile zur Desinfektion von Laboratoriumsgerät·!! verwendet werden, die nit Staphvloooous infiaiert sind, insbesondere wenn die Geräte durch übliche Desinfektion gesohädigt werden können.Umbrinoayoin and its antibiotic components can be found in Research and hospital laboratories for the isolation of Gram-negative bacteria from soil samples or from smears or from Body exudates are used in which mixed populations of gram-positive and grass-negative bacteria. «Furthermore, umbrinomycin and its antibiotic components for the disinfection of laboratory equipment · !! used that nit staphvloooous are infed, especially if the devices are can be damaged by normal disinfection.
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Umbrinomycin, Umbrinomycin A und Umbrincmycin B sind Alkohole, die mit Säuren Ester bilden. Diese.Sster können durch Umsetzung der Umbrinomycine mit einem Aoylhälogenid oder Säureanhydrid in Gegenwart einer Base« wie Pyridin, hergestellt werden. Sa die Umbrinomycine drei acylierbare Hydroxylgruppen im Molekül enthalten, können sie, je nach dem Mengenverhältnis des Aoylierungsmittels zum Umbrinomyoin, Mono-, Di- und Triester bilden. Bei Verwendung von überschüssigem Acylierungemittel bildet sich der Triester.Umbrinomycin, Umbrinomycin A and Umbrincmycin B are alcohols, which form esters with acids. These.Sster can by reacting the umbrinomycins with an aoyl halide or acid anhydride in Presence of a base such as pyridine. Sa the Umbrinomycins contain three acylatable hydroxyl groups in the molecule, they can, depending on the ratio of the aoylating agent to the umbrinomyoin, form mono-, di- and tri-esters. at Use of excess acylating agent forms the Trieste.
Es kann zwar jedes Aeyllerungsmittel verwendet werden, die bevorzugten Acylierungsmittel aind jedoch die Säureanhydride und Säurechloride von Kohlenwasserstoffcarbonsäuren mit weniger als 12 Kohlenstoffatomen, z.B. die niederen aliphatischen Fettsäuren, wie Essigsäure und Propionsäure, die niederen olefinisch ungesättigten aliphatischen Fettsäuren, die monocyclischen aromatischen Carbonsäuren, wie Benzoesäure, die durch einen monocyolischen aromatischen Rest substituierten niederen aliphatischen Carbonsäuren, wie Phenylessigsäure, die Cjcloalkanoarboneäurea und die Cyoloalkencarbonsäuren.While any alkylating agent can be used, the preferred acylating agents are acid anhydrides and Acid chlorides of hydrocarbon carboxylic acids with less than 12 carbon atoms, e.g. the lower aliphatic fatty acids, such as acetic acid and propionic acid, the lower olefinically unsaturated aliphatic fatty acids, the monocyclic aromatic carboxylic acids, such as benzoic acid, the lower aliphatic acids substituted by a monocyolic aromatic radical Carboxylic acids such as phenylacetic acid, cycloalkanoarboxylic acid and the cyanoalkenecarboxylic acids.
Kristallines Umbrinomycin A hat folgende physikalische und ohemisahen Eigenschaften:Crystalline Umbrinomycin A has the following physical and ohemical properties:
Farbe: RotRed color
(Differenz)(Difference)
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BAD ORIGINAU 109823/0179
BAD ORIGINAU
Löslichkeit: Löslich in Äther, Methanol und Benzol,Solubility: Soluble in ether, methanol and benzene,
unlöslich in Hexan.insoluble in hexane.
Ultraviolettspektrum: Die UV«-Absorptionsmaxima von kristallinem Umbrinomycin A in Äthanol sind ιUltraviolet spectrum: The UV «absorption maxima of crystalline Umbrinomycin A in ethanol are ι
λ max (ϊψ) 242.5 504 476 λ max (ϊψ ) 242.5 504 476
Ultrarotspektrum: Das Ifr-Absorptionsspektrum vonUltrared spectrum: The Ifr absorption spectrum of
Umbrinomycin A suspendiert in Paraffinöl (Hujol) ist in Figur 1 angegeben»Umbrinomycin A suspended in paraffin oil (Hujol) is indicated in Figure 1 »
Kristallines Umbrinomycin B hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:Crystalline Umbrinomycin B has the following physical and chemical properties:
Farbe: KastanienbraunColor: maroon
Schmelzpunkt: 192'- 193,50CMelting point: 192'- 193.5 0 C
Summenformel G22H2408; ber·: c 63,53 1>\ H 5,91 ^J 0 30,56 $> Molecular formula G 2 2 H 24 0 8 ; ber : c 63.53 1> \ H 5.91 ^ J 0 $ 30.56>
(Differenz)(Difference)
Löslichkeit; Die gleichen LöslichkeitaeigenachaftenSolubility; The same solubility properties
wie Umbrinomycin A. Ultraviolettspektrums Die UV-Abs.orptionsmaxima von krietalli-like umbrinomycin A. Ultraviolet spectrum The UV absorption maxima of crystalline
nem Umbrinomyoin B in Äthanol sind: A max (ιψ) £ nem umbrinomyoin B in ethanol are: A max (ιψ) £
243 16 5<X243 16 5 <X
304 19 000304 19,000
476 5 500476 5,500
Ultrarotspektrumj Dae IR-Abeorptionsspektrum iron Umbrino-Infrared spectrum j Dae IR absorption spectrum iron Umbrino-
myoin B suspendiert in P&raffinölmyoin B suspended in P & raffin oil
(Nujöl) ist in Figur 2 angegeben. 1098 2 3/0179 (Nujöl) is indicated in Figure 2. 1098 2 3/0179
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
Diumycin ist ein Gemisch avis mindestens awei Antibiotika, nämlich Diumycin A und Diumycin B. Dieses Gemisch, und seine Bestandteile eind Antibiotika mit Aktivität gegen grampositive Bakterien und säurebeständige Bakterien, Im Röhrehentest mit av/eifacher Verdünnung unter Verwendung do« in Baispiel 14 erhaltenen Materials hat das Produkt folgende Kindeatheraiafconaentrationen:Diumycin is a mixture of at least two antibiotics, namely Diumycin A and Diumycin B. This mixture and its components and antibiotics with activity against gram-positive bacteria and acid-resistant bacteria, in the tube test with av / single dilution using the material obtained in Example 14 the product has the following Kindeatheraiafconaentrationen:
Kindeathemnikonzentraticm MikroorganiamuBChildhood Concentraticm Microorganisms
Staphylococcus aureua 209 P . 0„06Staphylococcus aureua 209 P. 0 "06
Streptococcus pyogenes ΰ 205 K0,002 Bacillus subtilis SO 3777 0,14Streptococcus pyogenes ΰ 205 K 0.002 Bacillus subtilis SO 3777 0.14
Klebsiella pneumoniae SO 1565 >25,OKlebsiella pneumoniae SO 1565> 25, O
Sarcina lutea SC 2495 >25,0Sarcina lutea SC 2495 > 25.0
Sscherichia coil SO 2927" >25,OSscherichia coil SO 2927 " > 25, O
Pseudomonas aei*uginosa SC 3840· ^25»0Pseudomonas aei * uginosa SC 3840 · ^ 25 »0
Candida albicans SO 1539 ■ >25,OCandida albicans SO 1539 ■> 25, O
Salmonella schottmuelleri SO 3850 >25,O Mycobacterium tuberculosis BOG 3?0Salmonella schottmuelleri SO 3850> 25, O Mycobacterium tuberculosis BOG 3 ? 0
Die einzelnen Bestandteile !Diumycin A und Diumycin B besitzen das gleiche qualitative antibakterielle Spektrum.The individual components! Diumycin A and Diumycin B possess the same qualitative antibacterial spectrum.
Diumycin, Diumycin A und Diumycin B sind Säuren, die mit Basen Salze bilden» Diese Salze können durch Umsetzung dee Diumycin« mit einer Base, ζ«β* einer anorganischen Base, wie AmmoniumhydroXyd, einem Alkalimetallhydroxid, wie Natriutnhydroxyd öder Kaliumhydroxyd, einem Erdalkalimetallhydroxyd, vie Calciumhydroxyd, Magnesiumhydroxyd oder Bariumhydroxyd, oder einer organischen Base, wie einem primären, sekundären oder tertiären Diumycin, Diumycin A and Diumycin B are acids that interact with bases Forming salts "These salts can be converted into diumycin" with a base, ζ «β * an inorganic base, such as ammonium hydroxide, an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide or Potassium hydroxide, an alkaline earth metal hydroxide, vie calcium hydroxide, Magnesium hydroxide or barium hydroxide, or an organic base such as a primary, secondary or tertiary
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Amin, e0B„ einem niedrigen Monoalkylamin, wie Methylamin, einem niedrigen. Pialkylamin, wie Diäthylaminr einem niedrigen Trialkylaminf wie £riäthylamin,oder einem niedrigen Hydroxyalkylamitir wie Ätlianolarain? hergestellt werden.Amine, e 0 B “a lower monoalkylamine, such as methylamine, a lower one. Pialkylamin as diethylamine r low as £ Trialkylaminf riäthylamin, or a low Hydroxyalkylamiti r as Ätlianolarain? getting produced.
Die Iliumyoine eind phosphorhaltige Atitibio1;ifcaf die bei der Säurehydrolyse kein ö-Deeoxyglucosamin (Öhinovooamin) bilden.The iliumyoins and phosphorus-containing atitibio1; ifca f which do not form any δ-deeoxyglucosamine (ohinovooamine) on acid hydrolysis.
Diumycin A hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften: Farbes " - farblos t weissDiumycin A has the following physical and chemical properties: Color "- colorless t white
Schmelzpunkt fler Säuret etwa 1800C unter ZersetzungMelting point fler Säuret about 180 0 C with decomposition
Elementaranalyse des Hydrats
der freien Säure {angenäherteElemental analysis of the hydrate
the free acid {approximated
Werte.)! G 46S5 fa H 7,2 #; Ii 4S5 $l P 2?0 fy 0 39|8 $ Values.)! G 46 S 5 fa H 7.2 #; Ii 4 S 5 $ l P 2 ? 0 fy 0 39 | 8 $
(Differenz)(Difference)
Spezifischer optischer /"Ot/^ - 8f7° (Kaliumsalz in Drehwert: Wasser)Specific optical / "Ot / ^ - 8 f 7 ° (potassium salt in rotation value: water)
Molekulargewicht: 1800 + 10 ^ in einer Mischung ausMolecular weight: 1800 + 10 ^ in a mixture of
10 j6 eines 0?2 molaren Natriumchlorid und 0f02 molaren Phoephatpuffers vom Pjj 6,5 und 90 $>' itthanol, bestimmt mit einer analytischen Ultrazentrifuge. 10 j6 one 0 ? 2 molar sodium chloride and 0 f 02 molar Phoephatpuffers PJJ from 6.5 to 90 $>'itthanol determined with an analytical ultracentrifuge.
Löslichkeit: Löslich in Wasser, niedrigenSolubility: Soluble in water, low
aliphatischen Alkoholen, Pyridin und Essigsäure; kaum oder nicht - löslich in Aceton, Chloroform und Benzol.aliphatic alcohols, pyridine and acetic acid; hardly or not - soluble in acetone, chloroform and benzene.
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Ultravi olettSpektrum jUltraviolet spectrum j
UltrarotSpektrum: Diumycin A als Kaliumsalz in Wasser
hat ein TJV-Absorptlonsmaxiraum bei
257 mu (Bä£m 118)
Bas IR-AbsorptionsSpektrum von
Diumycin A als freie Säure im Kaliumbromid~Pressling
ist in Figur 3 und das des KaliumsalzöB als Kaliumbromidpressling
ist in Figur 4 wiedergegeben.Ultra-red spectrum: Diumycin A as the potassium salt in water has a TJV absorption maximum at 257 mu (Bä £ m 118)
The IR absorption spectrum of diumycin A as the free acid in the potassium bromide pellet is shown in FIG. 3 and that of the potassium salt as the potassium bromide pellet is shown in FIG.
Neutralisati onsäquivalent durch potentiometrisohe Titration;Neutralization equivalent by potentiometric titration;
540540
Verteilungskoeffizient in n-Propanol. n-Butanol und 0,5 n~Ammoniak (2:3:4 Volumteile):Partition coefficient in n-propanol. n-butanol and 0.5 n ~ ammonia (2: 3: 4 parts by volume):
0,19.0.19.
Diumycin B hat folgende physikalische und chemische EigenschaftentDiumycin B has the following physical and chemical properties
Farbe:
Schmelzpunkt: Farblos, weissColour:
Melting point: colorless, white
etwa 1700C unter Zersetzungabout 170 ° C. with decomposition
Blementaranalyse der freien Säure als Hydrat (Näherungswert): C 45f9 $>\ H 6,6 #j N 4,6 #; P 1,8 # 0 41,1 #Elemental analysis of the free acid as hydrate (approximate value): C 45 f 9 $> \ H 6.6 #j N 4.6 #; P 1.8 # 0 41.1 #
(Differenz)(Difference)
H20-Hydratwaßser: Molekulargewicht:H 2 0 hydrate water: Molecular weight:
löslichkeit:solubility:
7,6 $ 1850 + 10 ^ im gleiohen Lösungsmittel wie für Diumycin A beschrieben; in einer analytischen Ultrazentrifuge7.6 $ 1850 + 10 ^ in the same solvent as described for diumycin A; in an analytical ultracentrifuge
bestimmte Die gleichen Löslichkeiteeigensohaften wie Diumycin A«determined the same solubility properties like diumycin A «
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Ultraviolettspektrum: Diumycin B hat kein UV-Absorptiöns-Ultraviolet spectrum: Diumycin B has no UV absorption
maximum zwischen 220 und 300 my.maximum between 220 and 300 my.
Ultrarotspektrum: Das IH-Absorptionsspektrum von DiumycinUltrared spectrum: The IH absorption spectrum of diumycin
B als freie Säure im Kaliumbromid-Pressling ist in figur 5 und das des Kaliumsal.ses im Kaliumbromid^Presaling ist in Figur 6 angegeben«B as free acid in the potassium bromide pellet is in Figure 5 and that of the potassium salt in potassium bromide ^ presaling is in Figure 6 indicated «
Verteilungskoeffizient in n-Propanol, n-Butanol, 0,5 η Ammoniak ( 2 s 3 5 4 Volumteile}: 0,39Partition coefficient in n-propanol, n-butanol, 0.5 η ammonia (2 s 3 5 4 parts by volume}: 0.39
Der filterkuchen der Fermentation von Streptomyces ümbrinus sowie jedes der hieraus isolierten Antibiotika,, d,h. Umbrinomyein, Umbrinomyoin A2 Umbrinomyein B, Diumycin s Diumycin A und Diumycin B? besitzt v/achstumsfordernde Eigeneohaften t wenn man ihre landwirtaohaftliehen Hutztieren, wie Geflügel und Schweinen« verfüttert ο Zu diesem Zwaok können diese Antibiotika den fieren zusammen .mit dem S*utter in einer Konzentration im Bereioh von etwa 0,5 bis etwa 100 g/Tonne Putter vermischt werden·The filter cake of the fermentation of Streptomyces ümbrinus as well as each of the antibiotics isolated from it, d, h. Umbrinomyein, Umbrinomyoin A 2 Umbrinomyein B, Diumycin s Diumycin A and Diumycin B ? has growth-demanding personal liability t if you feed your farm animals such as poultry and pigs Putter to be mixed
Die Beispiele erläutern die Erfindung«The examples explain the invention
lomatenmark-Hafermehl -AgarschrMgen werden mit Streptomyoes ümbrinus A2GC 15 972 beimpft» Danach werden sie 7 bis 10 Tage inkubiert und hierauf in 125 ml eines wässrigen Sojabohnenmehl-Nährmediums Uberimpft, das in 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben enthalten ist· Das Kulturmedium hat folgende Zusammensetzung:The tomato paste-oatmeal-agar paste is made with Streptomyoes ümbrinus A2GC 15 972 »After that they are inoculated for 7 to 10 days incubated and then in 125 ml of an aqueous soybean meal nutrient medium Inoculated in 500 ml Erlenmeyer flasks The culture medium has the following composition:
1 0 9823 / 0.1 7 9
BAD ORIGINAL1 0 9823 / 0.1 7 9
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Lösung10 ral of a 0.05 #
solution
Das Nährmedium wird 20 Minuten bei 1210C im Autoklaven sterilisiert. Danach werden die Erlenmeyer-Kolben 72 bis 96 Stunden auf einer Drehschttttelmaschine bei 250C inkubiert.The nutrient medium is sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the Erlenmeyer flask is incubated for 72 to 96 hours on a Drehschttttelmaschine at 25 0 C.
Aus den Erlenmeyer-Kolben wird eine 5 $-ige Übertragung auf 500 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt,, die 135 ml des gleichen Kulturmediums enthalten, jedoch unter Fortlassung des Agar. Die Kolben werden inkubiert und in gleicher Weise wie die ersten Kolben gesohüttelt. Proben werden nach 3, 5 und 7 Tagen entnommen. Die Proben werden mit 0,2 η Salzsäure auf pH 3 eingestellt, das Myoel wird abgeschleudert und mit dem gleichen Volumen Methanol extrahiert wie der Überstand, Der Methanolextrakt wird papierchromatographisch untersucht. Das Chromatogramm wird an Whatman 4 Papier durchgeführt, und die Ohromatogramme werden mit folgendem Löeungsmittelsystem entwickelt: n-Butanol, Wasser, Essigsäure, 4:5:3. (Volumina). Die obere Phase dieses Lösungsraittelsyeteme wird ale Lösungsmittel verwendet. Xn diesem System hat das rohe antibiotisohe Umbrinomycinmaterial einen Rp-Wert von etwa 0,9, während Diumycin einen R^-Wert von etwa 0,5 aufweist«, Daß -aiitibiotieciie Ifo-be-rici) virci dvxOh Biosmto«A $ 5 transfer is made from the Erlenmeyer flasks to 500 ml Erlenmeyer flasks which contain 135 ml of the same culture medium, but omitting the agar. The flasks are incubated and shaken in the same way as the first flasks. Samples are taken after 3, 5 and 7 days. The samples are adjusted to p H 3 with 0.2 η hydrochloric acid, the Myoel is spun off and extracted with the same volume of methanol as the supernatant The methanol extract is analyzed by paper chromatography. The chromatogram is performed on Whatman 4 paper, and the ear chromatograms are developed with the following solvent system: n-butanol, water, acetic acid, 4: 5: 3. (Volumes). The upper phase of this solvent system is used as a solvent. In this system, the crude umbrinomycin antibiotic material has an Rp value of about 0.9, while diumycin has an R ^ value of about 0.5 "That -aiitibiotieciie Ifo-be-rici) virci dvxOh Biosmto"
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graphie gegenüber Staphylococcus aureus 209 P festgestellt.graph against Staphylococcus aureus 209 P.
Ein 4i5 Liter Ansatz von Streptomyoes umbrinuß ATOC 15972 wird folgendermassen vergoren:A 4i5 liter batch of Streptomyoes umbilical ATOC 15972 is made fermented as follows:
(A) Herstellung des Inoculums(A) Production of the inoculum
Inoculumciuelle: Kultur von Streptomyaee umbrinus AICC 15972, konserviert durch Lyophilisierung in Milchs Nährmedimn Inoculumciuelle: culture of Streptomyaee umbrinus AICC 15972, preserved by lyophilization in milk culture medium
Lösungml of a 0 * 05 # igen
solution
Zwei 500 ml fassende Erlenmeyer-Koibenf die jeweils 125 ml des Nährmediums enthalten, werden 96 Stunden bei 250C auf der Dreh* schüttelmaschine inkubiert« 250 ml der erhaltenen Gärbrühe werden zu 4i5 Liter des vorgenannten Kährmediums.. jedoch unter Fortlassung von Agar in einen 7 Liter fassenden Stutzen gegeben, und 168 Stunden in einem Wasserbad bei 250C unter Rühren inkubiert. Dem Ansatz werden etwa 0,005 Ψ eines Sohaumbrechers einverleibt» Während der.Inkubation wird die Gärbrühe in einer Menge von 2 Liter Luft/Minute belüftet und mit 500 U/Hinc gerührt. Das erhaltene Material wird mit Salzsäure auf pH 3,0 angesäuert und ..dasTwo 500-ml Erlenmeyer Koiben f * shaker each 125 ml of the nutrient medium contained 96 hours at 25 0 C on the rotary incubated "250 ml of the fermentation broth obtained are to 4I5 liter of the aforementioned Kährmediums .. However, with the omission of agar in given a 7 liter nozzle, and incubated 168 hours in a water bath at 25 0 C with stirring. About 0.005 Ψ of a shoe breaker is incorporated into the batch. During the incubation, the fermentation broth is aerated at an amount of 2 liters of air / minute and stirred at 500 U / Hinc. The material obtained is acidified with hydrochloric acid to p H 3.0 and ..das
10 98 2 3^0479
BAD ORIGINAL ; '10 98 2 3 ^ 0479
BATH ORIGINAL ; '
Myoel wird abfiltriert·Myoel is filtered off
Bin 30 Liter Ansäts von Streptomyees umbrinus wird in einem 38 Liter fassenden lOrraenter aus korrosionsbeständigem Stahl unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Mährmection und unter den angegebenen Arbeitsbedingungen fermentiert:Am 30 liters of Streptomyees umbrinus seeds in one 38 liter lorraenter made of corrosion-resistant steel using the method described below and fermented under the specified working conditions:
It StufeIt stage
Inoculum: Kultur von Streptomycee umbrinus ATCO 15972? konserviert durch Lyephilisierung in Milch und auf einem Somatenmark-Hafermehl-Sehrägagar gewachsen.Inoculum: culture of Streptomycee umbrinus ATCO 15972 ? Preserved by lyephilisation in milk and grown on a somaten pulp-oatmeal very agar.
HeJirraediumHeJirraedium
Sojjabohnenniehl (Steley's 4S) 1,5 1° entwässertes Kartoffelpüree 1*5 #Soy bean niehl (Steley's 4S) 1.5 1 ° dehydrated mashed potatoes 1 * 5 #
ßluaose 5?O $> ßluaose 5? O $>
CoCl2.2H2O 0,0005-JtCoCl 2 .2H 2 O 0.0005-Jt
OaCO5 lf0 1> OaCO 5 l f 0 1>
Agar 0,25 #♦Agar 0.25 # ♦
125 ml dieses Nährmediums in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben werden 96 Stunden auf einer Drehschüttelmaaohine bei 25°C inkubiert.Put 125 ml of this nutrient medium in a 500 ml Erlenmeyer flask Incubated for 96 hours on a rotary shaker at 25 ° C.
II. StufeII stage
Inoculumquelle: 125 ml Gärbrühe dar ersten Stufe Nährmedium: Das gleiche wie in Stufe 1· 1000 ml des Nährmediuma und Inoculums in einem 4000 ml fassenden Kolben werden 48 StundenInoculum source: 125 ml fermentation broth for the first stage Nutrient medium: the same as in stage 1 x 1000 ml of the nutrient mediuma and Inoculums in a 4000 ml flask are 48 hours
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BAD ORiatNAL109823/0179
BAD ORiatNAL
~ 17 -~ 17 -
bei 250C auf der Iteehechüttelmaschine inkubiert·incubated at 25 0 C on the Itehe shaking machine
III. StufeIII. step
inkubiert. Während der Inkubation wird die Gärbrühe in einer Menge von 1 Fuss/Minute oberflächlicher Luftgesohwindigkeit belüftet und während der ersten Stunden gerührt und danach in einer Geschwindigkeit von 4 Puβe/Minute oberflächlicher Luftgeschwindigkeit belüftet und gerührt.incubated. During the incubation, the fermentation broth becomes in a lot ventilated at 1 foot / minute superficial air velocity and stirred for the first hours and then aerated and stirred at a rate of 4 puffs / minute superficial air speed.
Der in Beispiel 2 erhaltene feuohte «yoelkuohen, der etwa 4 i> filterhilfe enthält, wird zweimal mit Z Gewiohteteilen Methanol extrahiert und jeweils abfiltriert. Das vereinigte Piltrat wird auf Pg 6 bis 8 eingestellt und unter verminderten Druck eingedampft· £· hinterbleibt eine wässrige Suspension, die auf Pg Tf0 eingestellt und dreimal mit jeweils 0,3 Yoluateilen ChIorοform extrahiert wird· Nach jeder Extraktion wird der pg-Wert bestimmtThe feuohte "obtained in Example 2 yoelkuohen, which contains about 4 i> filter aid, extracted twice with Z Gewiohteteilen methanol and in each case filtered off. The combined piltrate is adjusted to Pg 6 to 8 and evaporated under reduced pressure · £ · an aqueous suspension remains which is adjusted to Pg T f 0 and extracted three times with 0.3 Yoluateilen ChIorοform · After each extraction the pg value certainly
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und, falls erforderlioh? erneut auf pjj 7?0 eingestellt. Die vereinigten Chloroformextrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und ansehliessend unter vermindertem Druck eingedampft» Der erhaltene schwere Syrup wird mit dem 8 bis 10-faohen Volumen Aceton versetzt, eine Stunde geschüttelt und dann filtriert. Der überstand wird unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingedampft und das erhaltene Konzentrat mit dem 10-fachen Volumen n-Hexan versetzt. Hierbei fällt rohse Umbrinoaycin aus.and, if necessary ? again set to pjj 7? 0. The combined chloroform extracts are dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated under reduced pressure. 8 to 10 times the volume of acetone is added to the heavy syrup, shaken for one hour and then filtered. The supernatant is evaporated to a small volume under reduced pressure and the concentrate obtained is admixed with 10 times the volume of n-hexane. Raw Umbrinoaycin precipitates here.
Die weitere Reinigung des rohen Umbrlnomycins wird durch DünnsohiohtChromatographie der in Hexan unlöslichen Fällung an Kieselsäuregel H bewirkt. Das Lösungsmlttelsystera besteht aus 10 1° Chloroform in Äthylaoetat. Die lachsfarbene Bande wird aus dem Kieselsäuregel mit Äthylaoetat eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft, über Natriumsulfat getrocknet und erneut mit dem gleichen Lösungemittelsystem an Kieselsäuregel H ohromatographiert. Die laohsfarbene Bande wird eluiert und das Sluat zur Trockene eingedampft. Ss werden 118 mg Produkt erhalten.The further purification of the crude umbromycin is effected by thin-solvent chromatography of the precipitate, which is insoluble in hexane, on silica gel H. The solvent system consists of 10 1 ° chloroform in ethyl acetate. The salmon-colored band is eluted from the silica gel with ethyl acetate. The eluate is evaporated under reduced pressure, dried over sodium sulfate and re-chromatographed on silica gel using the same solvent system. The tan-colored band is eluted and the sluate is evaporated to dryness. 118 mg of product are obtained.
118 ag des in Beispiel. 4 erhaltenen Produktes «erden auf eine Qhromatographiersäule gegeben, die mit 20 g säuregewaeohenea Aluminiumoxyd gefüllt ist. Die Chromatograph!ersäule wird mit Hexan gewaaonen» Hierbei wird inaktives Material abgetrennt. Da- · naoh wird da· Material mit einem Gemisch aus A'thylaoetat, Methanol und Essigsäure Ib Volumverhältnis 94 ι 3 < 1 eluiert. Die dunkelrote Bande wird aufgefangen und zur Trookene eingedampft» Aus·- beute 70 mg gereinigtes Umbrinomyoin,118 ag des in example. 4 obtained product «ground to a Chromatography column filled with 20 g acid-weighted a Aluminum oxide is filled. The Chromatograph! Er column is with Hexane won »This separates inactive material. There- · The material is then mixed with a mixture of ethyl acetate and methanol and acetic acid Ib volume ratio 94 ι 3 <1 eluted. The dark red band is caught and evaporated to Trookene »Aus · - loot 70 mg of purified umbrinomyoin,
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25 mg des gemäße Beispiel 5 erhaltenen Materials werden erneut an säure gov/aschenem Aluminiumoxyd (Merck) der Dtinnschichtchromatographie mit 50 ?£ ühloroform enthaltendem Äthylacetat unterworfen. Das Eluat wird eingedampft« Bs hinterbleiben 21 mg einee kastanienbraunen Pulvers* Nach Umkristallisation aus Benzol25 mg of the material obtained according to Example 5 are again on acidic aluminum oxide (Merck) by tin-layer chromatography with ethyl acetate containing 50% chloroform subject. The eluate is evaporated. 21 mg remain a chestnut brown powder * After recrystallization from benzene
werden 14,4 mg gereinigtes Umbrinomycin vom IFp* 105 bis HO0C C9HcOH14.4 mg of purified umbrinomycin from IFp * 105 to HO 0 C C 9 HcOH
^ C9HcOH
erhalten, A m^ 302 ψ (£ 20 200} ? 4T2 mu (<f 5600)..
O22H24O8 (4-16,4·)ϊ her.; C 63,45? K 5.81 #.^ C 9 HcOH
obtained, A m ^ 302 ψ (£ 20 200}? 4T2 mu (<f 5600) .. O 22 H 24 O 8 (4-16.4 ·) ϊ her .; C 63.45? K 5.81 #.
gef.: C 65,22? H 5,98 p. found: C 65.22? H 5.98 p.
Bas gemäös Beispiel 6 erhaltene gereinigte Material ist ein Gemisch von Ümbrinomycin A und Urabrinomycin B. The purified material obtained according to Example 6 is a mixture of Ümbrinomycin A and urabrinomycin B.
Isolierung von Umbrinomyoin A und IJmbrinomycin B Das gemäBS Beispiel 6 erhaltene Gemisch der Antibiotika wird durch Säulenchromatographie an eauregewaschenem Aluminiumoxyd (Aktivität lV)durch stufenloses Auswaschen (gradient elution chromatography) mit folgenden Lösungsmitteln getrennt» Beneol, Chloroform und Äthylacetat, ümbrinomyein A wird zuerst aus der Chromatographiersäule eluiert und aus Benzol umkristallisierti Fp. 113 bis 1170Oo Nach .weiterer Reinigung durch Dünnschicht*- Chromatographie an säuregewaschenem Aluminiumoxyd mit einem Gemisch gleicher Volumina Chloroform und A'thylacetat als Entwick- "· lungslösungsmittöl und anschlieesender ümkristallisation aus Benzol wird reines Ümbrinoiayoin A in Form tiefroter Kristalle erhaltene Isolation of Umbrinomyoin A and Ijmbrinomycin B The mixture of antibiotics obtained according to Example 6 is separated by column chromatography on acid-washed aluminum oxide (activity IV) by stepless washing (gradient elution chromatography) with the following solvents: Beneol, chloroform and ethyl acetate, umbrinomyein A is separated first the chromatography column and eluted to 117 0 Oo After .weiterer cleaning by thin * from benzene umkristallisierti mp. 113 - chromatography on acid-washed aluminum oxide with a mixture of equal volumes of chloroform and A'thylacetat as development "· development of solvent-oil and anschlieesender ümkristallisation from benzene pure Ümbrinoiayoin A obtained in the form of deep red crystals
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Umbrinomycin B wird anschliessend aus der Chroiaatographiersäule eluiert« Durch fraktionierte Kristallisation aus Benzol werden dunkelkastanienbraune Kristalle dee reinen Uiabrinomycin B erhalten. Umbrinomycin B is then extracted from the chromatography column eluted «by fractional crystallization from benzene dark maroon crystals of pure uiabrinomycin B were obtained.
Acylierung von Umbrinomycin B Ac ylation of Umbri nomycin B
27 mg Umbrinomycin B werden in 1 ml Pyridin und 0,5 ml Esßigsäureanhydrid gelöst, und das Gemisch wird über Nacht stehengelassen. Danach wird die erhaltene Lösung eingedampft„ der Rüok~ stand mit IQ #-iger wässriger liatriurabicarbonatlösung gewaschen und ansohliessend mit Chloroform extrahiert«. Der CIrloroformextrakt wird eingedampft und das Produkt durch Dünnschicht-» Chromatographie an neutralem Aluminiumoxyd der Aktivität 4 ßiit Chloroform als Entwioklungslösungsmittel gereinigt. !Die entsprechende orangefarbene Bande wird mit Ithylacetat eluiert und das Produkt aus Methanol umkristalüsiert* Das Triacetylderivat des Umbrinomycin B fällt in orangefarbenen Kristallen vom 3?p.27 mg of umbrinomycin B are dissolved in 1 ml of pyridine and 0.5 ml of acetic anhydride dissolved, and the mixture is left to stand overnight. The solution obtained is then evaporated Stand washed with IQ # aqueous liatric bicarbonate solution and then extracted with chloroform «. The chloroform extract is evaporated and the product by thin layer »chromatography on neutral aluminum oxide of activity 4 ßiit Purified chloroform as a developing solvent. !The corresponding orange band is eluted with ethyl acetate and the product recrystallizes from methanol * The triacetyl derivative of umbrinomycin B falls in orange crystals from 3? p.
125 bis 1260C au. λ£ΐχ5°Η 2^ ψ (& l0 80°)ϊ 302 ψ (f 22 400)? 458 mu ( £ 4 100).125 to 126 0 C au. λ £ ΐχ 5 ° Η 2 ^ ψ (& l0 80 °) ϊ 302 ψ (f 22 400)? 458 mu (£ 4,100).
Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 8, jedoch unter Verwendung äquivalenter Mengen anderer Aoylierungsmittel, wie Propionsäureanhydrid oder Benzoylchlorid anstelle von EssigsäureanhydridP werden die entsprechenden Acylderivate von ümbrinomyoin B erhalten. In the same way as in Example 8, but using equivalent amounts of other aoylating agents, such as propionic anhydride or benzoyl chloride instead of acetic anhydride P , the corresponding acyl derivatives of umbrinomyoin B are obtained.
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BeiBPieX 9BeiBPieX 9
Gemäss Beispiel 8 wird Uiabrinomyein A acetyliert. Das orangefarbene Triacetylderivat schmilzt bei 169,5 bis 170,5°G» According to Example 8, Uiabrinomyein A is acetylated. The orange-colored triacetyl derivative melts at 169.5 to 170.5 ° G »
'X c2H5OIi 254 mu (£11 000)? 302 mu (£ 21 200); max 'X c 2 H 5 OIi 254 mu (£ 11,000)? 302 mu (£ 21,200); Max
4-54 mu (f 3 900).4-54 mu (f 3 900).
Der pjj-Wert der vereinigten Görbrtihen aus den 3 bis 30 Liter Fermentationen dee Beispiels 3 wird mit konzentrierter Salzsäure auf 3 eingestellt. Danach werden 1,5 kg Diatomeenerde als Filtrierhilfe zugegeben, und das unlösliche Material wird abfiltriert. Es werden 11,0 kg Myoelkuchen erhalten.The pjj value of the combined Görbrtihen from the 3 to 30 liters Fermentations of Example 3 are carried out with concentrated hydrochloric acid set to 3. Thereafter, 1.5 kg of diatomaceous earth are added as a filter aid and the insoluble material is filtered off. 11.0 kg of myoel cake are obtained.
11,0 kg des in Beispiel 10 erhaltenen Mycelkuohens werden zweimal jeweils 30 Hinuten mit jeweils 30 Liter Methanol extrahiert. Naoh jeder Extraktion wird die Masse filtriert. Die vereinigten Methanolextrakte werden auf pH 6 eingestellt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2,5 Liter eingedampft. Die erhaltene wässrige Suspension wird auf p„ β eingestellt und viermal mit jeweils 500 ml Butanol extrahiert. Hierdurch werden die Umbrinomyoine abgetrennt, während die Diumyoine in der wässrigen Phase verbleiben« Danach wird die wässrige Phase mit 2 η Salzsäure auf pH 3 eingestellt und dreiiritl alt jeweils 1 Liter Buta~ nol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte (3 Liter) werden dreimal mit jeweils 200 ml Wasser extrahiert, das während der Extraktion mit 2,5 η Katronlauge auf Pjj 7 eingestellt wird. Die11.0 kg of the mycelia obtained in Example 10 are extracted twice for 30 minutes each time with 30 liters of methanol each time. After each extraction the mass is filtered. The combined methanol extracts are adjusted to p H 6, and evaporated under reduced pressure to a volume of 2.5 liters. The aqueous suspension obtained is adjusted to p "β and extracted four times with 500 ml of butanol each time. Thereby, the Umbrinomyoine be separated while the Diumyoine in the aqueous phase remains "Thereafter the aqueous phase with hydrochloric acid to 2 η p H is adjusted 3, and 1 liter each dreiiritl old buta nol ~ extracted. The combined butanol extracts (3 liters) are extracted three times with 200 ml of water each time, which is adjusted to Pjj 7 with 2.5 η sodium hydroxide solution during the extraction. the
. 109823/JM 7 9.. 109823 / JM 7 9.
BAD ORlGtNALBAD ORlGtNAL
vereinigten wässrigen Extrakte werden gefriergetrocknet. Es hinterbleiben 22,9 g Rüokstand, der in 250 ml Methanol aufgenommen wird, Unlösliche Stoffe werden abfiltriert, das Filtrat wird eingedampft, Ee hint er bleiben 12,0 g rohes Antibiotikum als bräunlich roter amorpher Feststoff mit einem Diumyeingehalt von 5 bis 10 #.combined aqueous extracts are freeze-dried. It 22.9 g of residue remain, which is taken up in 250 ml of methanol. Insoluble substances are filtered off and the filtrate becomes evaporated, Ee behind he remain 12.0 g of raw antibiotic as brownish red amorphous solid with a diumyein content from 5 to 10 #.
2 g des in Beispiel 11 erhaltenen rohen Antibiotikums werden in 10 ml QfI η Ammoaiumbioarbona1;lösung gelöst und auf eine Chromatographiersäule (9Ox 3,2 cm) von Sephadex 75 gegeben, die mit dem gleichen Puffer behandelt wurde. Die Säule wird mit 0,1 η Ammoniumbioarbonatlösung entwickelt*, und 100 Fraktionen von jeweils 15 ml werden aufgefangen und an Hand der UV-Absorption bei 257 mu analysiert« Das Ausmass der Absorption bei 257 mu entspricht etwa dem Ausmaas der biologischen Aktivität. Die Hauptmenge des Antibiotikums befindet sich in den Fraktionen 25 bis 4Oo Diese Fraktionen werden gefriergetrocknet. Bs werden 0,85 g Produkt erhalten, das 15 bis 20 # Diumycin enthält.2 g of the crude antibiotic obtained in Example 11 are dissolved in 10 ml of QfI η ammonium bicarbonate solution and applied to a Sephadex 75 chromatography column (90 × 3.2 cm) which has been treated with the same buffer. The column is developed with 0.1 η ammonium bicarbonate solution * and 100 fractions of 15 ml each are collected and analyzed on the basis of the UV absorption at 257 μm. The extent of the absorption at 257 μm corresponds approximately to the extent of the biological activity. The bulk of the antibiotic is in fractions 25 to 40o. These fractions are freeze-dried. 0.85 g of product are obtained which contains 15 to 20 # diumycin.
Das in Beispiel 12 erhaltene rohe Antibiotikum wird weiter gereinigt duroh Chromatographie an mit Säure gewaschenem Kieselsäuregel (Korngrööse etwa 0,14 bis 0,07 mm)» Ο,θ g des rohen Antibiotikums, gelöst in 20 ml eines Gemisches aus 8 Volumteilen Propanol und 2 Volumteilen 2 η Ammoniaklösung werden auf eine Chromatographieraäule (33 x 2,5 om) von Kieselsäuregel gegeben« und die Kolonne wird entwickelt und mit dem gleichen Lösungsmit-The crude antibiotic obtained in Example 12 is further purified duroh chromatography on acid-washed silica gel (grain size about 0.14 to 0.07 mm) »Ο, θ g of the crude Antibiotic dissolved in 20 ml of a mixture of 8 parts by volume of propanol and 2 parts by volume of 2 η ammonia solution are applied to a Chromatography column (33 x 2.5 om) given by silica gel « and the column is developed and with the same solvent
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telgemiseh eluiert« Es werden Fraktionen von jeweils 15 ml aufgefangen» Die Fraktionen werden auf ihre UV-Absorption "bei 257 rau und die biologische Aktivität geprüft» Die Hauptmenge dee Antibiotikums befindet sich in den Fraktionen 65 bis 90. Die vereinigten, biologisch aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampfte Es hinterbleiben 152 mg eines hellgelblichen amorphen Produktes mit einem Diumyoingehalt von 80 bis 85 ^.telgemiseh eluted «Fractions of 15 ml each are collected» The fractions are based on their UV absorption " 257 rough and the biological activity checked »The main amount dee Antibiotic is in fractions 65 to 90. The combined, biologically active fractions are reduced under Pressure evaporated to dryness remain behind 152 mg of a light yellowish amorphous product with a diumyoin content of 80 to 85 ^.
Das Diumycin kann durch VerteilungsBäulenehromatographie an kristalliner Cel3.ulose (Avioel) unter Verwendung eines Gemisches aus 1 Volumteil Propanol, 3 Volumteilen Butanol und 4 Volumteilen 2 η Ammoniumhydroxydlösung als LÖsungsmlttelsystein weiter gereinigt werden. Die OellxtXoae wird mit 50 # ihres Gewichtes der unteren Phase des Lösungsmittelsystems getränkt und mit Hilfe der oberen Phase des Lb'sungsmittelsystems in ein Chromatographierrohr (38 χ 2«.5 cm) gegeben;. 235 mg des in Beispiel 13 erhaltenen Antibiotikums werden in 3 ml der unteren Phase des vorgenannten Lösungsmittelsyetems gelöst und auf das Chromatographlerrohr gegeben. Danach wird die obere Phase des Lösungsmittelsystems zur Entwicklung und Eluierung des Antibiotikums verwendet» Bs werden 90 Fraktionen von jeweils 15 ml aufgefangen. Der Hauptteil dos Antibiotikums befindet sich in den Erektionen 12 bis 37t Diese Fraktionen werden vereinigtf zur Trockene eingedampft, der Rückstand wird in Methanol aufgenommen und durch Zueate von Diäthyläther ausgefällt. Es werden 200 mg des farblosen„ amorphen Ammoniumsalzes von reinem Diumycin erhalten«The diumycin can be further purified by distribution column chromatography on crystalline Cel3.ulose (Avioel) using a mixture of 1 part by volume of propanol, 3 parts by volume of butanol and 4 parts by volume of 2 η ammonium hydroxide solution as the solvent system. The OellxtXoae is impregnated with 50 # of its weight in the lower phase of the solvent system and, with the aid of the upper phase of the solvent system, placed in a chromatography tube (38 χ 2 ".5 cm). 235 mg of the antibiotic obtained in Example 13 are dissolved in 3 ml of the lower phase of the aforementioned solvent system and placed on the chromatograph tube. The upper phase of the solvent system is then used to develop and elute the antibiotic. 90 fractions of 15 ml each are collected. The main section dos antibiotic is in the erections 12 to 37t These fractions were combined f be evaporated to dryness, the residue is taken up in methanol and precipitated by Zueate of diethyl ether. 200 mg of the colorless "amorphous ammonium salt of pure diumycin are obtained"
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Der in Beispiel 14 erhaltene Diumycinkomplex "besteht aue dem Hauptantibiotikum Diumycin Δ und einer geringeren Menge Diumycin B. Diumycin A kann von Diumycin B auch durch Gegenstromverteilung unter Verwendung des Lösungsmittelsystems aue 2 Voluiateilen n-Propanol, 3 Volumteilen η Butanol und 4 Volum-« teilen 0?5 η Ammoniumhydroxydlösung abgetrennt werden.The diumycin complex "obtained in Example 14" consists of the main antibiotic diumycin Δ and a smaller amount of diumycin B. Diumycin A can also share diumycin B by countercurrent distribution using the solvent system as 2 parts by volume of n-propanol, 3 parts by volume of butanol and 4 parts by volume 0 ? 5 η ammonium hydroxide solution are separated.
300 mg des in Beispiel 14 erhaltenen Aramoniumsalzes der Diumycine werden in einer Gegenstroiaverteilungsvorrichtung unter Stickstoff und mit Hilfe des vorgenannten LÖBungsmittelsystems 500 Übertragungen unterworfen« Die Röhren 65 bis 90 (K -* O1,19) werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft« .Der RUcketand wird in Methanol aufgenommen und mit Diät.hyläther ausgefällte Ss werden 98 mg des Ammoniumsalzes von Diumycin A erhalten« Die Rohre 145 bis 200 werden in ähnlicher Weise aufgearbeitet. Es werden 10 mg des Ammoniumsalsseß von Diumycin B erhalten (K_» 0*47)·300 mg of the aramonium salt of the diumycins obtained in Example 14 are subjected to 500 transfers in a counterflow distribution device under nitrogen and with the aid of the aforementioned solvent system. The tubes 65 to 90 (K - * O 1 , 19) are combined and evaporated under reduced pressure Ruckand is taken up in methanol and 98 mg of the ammonium salt of diumycin A precipitated with diethyl ether are obtained. The tubes 145 to 200 are worked up in a similar manner. 10 mg of the ammonium salt of diumycin B are obtained (K_ »0 * 47) ·
Die freie Säure von Diumycin A wird dadurch erhalten, dass man 50 mg des Ammoniumsalzes in Wasser löst und die Lösung mit einem Kationenharzaustauscher (Dowex 50) in der H+-Form behandelt. Der Harzaustauscher wird abfiltriert und das Piltrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Methanol aufgenommen und durch Zusatz von Äthylacetat ausgefällt,, Bs werden 41 mg der farblosen,, amorphen freien Säure von Diumycin A erhalten«The free acid of diumycin A is obtained by dissolving 50 mg of the ammonium salt in water and treating the solution with a cation resin exchanger (Dowex 50) in the H + form. The resin exchanger is filtered off and the piltrate is evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is taken up in methanol and precipitated by adding ethyl acetate. 41 mg of the colorless, amorphous free acid of diumycin A are obtained "
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Diumyoin A und B können durch Verteilungspapierchromatographie von einander getrennt und durch Bioautographie identifiziert werden. 0,1 f des in Beispiel 14 erhaltenen Materials werden auf zweifach mit Säure gewaschenes Filterpapier (2«.B. Munkteils Ho. S ·302) aufgetragen, und das Filterpapier wird durch eine Lösung von Aceton und die untere Phase des Lösungsmittelsystems (2:1 Volumteile) getauchte Danach wird das Papier 2 bis 3 Hinuten bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet und hierauf mit der oberen Phase des LÖsungsmitteleystems 16 Stunden ent» wickelt, das aus 1 Volumteil n-Propanol, 3 Volumteilen n-Butanol und 4 Volumteilen 0,5 η Ammoniumhydroxydlösung besteht« Die Lösungsmittel werden durch !Trocknen an der Luft abgetrennt, undDiumyoin A and B can be separated from each other by partition paper chromatography and identified by bioautography. 0.1 f of the material obtained in Example 14 are applied to dual acid-washed filter paper (2 '.B Munkteils Ho S · 302nd.), And the filter paper is passed through a solution of acetone and the lower phase of the solvent system (2: 1 part by volume) then the paper is dried in air for 2 to 3 minutes at room temperature and then developed with the upper phase of the solvent system for 16 hours. 5 η ammonium hydroxide solution consists «The solvents are separated by! Drying in air, and
wird/
das Papier auf Agar bioautographiert,, der mit Staphylococcus
aureus 209 P beimpft ist. Diumyoin A ist gekennzeichnet durch
einen R^-Wert von 0,32 und Diumyoin B durch einen R^-Wert von
0,45. will/
bioautographed the paper on agar inoculated with Staphylococcus aureus 209 P. Diumyoin A is characterized by an R ^ value of 0.32 and diumyoin B by an R ^ value of 0.45.
Beispiel 17 Salze von Diumycin AExample 17 Salts of diumycin A
Die freie Säure von Diumyoin A wird in Wasser suspendiert, (30 mg/αϊ) und mit 1 η Kaliumhydroxydlögung auf Pg 8 eingestellt. Das Gemisch wird bis zur vollständigen Lösung des Antibiotikums gerührt. Dann werden 8 VoXumteile Aceton zugegeben, und das ausgefällte Kaliumsalz wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. ■The free acid of diumyoin A is suspended in water, (30 mg / αϊ) and adjusted to Pg 8 with 1 η potassium hydroxide solution. The mixture is stirred until the antibiotic has completely dissolved. Then 8 parts by volume of acetone are added, and the precipitated The potassium salt is filtered off and dried under reduced pressure. ■
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In ähnlicher Weise werden gemäse Beispiel 17 unter Verwendung äquivalenter Mengen Natriumhydroxyd, Bariumhydroxyd oder organischer Basen, wie Dimethylamine die entsprechenden Salze von Diumyoln A erhalten« Bei Verwendung von Diumyoin B im Verfahren des Beispiels 17 wird auch das entsprechende Kaliumsalz erhalten. Similarly, according to Example 17, using equivalent amounts of sodium hydroxide, barium hydroxide or organic bases such as dimethylamine, the corresponding salts of diumyoln A are obtained. If diumyoin B is used in the process of example 17, the corresponding potassium salt is also obtained.
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109823/017 9 BATH ORIGINAL
109823/017 9
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Legal Events
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| OHW | Rejection |