DE1518379C

DE1518379C - Verfahren zur Spaltung racemischer Aminosäuren in ihre optischen Antipoden

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Publication number: DE1518379C
Authority: DE
Inventors: Ichiro Toyonaka; Tosa Tetsuya; Endo Noriko; Kyoto; Chibata (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd

Description

1 2

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zerlegung dem obigen Verfahren benutzt werden. Wäßrige racemischer Aminosäuren, bei dem Acylaminosäuren Lösungen, die Acylase enthalten, können direkt geasymmetrisch hydrolysiert werden. · wonnen werden, indem man einen der Mikroorganis-

Es ist bekannt, daß Acylase aus Schimmelpilzen . men in einem wäßrigen Medium kultiviert und die

wie Aspergillus oryzae die Fähigkeit besitzt, das 5 erhaltene Kultur filtriert. Man kann die Lösung auch

i.-Isomere einer Acylaminosäure selektiv zu der freien herstellen, indem man einen der Mikroorganismen

L-Aminosäure zu hydrolysieren, während das D-Iso- auf ein Weizenkleie-Medium impft, das vorher im

mere nicht hydrolysiert wird, wenn man die beiden Autoklav erhitzt wurde, das Gemisch unter geeigneten

Enantiomorphen mit diesem Enzym in einer wäßrigen Bedingungen bebrütet und die gewonnene Kultur

Lösung bebrütet. Die racemische Aminosäure kann io mit Wasser extrahiert.

so durch die enzymatische Reaktion zerlegt werden. Es können auch Acylaselösungen verwendet werden, Nach Vollendung der Hydrolyse wird die Reaktions- die noch verschiedene Verunreinigungen wie Eiweißlösung zur Ausfällung des Enzyms zum Sieden ge- . und Farbstoffe enthalten, da solche Verunreinigungen bracht oder angesäuert und der Niederschlag dann durch anschließendes Waschen mit Wasser leicht abfiltriert. Im Filtrat wird der in freier Form vorlie-. 15 von dem Adsorbens entfernt werden können, gende Teil der Aminosäure von-dem acylierten Teil Als Ausgangsmaterial eignen sich erfindungsgemäß auf Grund der verschiedenen Löslichkeit abgetrennt. viele N-Acylderivate von' racemischen Aminosäuren. Das Enzym kann also nur einmal verwendet werden Als Beispiele seien angeführt: u-N-Acetylaminosäuren und wird dann verworfen. Außerdem erfordert die wie N-Acetylalanin, N-Acetylvalin, N-Acetylleucin, Isolierung der gebildeten Aminosäure zusätzlich, die 20 N-Acetylisoleucin, N-Acetylserin, N-Acetylthreonin, Entfernung des Enzyms und die Abtrennung der N-Acetylcystein, N-Acetylrrtethionin, N-Aeetylphe- ■ Verunreinigungen von dem Produkt. nylalanin, N-Acctyltyrosin, N-Acety!asparaginsäure,

Erfindungsgemäß lassen sich diese. Nachteile bei N-Acetylglutaminsäure, u-N-Acetyllysin, ü-N-Acetylder Spaltung racemischer Aminosäuren in ihre opti- ornithin, N - A'cetyltryptophan, a- N - Acetylhistidin, sehen Antipoden durch Einwirken von Acylase aus 25 „,<·- N,N'- Diacetyllysin, n,t>- N,N' - Diacetylornithin, Schimmelpilzen aufeine wäßrige Lösung von u-N-Acyl- «-N-Acetyl-r-N-ibenzoyl-lysin. Auch andere Acylaminosäuren ausschalten, indem man das Verfahren derivate wie N-Formyl-, N-Chloracetyl-, N-Brommit einer Acylase durchführt, die in praktisch wasser- acetyl-, N-Propionyl-, N-Butyryl- oder N-Benzoylunlöslicher Form auf einem auf der Basis eines Poly- derivate von α-Aminosäuren können verwendet wersaccarids hergestellten Anionenaustauscher adsorbiert jö den.

ist und wobei man der Lösung der a-N-Acylamino- Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Er-

säure vorzugsweise eine kleine Menge Kobalt(II)- findung wird das Racemat einer N-Acylaminosäure

ionen zusetzt und anschließend die durch selektive in Wasser in der Menge gelöst, daß eine Konzentration

Hydrolyse gebildete freie Aminosäure der L-Kon- von 0,1 bis 0,25 Mol/l erhalten wird und die Lösung

figuration in¹ an sich bekannter Weise von der un- 35 dann auf einen pH-Wert von 5,0 bis 9,0 gebracht,

veränderten «-N-Acylaminosäure der n-Konfigura- Nach Zugabe der oben beschriebenen wasserunlösli-

tion trennt. . chen Enzyinzubereitiing wird das Gemisch bei einer

Anionenaustauscher-Polysaccharide sind Derivate Temperatur von 30 bis 70" C unter Rühren bis zur

von Polysacchariden wie Cellulose, Dextran oder Vollendung der Reaktion bebrütet. Eis ist vorteilhaft,

Stärke und besitzen verschiedene ionisierbare Grup- 40 eine kleine Menge Kobalt(II)-ionen als Aktivator

pen. im Molekül. Sie sind dem Biochemiker gut be- zu der Substrallösuiig zuzusetzen. Nach Beendigung

kannt und diesen als Adsorbentien bei der Reinigung der Reaktion wird das Gemisch zur Gewinnung des

oder Trennung vieler biochemischer Substanzen. Die unlöslichen Enzyms für die anschließende Verwen-

bevorzugten Produkte sind unter verschiedenen Hau- dung filtriert. Das L.-Isomere, das in Form der freien

delsnamen erhältlich, wie z.B. »DEAE-Sephadex« 45 Aminosäure vorliegt, kann auf übliche Weise aus dein

(Diäthylaminoäthyl-dextran), »DEAE-Cellulose« (Di- Filtrat isoliert werden. Man kann beispielsweise das

äthylaminoäthyl-cellulose), »TEAE-Cellulose« (Tri- Filtrat so weit eindampfen, daß der größte Teil der

äthylamino-cellulose),»ECTEOLA-CellulosewieinRe- freien Säure ausfällt. Die Mutterlauge wird dann

aktionsprodukt aus Alkalicellulose mit Epichlorhy- bis zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit

drin und Triäthanolamin) u. a. 50 einer Flüssigkeit extrahiert, in der die Acylaminosäure

Die erfindungsgemäß zu verwendende Acylase- löslich und die freie Säure nicht löslich ist.

zubereitung kann hergestellt werden, indem man eine Es kann aber auch ein kontinuierliches Durehlauf-

dieser Adsorbentien in ein Rohr füllt, so daß eine verfahren an Stelle des oben beschriebenen Verfahrens

Säule erhalten wird, und eine wäßrige Acylaselösung angewandt-werden.. In diesem Fall werden wäßrige

mit geeigneter Durchlaufgeschwindigkeit durch die .55 Lösungen der N-Acylaminpsäure durch eine Säule

Säule schickt,- wobei die Acylase auf dem Adsorbens mit der oben beschriebenen wasserunlöslichen Enzyni-

in wasserunlöslicher Form adsorbiert wird. Das zubereitung geschickt. Die geeignete Durchlaufge-

Adsorbens kann auch zu der Lösung zugegeben und schwindigkeit der Substratlösung läßt.sich leicht auf

das Gemisch einige Stunden gerührt werden. Das experimentellem Wege ermitteln. In der abfließenden

erhaltene Adsorbens wird dann durch Filtration oder ^6o Lösung werden freie L-Aminosäure und D-Acylamino-

Zentrifugierung abgetrennt. säure auf die oben beschriebene Weise voneinander

Als Acylasequelle werden bevorzugt Enzymzuberei- getrennt. .

tungen mit Acylase aus Mikroorganismen wie Aspcr- Es wurde gefunden, daß die Reaktion sogar noch gillus oryzae, Aspergillus meleus, Aspergillus nidulans, bei etwa 70 C zufriedenstellend durchgeführt werden Penicilliuin vinaceum oder Penicülium corymbiferum ^f>5 kann, obwohl die meisten der gewöhnlichen Enzymverwendet. Zubereitungen bekanntlich ihre enzymatische Aktivität

Sie können nach dem Lösen-in Wasser zur Herstel- bei so hohen Temperaturen wie 70"C verlieren. Der

lung der wasserunlöslichen Enzym/ubereitiing nach unlösliche Komplex des Enzyms behält tatsächlich

mehr als 60% seiner ursprünglichen Aktivität, wenn man ihn 15 Minuten auf 70⁰C erhitzt, während das Enzym in freier Form unter den gleichen Bedingungen seine Aktivität nahezu vollständig verlierf. Ferner wurde gefunden, daß ein Erwärmen auf eine Temperatur von etwa 50 bis 60" C die Reaktion beschleunigt. Die Wärmebeständigkeiten des Enzyms in Form des wasserunlöslichen Komplexes und in freier Form wurden miteinander verglichen, indem 5 bis 15 Minuten auf 65 bis 80⁰C erhitzt wurde. Tabelle I zeigt die verbliebene Acylaseaktivität in Prozenten der ursprünglichen Aktivität bei dem unlöslichen Komplex und dem freien Enzym. Wie sich erkennen läßt, ist der Komplex stabiler als das freie Enzym.

Tabelle I

Tempe ratur Γ C)	Erhit zungszeit (Minuten)	Verblieben der Acy unlöslicher Acylasekomplex	er Prozentsatz ;iseaktivität nicht adsorbierte Acylaseiösung
65	5	100	75,2
	K)	88,2	. 64,0
	15	87,3	52,0_f
70	. 5	92,4	25,2
	10	78,3	10,0
	15	61,0	6,0
75 ^: ·	5	29,0	1,2
	10	22,0	1,2
	. 15	7,0	0
80	•5	11,3	0
	10	9,3	0
	15	2,8	0

Das erhaltene D-Isomere, das in Form der Acylaminosäure vorliegt, kann zu der freien D-Aminosäure hydrolysiert werden. Gewöhnlich wird aber das acylierte D-Enantiomorphe zur weiteren Zerlegung racemisiert, weil die meisten D-Aminosäuren biologisch wertlos sind.

In den Beispielen wird die Aktivität aller Enzymzubereitungen als »Einheit« angegeben, wie im »Report of the Commission on Enzymes of the International Union of Biochemistry (1961)« beschrieben ist. Die »Einheit« der Aktivität gibt also die Anzahl der Mikromole des Substrats an, die unter der.Ein wirkung des Enzyms in einer Minute hydrolysiert werden, gemessen nach einer der folgenden Methoden:

1. Freies Enzym
Die Substratlösung enthält:

0,2molare Lösung von N-Acetyl-

DL-methionin (pH 7,0)

3 · 10~³molare Lösung von CoCl₂
.0,1 molare Phosphatpufferlösung
.(pH 7,0) .·...

. 0,5 ml
. 0,5 ml

1,0 ml

2. Unlösliches Enzym im Batchverfahren
Die Substratlösung enthält:

2/15molare Lösung von N-Acetyl-DL-methionin (pH 7,0) 5,0 ml

l/15molare Phosphatpufferlösung
(pH 7,0) 10,0 ml

2-10~^Jmolare Lösung von CoCl₂ 5,0 ml

Zu der Lösung werden 10 bis 40 mg der unlöslichen Enzymlösung zugesetzt, und das Gemisch wird'30 Minuten bei 37° C unter Rühren bebrütet. Nach dem Filtrieren des Gemisches wird das L-Methionin auf die gleiche Weise wie oben bestimmt.

3. Unlösliches Enzym im Durchlaufverfahren

Die Substratlösung enthält Acetyl-DL-methionin in einer Konzentration von 0,05 Mol und CoCl₂ in einer Konzentration von 5 · 10~⁴ Mol (pH 7,0). DieSubstratlösung wird mit einer Geschwindigkeit von 5 m/ml/Std. bei 37°C durch eine Säule des unlöslichen Enzyms, geschickt. Das L-Methionin in den Effluat wird auf die gleiche Weise wie oben bestimmt.

In den folgenden Beispielen steht »DEAE-Cellulose« für Diäthylaminoäthyl-celliilose.

B e i s ρ i e I 1

50 g einer Festkultur, die durch Kultivierung von Aspergillus oryzae auf mit Dampf behandelter Weizenkleie hergestellt war, wurden in 500 ml Wasser 2 Stunden gerührt und filtriert, wobei 450 ml der Enzymlösung mit 0,33 Einheiten/ml erhalten wurden. Die Lösung wurde durch eine Säule mit 30 ml »DEAE-Cellulose« (OH-Typ, Austauschkapazität 0,88 m²/g) geschickt, die in ein Glasrohr mit den Abmessungen 2 χ 9,5 cm gefüllt war, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 75 ml/Std. bei 5° C betrug. Die Säule wurde mit . Wasser gewaschen. Das Enzym war auf dem Adsorbens als wasserunlöslicher Komplex adsorbiert (Acylaseaktivität 46,2 Einheiten/Säule).

345,6 g N-Acetyl-DL-methionin wurden in 900 ml 2n-Natronlauge gelöst, mit 1071 mg Kobalt(II)-chlorid-hexahydrat versetzt und mit Wasser verdünnt, bis das Volumen 91 betrug. Die Lösung (pH 7,0; Konzentration an N-Acetyl-DL-methionin 0,2 Mol, Konzentration an Kobaltionen 5 ■ 10"* Mol) wurde kontinuierlich durch die oben beschriebene Säule geschickt, wobei bei 37" C und mit, Durchlaufgeschwindigkeiten von 40 und 20 ml/Std. gearbeitet wurde. Die Konzentration an L-Methionin in den Effluat wurde kolorimetrisch nach der Ninhydrin-Methode an von Zeit zu Zeit entnommenen Proben geprüft und die Umwandlungsgeschwindigkeit von. N-Acetyl-DL-methionin zu L-Methionin daraus berechnet.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt und zeigen eine beachtliche Beständigkeit des unlöslichen Enzymkomplexes.

Zu dieser Lösung wird. 1,0 ml der Acylaselösung zugesetzt und das Gemisch 30 Minuten bei 37"C bebrütet. Die Menge des gebildeten freien L-Methionins wird kolorimetrisch nach der Ninhydrin-Methode bestimmt.

Tabelle II

Zeit
(Stunden)

. 21
48

Umwandlungsgeschwindigkeiten zu L-Methionin	20 ml/Stunden
Durchlaufgeschwindigkeit	100%
40 ml/Stunden	100%
69,3% .	100%
69,8%
68,9%

Fortsetzung

	Umwandlungsgeschwindigkeiten zu i.-Methionin	20 anstunden
Zeit	Durchlaufgeschwindigkeit	100%
(Stunden)	40 myStunden	100%
75	69,2%	100%
96	69,4%	100%
120	68,8%-
130	69,6%

B e i s ρ i e 1 2

Die gleiche Acylaselösung wie im Beispiel 1 wurde durch eine Säule mit 6 ml »DEAE-Cellulose« (OH-Typ, Austauschkapazität 0,53 m²/g) geschickt, die in ein Glasrohr mit den Abmessungen 0,9 χ 9,5 cm gefüllt: * war, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 75 ml/Std. betrug, anschließend wurde die Säule mit sehr viel Wasser gewaschen. Das Enzym war auf dem Adsorbens in Form eines unlöslichen »DEAE-Cellulosew-Acylasekomplexes (Acylaseaktivität 4,0 Einheiten/Säule) adsorbiert. ·

Eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 0,25 Mol an N-Acetyl-DL-methionin und 5 · 10"⁴ Mol an Kobalt(II)-ionen (pH 7,0) wurde mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 7,5 ml/Std. bei den verschiedenen, in Tabelle III angegebenen Temperaturen durch die Säule geschickt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit zu L-Methionin wurde in allen Fällen berechnet und die folgenden Ergebnisse erhalten:

	Tabelle III	42" C	47°C ■	Temperatur 52° C	57" C	62" C	67" C ·
	37°c	41,0	57,1	65,5	75,2	81,8	86,6
Umwandlungsgeschwindigkeiten zu L-Methionin (%)	31,2

Beispiel 3

Eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 0,05 Mol an N-Acetyl-DL-methionin und 5 · 10~⁴ Mol an Kobalt(II)-ionen wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde bei 37° C mit den in Tabelle VI angegebenen Durchlaufgeschwindigkeiten durch die im Beispiel 1 verwendete Säule geschickt.

Die Umwandlungsgeschwindigkeiten von N-Acetyl-DL-methionin zu L-Methionin wurde nach dem in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Verfahren berechnet.

Das obige Verfahren wurde wiederholt, aber es wurden jeweils die übrigen, in Tabelle IV aufgeführten fx-N-Acyl-DL-aminosäuren an Stelle von N-Acetyl-DL-methionin verwendet. .

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV wiedergegeben.

Tabelle IV

a-N-Acetyi-DL-aminosäuren

Konzentration

(Mol/l) ' Umwandlungsgeschwindigkeiten zu L-u-Aminosauren (%)
gebildete L-Aminosäuren

Durchlaufgeschwindigkeit (ml/Std.)

30

15

. 7,5

N-Acetyl-DL-methionin .......

N-Acetyl-DL-phehylalanin

N-Acetyl-DL-tryptophan

N-Acetyl-DL-vaiin

f-N-Benzoyl-a-N-acetyl-DL-lysin

0,05 0,05 0,05 '0,05 0,02 L-Methionin

L-Phenylalanin

L-Tryptophan

L-Valin

F-N-Benzoyl-L-lysin

52,1
47,3
45,6
55,1
98,0

88,9
81,6
74,8
86,7
100

100 100 100 100

Beispiel4

33,3 mg einer Acylasezubereitung (620 Einheiten/g), die aus Aspergillus oryzae erhalten war, wurden in 3 ml Wasser gelöst. Die Lösung, wurde durch eine Säule mit 10 ml »DEAE-Sephadex« (Handelsname) (A-50, OH-Typ) geschickt, die in ein Glasrohr mit den Abmessungen l,0x 12,7 cm gefüllt war. Die Säule wurde mit reichlich Wasser gewaschen. Das Enzym war auf dem Adsorbens als unlöslicher Komplex adsorbiert worden (Säule Nr. 1, Acylaseaktivität 7,1 Einheiten/Säule).

Außerdem wurden 20 mg einer Acylasezubereitung (570 Einheiten/g), die aus Penicillium vinaccum erhalten war, in 3 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule mit 6 ml » DEA E-CcIIu lose« (OH-Typ) geschickt, die in ein Glasrohr von 0,9 χ 9,5 cm gefüllt war.'Die Säule wurde mit reichlich Wasser gewaschen und der gewünschte Komplex erhalten (Säule Nr. 2, Acylaseaktivität 1,1 Einheiten/Säule).

Eine wäßrige Lösung mit N-Acetyl-DL-methionin und Kobalt(II)-ionen in Konzentrationen von 0,2 bzw. 5· 10"⁴ Mol (pH 7,0) wurde bei 37°C mit der in Tabelle V angegebenen Durchlaufgeschwindigkeit durch die Säule 1 geschickt. Entsprechend wurde eine wäßrige Lösung mit N-Acetyl-Di.-metliionin und Kobalt(Il)-ionen in .Konzentrationen von 0,05 bzw. 5-H)-⁴MoI unter den· gleichen Bedingungen wie oben durch die Säule 2 geschickt. Die Umwandlungsgeschwindigkeit zu. i.-Methionin ist für beide Fälle in der Tabelle V wiedergegeben.

	Konzen tration an	Tabelle V	15	7,5	3	2
Enzym	N-Acetyl-		38,4 .	65,3	100	—
zuberei	DL-meth-		18,6	35,1	—	98,5
tung	. ionin-
	(Mol/I)	- Umwandlungsgeschwindigkeit (%)
	0,2	Durchlaufgeschwindigkeit (ml/Std.)
(I)	0,05
(Π)
	30
20,3
9,4

IO

Beispiel 5

50 g einer festen Kultur, die durch Kultivierung von Aspergillus oryzae auf einem festen Medium aus Weizenkleie und Reisschalen hergestellt war, wurden mit 500 ml Wasser 2 Stunden extrahiert. Die erhaltenen 450 ml Extrakt wurden durch eine Säule mit 30 ml »DEAE-Cellulose« (OH-Typ) in einem Glasrohr von 2.x 9,6 cm geschickt, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 75 ml/Std. betrug. Die Säule wurde mit reichlich. Wasser gewaschen, und es wurde der unlösliche Komplex erhalten (Acylaseaktivität 46,2 Einheiten/Säule). .

114,2 g N-Acetyl-DL-methionin und 357 mg Kobalt(II)-chlorid-hexahydrat wurden in 2n-Natron-^v lauge gelöst, und es wurde eine Lösung mit dem pH-Wert 7,0 erhalten. Die Lösung wurde bei 37° C mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von 20 ml/Std.. durch die oben beschriebene Säule geschickt. Das Effluat wurde aufgefangen und unter vermindertem Druck auf ein Fünftel ihres Anfangsvolumens eingeengt, wobei der größte Teil des L-Methionins auskristallisierte. Nach dem Abfiltrieren der Kristalle wurde die Mutterlauge zur Trockne gedampft, Äthanol zu dem Rückstand zugegeben, um das Acetyl-D-methionin zu extrahieren und filtriert, um die zurückbleibenden Kristalle von L-Methionin zu isolieren. Die gewonnenen Kristalle wurden vereinigt und aus wäßrigem Methanol umkristallisiert, wobei 40,8 g L-Methionin erhalten wurden, die sich bei 279 bis 28 Γ C zersetzten.

45

50

55

IaYo⁵ = +23,4° (C = 3, in n-HCl).

Der Äthanolextrakt von oben wurde zur Trockne gedampft und der Rückstand in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule mit einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp geschickt, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 200 ml/ Std. betrug. Das Harz wurde mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen, die abfließende Flüssigkeit mit den Waschlösungen vereinigt und zur Trockne gedampft. Der Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert und ergab 50,6 g N-Acetyl-D-methionin vom Schmelzpunkt 104⁰C. '

[α]« = +19,6° (C = 3, in Wasser).

9,6 g dieser Verbindung wurden in 85 ml 2n-Salzsäure 2 Stunden am Rückfluß gekocht. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne gedampft, der Rückstand mit 2 η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 5,5 neutralisiert und aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert, wobei 5,3 g n-Methionin erhalten wur- ^b5 den, die sich bei 280 bis 281" C zersetzten.

MS⁵ = -23,4° (C = 3, in n^HCI).

Beispielo

82,9 g N-Acetyl-DL-phenylalanin wurden in 200 ml .2 η-Natronlauge gelöst. 238 mg Kobalt(II)-chloridhexahydrat wurden zu der Lösung zugesetzt, und die Lösung wurde dann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 2 1 verdünnt. Die Lösung wurde durch die im Beispiel 5 verwendete Säule geschickt, wobei die Durchlaufgeschwindigkeit 15 ml/Std. bei 37"C betrug.

Die abfließende Flüssigkeit wurde auf etwa ein Fünftel ihres Anfangsvolumens eingeengt, wobei der größte Teil des L-Phenylalanine auskristallisierte. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt, und die Mutterlauge wurde zur Trockne gedampft. Zum Rückstand wurde Äthanol zugegeben, um das Acetyl-D-phenylalanin zu extrahieren, und die zurückbleibenden . Kristalle wurden abfiltriert. Die gewonnenen Kristalle wurden vereinigt und aus Wasser umkristallisiert, wobei 29,6 g L-Phenylalanin erhalten wurden, die sich bei 280 bis 282° C zersetzten.

lall⁷ = -34,4* (C = 1, in Wasser).

Der Äthanolextrakt von oben wurde zur Trockne gedampft und der Rückstand aus verdünnter Salzsäure 'umkristallisiert. Die erhaltenen Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert, wobei 37,4 g N-Acetyl-D-phenylalanin vom Schmelzpunkt 170" C erhalten wurden.

[a]² ₀ ⁷= -50,5° (C■= 1, in absolutem Äthanol).

10,4 g dieser Verbindung wurden hydrolysiert und in der im Beispiel 5 beschriebenen Weise umkristallisiert, wobei 6,4 g D-Phenylalanin erhalten wurden, die sich bei 283 bis 284° C zersetzten.

Ia]I⁷ = +34,9° (C = ί, in Wasser).

B e i s ρ i e 1 7

30 ml »DEAE-Cellulose« (OH-Typ) wurden zu 350 ml der im Beispiel 1 verwendeten Enzymlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 Stunden unter Kühlung gerührt und dann filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wurde sorgfältig mit Wasser gewaschen, wobei- ein wasserunlöslicher »DEAE - Cellulose«- Acylasekomplex erhalten ' wurde (Acylaseaktivität 20,6 Einheiten/g auf Trockenbasis). 8,29 g N-Acetyl-DL-phenylalanin wurden in 20 ml 2n-Natriumhydroxyd gelöst. Die Lösung würde mit 24 mg Kobalt(II)-chlorid-hexahydrat versetzt und auf ein Gesamtvolumen von 200 ml verdünnt. Dann wurde der obige Enzymkomplex zu der Lösung zugegeben und das Gemisch 24 Stunden bei 37° C unter Rühren bebrütet. 2,82 g L-Phenylalanin und 3,61 g N-Acetyl-D-phenylalanfn konnten durch Wiederholung des im Beispiel 6 beschriebenen Verfahrens erhalten werden. Während des Fortschreitens der Reaktion wurde die Umwandlungsgeschwindigkeit zu L-Phenylalanin gemessen, wobei die folgenden Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle VI

Umwandlungsgeschwindigkeit
zu Phenylalanin (%)

Bebrütungszeit (Std.)

42,4

63,4

009 646/159

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Spaltung racemischer Aminosäuren in ihre optischen Antipoden durch Einwirken von Acylase aus Schimmelpilzen auf eine wäßrige Lösung von a-N-Acylaminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit einer Acylase durchführt, die in praktisch wasserunlöslicher Form auf einem auf der Basis eines Polysaccarids hergestellten Anionenaustauscher adsorbiert ist, und wobei man der Lösung der «-N-Acylaminosäure vorzugsweise eine kleine Menge Kobalt(II)-ionen zusetzt und anschließend die durch, selektive Hydrolyse gebildete freie Aminosäure der !.-Konfiguration in

an sich bekannter Weise von der unveränderten a-N-Acylaminosäure der D-Konfiguration trennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens die Lösung des a-N-Acylderivats der racemischen Aminosäure kontinuierlich durch eine Säule schickt, die die in praktisch wasserunlöslicher Form auf dem Anionenaustauscher adsorbierte Schimmeipilzacylase enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren mit einer Schimmeipilzacylase durchführt, die aus Aspergillus oryzae oder PenicilHum, vinaceum gewonnen wurde. λ ^ -,.. . .· ^ .