DE1545915B2 - Verfahren zur herstellung von 3- hydroxymethylcephalosporinen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von 3- hydroxymethylcephalosporinenInfo
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Description
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20
35
4o
45
Cephalosporin C und dessen Derivate können einer enzymatischen Hydrolyse unter Verwendung einer aus
Orangenschale stammenden Esterase (britische Patentschrift 9 66 222) unterworfen werden, um Produkte zu
ergeben, worin die Acetoxygruppe durch eine Hydroxygruppe ersetzt ist, und aus derartigen Produkten können
Analoge von Cephalosporin C und dessen Drivaten hergestellt werden, die statt einer Acetoxygruppe
beispielsweise andere Acyloxygruppen oder Alkoxygruppen aufweisen. Solche Analogen sind von Interesse,
da mehrere von ihnen im Vergleich mit Cephalosporin C eine modifizierte Wirksamkeit besitzen.
Die enzymatische Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten mittels der Citrusesterase ist
unbequem, vor allem, wenn man in größerem Maßstab arbeitet, da eine sehr große Anzahl von Orangen
erforderlich ist, um ausreichend Enzym zur Hydrolyse selbst kleiner Mengen zu erhalten.
Es wurde gefunden, daß Weizenkeimesterase zur Hydrolyse von Cephalosporin C und dessen Derivaten
zu den entsprechenden Hydroxymethylverbindungen befähigt ist.
CH2 · OH
CH7-C
C·COOH
(H)
CH-N ■:
CH-CO
worin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der
allgemeinen Formel
CH2-O- COCH3
CH2-C
CH2-C
/ V
S C·COOH
CH-N
CH-CO
in welcher X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase Weizenkeimesterase verwendet, und die Hydrolyse in
wäßrigem Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.
Weizenkeimesterase wird vorzugsweise als esterasehaltiger Extrakt von Weizenkeimen verwendet. Solche
Extrakte werden zweckmäßig hergestellt, indem man Weizenkeime durch Extraktion mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel,
z. B. Petroläther, entfettet. Die entfetteten Weizenkeime können dann als solche
verwendet werden, oder das Enzym kann aus dem festen Rückstand durch Extraktion mit Wasser extrahiert
werden, wobei sich die erhaltenen wäßrigen Extrakte zur direkten Verwendung im erfindungsgemäßen
Verfahren eignen. Ein Verfahren zur Herstellung von Extrakten von Weizenkeimesterase ist beispielsweise
von Singer et al. in Arch. Biochem. und Biophys. 18,229 (1948) beschrieben.
Die erfindungsgemäße Hydrolyse einer Verbindung der allgemeinen Formel I unter Verwendung von
Weizenkeimesterase wird in wäßrigen Medien bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchgeführt.Wenn
7-ACA (7-Aminocephalosporansäure) das Substrat ist, wird der pH-Wert vorzugsweise bei 6,45 gehalten. Die
Hydrolose wird durchgeführt, indem man das Gemisch bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise zwischen
20 und 45°C hält, bis die Hydrolyse beendet ist. Die Beendigung der Hydrolyse kann festgestellt
werden, indem man von Zeit zu Zeit einen Anteil des Reaktionsgemisches mit Alkali titriert.
Der pH-Wert kann mit fortschreitender Hydrolyse eingestellt werden, um ihn innerhalb der gewünschten
Grenze zu halten, indem man Alkali zur Neutralisierung der gebildeten Essigsäure zugibt. Wenn bei dieser
Arbeitsweise die theoretische Menge an Alkali, die dem Acetatgehalt der zu hydrolysierenden Verbindung
entspricht, verbraucht ist, kann die Reaktion als beendet betrachtet werden. Die Beendigung kann auch durch
chromatographische Analyse verfolgt werden.
Die Hydrolyseprodukte können durch übliche Methoden gewonnen werden, wobei das tatsächliche Verfahren
von der Art des Produktes abhängt. Als Vorstufe wird die Hydrolyseflüssigkeit vorzugsweise zuerst zur
Entfernung von Protein daraus, z. B. durch Zugabe eines Proteinfällungsmittels, wie eines mit Wasser mischbaren
Lösungsmittels, wie Aceton oder Methanol, und anschließende Abtrennung des gefällten Proteins, z. B.
durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren, behandelt.
Bei Lösungsmittel-löslichen Hydroxymethylderivaten von Cephalosporin C, z. B. 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure
und 7-(Thienyl-2'-acetamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure, kann das Hydrolysegemisch bei einem saueren
pH-Wert der Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für das gewünschte Produkt
unterworfen werden. Die Extraktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 3 bis 4 durchgeführt. Zu
geeigneten Lösungsmitteln gehören beispielsweise Esterlösungsmittel, z. B. Äthylacetat oder Butylacetat,
und mit Wasser nicht mischbare Ketone, z. B. Methylisobutylketon. Die so erhaltenen Lösungsmittelextrakte
können mit Wasser, zweckmäßigerweise bei einem pH-Wert von 6 bis 8, z. B. etwa 7,5, reextrahiert werden,
und das gewünschte Produkt kann gewonnen werden, z. B. durch Lyophilisieren, oder die Lösungsmittelextrakte
können zur Trockne verdampft werden. Das erhaltene Produkt kann nach Wunsch umkristallisiert
werden. Im Falle von Produkten, die nicht in Lösungsmitteln löslich sind, z. B. 7-(D-5'-Amino-5'-carboxypentanamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-car-
bonsäure und 3-Hydroxymethyl-7-amino-ceph-3-em-4-carbonsäure, kann das Reaktionsgemisch zuerst zur
Entfernung von Protein und anderem hochmolekularen Material wie oben dargelegt behandelt werden. Das
gewünschte Produkt kann dann durch Adsorption an einem geeigneten Anionenaustauscherharz aus gepufferter
Lösung und anschließende Elution gewonnen werden. Die erhaltenen Extrakte können aufgearbeitet
werden, um die gewünschte Substanz zu gewinnen, beispielsweise lyophilisiert, und weiter nach Wunsch
behandelt werden.
3-Hydroxymethyl-7-amino-ceph-3-em-4-carbonsäure (das Reaktionsprodukt von 7-ACA) wird jedoch
zweckmäßiger gewonnen, indem man den pH-Wert des Reaktionsmediums auf den isoelektrischen Punkt des
Produktes, das heißt einen pH-Wert von etwa 4,5, einstellt, um die Ausfällung des Produktes zu bewirken.
Der Niederschlag kann dann abfiltriert oder abzentrifugiert und gewaschen werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
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Vorarbeiten:
100 g Weizenkeime wurden durch Extraktion mit 3x5 Volumen niedrig-siedendem Petroläther (Kp.
bis 60° C) entfettet und dann an der Luft trocknen gelassen. Die entfetteten Weizenkeime wurden dann
mit 1 Liter Wasser bei 4° C 15 Minuten gerührt und bei 00C 20 Minuten bei 1800 U.p.M. (1100 χ g) zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde dann entweder sofort bei den Versuchen verwendet oder im
Tiefkühlschrank aufbewahrt, bis sie gebraucht wurde.
Der in den Beispielen erwähnte Thienylrest ist der 2'-Thienylrest.
7-(D-5'-Amino-5'-carboxypentanamido)-3-hydroxymethyl-ceph-3-em-4-carbonsäure
1,62 g Cephalosporin C-Natriumsalz (etwa 80%ig) wurden in 325 ml Weizenkeimextrakt gelöst und der
pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt. Diese Lösung wurde dann bei 37°C inkubiert, und der pH-Wert wurde mit 1
n-NaOH in stündlichen Intervallen eingestellt. Nach 4 Stunden war die theoretische Menge an 1 n-NaOH (2,4
ml) zugegeben, was einer vollständigen Freisetzung der Essigsäure entsprach.
Dann wurden 2 Volumen Aceton zugegeben und das ausgefallene Protein wurde abzentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wurde dann im Vakuum bei 30° C auf ein Volumen von 28 ml eingeengt. Nach der Zugabe
eines gleichen Volumes 0,6 n-Pyridinacetat bei pH 5,0 wurde die Lösung oben auf eine Säule eines schwach
basischen Polyamin-Anionen-Austauschharzes aus vernetztem Polystyrol/Divinylbenzol in der Acetatform
gegeben, die in 0,3 η-wäßrigem Pyridinacetat bei einem pH-Wert von 5,0 gepackt war. Die Elution wurde mit 0,3
η-wäßrigem Pyridinacetat bei pH 5,0 begonnen, und es wurden 25 ml Fraktionen gesammelt, wobei das Produkt
in den Fraktionen 24 bis 54 nach der Ninhydrinmethode festgestellt wurde. Diese Fraktionen wurden vereinigt
und gefriergetrocknet. Die Festsubstanz wurde in 15 ml Wasser gelöst und durch Zugabe von 100 ml trockenem
Aceton ausgefällt. Nach Mahlen zu einem Pulver unter trockenem Aceton wurde die Festsubstanz in 20 ml
Wasser aufgenommen, der pH-Wert wurde mit 1 n-NaOH auf 7,5 eingestellt und die Lösung wurde
gefriergetrocknet. Die 850 mg des so erhaltenen Feststoffes wurden in 7,5 ml Wasser gelöst und 17 ml
Äthanol langsam zugegeben. Es wurde ein gefärbter Niederschlag erhalten, der verworfen wurde, und die
Kristallisation wurde in der überstehenden Lösung durch langsame Zugabe von weiterem Äthanol angeregt.
Das Produkt wurde mit Äthanol und Äther gewaschen und im Vakuum über CaCb getrocknet.
Ausbeute = 435 mg.
200 mg wurden aus wäßrigem Äthanol kristallisiert, wonach das Produkt die folgenden Eigenschaften hatte:
260
260 πιμ = 181[a]2 D° = +109°
Analyse für: Ct4Hi8O7N3S · Na · 3,5H2O:
Berechnet: C 36,7, H 5,5, N 9,4 , S 7,0 %;
Gefunden: C 36,4, H 5,8, N 9,51, S 6,89%.
Gefunden: C 36,4, H 5,8, N 9,51, S 6,89%.
Eine Spur Cephalosporin C (< 2%) konnte durch Bioautographie in Methanol auf feuchten, auf pH 6,0
gepufferten Papieren, die 16 Stunden entwickelt und auf Vibrio cholerae-Platten inkubiert waren, nachgewiesen
werden.
7-Phenylacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure
25 g Natrium-7-phenylacetamidocephalosporanat
wurden in 5 Liter wäßrigem Weizenkeimesterasepräparat gelöst. Der pH-Wert wurde auf 6,7 eingestellt und
das Gemisch bei 37° C 4 Stunden inkubiert, wobei der pH-Wert in lstündigen Abständen mit 1 n-Natriumhydroxyd
auf pH 6,7 eingestellt wurde. In 4 Stunden waren 87% der theoretischen Aufnahme von 61 ml erforderlich
und die Reaktion wurde nach der chromatographischen Untersuchung als beendet betrachtet.
Nach Einengen im Vakuum bei 18°C auf ein Volumen von 1600 ml wurde das Protein in der Lösung durch
Zugabe von 2 Volumen Aceton und anschließendes lOminütiges Zentrifugieren bei 1500 U.p.M. ausgefällt.
Der Niederschlag wurde mit 1 Liter 66%igem Aceton in Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden
mit der überstehenden Lösung vereinigt. Die Lösung wurde dann im Vakuum auf ein Volumen von 1500 ml
eingeengt und mittels Filtrieren durch eine Astbestschicht geklärt.
Die Extraktion der 7-Phenylacetamido-3-hydroxymethyI-ceph-3-em-4-carbonsäure
wurde durch Einstellung des pH-Wertes der wäßrigen Lösung auf 3,5 mit 10%iger Phosphorsäure und Extraktion in 3 χ 1
Volumen Äthylacetat bewirkt. Dann wurde sie in 3 χ 750 ml Wasser durch Zugabe von 1 n-Natriumbicarbonat
zur wäßrigen Phase, bis der GleichgewichtspH-Wert 7,0 betrug, zurückextrahiert. Der Überschuß
an Natriumbicarbonat wurde durch Behandlung mit überschüssigem Carbonsäure-Kationenaustauscherharz
aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol zerstört, die Lösung im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet,
was 14,34 g amorphes Natrium-7-phenylacetamido-3-hydroxymethyI-ceph-3-em-4-oat
von 62°/oiger Reinheit ergab.
Die Kristallisation wurde vorgenommen, indem diese Festsubstanz mit 500 ml Methanol extrahiert und die
Lösung dann langsam eingedampft wurde, was in der ersten Ausbeute 3,266 g Material (95% rein) und in der
zweiten Ausbeute 4,3 g (65% rein) ergab. Die Reinheit dieser Proben wurde durch UV-Absorption bestimmt,
wobei ein theoretischer Wert von Ek°„ 260 ηιμ = 240
für diese reine Substanz angenommen wurde.
7-Thienylacetamido-3-hydroxymethyI-ceph-3-em-4-carbonsäure
3,63 g 7-Thienylacetamido-cephaIosporansäure wurden
in 50 ml Wasser unter Zugabe von 1 n-Natriumbicarbonat,
bis der pH-Wert 7,0 betrug, gelöst. 700 ml wäßrige Weizenkeimesteraselösung wurden zugegeben,
und das Gemisch wurde bei 37°C4'/2 Stunden inkubiert,
wobei der pH-Wert bei 6,3 gehalten wurde. Dann wurden 1200 ml Aceton unter Rühren zugegeben und
das ausgefallene Protein durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde im Vakuum bei 3O0C auf 250 ml eingeengt,
der pH-Wert wurde mit verdünnter Phosphorsäure auf 3,5 eingestellt und die Lösung wurde mit 3 χ 250 ml
Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden dann mit 3 χ 50 ml H2O unter Zugabe von 1
n-NaHCO3-Lösung bei jeder Extraktion, bis der pH-Wert im Gleichgewicht 7,0 betrug, rückextrahiert.
Diese vereinigten Extrakte wurden von überschüssigem NaHCO3 durch Zugabe von Carbonsäure-Kationenaustauscherharz
aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol befreit, bis der pH-Wert auf 5,8 fiel. Beim
Gefriertrocknen wurden 2,76 g einer amorphen Festsubstanz erhalten. Diese wurde in 110 ml Methanol
gelöst, durch Zentrifugieren geklärt und dann langsam eingedampft, bis die Kristallisation einsetzte. Diese war
nach 24 Stunden bei 4° C beendet, was 926 mg einer kristallinen Festsubstanz ergab.
λ „,„χ.= 235 Γημ, Ef^ = 235 πιμ = 278.
Angenommene Reinheit, bezogen auf UV-Absorption, = 90%.
λ „,„χ.= 235 Γημ, Ef^ = 235 πιμ = 278.
Angenommene Reinheit, bezogen auf UV-Absorption, = 90%.
7-Benzylthioacetamido-3-hydroxymethylceph-3-em-4-carbonsäure
4 g 7-BenzyIthioacetamido-cephalosporansaures Natriumsalz
wurden in einer Enzymlösung gelöst, die aus 100 g entfetteten Weizenkeimen erhalten wurde. Der
pH-Wert wurde sofort mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 6,7 eingestellt und das Ganze bei 37°C inkubiert. Der
pH-Wert wurde in Zeitabständen mit 1 n-Natriumhydroxyd auf 6 bis 7 eingestellt und die Reaktion beendet,
als kein weiteres Alkali mehr verbraucht wurde.
Das Inkubat wurde mit 2 Volumen Aceton gerührt und das ausgefallene Protein abfiltriert. Aceton wurde
dann vom Filtrat durch Einengen im Vakuum bei 30°C entfernt. Die erhaltene wäßrige Lösung wurde mit
konzentrierter Phosphorsäure auf pH 2,5 eingestellt und mit 3 χ 1 Volumen Äthylacetat extrahiert, wobei der
pH-Wert nach Erfordernis wieder eingestellt wurde.
Die Äthylacetatschichten wurden abgetrennt und sofort in Vs Volumen Wasser zurückextrahiert, das so viel
gesättigte Natriumbicarbonatlösung enthielt, um die wäßrige Schicht auf pH 7,0 zu bringen. Die vereinigten
wäßrigen Schichten wurden dann mit Carbonsäure-Kationenaustauscherharz aus vernetzten Polyacralsäuren/Divinylbenzol
auf einen pH-Wert von etwa 5,0 eingestellt, das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat
lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 2,84 g.
Die Analyse durch UV-Spektroskopie zeigte eine
Reinheit von 68%. Die Chromatographie in Äthylacetat-pH
5,0-Natriumacetat-Puffersystem und die anschließende Bioautographie auf Staphylococcus aureus-Platten
zeigten nur einen Flecken, welcher der Hydroxysäure entsprach.
Das Produkt wurde weiter durch Solventextraktion gereinigt.
Die oben erhaltene Festsubstanz wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert wurde wie vorher auf
2,5 eingestellt. Die Hydroxysäure wurde in Äthylacetat aufgenommen, indem sie mit 3 χ 50 ml Lösungsmittel
geschüttelt wurde. Dann wurde sie in 50 ml Wasser reextrahiert, welches die theoretische Menge an
Natriumbicarbonat enthielt (420 mg). Die Äthylacetatschicht wurde dann mit 50 ml Wasser gewaschen, das
etwas gesättigtes Natriumbicarbonat enthielt.
Die wäßrigen Schichten wurden vereinigt, der pH-Wert wurde mit Carbonsäure-Kationenaustauscherharz
aus vernetzten Polyacrylsäuren/Divinylbenzol wie vorher eingestellt und dann wurde lyophilisiert.
Dies ergab ein Produkt, das nach der UV-spektroskopischen Analyse eine Reinheit von 79% aufwies.
Die Endreinigung wurde durch Kristallisation bewirkt. Die obige Festsubstanz (110 mg) wurde in einem
Gemisch von 2 ml Dimethylsulfoxyd und 2 ml Methanol durch gelindes Erwärmen gelöst. Nach Filtrieren
wurden 6 ml Äther zugegeben und beim Abkühlen und Kratzen schieden sich Kristalle aus. Diese Kristalle
wurden gewonnen und schienen nach der UV-Analyse rein zu sein.
Eil
3-Hydroxymethyl-7-thienyIacetamido-
ceph-3-em-4-carbonsäure
(Alternativverfahren zu Beispiel 3)
(Alternativverfahren zu Beispiel 3)
Weizenkeime wurden entfettet, indem sie in eine chromatographische Säule gepackt wurden und Petrol-
äther (Kp. 40 bis 60°) durch sie perkolieren gelassen wurde, bis das Eluat farblos war.
Die getrockneten Keime wurden in einem Polyäthylenbeutel bei Zimmertemperatur aufbewahrt.
Eine Suspension von 250 g entfetteten Weizenkeimen in 2 Liter destilliertem Wasser wurde unter Rühren auf
370C erwärmt. 30 g Natrium-7-thienylacetamido-cephalosporanat
wurden zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37°C gehalten. Während dieser Zeit
wurde der pH-Wert durch Zugabe von 2 n-Natriumhydroxylösung bei 6,6 bis 6,9 gehalten. Dann wurden 3
Liter Aceton zugegeben, um Proteine auszufällen, und die ausgefallene Festsubstanz wurde durch Vakuumfiltrieren
entfernt und gründlich mit Wasser gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf etwa 3 Liter
eingeengt, bevor es mit 2 χ 500 ml Äthylacetat gewaschen wurde, um jegliches neutrales Material zu
entfernen. Die klare wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit 1 Liter Äthylacetat bedeckt und mit sirupöser
Phosphorsäure auf pH 3,5 angesäuert. Während des Ansäuerns wurde das Gemisch kräftig gerührt. Die
organische Schicht wurde abgetrennt und die wäßrige Schicht gründlich mit 2 χ 500 ml Äthylacetat extrahiert.
Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzsole gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet
und eingedampft. Während des Eindampfens schied sich die kristalline 3-Hydroxymethyl-7-thienylacetamidoceph-3-em-4-carbonsäure
aus und wurde abfiltriert. Ausbeute = 13,4 g (53%). Einengen des Filtrats ergab eine weitere Ausbeute von 0,5 g an weniger reinem
Material.
Das Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert. Es hatte dann einen Schmelzpunkt von 205 bis 2150C
(Zersetzung),
[a,]"= +138° (Methanol,c= 1,0)
AmM.(Phosphatpuffer,pH 6)236 ηιμ(Ε{* = 396, ε = 14 000), Inflexion bei 259 πιμ^Ι = 251, ε = 8 950), vma;t(Nujol) 3400 (OH), 3220 (NH), 1760 (0-Lactam), 1720 (- COOH),
und 1652 und 1555 cm -' (- CONH). N.M.R.-Spektrum (D2O, NaHCO3) :τ = 2,602,98,4,40, 4,93,5,72,6,10,6,33,6,16 p.p.m.
AmM.(Phosphatpuffer,pH 6)236 ηιμ(Ε{* = 396, ε = 14 000), Inflexion bei 259 πιμ^Ι = 251, ε = 8 950), vma;t(Nujol) 3400 (OH), 3220 (NH), 1760 (0-Lactam), 1720 (- COOH),
und 1652 und 1555 cm -' (- CONH). N.M.R.-Spektrum (D2O, NaHCO3) :τ = 2,602,98,4,40, 4,93,5,72,6,10,6,33,6,16 p.p.m.
Rf= 0,06 (Standard-Chromatographiepapier, mit Natriumacetat
auf pH 5 gepuffert.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol: 0,1 m-Natriumacetat (pH 5,0)= 8 :1 :8 im absteigenden System bei 38°), Rf= 0,68 (n-Propanol: Wasser = 7:3); Rf= 0,26 auf Kieselsäureplatten mit n-Butanol: Äthanol: Wasser= 4:1 :5.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol: 0,1 m-Natriumacetat (pH 5,0)= 8 :1 :8 im absteigenden System bei 38°), Rf= 0,68 (n-Propanol: Wasser = 7:3); Rf= 0,26 auf Kieselsäureplatten mit n-Butanol: Äthanol: Wasser= 4:1 :5.
S-Hydroxymethyl^-phenylacetamido-
ceph-3-em-4-carbonsäure (Alternativverfahren zu Beispiel 2)
Die oben bezeichnete Verbindung wurde in 50%iger Ausbeute aus Natrium-7-phenylacetamido-cephalosporanat
unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt. Das Produkt wurde aus
Äthylacetat-Methanol umkristallisiert, F= 190 bis 195° C (Zersetzung),
[otfi = +152° (Methanol, C= 1,0), Ama4Phosphatpuffer, pH 6) = 260 Γημ,(Ε!™ = ε = 8700),
>w(Nujol) = 3360(OH),
[otfi = +152° (Methanol, C= 1,0), Ama4Phosphatpuffer, pH 6) = 260 Γημ,(Ε!™ = ε = 8700),
>w(Nujol) = 3360(OH),
3200 (NH), 1752 (j3-Lactam),
1718(COOH) und 1642und 1548 cm-1 (CONH).
N.M.R.-Spektrum(D2O,NaHCO3):τ= 2,58;4,35;4,88;
5,69; 6,26; 6,45 p.p.m.
Rf= 0,06 (Standard-Chromatographiepapier, auf pH 5 mit Natriumacetat gepuffert.
Rf= 0,06 (Standard-Chromatographiepapier, auf pH 5 mit Natriumacetat gepuffert.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol: 0,1 m-Natriumacetat
(pH 5) = 8 :1 :8 im absteigenden System bei 38° C),
Rf= 0,66(n-Propanol: Wasser = 7:3).
Rf= 0,66(n-Propanol: Wasser = 7:3).
3-Hydroxymethyl-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-ceph-3-em-4-carbonsäure
3-Hydroxymethyl-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-
ceph-3-em-4-carbonsäure wurde aus Natrium-7-(2',6'-dimethoxybenzamido)-cephalosporanat
nach der in Beispiel 5 beschriebenen Arbeitsweise hergestellt.
Das Produkt kristallisierte aus Methanol mit
Das Produkt kristallisierte aus Methanol mit
[<%]"= +68° (Methanol, c= 1,0),
λη,Μ. (Phosphatpuffer, pH 6) 253 -256 ΐημΕί™ = 276,
ε= 10 900), iw(Nujol) 177O(j3-Lactam),
1690(-COOH), 1540 und 1630(-CONH-)
und 1253 cm -' (Methoxyaryl);
und 1253 cm -' (Methoxyaryl);
N.M.R.-Spektrum (D2O, Natriumbicarbonat);
Resonanzen bei 6,14; 2,55; 3,25;4,19; 4,79 und 5,72 τ.
Chromatographische Einzelheiten:
Rf= 0,05 (Standardchromatographiepapier, mit Natriumacetat auf pH 5 gepuffert.
Lösungsmittel: Obere Phase
Äthylacetat: n-Butanol: 0,1 m-Natriumacetat
(pH5)= 8:1 :8 im absteigenden System bei 38° C),
Rf= 0,73(n-Propanol: Wasser= 7 :3).
Analyse für: Ci7Hi8N2O7S:
Berechnet: C 51,7, H 4,6, N 7,1%;
gefunden:' C 51,8, H 4,8, N 6,8%.
gefunden:' C 51,8, H 4,8, N 6,8%.
Die Verbindung zeigte blaue Fluoreszenz bei Bestrahlung mit UV-Licht.
25 g 7-ACA wurden in 100 ml Wasser durch Zugabe von 110 ml 1 n-NaOH gelöst. Diese Lösung wurde zu 5
Liter rohem Weizenkeimextrakt zugegeben und 4 V2 Stunden bei 37° C umgesetzt, wobei alle Stunden
1 n-NaOH zugegeben wurde, um den pH-Wert bei 6,45 zu halten. In dieser Zeit wurden 51 ml (55% der Theorie)
an 1 n-NaOH zugegeben. Weitere 41 ml 1 n-NaOH wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei 22° C
über Nacht stehen gelassen.
Nach Einengen im Vakuum auf 2,5 Liter bei 25° C wurden unter Rühren 5 Liter Aceton zugegeben. Der so
gebildete Niederschlag wurde entfernt und das Filtrat im Vakuum auf 450 ml eingeengt. Die Einstellung des
pH-Wertes der Lösung auf 4,5 mit Eisessig führte zur
Ausfällung des Produktes, das abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet wurde.
Ausbeute = 10g. (Die Mutterlaugen wurden nicht untersucht.)
Eigenschaften:
UV-Absorption AmM = 265 πιμ (in"/40 NaHCO3)
E! :°m 260 πιμ = 380 (ε = 8750)
E! :°m 260 πιμ = 380 (ε = 8750)
Die Reinheit wurde, bezogen auf die UV-Analyse, zu 95% bestimmt.
709 525/506
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxymethylcephalosporinen der allgemeinen FormelCH2 · OHC·COOH(H)CW1-C^^CH- n'
CH-CO
Xworin X eine Acylamino- oder eine Aminogruppe bedeutet, durch Hydrolyse von Verbindungen der allgemeinen FormelCH2-O- COCH3CH7-CC·COOH(I)CH-N
CH- CO
Xworin X die oben angegebene Bedeutung besitzt, mittels einer Esterase, dadurch gekennzeichnet, daß man als Esterase Weizenkeimesterase verwendet und die Hydrolyse in wäßrigem Medium bei einem pH-Wert zwischen 5 und 8 durchführt.Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel
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