DE1442113A1

DE1442113A1 - Verfahren zur Zuechtung von einzelligen Gruenalgen,wie Chlorella

Info

Publication number: DE1442113A1
Application number: DE19651442113
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Endo; Kei Nakajima; Minoru Shirota
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1964-09-11
Filing date: 1965-09-03
Publication date: 1969-10-09
Also published as: GB1109658A; US3316674A; BR6573021D0

Description

41 1 ld

Kabushiki Kaisha Yakult Honsha

in
Tokio (Japan)

Vorfahren zur Züchtung von einzeiligen Grünalgen, wie

Chlorella

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur industriellen Züchtung von einzelligen Granalgen, wie Chlorella unl Senedesmus (nachstehend als Cnlore'lla u.dgl. bezeicnnst), iie als Rohstoff für Lebensmittel, Futtermittel, tfaciistumsfordernde Faktoren fur Milchsäurebakterien, Arzneimittel, Chlorophyll und physiologisch, aktive Faktoren u.dgl. Bedeutung gewonnen haben.

Chlorella u.dgl. sind als pnotosynthetisoher, autotropher Organismus bekannt, und im allgemeinen wurde das Verfahren IiC Teichkultur in einem offexien, umge.välztexi System im Freien bisher als einziges Verfahren zur Massenzuchtung

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angewendet. Andererseits ist es jedoch, bekannt, dass Chlorella u.dgl. in Gegenwart von organischen Substanzen ein sogenanntes heterotrophes Wachstum zeigen.

Die Erfinder haben bereits ein Verfahren zur Züchtung von Chlorella u.dgl. in großtechnischem Maßstab in einem Tank entwickelt, wobei ohne Lichtzufuhr Zucker als Energiequelle verwendet, also nur vom heterotrophen Wachstum Gebrauch gemacht wurde. Die Erfindung betrifft ein modifiziertes Verfahren, das sich von diesem Tankkulturverfahren ableitet. Es wird nämlich bei der heterotrophen Züchtung von Chlorella u.dgl., wie sie oben beschrieben ist, gleichzeitig die Teciinik des sogenannten autotrophen Wachstums, wobei Licht zugeführt wird, angewendet; nach diesem Verfahren werden weitere Verbesserungen der Wachstumsgeschwindigkeit und eine grössere Ausbeute an Chlorella u.dgl. erhalten, die in den Komponenten der Algexizellen reich an Farbstoffen sind.

Die Erfindung wird in der nachstehend beschriebenen Weise ausgeführt. .-

Wurden Chlorella u.dgl. iieterotroph mit Hilfe von Zuckern als Energiequelle gezücntet, so entstand Kohlendioxyd, und es wurde gefunden, dass eine Bestrahlung in diesem Fall zu einer pnotosynthetischen Reaktion führte. Diese Beobachtung

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lieferte ein Verfahren zur Erzeugung eines sogenannten mixotrophen Wachstums auf industrieller Basis, wobei gleichzeitig ein heterotrophes und autotrophes Wachstum stattfand. Dieses Verfahren wurde entwickelt, nachdem diese Erscheinung vollständig erklärt war.

Man nimmt im allgemeinen an, dass für das maximale Wachstum von Chlorella u.dgl. eine Lichtintensität von mehr als 10 COO Lux erforderlich ist, wenn die Züchtung nach lern phot©synthetischen autotrophen-"Wachstum durchgeführt wird, und dass bei einer Belichtung mit nur 400 Lux überhaupt kein Wacnstum stattfindet.

Es wurde jedoch gefunden, dast- beim neterotrophen Wachstum. ein maximales Wachstum erreic.it werden kann, wenn man gleichzeitig mit-einer Lichtstarke von weniger als 1COC Lux arbeitet und dass sogar eine Lichtstarke voxi nur 10 Lux merkliche Wirkungen hinsichtlicn des '.Vac ns turas von Chlorella zeigt. Dies beweist, dass auch beim neterctropiien Wachstum lie Anwendung von parallellaufenden Rtoff.vechselvorgä.i^en im photosynthetiscnen Sy3ten; vcrteilnaft ist. -üesr.alc liefert; diese mixotrophe Tankkultur -^iλ Vc-ri'ahre.-*, las ni^ht nur dem älteren Verfahre;: des ^ nc tosy..t;i£tis one., autotropher. Vi'achetun.s, sondern auch ieir. neuere.! το.. iSü Erfi.iier.x auf-

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gefundenen Verfahren den heterotrophen Tankkultur überlegen ist.

Tabelle 1 zeigt den Einfluss verschiedener Lichtintensitäten auf die Wachstumsmengen bei mixotrophem Wachstum.

Tabelle 1

Einfluss der Lichtintensität auf die Wachstumsmengen

Lichtin tensität	Dauer de CSi	48	; 96	ir Züchtung -d.)	192	Chlorophyllgehalt in den erhaltenen
(Lux)	0,16	0,42	144	5,6	Algenzellen (*)
0	0,28	1 ,16	1,6	6,6	1,8
10	0,28	1,2	4,6	6,4	1,9
30	0,26	1,1	5,4	6,0	- 2,6
100	0,28	1 ,02	5,0	6,6	2,8
300	0,32	1,56	5,6	8,1 _	3,3
1000	7,0	3,7

Anmerkung: Die Beleuchtungsstärke bezieht sich auf die Oberfläche einer Kulturlösung von einem Liter. Die Wachstumsmenge hat die Dimension g/Liter. Kulturbedingung: Nach dem Einimpfen in ein Kulturmedium aus anorganischen Salzen unter Zusatz von 1 1° Glukose und 0,5 i° Hefeextrakt bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet.

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Wie aus den in Tabelle 1 angegebenen Versuchsergebnissen hervorgeht, wurde die Wachstumsmenge schon bei einer Lichtintensität von nur 10 Lux, verglichen ohne Belichtung, merklich beeinflusst, und die Wachstumsmenge erhöhte sich proportional zur Lichtstärke. Hinsichtlich der Ausbeute gegenüber Zuckern betrug die Ausbeute ohne Bestrahlung 56 p, wogegen die Ausbeute bei einer Lichtstärke von 1000 Lux 81 /ο, also das 1,4fache, betrug. Dar Gehalt an Chlorophyll und den Farbstoffen de3 Carotinoidsystems in den Algsnzellen erhöhte sich proportional zur Lichtintensität, und bei 1000 Lux war dieser Gehalt sogar gleich wie bei Chlorella, die durch photosynthetisches, autotrophes Wachstum erhalten wurde»

Es liess sich experimentell nachweisen, dass die Belichtung offenbar einen wachstumsfördernden Faktor darstellt, unabhängig, ob dem Kulturmedium Aminosäuren zugegeben wurden oder nicht.

Das verwendete Licht kann künstliches Licht sein, und da sogar ein ziemlich achwaches Licht den gewünschten Effekt gibt, können die üblicherweise verwendeten Gärtanks, im allgemeinen ohne groase Umbauten verwendet werden. Eine Belichtung durch Schaugläser (normalerweise zwei) am oberen Exide des Tanks, durcn die die Kultur beobachtet werden kann, ist

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ausreichend. Beispielsweise ergibt eine Belichtung mit zwei 100-Watt-Lampen auf 1000 Liter Kulturmedium durch die oberen Schaugläser bei einer Entfernung von 50 cm zwischen der Lichtquelle und der Oberfläche der Kulturflüssigkeit an der Oberfläche der Flüssigkeit eine Beleuchtungsintenaität von mehr als 5000 Lux; da weiterhin das Kulturmedium immer gerührt wird, wird der Zweck und die Wirkung der Belichtung vollkommen erreicht. ■ ·

Das beschriebene Kulturverfahren eignet sich sowohl für die selektive Isolierung von Stämmen von Chlorella u.dgl. als auch für die industrielle Züchtung dieser Stämme. Das Verfahren arbeitet zuverlässig bei der Isolierung der Stämme und auch bei deren Massenproduktion.

Die Merkmale des Kulturverfahrens unter Anwendung des mixotrophen Wachstums lassen sich wie folgt zusammenfassen:

(a) Die Wachstumsmenge je Mengeneinheit Kulturmedium ist hoch, und die Ernte lässt sich wirtschaftlich gewinnen (Die Ausbeute, bezogen auf den Zucker, ist hoch).

(b) Der Farbstoffgehalt in den Algen erhöht sich.

(c) Die Anzahl der Stämme von Chlorella u.dgl., auf die die Tankkultur anwendbar ist, erhöht sich, wobei man Stämme mit grossen Wachstumsmengen erhält, die auf diese Weit· bei passenden Kulturbedingungen verwendbar sind.

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Wie die Erfinder bereits festgestellt haben, ist das jüngere Verfahren des heterotrophen Wachstums dem älteren Verfahren des autotrophen Wachstums (in einem offenen, umgewälzten System) überlegen; das Verfahren des mixotrophen Wachstums, das den Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt, ist jedoch vom industriellen Standpunkt noch viel vorteilhafter ale das Tankkulturverfahren mit heterotrophen Wachstum.

Naohatehend sind einige Ausführungsbeispiele angegeben.

Beispiel 1

Ein Medium wurde unter Verwendung der nachstehenden Komponenten hergestellt:

Harnstoff 1,0 g/Liter

MgSO₄.7H₂O 0,25 "

KH₂PO₄ 0,25 "

KCl 0,25 "

Fe-Lösung und modifizierte A^-Lösung je 1 ml

Glukose 1C,0 g/Liter

Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.

. *Fe-Lösung: FeSO₄-TH₂O 2,0 g/Liter

konz. H₂SO₄ 4 Tropfen/Liter

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- 8' - - ■■■-. ■..'■■

^Modifizierte A^-Lösung: H₅BO₅ .......... 2,86 g/Liter

MnCl₀ ·4Η_ο0 1,81 "

ZnSO.·7ΗλΟ 0,221 "

MoO₅ .... .. 0,0177' "

₄*5H₂0 ",... ...0,079 "

CoCl₂ 1,00 "

100 ml Kulturmedium wurden in einen 500 ml-Kolben eingefüllt, mit einem Wattepfropfen verschlossen,,unter einem Druck von etwa 1 atü 15 Minuten sterilisiert, mit verschiedenen Stämmen von Chlorella, die vorher in Eeinkultur isoliert und auf getrennten Agarmedien mit anorganischen Salzen autotroph gezüchtet waren, beimpft.Die Stämme' wurden unter Schütteln bei 30⁰C gezüchtet, wobei die Oberfläche des Mediums mit 1000 Lux belichtet wurde. \ ^: \

Ein Stamm, der nach 6 Tagen das aktivste Wachstum zeigte, würde auf ähnliche Weise mehr als dreimal weitergezüchtet. Die so erhaltene Kultur wurde als. Impfkultür verwendet.·

Die Impfkultur wurde dann in 1 Liter eines Kulturmediums mit der obigen Zusammensetzung (0,5 g/Liter) eingeimpft und unter: Rühren bei 3O⁰C zwei Tage unter Belichtung mit einer Intensität von 1000 Lux gezüchtet, worauf das gebildete Produkt geerntet

wurde. ■· \ .

Ausbeute (Trockensubstanz) .............. 6 g/Liter.

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I H *♦ ί. I IU

Bei der großtechnischen Erzeugung wird die Kulturlösung in allen Tanks mehrmals um das Zehnfache , d.h. von 4 Liter auf 40 Liter, dann auf 400 Liter und schliesslich auf 40C0 Liter erhöht,, wobei die in der vorausgegangenen Stufe erhaltene Kultur der nachfolgenden Kultur eingeimpft werden kann. Jeder Kulturtank ist mit einem Rührer, einer Belüfturigsvorrichtung und einem Thermostaten ausgerüstet, und am oberen oder seitlichen Ende des Kulturtanks ist eine Schauöffnung aus Glas, die hitze- und druckbeständig ist, angebracht.

Das Kulturmedium mit der obigen Zusammensetzung v/ird in den Tank eingefüllt, unter Druck sterilisiert, abgekühlt, und mit einer Impfkultur versetzt, und dann unter Rühren bei 30⁰C et- >?a 2 Tage gezüchtet, wobei eine kleixie Menge steriler Luft eingeleitet tfird. Während der Züchtung wird dann durch die Schauöffnung belichtet. Eine Kultur von 4000 Litern wicd mit zwei 100-Watt-Lampen von der Oberseite des Tanks belicntet.

Die Ausbeute aus der letzten Kultur von 4000 Litern beträgt 20 kg Trockensubstanz.

Beispiel 2

Ein Kulturmedium wird unter Verwendung der nachstehenden Komponenten hergssteilt:

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Harnstoff .. .. .....................Λ... 2 ,0 g/Liter . ■-,

MgS0₄'7H₂0 .. 2,0 "

KH₂PO₄ 3,0 "

*Ee-Lösung und modifizierte A^.-Lösung ..*.... je 5,0 ml

Glukose ....... .....«,... 10,0 g/Liter

Aminosäuren des Caseins 5,0 "

Der pH-Wert wird auf 6,0 eingestellt.

,* Die; Zusammensetzung der Fe-Lösung und der modifizierten Ac-1'Qsung entsprach der von Beispiel t.

100 ml des obigen Kulturmediums wurden in einen 500 ml-Kolben, der mit einem Wattestopfen verschlossen war, eingebracht, unter einem Druck von etwa 1 abü 15 Minuten sterilisiert, jeweils mit verschiedenen Stämmen von vorher in Reinkultur isolierter und autotroph auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen Unter Schütteln bei 3O⁰C unter Belichtung mit einer Intensität von 1000 Lux an der Oberfläche der Kultur gezüchteter Chlorella beimpft. Fach 6 Tagen wurde der am stärksten gewachsene Stamm als Impf subs tanz verwendet, und das Yerfahre-n'wurde mehr als dreimal wiederholt, um das Algenprodukt zu vermehren. Per neugewachsehe Stamm wurde dann als Impfkultur in einem Kulturmedium verwendet, das durch Vermischen der nachstehenden Korn- ponenten- erhalten wurde; . '-.. ■ ■ '-■ '

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Harnstoff .........., . 2,0 g/Liter

MgSO₄.7H₂O 2,0 "

KH₂PO₄ 3,0 "

KCl 0,25 "

Jfe-Lösung und .modifizierte A^-Lösung ....... je 5,0 ml

Glukose 50,0 g/Liter

Extrakte von entfetteten Sojabohnen 50 ml (N=400

3 g Impfkultur wurden in 1 Liter dieses Kulturmediums eingebracht und unter Schütteln bei 30°C bei gleichzeitiger Belichtung mit einer Intensität von 1000 Lux gezüchtet; nach 36 Stunden wurde eine vorher zubereitete und sterilisierte Harnstofflösung, die 3 g Harnstoff auf 10 ml enthielt, aseptisch dem Kulturmedium beigemischt, worauf nach 12 Stunden Weiterzüchtung die Algen geerntet wurden.

Ausbeute (Trockensubstanz) ............. 40 g/Liter

Bei einer großtechnischen Züchtung wurde das Potenzierverfahren nach Beispiel 1 diskontinuierlich durchgeführt, wobei auf der Stufe der letzten Kultur von 4000 Liter eine vorher durch Auflösen von 12 kg Harnstoff in 50 Liter Y/asser und Sterilisierung hergestellte Harnstofflösung etwa 36 Stunden nach Beginn der Züchtung aseptisch in das Kulturmedium eingetragen wurde. Es wurde noch 12 Stunden weitergezüchtet,, worauf die gebildeten Algen geerntet wurden.

Ausbeute (Trockensubstanz) 148 kg/4 t.

- Patentanspruch 909*41/0344

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Claims

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P a t e nt ans ρ r u c h"

Verfahren zur industriellen Züchtung von einzelligen Grünalgen, wie Chlorella, dadurch gekennzeichnet, dass man einzellige Grünalgen, wie Chlorella und Senedesmus, in ein Kulturmedium aus anorganischen Salzen, das mit Zuckern oder organischen Säuren und gegebenenfalls mit Aminosäuren oder aminosäurehaltigen Natur subs tanzen als wachs tumsf or derMeii Faktoren versetzt ist, einimpft, die Algen unter Schütteln bei geeigneten Temperaturen züchtet, die Kultur, insbesondere ohne Zufuhr von Kbhlendioxyd, über einen Zeitraum von mehreren Tagen fortlaufend belichtet, dann die Stämme mit dem stärksten Wachstum selektiv isoliert, die Züchtung der isolierten Stämme mehrmals in ähnlicher Weise wiederholt, einen Stamm mit der stärksten Vermehrung als Impfstamm auswählt, diesen Stamm in ein sterilisiertes Kulturmedium mit" der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung einimpft und dann bei geeigneten Temperaturen unter Schütteln odex Rühren unter Belüften bei fortwährender Belichtung ohne besondere Zufuhr von Kohlendioxyd eine Seinkultur erzeugt.

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