DE1242235B

DE1242235B - Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Peptiden

Info

Publication number: DE1242235B
Application number: DES92870A
Authority: DE
Inventors: Dr Roger Boissonnas; Dr Stephan Guttmann
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1963-08-30
Filing date: 1964-08-28
Publication date: 1967-06-15
Also published as: NL6409802A; US3388113A; GB1076903A; CH426863A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

^C07c

Co

α /o C

Deutsche Kl.: --6frl

Nummer: 1242 235

Aktenzeichen: S 92870IV b/12 q

Anmeldetag: 28. August 1964

Auslegetag: 15. Juni 1967

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Polypeptiden.

Die basische Aminosäure Arginin bildet einen Bestandteil verschiedener in der Natur vorkommender, biologisch aktiver Peptide. Bei der Synthese von Polypeptiden, die Arginin enthalten — seien dies nun natürliche oder künstlich hergestellte —, muß die Guanidinogruppe des Arginins geschützt werden, da sonst unerwünschte Nebenreaktionen eintreten können. Als Schutzgruppe für die Guanidinogruppe wurden bisher die Nitrogruppe, die p-Toluolsulfonyl- und die Carbobenzoxygruppe verwendet.

Diesen drei Gruppen haften aber verschiedene Nachteile an: Die Nitrogruppe ist nur durch katalytische Hydrierung abspaltbar. Diese verläuft bekanntlich besonders mühsam und oft unvollständig bei höheren Peptiden. Die p-Toluolsulfonylgruppe läßt sich nur durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak abspalten. Diese Methode kann ao jedoch bei Polypeptiden, die Methionin enthalten, nicht verwendet werden und führt auch bei vielen anderen Polypeptiden zu Spaltungen in der Peptidkette, wodurch die Ausbeute am gewünschten Endprodukt stark herabgesetzt wird. Es ist auch nicht möglich, den Carbobenzoxyrest sowohl zum Schutz der Guanidinogruppe wie auch zum Schutz der Λ-Aminogruppe des Arginins bzw. des Arginin enthaltenden Polypeptids zu verwenden, da bis heute noch keine Methode bekannt ist, den Carbobenzoxyrest selektiv von der x-Aminogruppe und nicht gleichzeitig von der Guanidinogruppe des Arginins abzuspalten: Bei katalytischer Hydrierung oder durch Behandlung mit Bromwasserstoffsäure in Eisessig wird der Carbobenzoxyrest sowohl von der Guanidinowie auch von der «-Aminogruppe abgespalten. Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Polypeptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Guanidinogruppe des Arginins während der zur Herstellung der Peptidkette notwendigen Reaktionsstufen durch eine p-Nitrocarbobenzoxygruppe schützt.

Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß der p-Nitrocarbobenzoxyrest bei Zimmertemperatur durch Einwirkung einer wasserfreien Lösung von Bromwasserstoffsäure in Eisessig von der Guanidinogruppe des Arginins nicht abgespalten wird, obwohl derselbe Rest sich von der a-Aminogruppe des Arginins bzw. des Arginin enthaltenden Polypeptids unter gleichen Bedingungen leicht abspalten läßt. Durch Einwirkung einer wasserfreien Bromwasserstoffsäurelösung in Eisessig kann nämlich die auf Verfahren zur Herstellung von Arginin
enthaltenden Peptiden

Anmelder:

SANDOZ A. G., Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr. W. Schalk, Dipl.-Ing. P. Wirth,

Dipl.-Ing. G. E. M. Dannenberg

und Dr. V. Schmied-Kowarzik, Patentanwälte,

Frankfurt/M., Große Eschenheimer Str. 39

Als Erfinder benannt:

Dr. Roger Boissonnas, Bottmingen;

Dr. Stephan Guttmann, Allschwil (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 30. August 1963 (10 776)

einer «-Aminogruppe stehende p-Nitrocarbobenzoxy- und die Carbobenzoxygruppe, der zum Schutz der Aminogruppe am meisten vei wendete Rest, beim Aufbau vielgliedriger Polypeptide abgespalten werden. Diese Methode der sauren Hydrolyse ist vergleichsweise sehr schonend, so daß diese Methode heute fast ausschließlich zum Aufbau biologisch hochaktiver Polypeptide verwendet wird.

Durch den p-Nitrocarbobenzoxyrest bleibt die Guanidinogiuppe jedoch auch geschützt, wenn man den Carbo-tert.butoxyrest oder den p-Methoxycarbobenzoxyrest, wie er ebenfalls zum Schutz der «-Aminogruppe verwendet werden kann, oder den tert.Butylesteirest zum Schutz der Caiboxylgruppe durch Einwirkung von Trifluoressigsäure abspaltet, wie auch bei Abspaltung des Triphenylmethylrestes von der Λ-Aminogiuppe durch wäßrige Essigsäuie und bei Verseifung einer Estergruppe durch Einwirkung wäßriger Alkalien. Die vorliegende Erfindung ist auch deshalb besonders überraschend, da an anderer Stelle festgestellt worden war, daß sich N-to-p-Nitrobenzyloxy-carbonyl-L-arginin zum Aufbau von Polypeptiden nicht eignet.

Die erfindungsgemäß verwendete Schutzgruppe ist auch stabil gegenüber allen für den Aufbau von Polypeptiden bisher bekanntgewordenen Kondensationsmethoden, wie z. B. die Azidmethode, die

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Methode der gemischten Anhydride, die Methode methylester in 100 ecm Acetonitril und 100 ecm

der aktivierten Ester, die Dicyclohexylcarbodiimid- Methylenchlorid, kühlt auf — 10⁰C, gibt 8,3 g Di-

methode und die Diimidazolcarbonylmethode. Diese cyclohexylcarbodiimid zu und schüttelt 50 Stunden

große Beständigkeit der Bindung zwischen der Guani- bei 20⁰C. Nach Filtrieren dampft man ab, löst den dino- und der p-Nitrocarbobenzoxygruppe ermöglicht 5 Rückstand in Essigester, wäscht mit verdünnter Säure

es somit, Arginin enthaltende Polypeptide relativ und wäßriger Natriumbicarbonatlösung, trocknet die

leicht und mit bisher unbekannt guter Ausbeute zu organische Lösung und dampft ab. Man löst den

synthetisieren. Rückstand in Essigester und fällt mit Äthyläther.

Die erfindungsgemäß verwendete Schutzgruppe Man erhält 12 g Dipeptidester. Schmp. 90⁰C (Zerkann durch alle genügend reaktionsfähigen funktio- »o setzung). [nc]? — —25° in Dimethylformamid,
nellen Derivate des p-Nitrophenylcarbonsäureesters

eingeführt werden, am zweckmäßigsten durch p-Nitro- Beispiel 4
carbobenzoxychlorid. Beispielsweise wird Arginin oder

ein Polypeptid, das als letztes Glied der Kette Arginin N-«-Carbobenzoxy-N-(guanidino)-p-nitro-

enthält und dessen <x-Aminogruppe durch eine der ·5 carbobenzoxy-L-arginyl-L-prohn

oben aufgezählten Schutzgruppen geschützt ist, mit Man löst 19,8 g N-a-Carbobenzoxy-N-(guanidino)-

p-Nitrocarbobenzoxychlorid in einei alkalisch-wäß- p-nitrocarbobenzoxy-L-arginin und 7,8 g L-Prolin-

rigen Lösung acyliert. Nach vollendetem Aufbau tert.butylester in 100 ecm Acetonitril und 100 ecm

des Polypeptide kann der p-Nitrocarbobenzoxyrest Methylenchlorid, kühlt auf — 10⁰C, gibt 8,3 g Divor, gleichzeitig oder nach den anderen Schutzgruppen so cyclohexylcarbodiimid zu, schüttelt 50 Stunden bei

des Peptids durch katalytische Hydrierung, zweck- 20⁰C, filtriert, dampft ab, löst den Rückstand in

mäßigerweise an einem Palladiumkatalysator, in Essigester, wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und

organischer oder wäßriger Lösung abgespalten wäßriger Natriumbicarbonatlösung, trocknet auf

werden. Natriumsulfat, dampft ab, löst den Rückstand in

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung 25 Essigester, fällt mit Äthyläther und filtriert. Man

beschrieben. löst den erhaltenen Dipeptidester in 100 ecm Trifluor-

essigsäure, läßt 1 Stunde bei 20⁰C stehen, dampft ab,

Beispiel 1 versetzt den Rückstand mit Äthyläther, filtriert, löst

vi /-. u u κι 1 α· \ d^en Rückstand in 100 ecm In-Ammoniumhydroxyd,

η ifiih h ^{y (}f ^{mO>
30 wäscht mit} Essigester, säuert die wäßrige Lösung an,

p-mtrocarbobenzoxy-L-arginm extrahiert den öligen Niederschlag mit Chloroform,

Man löst 90 g Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-arginin in trocknet und dampft ab. Man löst den Rückstand

einem Gemisch von 350 ecm ln-Natriumhydroxyd in Chloroform und fällt mit Äthyläther. Nach FiI-

und 350 ecm Dioxan, versetzt langsam mit einer trieren und Trocknen erhält man 14,3 g N-«-Carbo-

Lösung von 97 g p-Nitrobenzyloxy-carbonylchlorid 35 benzoxy-N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-

in 100 ecm Dioxan und hält das pH bei 12 mittels L-prolin. Schmp. 115⁰C (Zersetzung). [<x]f = —29°

Zugabe von 4n-Natriumhydroxyd. Nach einer Stunde in 95°/^βΓ Essigsäure,
gibt man 2000 ecm Wasser zu, filtriert, extrahiert das

Filtrat mit Äthyläther und stellt das pH der wäßrigen Beispiel 5
Phase auf 2. Das ausgeschiedene öl wird in 300 ecm 40

Methanol, das 12 g Natriumhydroxyd enthält, gelöst, N-(Guanidmo)-p-mtrocarbobenzoxy-

1 Stunde bei 20⁰C belassen und auf die Hälfte ein- L-arginyl-L-prolin-methylester-Dihydrobromid

geengt. Man gibt 600 ecm Wasser zu, säuert mit ver- Man löst 81 g N-«-Carbobenzoxy-N-(guanidino)-

dünnter Schwefelsäure an und kristallisiert das aus- p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-methylester in

geschiedene öl aus einem Gemisch von Essigester— 45 500 ecm einer 4n-Lösung von Bromwasserstoff in

Dioxan (8:2). Man erhält 91g N-a-Carbobenzoxy- Eisessig, läßt 1 Stunde bei 2O⁰C stehen, fällt mit

N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginin. Schmp. Äthyläther, filtriert, löst den Rückstand in 200 ecm

127⁰C. [oc]f = -4° in Dimethylformamid. Methanol und kristallisiert durch Zusatz von Äthyläther. Nach Filtrieren, Waschen und Trocknen erhält

Beispiel2 50 man 76g Dipeptidester-Dihydrobromid. Schmp.

N-iGuanidinoVp-nitrocarbobenzoxy- Ψ°^€ (Setzung). Mf = -33° in 95«/„iger Essig-

L-arginin-Dihydrobromid ^{sa e}'

Man löst 5 g N-a-Caibobenzoxy-N-(guanidino)- Beispiel 6

p-nitrocarbobenzoxy-L-arginin in 50 ecm einer 4n- 55

Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig, läßt 1 Stunde Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-

bei 20°C stehen, fällt das entstandene Hydrobromid N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-

mit Äther, filtriert und wäscht mit Äthyläther. Nach L-arginyl-L-proun-methylester

Trocknen erhält man 5,2 g N-(Guanidino)-p-nitro- Man löst 9,6 g Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-phenylalanin-

carbobenzoxy-L-arginin-Dihydrobromid. Schmp. 60 2,4,5-trichlorphenylester und 12,5 g N-(Guanidino>

130⁰C (Zersetzung). [<x]f — +8° in Methanol. L-arginyl-L-prolin-methylester-Dihydrobromid in

20 ecm Dimethylformamid, gibt 5,6 ecm Triäthylamin

Beispiel 3 zu und läßt 16 Stunden bei 20⁰C stehen. Nach Zu-

_VT ~ . , ,,, .... . gäbe von 500 ecm Essigester wäscht man mit ver-

N-«-Carbobenzoxy_:N-(guanidmo)-p-nitro- β₅ dünnter Schwefelsäure und wäßriger Natriumbi-

carbobenzoxy-L-arginyl-L-prohn-methylester carbonatlösung, engt ein und fällt mit Äthyläther.

Man löst 19,8 g N-Ä-Carbobenzoxy-N-iguanidino)- Man erhält 13,6 g Tripeptidester. Schmp. 130⁰C

p-nitrocarbobenzoxy-L-arginin und 6,0 g L-Prolin- (Zersetzung). [<x]f = —36° in Dimethylformamid.

Beispiel 7

N-oc-Carbobenzoxy-N-(guanidino)-p-nitro-

carbobenzoxy-L-arginyl-N-(guanidino)-

p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-

methylester

Man löst 22,4 g N-«-Carbobenzoxy-N-(guanidino)-L-arginin und 32,5 g N-(Guanidino)-L-arginyl-prolinmethylester-Dihydrobromid in 20 ecm Dimethylformamid und 150 ecm Acetonitril, kühlt auf -1O⁰C, gibt 14 ecm Triäthylamin und 11,3 g Dicyclohexylcarbodümid zu und schüttelt 3 Tage bei 2O⁰C. Man filtriert, dampft das Filtrat ab, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester und n-Butanol (9:1), wäscht mit verdünnter Schwefelsäure und wäßriger Natriumbicarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat, engt ein und fällt mit Äthyläther. Nach zweimaliger Umfällung filtriert und trocknet man und erhält 22 g Tripeptidester. Schmp. 115°C (Zersetzung). [tx]? = —20° in Dimethylformamid.

Beispiel 8

Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-

N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-

L-arginyl-L-prolin

MaQ löst 10 g Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-N-iguanidino^p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolinmethylester in 50 ecm Dioxan und 20 ml ln-Natriumhydroxyd, läßt 1 Stunde bei 20°C stehen, gibt 500ccm Wasser zu und leem Eisessig. Man extrahiert den öligen Niederschlag mit Chloroform, trocknet über Natriumsulfat, engt ein und fällt mit Äthyläther. Nach Filtrieren und Trocknen erhält man 8,6 g Tripeptid. Schmp. 172°C. [ot]f = -34° in 95°/_oiger Essigsäure.

Beispiel 9

N-a-Carbobenzoxy-N-iguanidinoJ-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin

Man löst 8,4 g N-«-Carbobenzoxy-N-(guanidino> p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-N-(guanidino)-p-iiitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin-methylester in 50ccm Dioxan, gibt 20 ecm 2n-Natriumhydroxyd zu, läßt 1 Stunde bei 20⁰C stehen, gibt 500 ecm Wasser und 1 ecm Eisessig zu, extrahiert mit einem Chloroformn-Butanol-Gemisch (9:1), trocknet über Natriumsulfat, konzentriert auf 100 ecm, fällt mit Äthyläther, filtriert und trocknet. Man erhält 8,0 g N-<%-Carbobenzoxy-N-iguanidino^p-nitrocaibobenzoxy-L-arginyl-N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin. ίο Schmp. 168°C. [<%]? = -27° in 95°/_oiger Essigsäure.

Beispiel 10
L-Arginyl-L-arginyl-L-prolin

»5 Man löst 6 g des im Beispiel 9 erhaltenen geschützten Tripeptids in 100 ecm 66%iger Essigsäure und hydriert in Anwesenheit von 1,0 g 10%igem Palladiumkatalysator. Nach 12 Stunden filtriert man, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Äthanol-

*o Äthyläther-Gemisch (1:1). Man erhält 2,5 g L-Arginyl-L-arginyl-L-prolin. [oc]f = —38° in 6n-HCl.

Beispiel 11
L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-prolin

Man löst 6 g Ν-Λ-Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-N-(guanidino)-p-nitrocarbobenzoxy-L-arginyl-L-prolin in 100 ecm 66°/oiger Essigsäure und hydriert bei normalem Druck in Anwesenheit von Ig 10°/_oigem Palladiumkatalysator. Nach 12 Stunden filtriert man, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Äthanol - Äthyläther - Gemisch (1:1). Man erhält 2,9 g L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-prolin. [*]f=—22° in 6n-HCl.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Arginin enthaltenden Polypeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man die Guanidinogruppe des Arginins während der zur Herstellung der Peptidkette notwendigen Reaktionsstufen durch eine p-Nitrocarbobenzoxygruppe schützt.

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