DE1211017B - Verfahren zum Zuechten von einzelligen Gruenalgen, wie Chlorella - Google Patents
Verfahren zum Zuechten von einzelligen Gruenalgen, wie ChlorellaInfo
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
- A01G33/00—Cultivation of seaweed or algae
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Description
BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. Cl.:
AOIh
Deutsche Kl.: 45 d-13/00
Nummer: 1211017
Aktenzeichen: K 57033III/45 d
Anmeldetag: 2. September 1965
Auslegetag: 17. Februar 1966
Die Erfindung betrifft die heterotrophe Züchtung von einzelligen Grünalgen, wie Chlorella, Senedesmus
u. dgl. (nachstehend als Chlorella u. dgl. bezeichnet), die als wichtige Rohstoffe für Lebensmittel,
Futtermittel, Heilmittel, Chlorophyll, wachstumsfördernde Faktoren für Milchsäurebakterien,
physiologisch aktive Faktoren u. dgl. angesehen werden. Erfindungsgemäß soll ein wirksames Verfahren
zur industriellen Massenkultur auf der Grundlage der Auswahl der Stämme geschaffen werden.
Chlorella u. dgl. sind als autotrophe Organismen bekannt, die unter Ausnutzung der Lichtenergie in
Gegenwart von anorganischen Salzen, Wasser und Kohlendioxyd durch Photosynthese wachsen; bisher
wurde im allgemeinen zu deren Massenzüchtung das Verfahren der Teichkultur in einem offenen, umgewälzten
System angewendet.
Da jedoch dieses Verfahren sehr vom Licht abhängt und nur geringe Ausbeuten liefert, ist es wegen
seiner vielen Nachteile für die industrielle Herstellung ungeeignet. Auf der anderen Seite ist bekannt, daß
Chlorella u. dgl. in der Dunkelheit und in Anwesenheit von organischen Substanzen wachsen. Die
Wachstumsausbeute ist jedoch sehr gering, und eine Züchtung von Chlorella nach diesem Verfahren in
großem Ausmaß war nicht denkbar.
Die Erfinder haben nun die heterotrophe Züchtung von Chlorella u. dgl. untersucht und haben erkannt,
daß eine Massengewinnung durch Tankkultur möglich ist, wenn Stamme von Chlorella u. dgl., die
unabhängig vom Licht zu einem starken Wachstum in der Lage sind, ausgewählt und geeignete Zuchtbedingungen
gefunden werden. Auf diese Weise können Proteine, Vitamine u. dgl., die hinsichtlich ihres
Nährwertes wertvoll sind, für die jedoch die Ausgangssubstanzen nicht ausreichen, sehr wirtschaftlich
und billig hergestellt werden, wobei Kohlehydrate, wie Zucker, die in großen Mengen zur Verfügung
stehen, als Energiequellen verwendet werden.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen gelang es, einen Stamm zu isolieren, der ohne Belichtung sehr
schnell wächst und sehr ergiebig ist. Zu diesem Zweck wurde Chlorella u. dgl. unter aeroben Bedingungen
unter Zusatz von Zuckern oder organischen Säuren sowie von Cystin, Cystein, Methionin, Serin,
Glycin, Lysin und Tryptophan oder von Natursubstanzen, die diese Aminosäuren enthalten, in den üblichen,
anorganische Salze enthaltenden Medien gezüchtet, ohne daß Kohlendioxyd gesondert eingeleitet
wurde. Weiterhin kann eine heterotrophe Kultur dieses Stammes unter geeigneten Bedingungen
Chlorella u. dgl. in so hohen Ausbeuten liefern, wie
Verfahren zum Züchten von einzelligen Grünalgen, wie Chlorella
Anmelder:
Fa. Kabushiki Kaisha Yakult Honsha, Tokio
Vertreter:
Dr. Ing. E. Hpffmann, Dipl.-Ing. W. Eitle
und Dr. rer. nat. K. Hoffmann, Patentanwälte, München 8, Maria-Theresia-Str. 6
Als Erfinder benannt:
Minoru Shirota, Sakyo-ku,
Hiroshi Endo, Kohrigaoka,
Kei Nakajima, Sakyo-ku (Japan)
Minoru Shirota, Sakyo-ku,
Hiroshi Endo, Kohrigaoka,
Kei Nakajima, Sakyo-ku (Japan)
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 11. September 1964 (51387)
sie nach der bekannten Teichkultur nicht möglich waren; hierauf beruht die vorliegende Erfindung.
Die praktische Durchführung der Erfindung ist nachstehend ausführlich beschrieben.
1. Verfahren zur selektiven Isolierung der Stämme Ein flüssiges Medium, das verschiedene Zucker
oder organische Säuren als Kohlenstoffquellen, Nitrate, Ammoniak, Ammoniumsalze und Harnstoff als.
Stickstoffquellen und Phosphor, Kalium, Schwefel, Magnesium, Mangan, Eisen, Bor, Zink, Molybdän,.
Kobalt und Kupfer in Form von anorganischen Salzen und mehrere Aminosäuren, wie Cystin,
Cystein, Methionin, Serin, Glycin, Lysin und Tryptophan oder Natursubstanzen, in denen diese Aminosäuren
vorkommen, enthält, wird in Kolben mit Wattestopfen eingefüllt und dann unter Erhitzen'
sterilisiert.
Die in den Kolben befindlichen Medien werden dann mit einer Vielzahl von Stämmen von Chlorella
u. dgl., die vorher aus Flüssen, Teichen, Reisfeldern, Abwasserkanälen u. dgl. in an sich bekannter Weise
in Reinkultur isoliert und autotroph in Agarmedien mit anorganischen Salzen gezüchtet wurden, beimpft
und unter Schütteln bei 20 bis 30° C in der Dunkelheit gezüchtet. Nach einigen Tagen werden die
Stämme mit dem stärksten Wachstum ausgewählt und in ähnlicher Weise wie oben mehrmals weitergezüchtet, worauf man schließlich den Stamm mit
609 508/?
dem schnellsten Wachstum und mit der größten Vermehrung auswählt. Das beschriebene Verfahren beschränkt
sich nicht auf flüssige Medien, sondern kann auch auf eine Standkultur angewendet werden, die
auf Medien in Form von Agarplatten mit einer ähnlichen Zusammensetzung geimpft wurde. In diesem
Falle wird eine Kolonie mit gutem Wachstum ausgewählt,
und die Isolierung wird in ähnlicher Weise wiederholt.
Durch Zusatz von Aminosäuren kann man heterotroph wachsende Stämme in einer äußerst kurzen
Zeit erhalten. Die in diesem Fall zu verwendenden Aminosäuren können aus Natursubstanzen, wie Sojabohnen,
Hefe, Fischmehl, Fleichextrakt, Milch, Casein, Abfälle von vergorener Milch, Weizenkleie
und Extrakten von Reiskleie, gewonnen werden. Der Einfluß der Aminosäurezusätze auf die Wachstumsgeschwindigkeit ist in der Tabelle angegeben.
Einfluß von Aminosäurezusätzen auf das Wachstum (Änderung der Wachstumsmenge nach Tagen)
Medien | 2 | 4 | Zeit (Tage) 6 |
8 | 14 | .Wachstunis geschwindig keit pro Tag |
Anorganische Salze enthaltendes Medium mit Zu satz von Glukose , |
0,022 0,034 |
0,028 0,26 |
0,04 2,4 |
0,056 5,8 |
0,24 6,4 |
0,17 1,34 |
Anorganische Salze enthaltendes Medium mit Zu satz,,-von Aminosäuren und Glukose ... ... |
Anmerkung: Die Zahlen in der Tabelle beziehen sich auf die Menge von getrockneter Chlorella (g/l).
Wie aus der Tabelle hervorgeht, ist das.Wachstum mit Aminosäurezusatz stärker als ohne Zusatz, wodurch
heterotroph wachsende Stämme sehr wirksam ausgewählt werden können. Weiterhin wird, wenn
heterotroph gewachsene Stämme unter Verwendung von Medien mit anorganischen Salzen und Glukose,
die jedoch keine Aminosäuren enthalten, isoliert werden, das Wachstum schwach, nachdem die zweite
Generation in der Dunkelheit gezüchtet wurde, und schließlich geht eine Vielzahl von Stämmen zugrunde.
Eine Weiterzüchtung ist dagegen möglich, wenn man Aminosäuren zusetzt, und man nimmt an,
daß der Zusatz von Aminosäuren bei der großtechnischen Züchtung einen wichtigen Einfluß hat. '
Weiterhin bewirkt der Zusatz von Aminosäuren zu dem Medium, daß die Komponenten des Mediums
schneller verwertet werden, weshalb man durch Erhöhung der Zucker- und Stickstoffkonzentration im
Medium ein starkes Wachstum in der Dunkelheit erhält, wobei die maximale Vermehrung bis zu 20 bis
30 g/l beträgt. In diesem Fall soll das Verhältnis der
Konzentration der Kohlenstoff quelle zu der der Stickstoffquelle (Verhältnis C: N) im Medium unterhalb
6 gehalten werden, damit der Proteingehalt in den Algenzellen auf mehr als 50% erhöht werden
kann.
Der so isolierte Stamm wächst in der Dunkelheit, braucht kein Licht, ergibt eine große Wachstumsgeschwindigkeit und ermöglicht eine Weiterzüchtung
und Wiederholung des Wachstums, wodurch das industrielle Tankkulturverfahren praktisch durchführbar
wird.
2. Züchtungsverfahren
Der wie oben angegeben ausgewählte Stamm wird in ein übliches Medium mit anorganischen Salzen
und Aminosäurezusätzen eingeimpft, wobei die zulässige Höchstmenge an Zuckern oder organischen
Säuren im Vergleich mit der Stickstoffquelle ein G: N-Verhältnis von 6 nicht überschreiten soll. Das
Medium wird in einen in der Gärungsindustrie üblichen Gärtank eingebracht und unter Belüften und
Rühren bei 30° C, ohne daß eigens belichtet wird,
gezüchtet. Hat die Chorella ihr stärkstes Wachstum erreicht, so wird die Menge des Mediums stufenweise
jeweils um einen Faktor von 10 erhöht, bis man schließlich eine Reinkultur in einem Tank von
einigen Tonnen erhält, die dann herausgenommen wird.
3. Vergleich zwischen einer heterotrophen Tankkultur gemäß der Erfindung und der üblichen Teichkultur
Das Verfahren gemäß der Erfindung ergibt bemerkenswerte Vorteile, wie sie nachstehend angegeben
sind. .
a) Die Wachstumsgeschwindigkeit nach dem Verfahren gemäß der Erfindung beträgt 16 g je Liter
und Tag, während man nach der Teichkultur eine Ausbeute von nur 0,086 g je Liter und Tag
erhält. Die Ausbeute ist also etwa 200mal größer. Weiterhin ändert sich nach dem Verfahren
gemäß der Erfindung der Eiweißgehalt der erzeugten Algen nicht, und der Gehalt an Vitamin-B-Komplex
ist viel höher.
b) Vom Standpunkt der industriellen Herstellung lassen sich die Substrate nach dem Verfahren
gemäß der Erfindung besser ausnutzen, wenn die Produktion gut überwacht wird; die Ernte
ist einfach, und· man kann unter hygienischen Bedingungen arbeiten. Weiterhin sind die Investitions-
und Herstellungskosten sehr niedrig. Bei den Verfahren der Teichkultur wirken wilde
Keime stark verunreinigend, die Qualität des Produktes ändert sich, die Geschwindigkeit, mit
der die Substrate verwertet werden, ist gering, und das Wetter spielt eine große Rolle, wodurch
dieses Verfahren für industrielle Anwendungszwecke ungeeignet ist.
c) Die Auswahl und Abtrennung von heterotrophen Stämmen kann durch Zusatz von Aminosäuren in kurzer Zeit leicht durchgeführt werden,
und diese Stämme zeigen eine starke, reproduzierbare Vermehrung.
Zur Erläuterung der Erfindung sind nachstehend einige Beispiele angegeben:
Es wurde ein Medium mit der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:
KNO3 1,25 g/l
MgSO4-7H2O 1,25 g/l
KH2PO4 1,25 g/l
Fe-Lösung * und modifizierte A5-Lo-
sung
je 1 ml
Glukose 10,0 g/l
Aminosäuren des Caseins 5,0 g/l
Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.
* Fe-Lösung:
FeSO4 · 7 H2O 2,0 g/l
Konzentrierte H2SO4 4 Tropfen/1
** Modifizierte As-Lösung:
H3BO3 2,86 g/l
MnCl2-4 H2O 1,81 g/l
ZnSO4-7 H2O 0,222 g/l
MoO3 0,0177 g/l
CuSO4 -5H2O 0,079 g/l
CoCl2 1,00 g/l
Die Medien mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurden in Kolben gefüllt, die Kolben
mit Watte verstopft, durch Erhitzen unter Druck sterilisiert, einzeln mit einer Vielzahl von vorher in
Reinkultur isolierten und autotroph auf einem Agarmedium mit anorganischen Salzen unter Schütteln
bei 30° C im Dunkeln gezüchteten Chlorellastämmen beimpft. Der Stamm, der nach 6 Tagen das stärkste
Wachstum zeigte, wurde als Impfmaterial für die nächste Kultur verwendet, worauf diese Arbeitsweise
mehr als dreimal wiederholt wurde, wobei die erhaltene Kultur dann als Impfkultur verwendet
wurde.
Dann wurde unter Verwendung der nachstehenden Komponenten ein weiteres Medium hergestellt:
KNO3 5,0 g/l
MgSO4 ·7H2O 1,25 g/l
KH2PO4 2,00 g/l
Fe-Lösung und modifizierte A5-Lo-
sung je 5 ml
Glukose 50 g/l
Extrakt aus entfetteten Sojabohnen 50 ml
Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.
Das Medium wurde unter Druck sterilisiert, mit der Impfkultur (3 g/l) versetzt und bei 30° C unter
Schütteln gezüchtet; nach 2 Tagen wurde eine vorher sterilisierte KNO3-Lösung (7 g/100 ml, N = 400 mg)
aseptisch zu der Kulturlösung gegeben, wobei der pH-Wert mit konzentrierter H2SO4 auf 6,0 eingestellt
wurde, worauf nach weiteren 2 Tagen die Algen geerntet wurden. Während der Züchtung wurde nicht
eigens belichtet.
Ausbeute (Trockensubstanz): 22,5 g/l.
Bei der industriellen Herstellung wurde das Kulturmedium stufenweise jeweils um einen Faktor
von 10 vergrößert. In diesem Fall war jeder Kulturtank mit einem Rührer, einer Belüftungsvorrichtung
und einer Nachheizvorrichtung versehen. Das Medium mit der oben angegebenen Zusammensetzung
wurde in den Tank eingefüllt, der dann nach dem Sterilisieren unter Druck und nach dem Abkühlen
mit der Kultur beimpft wurde; die Züchtung wurde bei 300C unter Rühren und Einleiten von aseptischer
Luft durchgeführt. Die nächste Kultur wurde nach dem gleichen Schema durchgeführt. Die Tanks
wurden nicht absichtlich belichtet.
j. Beispiel 2
Es wurde ein Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:
Harnstoff 1,00 g/l
MgSO4-7H2O 0,25 g/l
KH2PO4 0,25 g/l
KCl 0,25 g/l
Fe-Lösung und modifizierte A5-Lo-
sung je 1,0 ml
Glukose 10,0 g/l
Aminosäuren des Caseins 5,0 g/l
100 ml Kulturmedium mit der oben angegebenen Zusammensetzung wurden in 500-ml-Kolben eingefüllt,
mit einem Wattestopfen verschlossen, unter einem Druck von etwa 1,05 atü 15 Minuten sterilisiert,
mit einer Vielzahl von vorher in Reinkultur isolierten und autotorph auf einem Agarmedium
mit anorganischen Salzen gezüchteten Senedesmus-Stämmen beimpft, worauf die Züchtung unter Schütteln
bei 30° C im Dunkeln durchgeführt wurde.
Nach einer Kulturdauer von 6 Tagen wurde der Stamm mit dem aktivsten Wachstum zum Beimpfen
der nächsten Kultur verwendet, worauf diese Arbeitsweise noch mehr als dreimal wiederholt wurde,
um die Impfkultur zu gewinnen.
Dann wurde ein sterilisiertes Kulturmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung mit der Impfkultur
(3 g/l) versetzt:
Harnstoff 2,0 g/l
MgSO4-7H2O 2,OgA
KH2PO4 3,0 g/l
KCl 0,25 g/l
Fe-Lösung und modifizierte A3-
Lösung 5,0 ml
Glukose 50,0 g/l
Abfallflüssigkeit von vergorener
Milch 50ml
(N=400mg)
Der pH-Wert wurde auf 6,0 eingestellt.
Die Züchtung wurde 36 Stunden bei 30° C unter
Schütteln durchgeführt, worauf eine vorher zubereitete und sterilisierte Harnstofflösung mit 3 g Harnstoff
je 50 ml aseptisch zu der Kultur gegeben wurde. Dann wurde noch 12 Stunden ununterbrochen weitergezüchtet,
worauf die Algen geerntet wurden. Ausbeute (Trockensubstanz): 32,5 g/l.
Bei der großtechnischen Gewinnung soll die Menge der Kluturlösung, wie bei der großtechnischen Gewinnung
nach Beispiel 1, fortlaufend erhöht werden. Auf der letzten Kulturstufe (40001) wird eine vorher
zubereitete und sterilisierte Harnstofflösung (12 kg Harnstoff, gelöst in 401 Wasser) etwa 36 Stunden
nach Beginn der Züchtung aseptisch der Kulturbrühe zugegeben, worauf die Algen nach weiteren
12 Stunden geerntet werden.
Ausbeute: 120 kg/41.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zum industriellen Züchten von einzelligen Grünalgen, dadurch gekennzeich-net, daß man einzellige Grünalgen, wie Chlorella oder Senedesmus, in ein sterilisiertes Medium mit .anorganischen Salzen und Zusätzen von Zuckern oder organischen Säuren und von mindestens einer bzw. allen Aminosäuren, wie Cystin, '5 Cystein, Methionin, Serin, Glycin, Lysin, Tryptophan oder Natursubstanzen, die diese Aminosäuren enthalten, einträgt, die Algen einige Tage unter Schütteln oder Rühren sowie unter Belüftung im Dunkehi bei optimalen Temperaturen. ohne besondere Zufuhr von Kohlendioxyd, züchtet, die Stämme mit starker Vermehrung isoliert, die Züchtung der isolierten Stämme noch mehrmals in der angegebenen Weise wiederholt, den Stamm mit der stärksten Vermehrung als Impfstamm auswählt, diesen Stamm in ein Medium aus anorganischen Salzen, dem die genannten Aminosäuren sowie eine maximale Menge an Zuckern, organischen Säuren und einer verwertbaren Stickstoffquelle zugesetzt sind, einimpft und ihn aseptisch bei geeigneten Temperaturen unter Schütteln oder Rühren, sowie unter Belüftung züchtet, ohne daß man eigens Licht oder Kohlendioxyd zuführt.609 508/3 2.66 ® Bundesdruckerei Berlin
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1211017X | 1964-09-11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1211017B true DE1211017B (de) | 1966-02-17 |
Family
ID=14802885
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DEK57033A Pending DE1211017B (de) | 1964-09-11 | 1965-09-02 | Verfahren zum Zuechten von einzelligen Gruenalgen, wie Chlorella |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1211017B (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0108580A1 (de) * | 1982-11-08 | 1984-05-16 | Amoco Corporation | Verfahren zum Einbringen fremder Gene in Grünalgen unter Verwendung con T-DNA aus Agrobacterium |
CN112694977A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-04-23 | 曹礼刚 | 一种小球藻的培养方法 |
-
1965
- 1965-09-02 DE DEK57033A patent/DE1211017B/de active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0108580A1 (de) * | 1982-11-08 | 1984-05-16 | Amoco Corporation | Verfahren zum Einbringen fremder Gene in Grünalgen unter Verwendung con T-DNA aus Agrobacterium |
CN112694977A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-04-23 | 曹礼刚 | 一种小球藻的培养方法 |
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