NO167024B - Fremgangsmaate for rensing av karnitin. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for rensing av karnitin, dvs. 4-trimetylamino-3-hydroksy-smørsyre, og særlig L-karnitin oppnådd på biokjemisk måte.

Karnitin anvendes i første rekke på det biologiske område, særlig det farmakologiske område, samt innen kosmetikk- og næringsmiddelindustrien og dets renhet er en viktig betingelse for dets anvendelse. I og med at de kjemiske fremstillings-metoder fører til racemiske blandinger, mens bare L-stereo-isomeren er biologisk aktiv, er det bare den biologiske frem-stillingsmåte som er interessant, da denne gir L-isomeren. Det er da av betydning å ha tilgang til en renseprosess som tillater lett fjernelse av forurensningene som skriver seg fra de materialer som anvendes ved den biokjemiske fremstillings-måte, særlig forskjellige proteiner og uorganiske substanser. Dette er den interessante fordel som følger med fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse idet denne tillater at man unngår den klassiske kromatograferingsmetode som ikke fjerner de uorganiske forbindelser.

Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse gjør det mulig med direkte oppnåelse av karnitinet i dets amfotære form i stedet for et salt av en sterk syre, særlig hydrokloridet, som i tilfellet med den tidligere kjente teknikk, f.eks. i henhold til patentskriftet FR- 2 398 046. Vider omfatter den maksimalt 5 trinn, mens det er minst 10 påfølgende operasjons-trinn i den tidligere kjente prosess hvor man anvender en kolonne med ionebytterharpiks.

Renseprosessen i henhold til den foreliggende oppfinnelse erkarakterisert vedat først surgjøres den vandige blanding som

inneholder karnitinet slik at tilstedeværende proteiner utfelles og etter separering av disse erstattes vannet i blandingen med en lavere alkohol, i det minste karnitinet oppløses ved oppvarming mens de uorganiske substanser separerer. Man oppnår da en alkoholoppløsning som er rik på karnitinsaltet og med god renhet.

Når man ønsker et enda renere produkt og særlig når fremstillingen av den amfotære forbindelse (CH,),N-CH-CHCH^COO~ i seg

-Jo11 2

OH

selv eller i form av sitt salt, fullføres rensingen på følg-ende måte. Faststoffet, ekstrahert fra den ovennevnte alko-holoppløsning, overføres til vandig oppløsning som nøytrali-seres med en base til omtrent 7,2 og den nøytraliserte oppløs-ning behandles slik at vannet erstattes av en lavere alkohol som utfeller saltet av nøytralisasjonsbasen for syren som tjente til surgjøring av den initiale blanding. Den alkohol-oppløsning som blir tilbake inneholder det amfotære karnitin med utmerket renhet som utvinnes i fast tilstand, særlig ved krystallisasjon i kulden, ved avdamping av oppløsningen eller ved utfelling ved tilsetning av et flytende ikke-løs-ningsmiddel.

I det følgende forklares de fem prosesstrinn i henhold til oppfinnelsen og som fører til et meget rent L-karnitin fra en uren vandig oppløsning av denne forbindelse, særlig som skriver seg fra blandingen oppnådd ved bio-omdannelse av 3-dehydrokarnitin.

1 - SURGJØRING AV BLANDINGEN

En syre, foretrukket en sterk syre, tilsettes den vandige opp-løsning slik at pH i denne nedsettes til en verdi omtrent 1-3, foretrukket nær eller lik 2. Syrer som svovelsyre, svovelsyrling, fosforsyre, perklorsyre, benzensulfonsyre etc. anvendes, idet f^SO^egner seg særlig bra. Denne operasjon virker

til utfelling av proteinene som befinner seg i den behandlede blanding og som deretter kan fjernes ved filtrering eller sentrifugering av den surgjorte væske.

2- UTFELLING AV UORGANISKE SALTER

Filtratet fra det foregående trinn behandles for å erstatte vannet med en lavere alkohol som kan oppløse karnitinet. Dette kan gjennomføres ved avdamping av vannet i oppløsningen og tilsetning av alkohol, eller bedre ved medrivningsavdamping Dette kan gjennomføres ved avdamping av vannet i oppløsningen og tilsetning av alkohol, eller bedre ved medrivningsavdamping med alkohol. Til slutt holdes alkoholoppløsningen ved en temperatur hvor karnitinet oppløses fullstendig mens de uorganiske forbindelser utfelles og separeres. Alkoholen kan være metanol, etanol, metoksyetanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, tert-butanol eller isobutanol idet etanol egner seg spesielt bra. Blandinger av alkoholer kan anvendes. Alt etter arten av alkoholen og oppløseligheten av karnitinet arb eider man ved en passende temperatur som generelt er fra 20-100°C.

3 - OVERFØRING I VANDIG LØSNING

Fra den alkoholiske oppløsning, oppnådd i det foregående trinn 2, kan man utvinne det oppløste karnitin i form av et salt av syren anvendt i trinn 1, med god renhet. Hvis man imidlertid ønsker å drive rensingen lenger, eller det dreier seg om frem-stilling av amfotært karnitin i stedet for dets salt, går man frem på følgende måte. Fra den alkoholiske oppløsning ekstra-heres karnitinsaltet, særlig ved avdamping av alkoholen eller ved utfelling ved hjelp av et ikke-løsningsmiddel som f.eks. et keton. Den sistnevnte foranstaltning bidrar ytterligere til å forbedre renheten. Det oppnådde salt løses i vann, foretrukket i en mengde av 100-500 g pr liter og oppløsningen underkastes det etterfølgende trinn 4.

4 - NØYTRALISERING

Oppløsningen fra det foregående trinn 3 nøytraliseres ved tilsetning av en base, oftest natriumhydroksyd. Selv om pH ved slutten av nøytralisasjonen kan svinge mellom 6,9 og 7,4 er verdien foretrukket nær eller lik 7,2. Denne nøytralisering frigir det amfotære karnitin i henhold til reaksjonen:

Ved at man her som eksempel har anført svovelsyre for surgjør-ing i henhold til trinn 1 og riatriumhydroksyd som base for nøytraliseringen.

Oppløsningen behandles etter denne nøytralisering for å erstatte vannet med en lavere alkohol som kan oppløse karnitinet. Man kan her arbeide som i trinn 2 i det foregående, dvs. ved avdamping av vannet, foretrukket under vakuum, og tilsetning av alkohol, eller avdamping under vakuum med medrivning av alkoholen.

Den nye alkoholoppløsning oppnådd på denne måte holdes ved den temperatur hvor karnitinet forblir oppløst, mens de uorganiske salter (natriumsulfat i det ovennevnte eksempel) dannet ved nøytraliseringen utfelles.

Man får da en alkoholoppløsning av meget rent karnitin.

5 - UTVINNING I TØRR TILSTAND

Fra alkoholoppløsningen tilbake etter trinn 4 utvinnes det faste tørre karnitin ved fullstendig avdamping av løsnings-midlet. En annen foranstaltning som også fremmer renheten består i å utfelle karnitinet ved tilsetning av et ikke-løs-ningsmiddel til alkoholoppløsningen og tilsetning av et over-skudd av aceton tillater avsetning av fast, meget rent karnitin.

Som nevnt i det foregående, selv om karnitin fra en hvilken som helst kilde kan renses ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse, egner den seg særlig godt for blandinger fra bio-omdannelse av det hydrokarnitin med asymmetrisk reduksjon av dette ved hjelp av NADH, med reduksjon av dannet NAD<+>med formiation, i nærvær av formiat-dehydrogenase (FDH). Utbyttene av L- arnitin og rensingen er bemerkelsesverdige når hydrogenasen FDH skriver seg fra gjærtypene Candida bodiini eller Pichia pastoris.

Det er disse to sistnevnte typer av oppløsninger av karnitin som behandles ved hjelp av de etterfølgende eksempler.

EKSEMEPL 1

Fremstillingen av L-karnitin gjennomføres ved innvirkning av redusert nikotinamid-adenindinukleotid, NADH, på dehydrokarnitin, og reduksjon av dannet NAD<+>ved hjelp av en maur-syregruppe med formiat-dehydrogenase FDH som katalysator.

Synteseskjemaet er da

(L-karnitin) og CDH = karnitin-dehydrogenase.

Detanvendte CDH skriver seg fra en ekstrakt fra dyrking av Pseudomona putida. Den utfelles ved hjelp av ammoniumsulfat tilsatt med 250 g pr liter til råekstrakten (55% metning). Felling oppnådd fra 20 ml ekstrakt, oppløses på nytt i 7 ml buffer Na2HP04/KH2P0450 mM, pH = 7,0, idet oppløs-

ningen underkastets gelfiltrering (G200) med etterfølgende~kromatografering på 5'AMP - Sepharose 4B (enzymet immobilisert ved affinitet etterfulgt av eluering med NAD<+>mM) og til slutt underkastet gelfiltrering ACA 44 for gjenvinning av enzymet berøvet NAD<+>og NaN^(dette er tilsatt eluerings-buffere for beskyttelse mot forurensningene).

Det derved oppnådde rene enzym har en spesifikk aktivitet på 55 U/mg og man innfører 50 U i en 50 ml reaktor.

Denne reaktor inneholder også: 2mM NAD<+>, 150 mM HC02NH4,

6 mg kloramfenikol og 40 U dvs. 60 mg kommersielt frysetørket formiat-dehydrogenase, DFH fremstilt fra Candida bodiini (ECl.2.1.2. — solgt av BOEHRINGER MANNHEIM).

Reaktoren tilføres en oppløsning holdt ved 4°C inneholdende krystallisert dehydrokarnitin-hydroklorid, oppløpst med konsentrasjon 0,8 M, så vel som maursyre 0,8 M. Innføringstakten er 1,2 ml/time. Temperaturen i reaktoren holdes ved 30°C og pH holdes ved 7,0 ved tilsetning av 2 N ammoniakk styrt ved hjelp av et pH-reguleringssystem.

Etter 230 timer oppnås et sluttvolum på 315 ml og en konsentrasjon av L-karnitin på 477 mM tilsvarende 98% utbytte.

Den derved oppnådde oppløsning underkastes følgende rense-operasjoner.

Bio-omdannelsesblandingen surgjøres til pH 2,0 med konsentrert svovelsyre. Proteinene utfelles og etter filtrering inndampes filtratet under vakuum (70°C/15 mmHg) og underkastes en med-rivningsbehandling med etanol. Blandingen berøves vann og an-rikes på et etanol. L-karnitinet er oppløselig i varm etanol mens de uorganiske salter ikke er oppløselige og utfelles. Etter filtrering på glassfritte, utvinnes en etanoloppløsning av L- tørnitinsulfat som utfelles med kold aceton (volumforhold aceton/etanol = 90/10). L-karnitinsulfatet oppløses i vann og nøytraliseres til pH = 7,2 ved hjelp av konsentrert natriumhydroksyd. Den oppnådde vandige løsning inndampes under vakuum under medrivning med etanol. Blandingen berøves vann og natriumsulfatet utfelles i etanolen. Etter filtrering på glassfritte gjenvinnes en etanoloppløsning av L-karnitin som ikke inneholder noe sulfat (test med Ba<+>^). Løsningsmidlet avdampes til oppnåelse av et tørt produkt. Dette oppløses i en minimumsmengde varm etanol (40°C) og utfelles ved hjelp av kold aceton. Det totale utbyttet av rensingen er 80%. Det totale utbyttet ved fremstillingen av rent L-karnitin blir da 80x98/100 = 78,4%.

Egenskapene av det oppnådde produkt er:

(o<t>)<20>= -30,2° (2,5, vann)

D

Sulfater mindre enn 400 ppm

-<1>H NMR (D20) (300 MHz) : $(ppm):

4,4 (guintuplett; J:5Hz; 1H); 3, 25 (dublett) - J:5Hz;2H); 3,05(singulett; 9H);2,25(dublett av dublett; 2H).

Enzymatisk bestemmelse: 100% karnitin.

EKSEMPEL 2 (sammenligning)

Alle operasjoner i eksempel 1 gjentas med den eneste forskjell at det anvendte FDH skriver seg fra gjæren Torulopsis candida (GFP 206) som beskrevet i eksempel 5, side 8 i det franske patentskrift 2.398046. Utbyttet av renset L-karnitin er da bare 58% og renheten av sluttproduktet er bare 92%. Dette viser betydningen av FDH som skriver seg fra Candida bodiini, tilsvarende den foretrukne form for den foreliggende oppfinnelse .

EKSEMPEL 3

Ved å forsøke å begrense volumøkningen i forbindelse med bio-omdannelsen anvendte man mer konsentrerte oppløsninger av reaksjonskomponentene dehydrokarnitin, maursyre og ammoniakk. Videre reduserte man konsentrasjonen av NAD<+>.

Således tilførte man i en 50 ml reaktor oppløsningen inneholdende :

Na2HP04/KH2P0450 mM pH: 7,5

NAD<+>0,2 mM

6 mg kloramfenikol.

40 U CEH summarisk renset som beskrevet i det foregående.

250 U FDH BOEHRINGER-MANNHEIM fra Candida Bodiini.

/VM.

CDH, ekstrahert fra P. Putida, ble utfelt med ammoniumsulfat (55% metning), sentrifugert og sentrifugeringsresten oppløst på nytt i fosfatbuffer 50 mM pH 7,5. En oppnådd oppløsning ble dialysert i 16 timer mot den samme buffer.

Reaktoren ble deretter tilført en oppløsning opprettholdt ved 4°C inneholdende dehydrokarnitin og maursyre og med konsen-trasjoner av begge på 1,6 M. Tilførselstakten var 0,6 mM/time Reaktortemperaturen ble holdt ved 30°C og pH ved 7,5 ved styrt tilsetning av 8 N ammoniakk. Etter 48 timer oppnås et sluttvolum på 90 ml og en konsentrasjon av L-karnitin på 500 mM, dvs. et utbytte på 98%.

Rensingen ble gjennomført som i eksempel 1 og ga det samme resultat.

EKSEMPEL 4

Det samme forsøk som i eksempel 3 ble gjennomført bortsett fra at det ble anvendt FDH fra Pichia Pastoris med følgende modi-fikasjoner :

NAD<+>0,4 mM

HC02NH.500 mM

4

og i fravær av kloramfenikol pga. at den sterke saltholdighet som skyldes den høye initiale konsentrasjon av arttnoniumformiat begrenset faren for forurensning. FDH ekstrahert fra en kul-tur av Pichia pastoris utfelt med ammoniumsulfat (50% metning), sentrifugert og resten oppløst på nytt i fosfatbuffer 50 mM pH 7,5 idet den oppnådd oppløsning ble dialysert i 16 timer mot bufferen.

De andre parametere for reaktoren var som i eksempel 3.

Etter 49 timer er sluttvolumet 60 ml og konsentrasjonen av L-karnitin 700 mM som tilsvarer et utbytte på 93%.

Bestemmelsen av enzymene viser en restaktivitet for 90% med hensyn til CDH og 90% med hensyn til FDH.

Rensingen av det oppnådde karnitin ble gjennomført på samme måte som i eksempel 1 og ga det samme resultat. Det viser seg at FDH fra Pichia pastoris gir ekvivalente resultater med FDH fra Candida bodiini, vesentlig bedre resultater enn oppnådd med FDH fra Torulopsis candida (eksempel 2).

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for rensing av karnitin,karakterisert vedat den vandige blanding inneholdende karnitinet surgjøres slik at tilstedeværende proteiner utfelles og etter separeringen av disse erstattes vannet i blandingen med en lavere alkohol som i det minste ved oppvarming av blandingen oppløser karnitinet mens uorganiske substanser separeres.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat faststoffet, ekstrahert fra den oppnådde alkoholoppløsning, bringes i vandig opp-løsning som nøytraliseres med en base til pH mellom 6,9 og 7,4 og den nøytraliserte oppløsning behandles slik at vannet erstattes med en lavere alkohol for utfelling av saltet av nøy-traliseringsbasen med den syre som tjente for surgjøring av den initiale blanding.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2,karakterisert vedat surgjøringen gjennom-føres slik at pH i blandingen bringes til en verdi fra 1-3, foretrukket 2 eller omtrent 2.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-3,karakterisert vedat det som syre for sur-gjøringen anvendes svovelsyre, svovelsyrling, fosforsyre, perklorsyre eller benzensulfonsyre, foretrukket svovelsyre.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4,karakterisert vedat det som lavere alkohol anvendes metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, isobutanol,tertbutanol eller en blanding av slike alkoholer idet etanol foretrekkes.

6. fremgangsmåte som angitt i krav 1-5,karakterisert vedat separeringen av uorganiske forbindelser fra alkoholen foretas ved en temperatur mellom 20 og 100°C og hvor karnitinet er fullstendig oppløst.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-6,karakterisert" ved at etter separeringen av de uorganiske forbindelser bringes karnitinet i vandig oppløs-ning foretrukket med konsentrasjon 100 - 500 g pr. 1.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7,karakterisert vedat en base tilsettes til den vandige oppløsning for å frigi amfotært karnitin hvoretter vannet i oppløsningen erstattes med en lavere alkohol for å utfelle det uorganiske salt som ble dannet ved tilsetning av basen og den alkoholiske oppløsning inneholdende det rensede amfotære karnitin, gjenvinnes.