-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven Kristallisation von 2'-O-Fucosyllactose (2'-FL) aus einer wässrigen Lösung, die auch 2',3-di-O-Fucosyllactose (DFL) enthält, unter Verwendung von Essigsäure, insbesondere aus einer wässrigen Lösung aus einer biotechnologischen Herstellung von 2'-FL. Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Kristallisation von 2'-FL, so dass der Restessigsäuregehalt in den so hergestellten 2'-FL-Kristallen weniger als 1 Gew.-% beträgt.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Für die biotechnologische Herstellung von 2'-FL sind viele Verfahren bekannt, wie z.B. die Fermentation mit transformierten E. coli. Einige von ihnen wurden nur mit qualitativen Analysemethoden untersucht, ohne die Ausbeute von 2'-FL oder die Isolierung aus der Fermentationsbrühe zu erwähnen (
WO 2010/070104 ,
WO 2012/007481 , Lee et al. Microb. Zellfaktor. 11:48 (2012)). Die Präparationsmethoden wurden im Labormaßstab durchgeführt und haben einen Endtiter von 25 g/l 2'-FL nicht überschritten (
Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006); M. Randriantsoa: Synthese microbiologique des antigenes glucidiques des groupes sanguins, These de Doctorat soutenue le 30/09/2008 à l'Université Joseph Fourier, Grenoble, France;
WO 2012/097950 ,
WO 2012/112777 ; Baumgärtner et al. Microb. Zellfaktor. 12:40 (2013)). Nach diesen Veröffentlichungen wurde 2'-FL aus dem wässrigen Kulturmedium oder Überstand, in dem die E.coli fermentiert wurden, durch:
- - Abtrennung des produkthaltigen Überstandes durch Zentrifugation,
- - Adsorption von 2'-FL auf einem Bett aus Aktivkohle, das mit Wasser gewaschen wurde, um wasserlösliche Verunreinigungen wie Salze, Aminosäuren und Proteinfragmente zu entfernen,
- - Elution von 2'-FL mit Alkohol oder wässrigem Alkohol und dann
- - Abtrennung von 2'-FL von anderen Kohlenhydraten wie Laktose und Fukose durch Gelpermeationschromatographie oder Flash-Chromatographie auf Kohle-Celit-Bett.
-
Der Hauptnachteil dieser Isolationsmethode war die Notwendigkeit einer chromatographischen Trennung, um entweder reines 2'-FL zu erhalten oder um zumindest eine Mischung zu erhalten, die zwar mit 2'-FL angereichert ist, aber immer noch unerwünschte Derivate enthält. Obwohl wiederholte chromatographische Trennungen zur Verbesserung der Reinheit führen können, können ihre hohen Kosten und relativ langen Zeiten für die Handhabung der Feed-Lösung und der Säulenpackung, die Durchführung der Trennung und optional die Regeneration der Packung, insbesondere im großen oder industriellen Maßstab, nachteilig und lästig sein.
-
Die Kristallisation oder Umkristallisation ist eine der einfachsten und kostengünstigsten Methoden, um ein Produkt aus einem Reaktionsgemisch zu isolieren, von Verunreinigungen zu trennen und Reinsubstanz zu erhalten. Eine Isolierung oder Reinigung mittels Kristallisation macht den gesamten technologischen Prozess robuster und kostengünstiger und damit vorteilhafter. In diesem Zusammenhang legt die
WO 2011/150939 offen, dass wasserfreie 2'-FL-Polymorphe I und II erhalten werden, und die
WO 2014/086373 legt offen, dass 2'-FL unter Verwendung von Methanol aus einem gefriergetrockneten Pulver, das aus einer wässrigen Fermentationsbrühe gewonnen wurde, kristallisiert wird. Darüber hinaus wird in der
WO 2014/009921 offenbart, dass mit Essigsäure 2'-FL-Sesquihydrat aus einer wässrigen Lösung oder wasserfreies 2'-FL-Polymorph I aus einem getrockneten 2'-FL-Sirup kristallisiert wird, wobei das 2'-FL in beiden Fällen durch eine Hydrierungsreaktion hergestellt wurde.
-
Aufgrund der bei der Fermentation von 2'-FL im wässrigen Kulturmedium entstehenden Nebenprodukte besteht jedoch weiterhin ein Bedarf an einem effizienten Verfahren zur Kristallisation von 2'-FL aus dem wässrigen Kulturmedium.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven Kristallisation von 2'-FL aus einer wässrigen Lösung durch Zugabe von Essigsäure zu der Lösung, die 2'-FL und ein oder mehrere andere fucosylierte Kohlenhydrate, insbesondere eine oder mehrere andere mono- und/oder multifucosylierte Lactosen, insbesondere eine oder mehrere difucosylierte Lactosen, insbesondere DFL, und gegebenenfalls Lactose, enthält. Vorteilhaft bei diesem Verfahren ist, dass die wässrige Lösung zuvor von einem wässrigen Nährmedium getrennt wurde, in dem das 2'-FL und DFL von einer gentechnisch veränderten Zelle produziert wurde. Ebenfalls vorteilhaft bei diesem Verfahren ist der Kohlenhydratgehalt der Lösung von mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 55 Gew.-%, bevorzugter mehr als 60 Gew.-%, insbesondere 62-68 Gew.-% bei einem 2'-FL/DFL-Verhältnis von mehr als 2:1, bevorzugter mehr als 4:1, noch bevorzugter mehr als 6:1, insbesondere zwischen 8:1 und 12:1. Auch bei diesem Verfahren werden vorteilhaft mindestens 2-10 Liter, vorzugsweise 3-9 Liter, besser noch 4-8 Liter Essigsäure pro Kilogramm 2'-FL in der Lösung verwendet.
-
Nach diesem Verfahren kann 2'-FL kristallisiert werden mit: i) einer Ausbeute von mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 85 %; ii) einer Reinheit von mindestens 92 %, vorzugsweise mindestens 95 %; iii) einem DFL-Gehalt von weniger als 3 %, vorzugsweise weniger als 2 %; und iv) einem Essigsäuregehalt von weniger als 3 %, vorzugsweise weniger als 2 %.
-
Ebenfalls vorteilhaft ist die selektive Kristallisation von 2'-FL aus der Lösung durch kontinuierliche oder portionsweise Zugabe der Essigsäure über einen Zeitraum von 5 bis 90 Stunden, vorzugsweise 10 bis 40 Stunden, bevorzugter 15 bis 30 Stunden, insbesondere etwa 20 bis 25 Stunden. Vorzugsweise werden zunächst etwa 25-50 % der Essigsäure zugegeben, der Rest wird in mehreren, vorzugsweise 2-4 Portionen zugegeben. Mit diesem Verfahren können 2'-FL-Kristalle mit einem Restessigsäuregehalt von weniger als 1 %, vorzugsweise nicht mehr als 0,5 %, erhalten werden.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Als Ergebnis der jüngsten Entwicklungen bei der Herstellung von 2'-FL durch die Kultivierung von gentechnisch veränderten E. coli wurden wässrige Fermentationsbrühen mit einem deutlich höheren Titer von 2'-FL hergestellt, z.B. mindestens 75 Gramm, vorzugsweise mindestens 100 Gramm, noch bevorzugter mindestens 115 Gramm 2'-FL pro Liter des Kulturmediums. Es wurden jedoch auch andere fucosylierte Kohlenhydrate als 2'-FL, insbesondere DFL, als Nebenprodukte in solchen hochtitrigen wässrigen Fermentationsbrühen in einem Gewichtsverhältnis DFL/2'-FL von 2:8 bis 1:9 gefunden. Bei den fucosylierten Kohlenhydraten in der wässrigen Lösung kann es sich bei anderen monofucosylierten Laktosen als 2'-FL um jede andere monofucosylierte Laktose handeln, die während der Fermentation infolge einer mangelhaften, defekten oder beeinträchtigten Fucosylierung außer einer α-1,2-Fucosylierung an der Galaktose-Einheit der Laktose (z.B. einer, die zu 3-O-Fucosyllactose (3-FL) führt), oder der Fucose-Migration von 2'-FL unter der Kultivierungsbedingung oder bei postfermentiven Operationen oder der Fucose-Hydrolyse von multifucosylierter, vorzugsweise difucosylierter Lactose, gebildet wird. Eine solche andere fucosylierte Lactose kann auch eine multifucosylierte, vorzugsweise difucosylierte, Lactose sein, die durch Überfucosylierung von Lactose unter den Kultivierungsbedingungen gebildet werden kann. Bei der difucosylierten Lactose handelt es sich vorzugsweise um 2,2'-Di-O-Fucosyllactose oder 2',3-di-O-Fucosyllactose (DFL), insbesondere DFL als charakteristisches Nebenprodukt, das bei der fermentativen Herstellung von 2'-FL entsteht. Diese wässrige Lösung kann auch kohlenhydratähnliche Verunreinigungen wie 2'-O-Fucosyllactulose, Lactose, Lactulose, Fucose, Glucose, Galactose und ähnliches enthalten.
-
Diese Kontaminationen können während der Fermentation oder in nachgeschalteten Aufreinigungs-/Isolationsschritten z.B. durch Umlagerung (z.B. 2'-O-Fucosyl-Lactulose, Lactulose) oder durch Hydrolyse (z.B. Fucose, Glucose, Galactose, Lactose) entstehen, oder es können nicht verbrauchte Edukte oder während der Fermentation zugesetzte Inhaltsstoffe sein (z.B. Glucose als Kohlenstoffquelle). Diese Verunreinigungen befinden sich typischerweise in einer Konzentration von nicht mehr als 1-2 Gew.-% (einzeln) bzw. 5-7 Gew.-% (insgesamt) in der wässrigen Lösung. Die wässrige Lösung kann in der Regel weiterhin bis zu 15 Gew.-%, vorzugsweise bis zu 10 Gew.-%, besser nicht mehr als 5 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 1 Gew.-%, Laktose als unverbrauchten Akzeptor enthalten, der der Fermentationsbrühe zugesetzt wird.
-
Es wurde nun entdeckt, dass 2'-FL selektiv aus einer wässrigen Lösung, die aus einer solchen hochtitrigen Fermentationsbrühe gewonnen wurde und 2'-FL und mindestens ein anderes fucosyliertes Kohlenhydrat als 2'-FL, insbesondere DFL, und gegebenenfalls andere kohlenhydratähnliche Verunreinigungen enthält, durch Behandlung der wässrigen Lösung mit Essigsäure kristallisiert werden kann. Diese selektive Kristallisation ist besonders vorteilhaft und überraschend, wenn die wässrige Lösung auch andere fucosylierte Kohlenhydrate und Lactose enthält. Diese selektive Kristallisation liefert 2'-FL von hoher Reinheit in einem Schritt, und typischerweise können Chargen von mindestens 100 g 2'-FL, wie z.B. mindestens 1 kg, oder mindestens 100 kg, oder sogar mindestens 1 Tonne 2'-FL, trotz des großen Konzentrationsbereichs von kontaminierenden zuckerähnlichen Verbindungen in solchen wässrigen Lösungen kristallisiert werden. Dabei kann 2'-FL mit einer Ausbeute von mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 85 %, kristallisiert werden. Die Reinheit von kristallisiertem 2'-FL kann mindestens 92 %, vorzugsweise mindestens 95 % betragen. Insbesondere kann der Gehalt an anderen fucosylierten Kohlenhydraten, insbesondere DFL, die während der Fermentation entstehen, in den 2'-FL-Kristallen weniger als 3 %, vorzugsweise weniger als 2 %, betragen, und der Essigsäuregehalt der 2'-FL-Kristalle kann weniger als 3 %, vorzugsweise weniger als 2 %, betragen. Das resultierende kristalline 2'-FL ist vorzugsweise ein wasserfreies 2'-FL, insbesondere ein 2'-FL Polymorph II, wie in der
WO 2011/150939 beschrieben.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die oben beschriebene, mit Essigsäure zu behandelnde wässrige Lösung einen Kohlenhydratgehalt von mehr als 50 Gew.-%, vorzugsweise mehr als 55 Gew.-%, bevorzugter mehr als 60 Gew.-%, insbesondere etwa 62-68 Gew.-%, und der Kohlenhydratgehalt der wässrigen Lösung hat ein 2'-FL/DFL-Verhältnis von mehr als 2:1, vorzugsweise mehr als 4:1, bevorzugter mehr als 6:1, insbesondere zwischen 8:1 und 12:1. Alternativ beträgt die 2'-FL-Konzentration in der oben beschriebenen wässrigen Lösung, die mit Essigsäure behandelt werden soll, 550-700 g/l, vorzugsweise 590-670 g/l. Die oben genannten Konzentrationsbereiche und -verhältnisse können auf herkömmliche Weise durch Aufkonzentrieren eines wässrigen Überstandes aus der Fermentationsbrühe erreicht werden, vorzugsweise nach Entfernung von z.B. Zellen, Proteinen, Proteinfragmenten, DNA, karamelisierten Nebenprodukten, Salzen und/oder geladenen Molekülen aus der Fermentationsbrühe. Die Aufkonzentrierung des Überstandes kann auf konventionelle Weise erreicht werden, z.B. durch Abdestillieren von Wasser bei reduziertem Druck (20-100 mbar) und bei einer Umgebungstemperatur bis 40-60 °C oder durch Nanofiltration.
-
Der resultierenden wässrigen Lösung wird Essigsäure zwischen Raumtemperatur (ca. 25 °C) und 50 °C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, zugegeben. Die Essigsäure wird der wässrigen Lösung kontinuierlich oder portionsweise über einen Zeitraum von 5 bis 90 Stunden, vorzugsweise 5 bis 50 Stunden, noch bevorzugter 10 bis 40 Stunden, noch bevorzugter 15 bis 30 Stunden, insbesondere etwa 20 bis 25 Stunden, zugesetzt. Wird die Essigsäure bei höherer Temperatur (z. B. bei etwa 50 °C) zugegeben, kann die Dauer der Zugabe kürzer sein: 5 bis 20 Stunden, vorzugsweise 8 bis 15 Stunden. Ebenfalls vorzugsweise wird während der Kristallisation die wässrige Lösung während der Essigsäurezugabe und vorzugsweise danach kontinuierlich bei gleicher Temperatur gerührt. Die Kristallisation wird vorzugsweise durch die Zugabe von 2'-FL-Impfkristallen in die wässrige Lösung eingeleitet, vorzugsweise innerhalb der ersten 2 bis 5 Stunden nach der Zugabe von Essigsäure in die wässrige Lösung.
-
Vorzugsweise werden pro 0,5-2,0 Gramm, insbesondere pro 1 Gramm, 2'-FL in der wässrigen Lösung etwa 2-10 ml Eisessig verwendet. So werden für eine wässrige Lösung von 550-700 Gramm/Liter 2'-FL, vorzugsweise 590-670 Gramm/Liter 2'-FL, deren Kohlenhydratgehalt mehr als 50 Gew.-% beträgt, mindestens etwa 2-10 Liter, vorzugsweise 3-9 Liter, bevorzugter 4-8 Liter, insbesondere 5-7 Liter, Essigsäure pro Kilogramm 2'-FL in der wässrigen Lösung verwendet.
-
Wenn 2'-FL aus der wässrigen Lösung selektiv durch kontinuierliche oder portionsweise Zugabe der Essigsäure, vorzugsweise durch Zugabe von etwa 25-50 %, insbesondere 50 %, der Essigsäure zu Beginn und den Rest in mehreren, vorzugsweise 2-3 gleichen Portionen, über einen Zeitraum von 5-50 Stunden, vorzugsweise 10-40 Stunden, besonders bevorzugt 15-30 Stunden, insbesondere etwa 20-25 Stunden, kristallisiert wird, können 2'-FL-Kristalle mit einem Restessigsäuregehalt von weniger als 1 Gew.-% erhalten werden.
-
Ebenfalls vorzugsweise kann 2'-FL selektiv aus der wässrigen Lösung durch portionsweise Zugabe der Essigsäure, vorzugsweise 4-5 Portionen, über einen Zeitraum von 60-90 Stunden kristallisiert werden, und es können 2'-FL-Kristalle mit einem Restessigsäuregehalt von weniger als 1 Gew.-%, insbesondere nicht mehr als 0,5 %, erhalten werden.
-
Die so erhaltenen 2'-FL-Kristalle sind größer und daher leichter filtrierbar als die bisherigen 2'-FL-Kristalle, insbesondere 2'-FL Polymorph II.
-
Die wässrige Lösung, aus der 2'-FL selektiv durch Essigsäure kristallisiert werden kann und die 2'-FL und ein oder mehrere andere fucosylierte Kohlenhydrate, vorzugsweise mindestens DFL, enthält, wird vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
- i) Kultivierung einer genetisch veränderten Zelle, vorzugsweise einer E. coli-Zelle, die mit einem rekombinanten Gen, das für eine α-1,2-Fucosyltransferase kodiert, transformiert wurde und die durch Fucosylierung von Lactose 2'-FL herstellen kann, in einem wässrigen Kulturmedium, das Lactose enthält, um eine Fermentationsbrühe herzustellen, die 2'-FL und das andere fucosylierte Kohlenhydrat, insbesondere DFL, enthält, und
- ii) Abtrennung von Nicht-Kohlenhydratpartikeln und Verunreinigungen aus der Fermentationsbrühe.
-
Schritt ii) in dem obigen Prozess kann einen konventionellen Demineralisierungsschritt beinhalten, bei dem Mineralien, Salze und andere geladene Moleküle aus der Fermentationsbrühe (die 2'-FL und das andere fucosylierte Kohlenhydrat enthält) extrahiert werden, um die wässrige Lösung herzustellen, aus der 2'-FL kristallisiert werden soll. Die Demineralisierung kann mit herkömmlichen Ionenaustauscherharzen durchgeführt werden, z.B. durch Durchleiten der Fermentationsbrühe durch ein Kationenaustauscherharz in H+-Form und ein Anionenaustauscherharz in freier Basenform. Das Kationenaustauscherharz ist vorzugsweise ein starker, das Anionenaustauscherharz ein schwacher Austauscher. Die lonenaustauscherharze entfernen nicht nur Salze und geladene Moleküle aus der Brühe, sondern können auch Proteine, DNA und Farbstoff-/Karamelkörper, die nach vorherigen Reinigungsschritten gegebenenfalls in der Brühe verbleiben, physikalisch adsorbieren. Alternativ kann die Demineralisierung mittels einer konventionellen Elektrodialyse oder einer konventionellen Membranfiltration/Diafiltrationsanlage unter Verwendung eines geeigneten Partikelgrößen-Cutoffs durchgeführt werden. Die so gewonnene Lösung kann dann entweder durch einen konventionellen Verdampfungsschritt oder durch eine konventionelle Nanofiltration aufkonzentriert werden.
-
Darüber hinaus kann Schritt ii) im oben genannten Verfahren auch eine konventionelle Behandlung mit Holzkohle, vorzugsweise vor dem Demineralisierungsschritt, umfassen, um Farbkörper und gegebenenfalls wasserlösliche Biomoleküle (z. B. Nukleinsäuren, Peptide, Proteine, Aminosäuren, Exopolysaccharide und Lipide), die von vorherigen Reinigungsschritten übriggeblieben sind, zu entfernen. Holzkohle hat eine schwächere Affinität zu Kohlenhydratverbindungen in wässrigem Medium als zu einigen wasserlöslichen lipophilen Verunreinigungen (z.B. Proteine und Aminosäuren mit lipophilen Anteilen, Lipide und gefärbte Aromakörper). So können die Kohlenhydrate, die frei von den lipophilen Verunreinigungen auf der Kohle sind, leicht mit (destilliertem) Wasser aus der Kohle gewaschen werden. Darüber hinaus kann Schritt ii) im oben genannten Verfahren auch einen konventionellen Klärschritt zur Entfernung von Zellen, Zellfragmenten und Proteinen nach der Fermentation, vorzugsweise vor der oben beschriebenen Holzkohlebehandlung, umfassen. Die Klärung kann auf konventionelle Weise erfolgen, z.B. durch Sedimentation in einer Zentrifuge, wobei eine geklärte oder teilweise geklärte Überstandslösung entsteht. Alternativ kann die Fermentationsbrühe auf konventionelle Weise einer Ultrafiltration unterzogen werden, um hochmolekulare Bestandteile zu entfernen. Die semipermeable Membran, die für die Ultrafiltration einer 2'-FL-Fermentationsbrühe verwendet wird, kann in geeigneter Weise einen Cut-off von 5-50 kDa, vorzugsweise 10-25 kDa, bevorzugterweise etwa 15 kDa, aufweisen. Abhängig von den Eigenschaften der zu klärenden Fermentationsbrühe können Kombinationen aus höher und niedriger abgeschnittenen Membranen (in dieser Reihenfolge) innerhalb des oben angegebenen Bereichs eingesetzt werden. Optional kann auf die Zentrifugation oder Ultrafiltration eine Nanofiltration folgen, bei der die wässrige Lösung, die 2'-FL und begleitende Kohlenhydrate enthält, auf herkömmliche Weise konzentriert wird, bevor sie mit Holzkohle behandelt wird. In diesem Nanofiltrationsschritt kann seine Membran eine Porengröße haben, die eine Rückhaltung von 2'-FL mit einem Molekulargewicht von 488 gewährleistet; daher kann typischerweise eine 200-300 Da Cut-off-Membran verwendet werden.
-
Schritt i) in dem oben genannten Verfahren erzeugt vorzugsweise 2'-FL in hohem Titer. Vorzugsweise wird ein E. coli-Stamm, insbesondere ein E. coli LacZ-Y+-Stamm, verwendet, der nur eine rekombinante Glycosyltransferase aufweist, die eine α-1,2-Fucosyltransferase ist, vorzugsweise eine α-1,2-Fucosyltransferase, die durch das futC-Gen aus Helicobacter pylori kodiert wird. Zur Herstellung einer Mischung von 2'-FL in hoher Ausbeute beinhaltet das Verfahren vorzugsweise: a) Versorgen des Kulturmediums mit einer Kohlenstoff- und Energiequelle und mindestens 50, vorzugsweise mindestens 75, noch bevorzugter mindestens 100, noch bevorzugter mindestens 125 Gramm Laktose, bezogen auf 1 Liter des ursprünglichen Kulturvolumens. Das Verfahren beinhaltet außerdem vorzugsweise: b) Laktose für mehr als 4 Tage, vorzugsweise bis zu 7 Tage, vorzugsweise kontinuierlich, in den Nährboden einzubringen. Es wird auch bevorzugt, dass das Endvolumen des Kulturmediums nicht mehr als das Dreifache, vorzugsweise nicht mehr als das Zweifache, insbesondere weniger als das Zweifache des Volumens des Kulturmediums beträgt, bevor die Laktose und die Kohlenstoff- und Energiequelle, vorzugsweise Glyzerin, dem Kulturmedium zugeführt werden.
-
Der Kultivierungsschritt des oben genannten Verfahrens wird vorzugsweise durchgeführt mit:
- - einer ersten Phase exponentiellen Zellwachstums, das durch ein Substrat auf Kohlenstoffbasis gewährleistet wird, und
- - einer zweiten Phase des Zellwachstums, die durch eine kontinuierlich zugeführte Kohlenstoff- und Energiequelle zusammen mit der ebenfalls kontinuierlich zugeführten Laktose begrenzt wird.
-
Der E. coli Stamm wird vorzugsweise kontinuierlich, vorzugsweise mindestens 4 Tage, insbesondere bis zu 7 Tagen, aber nicht länger als etwa 9-10 Tage, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 35 °C und vorzugsweise unter kontinuierlichem Rühren, kontinuierlicher Belüftung und kontinuierlicher Zufuhr des Kohlenstoff- und Energieträgers und der Laktose kultiviert. Die so hergestellte Fermentationsbrühe enthält vorzugsweise mindestens 75 Gramm, noch bevorzugter mindestens 100 Gramm, insbesondere bis zu etwa 115 Gramm pro Liter fucosylierte Kohlenhydrate, einschließlich DFL in einer Menge von etwa 2,5-20 Gew.-% bezogen auf 2'-FL.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1 -- Herstellung einer Fermentationsbrühe mit 2'-FL in hoher Ausbeute Bakterienstämme und Inokulumaufbereitung:
- Gentechnisch veränderte E. coli wurde aus E. coli K-Stamm gemäß WO 01/04341 und Drouillard et al. Angew konstruiert. Chem. Int. Ed. Eng. 45, 1778 (2006), durch die Deletion von Genen, die Laktose, die Oligosaccharidprodukte und ihre
- Stoffwechselzwischenprodukte abbauen können, u. a. die Gene lacZ, lacA und wcaJ, die Beibehaltung der an der GDP-Fucosebiosynthese beteiligten manB-, manC-, gmd- und wcaG-Gene und die Einfügung des H. pylori futC-Gens für α-1,2-Fucosyltransferase als einzige Glycosyltransferase.
-
Fermentationsbedingungen:
-
Glucose, Glycerin, Isopropylthio-β-D-Galactopyranosid (IPTG) und Lactose wurden jeweils bei 120°C sterilisiert.
-
Die Kultur wurde in einem 3 l Fermenter mit 1,5 l mineralischem Kulturmedium durchgeführt (Samain et al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999)). Die Temperatur wurde auf 33 °C gehalten und der pH-Wert mit 28% NH4OH auf 6,8 reguliert. Das Inokulum (1 % des Volumens des Basalmediums) bestand aus einem LB-Medium und der Kultur des produzierenden Stammes. Die exponentielle Wachstumsphase begann mit der Inokulation und endete bis zur Erschöpfung der Kohlenstoffquelle (Glukose 17,5 g/l), die dem Medium zunächst zugegeben wurde. Der Induktor (Isopropyl Thio-β-D-Galactopyranosid, IPTG, 1-2 ml einer 50 mg/ml Lösung) wurde am Ende der Exponentialphase zugegeben. Dann wurde ein Fed-Batch realisiert, bei dem 1 I einer Dosierlösung mit 500 g Glycerin und 160-200 g in Wasser gelöster Laktose verwendet wurde, die der Kultur während 4-7 Tagen zugesetzt wurde. Am Ende der Fermentation schwankte die 2'-FL-Konzentration in der Fermentationsbrühe zwischen 68-114 g/l und das 2'-FL/DFL-Verhältnis in der Brühe zwischen etwa 80:20 bis 92:8. Die fucosylierte Lactulose (2'-O-Fucosyl-Lactulose) betrug in dieser Brühe nicht mehr als 1 %.
-
Reinigung der Fermentationsbrühe:
-
Aus der Fermentationsbrühe von Beispiel 1 wurden Zellen und Proteine durch Ultrafiltration entfernt und die erhaltene Lösung durch Nanofiltration aufkonzentriert. Die Lösung wurde dann mit Holzkohle behandelt, um sie zu entfärben. Die entfärbte Lösung wurde elektrodyalisiert und bei reduziertem Druck (20-30 mbar) und bei 60 °C auf die in den folgenden Beispielen angegebenen erforderlichen Konzentrationen konzentriert.
-
Beispiel 2 -- Selektive Kristallisation von 2'-FL
-
Eine gereinigte Fermentationsbrühe (100 ml, mit ≈ 22,6 g 2'-FL, ≈ 2,2 g DFL und ≈ 1 g Laktose, bestimmt mittels HPLC) wurde zu einer ≈ 63 w/w% (alle Kohlenhydrate) wässrigen Lösung konzentriert, zu der langsam Eisessig (45 ml) bei Raumtemperatur zugegeben wurde. Nach der Zugabe des Impfkristalls (100 mg) wurde unter Beibehaltung der Temperatur ca. 3 Stunden gerührt. Die Kristallisation begann. Dann wurden der Aufschlämmung bei Raumtemperatur unter fortgesetztem Rühren weitere 3 Stunden lang langsam 22,5 ml Essigsäure zugegeben. Dann wurden 22,5 ml Essigsäure bei Raumtemperatur langsam und unter fortgesetztem Rühren für weitere 17 Stunden zu der Aufschlämmung hinzugefügt. Feste weiße Kristalle wurden abfiltriert, zweimal mit 10 ml kalter Essigsäure gewaschen und 18 Stunden bei 60 °C unter Vakuum (50 mbar) getrocknet, um weiße Kristalle von 2'-FL Polymorph II (19,6 g, 86 %) zu erhalten. HPLC-Assay: 95,6 % 2'-FL, 0,67 % DFL, 0,29 % Laktose, 0,79 % Essigsäure, 0,60 % Wasser.
-
Beispiel 3 -- Selektive Kristallisation von 2'-FL
-
Das Verfahren aus Beispiel 2 wurde mit einer anderen Art der Zugabe von Eisessig in die wässrige Lösung wiederholt. Zuerst wurden 33 ml Essigsäure langsam bei Raumtemperatur zugegeben, gefolgt von der Zugabe von Impfkristallen, dann eine zweite Portion Essigsäure (12 ml) nach 18 Stunden, eine dritte Portion Essigsäure (12 ml) in 3 Stunden, eine vierte Portion Essigsäure (12 ml) in 3 Stunden und eine fünfte Portion Essigsäure in 1,5 Stunden (21 ml), und das Rühren der Aufschlämmung wurde 64 Stunden lang fortgesetzt. Nach Filtration, Waschen und Trocknen wurden weiße Kristalle von 2'-FL Polymorph II (19,4 g, 85 %) erhalten. HPLC-Assay: 98,8 % 2'-FL, 0,03 % DFL, 0,09 % Laktose, 0,27 % Essigsäure, 0,73 % Wasser.
-
Beispiel 4 -- Selektive Kristallisation von 2'-FL
-
Eine gereinigte Fermentationsbrühe (600 ml, mit ≈ 173 g 2'-FL und ≈ 17 g DFL, bestimmt mittels HPLC) wurde durch Entfernen von Wasser unter Vakuum zu einer wässrigen Lösung mit einer 2'-FL-Konzentration von ≈ 630 g/l konzentriert. Eisessig (1,0 I) wurde unter Rühren bei 35-45 °C langsam zugegeben. Nach dem Abkühlen der Mischung auf Raumtemperatur wurde Impfkristall (100 mg) zugegeben und 24 Stunden lang gerührt. Feste weiße Kristalle wurden abfiltriert, zweimal mit 180 ml kaltem Aceton gewaschen und bei 40 °C unter Vakuum getrocknet, um weiße Kristalle von 2'-FL Polymorph II (166,6 g, 96 %) zu erhalten.
-
Beispiel 5 -- Selektive Kristallisation von 2'-FL
-
Eine gereinigte Fermentationsbrühe (200 ml, die 2'-FL und DFL im Gewichtsverhältnis von etwa 9:1 enthält) wird zu einer ≈ 63 w/w%igen (alle Kohlenhydrate enthaltenden) wässrigen Lösung konzentriert, zu der Eisessig (180 ml) bei 40-45 °C über 75 min. zugegeben wird. Die Kristallisation beginnt spontan. Die Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und 2,5 Tage gerührt. Feste weiße Kristalle werden abfiltriert, mit Essigsäure und Isopropanol gewaschen und getrocknet, so dass weiße Kristalle von 2'-FL Polymorph II (38,1 g, 84 %) entstehen.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- WO 2010/070104 [0002]
- WO 2012/007481 [0002]
- WO 2012/097950 [0002]
- WO 2012/112777 [0002]
- WO 2011/150939 [0004, 0011]
- WO 2014/086373 [0004]
- WO 2014/009921 [0004]
- WO 0104341 [0024]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- Drouillard et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 1778 (2006) [0002]
- Samain et al. J. Biotechnol. 72, 33 (1999) [0026]