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Verweis auf verwandte Anmeldungen
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Diese Anmeldung beansprucht die Prioritätsrechte der vorläufigen
US-Patentanmeldung Nr. 62/203,311 , eingereicht am 10. August 2015, der vorläufigen
US-Patentanmeldung Nr. 62/303,227 , eingereicht am 3. März 2016, und der vorläufigen
US-Patentanmeldung Nr. 62/341,563 , eingereicht am 25. Mai 2016, wobei diese Anmeldungen in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind.
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Technischer Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegenden Lehren betreffen allgemein Zusammensetzungen, Prozesse, Methoden und Kits für die Vorbereitung von Proben, die genetisches Material für einen folgenden Nachweis und/oder eine folgende Quantifizierungsanalyse enthalten.
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Beschreibung der verwandten Technik
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Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ist eine Technik zum Selektieren oder Mikrodissektieren einer spezifischen Zelle (mehrerer spezifischer Zellen) aus einer gemischten Population, üblicherweise unter mikroskopischer Visualisierung. LCM-Techniken werden angewendet, um eine einzelne Zelle oder einige wenige Zellen aus frischem oder archiviertem Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe, Blut, Sperma oder anderen biologischen Proben zu isolieren. Eine Analyse von Nukleinsäuren, die anhand von LCM aus frischen oder archivierten Formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten extrahiert wurden, wird beispielsweise verwendet, um Informationen über Proben-DNA (z.B. Genotyp) und - RNA (z.B. Genexpression) zu liefern, da sie mit einer Probenmorphologie und/oder einem Krankheitszustand in Zusammenhang stehen. Anhand von LCM kann die biologische Probe unter Verwendung eines Mikroskopsystems untersucht werden, und einzelne Zellen oder Zellgruppen können unter Verwendung eines oder mehrerer Laser selektiert und mikrodissektiert werden. Durch verschiedene LCM-Techniken kann die selektierte Probe von unerwünschten Teilen der größeren Probe getrennt und in einen Behälter übertragen werden, beispielsweise eine Mulde, ein Vial oder ein Röhrchen, um die selektierte Probe zur Verwendung in einem folgenden Assay, Versuch oder Test, beispielsweise in einem Polymerase-Kettenreaktions(PCR)- oder Sequenzierungs-Assay oder -Workflow, vorzubereiten.
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Ein Ziel von vielen LCM-Anwendungen ist die Bereitstellung einer hohen Ausbeute an Qualitäts-RNA aus frischen oder archivierten FFPE-Proben. Die Formalinfixierung einer FFPE-Probe kann eine molekulare Vernetzung innerhalb der Proben hervorrufen, wodurch die Gewinnung von Nukleinsäuren erschwert und auch ihre Ausbeute und Qualität verringert wird. Dies wirkt sich auf die Effizienz eines folgenden Nachweises aus.
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Zusätzlich zur Erhöhung der Qualität und der Ausbeute selektierter Proben aus frischen oder FFPE-Prüfsubstanzen besteht in der Technik ein Bedarf, einen Gesamtdurchsatz durch Verkürzen der Zeit zu erhöhen, die nötig ist, um Proben für folgende Tests vorzubereiten. Heute erhältliche FFPE-RNA-Isolierkits empfehlen einen ziemlich langen Proteinase-K(ProK)-Verdau über Nacht bei 37 Grad Celsius für eine Probenlyse, gefolgt von mehreren Reinigungsschritten, um RNA aus LCM-FFPE-Gewebe zu gewinnen, bevor sie in einem folgenden Schritt analysiert wird. Diese Herangehensweise erfordert auch Probenübertragungsschritte, die eine zusätzliche Variabilität in Bezug auf Ausbeute und Qualität der RNA einführen können. Dieser aus mehreren Schritten bestehende Workflow kann insbesondere bei einer RNA-Isolierung aus Probentypen mit geringem Einsatz, beispielsweise einzelnen Zellen und kleinen Populationen seltener Zellen, problematisch sein. Infolgedessen besteht ein Bedarf an einer verbesserten, auf LCM-FFPE-Lyse basierenden Lösung für die Extraktion von RNA aus beschränkten LCM-FFPE-Proben, welche die Integrität der RNA aufrechterhält, wodurch die Ausbeute von folgenden Anwendungen, beispielsweise PCR oder Sequenzierung, z.B. Sequenzierung der nächsten Generation (Next Generation Sequencing, NGS)) erhöht wird.
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Daher sind neue Verfahren und Systeme, die bei der Gewinnung qualitativ hochwertiger RNA aus durch LCM erhaltenem FFPE-Gewebematerial mit geringem Einsatz helfen, sehr erstrebenswert, ebenso wie verbesserte Möglichkeiten der Verarbeitung solcher Proben auf eine Weise, welche die Verarbeitungszeit verkürzt und weniger oder gar keine Übertragungen einer selektierten Probe erfordert.
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Figurenliste
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Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können aus der folgenden ausführlichen Beschreibung besser verstanden werden, wenn man sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen liest. Diese Ausführungsformen, die nur der Veranschaulichung dienen, zeigen neuartige und nicht offensichtliche Aspekte der Erfindung. Die Zeichnungen beinhalten die folgenden Figuren:
- 1A ist eine schematische Darstellung eines ersten Systems gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 1B ist eine schematische Darstellung eines zweiten Systems gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 2 ist eine schematische Darstellung eines dritten Systems gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 3 ist eine schematische Darstellung eines vierten Systems gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 4A und 4B sind schematische Darstellungen von zwei Verfahren zum Verarbeiten einer selektierten Probe unter Verwendung des in 1B gezeigten Systems gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 5A und 5B sind schematische Darstellungen eines Verfahrens zum Verarbeiten einer selektierten Probe unter Verwendung des in 3 gezeigten Systems gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
- 6 ist eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Verarbeiten einer selektierten Probe gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 7 ist eine schematische Darstellung von Workflows gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
- 8 ist eine schematische Darstellung eines Workflows gemäß einem LCM-bis-PCR-Protokoll des Standes der Technik (einem „heutigen Protokoll“) und eines Workflows gemäß einem LCM-bis-PCR-Protokoll gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (einem „neuen Protokoll“).
- 9 ist ein Balkendiagramm, das eine RNA-Ausbeute in Bezug auf einen durchschnittlichen Ct-Wert für verschiedene Lysebedingungen oder -protokolle zeigt.
- 10 ist ein Balkendiagramm, das die Durchführung einer qPCR an FFPE-LCM-isolierter RNA aus einem >2 Jahre alten Brustkrebs-FFPE-Gewebeblock gemäß zwei unterschiedlichen Lysebedingungen oder -protokollen zeigt.
- 11 ist eine schematische Darstellung eines LCM-bis-Sequenzierung-Protokolls des Standes der Technik (eines „heutigen Protokolls“) und eines LCM-bis-Sequenzierung-Protokolls gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung (eines „neuen Protokolls“) zeigt.
- 12 ist ein Balkendiagramm, das eine RNA-Ausbeute in Bezug auf einen durchschnittlichen Ct-Wert für verschiedene Lysebedingungen des in 8 gezeigten LCM-bis-PCR-Workflows Eintagesprotokolls zeigt.
- 13 ist eine erläuternde Zusammenfassung einer NGS-RNA-Ausbeute und von Bibliotheksdaten mit einem Ampliseq Cancer 50 Panel.
- 14-16 sind Ergebnisse aus Versuchen für eine RNA-Probe, die geeignet sind, Vorteile von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren.
- 17-19 sind Ergebnisse aus Versuchen an einer DNA-Probe, die geeignet sind, Vorteile von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren.
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Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
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Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Kontakt“ einen Zustand oder eine Bedingung einer Berührung oder einer unmittelbaren Nähe. Wenn „A in Kontakt mit B ist, berühren sich A und B daher oder befinden sich in unmittelbarer Nähe zueinander. Ein Kontakt zwischen A und B bedeutet nicht unbedingt, dass A und B aneinandergefügt, -befestigt oder -gebunden sind, aber solche Zustände sind eingeschlossen.
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Solange nichts anderes angegeben wird oder sich aus dem Gebrauch ergibt, bedeutet der Begriff „etwa“ oder „ungefähr“, wie hierin verwendet, innerhalb von ±10 % der angegebenen Größe, für die „etwa“ oder „ungefähr“ ein Modifikator ist.
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In 1A ist ein System oder Instrument 100a bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schematisch dargestellt. Das System 100a kann ein optisches System oder Instrument sein, beispielsweise ein Mikroskop oder ein Laser-Capture-Mikrodissektions(LCM)-lnstrument oder -Apparat mit einem optischen Kopf 102a. Das System 100a kann ferner eine Basis 105a umfassen, die dafür ausgelegt ist, ein Substrat 110a aufzunehmen oder zu tragen, das eine Oberfläche 112a umfasst, die eine biologische Prüfsubstanz oder eine heterogene Mischung biologischer Zellen 115a enthält und/oder damit in Kontakt steht. Das System 100a kann dafür ausgelegt sein, eine selektierte oder isolierte Probe 118a aus der biologischen Prüfsubstanz oder heterogenen Mischung biologischer Zellen 115a zu selektieren, abzutrennen, zu isolieren und/oder auf andere Weise bereitzustellen. Die selektierte Probe 118a kann mehrere Zellen umfassen oder kann eine einzelne Zelle umfassen.
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Der optische Kopf 102a kann einen oder mehrere Laser aufweisen, die dafür ausgelegt sind, die selektierte Probe 118a von der Oberfläche 112a zu entfernen und/oder die auf der Oberfläche 112a befindliche selektierte Probe 118a abzutrennen oder zu isolieren. In solchen Ausführungsformen kann ein Laser oder eine andere Einrichtung verwendet werden, um die selektierte Probe 118a für eine weitere Verarbeitung und/oder Vorbereitung abzulösen oder auf andere Weise in eine Kappe, einen Behälter, ein Röhrchen, eine Kapillare oder dergleichen (nicht dargestellt) zu übertragen.
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Die selektierte Probe 118a kann eine frische Probe (z.B. eine frische Gewebeprobe), eine Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Probe oder irgendeine andere Art von biologischer Probe (z.B. irgendeine biologische Probe, die sich für eine LCM-Verarbeitung eignet) umfassen. Die selektierte Probe 118a kann anschließend für einen folgenden Assay, Versuch oder Test verarbeitet oder vorbereitet werden, beispielsweise, um eine oder mehrere Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben oder um eine oder mehrere Ribonukleinsäure(RNA)-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben.
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In 1B ist ein System oder Instrument 100b bestimmter Ausführungsformen schematisch dargestellt. Das System 100b kann ein optisches System oder Instrument sein, beispielsweise ein Mikroskop oder ein Laser-Capture-Mikrodissektions(LCM)-Instrument mit einem optischen Kopf 102b. Das System 100b kann ferner eine Basis 105b umfassen, die dafür ausgelegt ist, ein Substrat 110b aufzunehmen oder zu tragen, das eine Oberfläche 112b umfasst, die eine biologische Prüfsubstanz oder eine heterogene Mischung biologischer Zellen 115b enthält und/oder damit in Kontakt steht. Das System 100b kann dafür ausgelegt sein, eine selektierte oder isolierte Probe 118b aus der biologischen Prüfsubstanz oder heterogenen Mischung biologischer Zellen 115b zu selektieren, abzutrennen, zu isolieren und/oder auf andere Weise bereitzustellen. Die selektierte Probe 118b kann mehrere Zellen umfassen oder kann eine einzelne Zelle umfassen.
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Der optische Kopf 102b kann einen oder mehrere Laser aufweisen, die dafür ausgelegt sind, die selektierte Probe 118b von der Oberfläche 112b zu entfernen und/oder die auf der Oberfläche 112b befindliche Probe 118b abzutrennen oder zu isolieren. In solchen Ausführungsformen kann die Schwerkraft oder eine andere Einrichtung, beispielsweise ein Laser, verwendet werden, um die selektierte Probe 118b für eine weitere Verarbeitung und/oder Vorbereitung in eine Kappe, einen Behälter, ein Röhrchen, eine Kapillare oder dergleichen (nicht dargestellt) zu übertragen. Die selektierte Probe 118b kann eine frische Probe (z.B. eine frische Gewebeprobe), eine Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Probe oder irgendeine andere Art von biologischer Probe (z.B. irgendeine biologische Probe, die sich für eine LCM-Verarbeitung eignet) umfassen.
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Die selektierte Probe 118b kann anschließend für einen folgenden Assay, Versuch oder Test verarbeitet oder vorbereitet werden, beispielsweise, um eine oder mehrere DNA-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben oder um eine oder mehrere RNA-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben.
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Wie in 4A gezeigt ist, kann ein Behälter, ein Gefäß, ein Röhrchen, eine Kapillare oder dergleichen unterhalb des Substrats 110b angeordnet werden, um die selektierte Probe 118b aufzunehmen, nachdem sie von der Oberfläche 112b abgetrennt worden ist. Wie in 4A gezeigt ist, kann beispielsweise ein Behälter 400 so angeordnet werden, dass er die selektierte Probe 118b aufnimmt, wenn diese durch die Schwerkraft oder eine andere äußere Kraft, beispielsweise eine durch einen Laserstrahl hervorgerufene Kraft, übertragen wird. In bestimmten Ausführungsformen weist ein Behälter 410 eine Behälterkappe 412 auf, wobei die selektierte Probe 118b durch die Schwerkraft oder eine andere externe Kraft, beispielsweise eine von einem Laserstrahl hervorgerufene Kraft, vom Substrat 110b auf die Behälterkappe 412 übertragen werden kann. Nachdem eine oder mehrere selektierte Proben 118b auf die Behälterkappe 412 übertragen wurden, kann die Behälterkappe in eine Öffnung 415 des Behälters 400 eingeführt werden, so dass die Probe(n) 118b im Behälter 400 aufgenommen und weiter verarbeitet werden kann (können).
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In 2 ist ein System oder ein Instrument 200 bestimmter Ausführungsformen schematisch dargestellt. Das System 200 kann ein optisches System oder Instrument sein, beispielsweise ein Mikroskop oder ein Laser-Capture-Mikrodissektions(LCM)-lnstrument mit einem optischen Kopf 202. Das System 200 kann ferner eine Basis 205 umfassen, die dafür ausgelegt ist, ein Substrat 206, das eine Oberfläche 207 umfasst, und ein Substrat 210, das eine Oberfläche 212 umfasst, aufzunehmen oder zu tragen. Das System 200 kann dafür ausgelegt sein, eine selektierte oder isolierte Probe 218 aus der biologischen Prüfsubstanz oder heterogenen Mischung biologischer Zellen 215 zu selektieren, abzutrennen, zu isolieren und/oder auf andere Weise bereitzustellen. Die selektierte Probe 218 kann mehrere Zellen umfassen oder kann eine einzelne Zelle umfassen.
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Der optische Kopf 202 kann einen oder mehrere Laser aufweisen, die dafür ausgelegt sind, die selektierte Probe 218 von der Oberfläche 212 zu entfernen und/oder die auf der Oberfläche 212 befindliche Probe 218 abzutrennen oder zu isolieren. In solchen Ausführungsformen können das System 200 und die Oberfläche 212 des Substrats 210 so gestaltet sein, dass nach einer Trennung des Substrats 210 vom Substrat 206 die selektierte Probe 218 an der Oberfläche 212 haften bleibt und/oder mit dieser in Kontakt bleibt und die übrigen Teile der biologischen Prüfsubstanz 215 an der Oberfläche 207 haften bleiben und/oder in Kontakt damit bleiben. Die selektierte Probe 218 kann eine frische Probe (z.B. eine frische Gewebeprobe), eine Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Probe oder irgendeine andere Art von biologischer Probe (z.B. irgendeine biologische Probe, die sich für eine LCM-Verarbeitung eignet) umfassen.
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In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Substrat
210 eine Laser-Capture-Mikrodissektionskappe (LCM-Kappe) und/oder einen Probenträger und/oder eine Extraktionsvorrichtung. Beispiele für Systeme, Vorrichtungen und Verfahren, die geeignet sind, um eine oder mehrere selektierte Proben
218 zu selektieren, abzutrennen, zu isolieren und/oder auf andere Weise zu übertragen, finden sich unter anderem in den
US-Patenten Nr. US5859699 US7075640 ,
US6690470 ,
US8346483 ,
US7456938 ,
US8722357 ,
US6528248 ,
US7776273 ,
US7229595 ,
US7749388 ,
US6469779 .
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Während der Verwendung steht jede der Oberflächen 207, 212 in Kontakt mit der biologischen Prüfsubstanz 215. Das System 200 kann dafür ausgelegt sein, die selektierte Probe 218 zu selektieren, abzutrennen, zu isolieren und/oder auf andere Weise von der Oberfläche 207 des Substrats 206 auf die Oberfläche 212 des Substrats 210 zu übertragen. Das Substrat 210 kann vom Substrat 206 abgehoben oder entfernt werden, so dass die selektierte Probe 218 für eine weitere Verarbeitung von der biologischen Prüfsubstanz 215 getrennt werden kann und/oder in einem Assay, Versuch oder Test verwendet werden kann, um den Inhalt der selektierten Probe 218 zu beschreiben oder zu quantifizieren. Die selektierte Probe 218 kann anschließend beispielsweise für einen folgenden Assay, Versuch oder Test verarbeitet oder vorbereitet werden, beispielsweise, um eine oder mehrere DNA-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben oder um eine oder mehrere RNA-Moleküle oder -Sequenzen nachzuweisen, zu quantifizieren oder zu beschreiben.
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Wie in 3 und 5A dargestellt ist, umfasst ein Substrat 310 in bestimmten Ausführungsformen eine LCM-Kappe 310, wobei die Oberfläche 312 der LCM-Kappe 310 einen Durchmesser aufweisen kann, der dafür ausgelegt ist, die LCM-Kappe 310 an einem relativ kleinen Behälter 500 (z.B. einem Behälter oder Vial mit einem Innenvolumen von 0,2 Millilitern oder etwa 0,2 Millilitern) zu befestigen. Ausführungsformen der LCM-Kappe 310, die sich für Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eignen, sind in der vorläufigen US-Anmeldung mit der Nummer 62/203,311 erörtert. In bestimmten Ausführungsformen kann das System 200 zur Verwendung mit sowohl einer LCM-Kappe 210 (z.B. zur Verwendung mit Behältern oder Vials eines relativ großen Volumens) als auch einer LCM-Kappe 310 (z.B. zur Verwendung mit Behältern oder Vials eines relativ großen Volumens und Vials eines relativ kleinen Volumens) ausgelegt sein. In solchen Ausführungsformen kann die LCM-Kappe 210 dafür ausgelegt sein, einen Behälter oder ein Vial mit einem Volumen von 0,5 Millilitern aufzunehmen, während die LCM-Kappe 310 dafür ausgelegt ist, einen Behälter oder ein Vial mit einem Volumen von 0,5 Millilitern oder etwa 0,5 Millilitern und einen Behälter oder ein Vial mit einem Volumen von 0,2 Millilitern oder etwa 0,2 Millilitern aufzunehmen.
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Es wurde festgestellt, dass die Verwendung einer LCM-Kappe 310 mit einem Behälter 500 mit einem Volumen von 0,2 Millilitern oder etwa 0,2 Millilitern gewisse Vorteile bei der Verarbeitung bestimmter Arten von selektierten Proben 218 bereitstellt. Zum Beispiel kann ein Behälter oder ein Vial mit einem Fassungsvermögen von 0,2 Millilitern verwendet werden, um selektierte Proben zu verarbeiten, die nur einige wenige Zellen umfassen oder die nur eine einzige Zelle enthalten. Wie nachstehend ausführlicher erörtert wird, kann die Verwendung eines Behälters oder Vials mit einem Fassungsvermögen von 0,2 Millilitern in Verbindung mit der LCM-Kappe 310 verwendet werden, um vorteilhafterweise die selektierte Probe zu verarbeiten (z.B. durch einen Lyse-Assay) und im gleichen Behälter einen folgenden Assay, Versuch oder Test durchzuführen. Was die selektierten Proben (z.B. die selektierte Probe 218) betrifft, die nur wenige Zellen oder nur eine einzige Zelle umfassen, so hilft die Verwendung eines einzigen Behälters vorteilhafterweise dabei, die Probenlösung zu bewahren, und verringert die Kontamination, die stattfinden kann, wenn eine Probenlösung von einem Behälter oder Vial auf einen anderen bzw. ein anderes übertragen wird.
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Wie in 5A dargestellt ist, wird in bestimmten Ausführungsformen die Kappe 310 beispielsweise vom Substrat 206 getrennt (oben links in 5A) und zu einem Behälter 500 gebracht, der ein Innenvolumen 505 umfasst und der beispielsweise ein Volumen 508 einer Lysemischung 510 enthält. Der kleinere Durchmesser an der Oberfläche 212 der LCM-Kappe 310 kann anschließend auf den Behälter 500 (5A, Mitte) abgesenkt oder gepasst werden, um einen geschlossenen Behälter 502 bereitzustellen. In bestimmten Ausführungsformen kann der geschlossene Behälter 502 umgekehrt werden, so dass die Lysemischung 510 mit der selektierten Probe 218 in Kontakt kommt, um eine Probenlösung 512 zu bilden (unten links in 5A). Wie ebenfalls in 5B gezeigt ist, können die LCM-Kappe 310 und der Behälter 500 auf eine Halterung, Plattform oder ein Gestell 520 gesetzt werden. Die Halterung 520, einschließlich der LCM-Kappe 310 und des Behälters 500, kann in einen Inkubator 525 gesetzt werden, um die selektierte Probe 218 zu inkubieren. In manchen Ausführungsformen werden beispielsweise mehrere Paare aus LCM-Kappe 310/Behälter 500 mit gleichen oder ähnlichen Geometrien bereitgestellt, wobei jede LCM-Kappe 300 jeweils eine selektierte Probe 218 enthält, die vom System 200 oder zwei oder mehr solcher Systeme bereitgestellt wird. In manchen Ausführungsformen können manche oder alle von den LCM-Kappen 310 auf die Halterung 520 gesetzt und/oder für eine Inkubation der selektierten Proben gleichzeitig in den Inkubator 525 gesetzt werden.
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In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Behälter 500 eine Mulde einer Mikrotiterplatte (z.B. einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden oder einer Mikrotiterplatte mit 384 Mulden), und die LCM-Kappe 310 wird auf eine Öffnung an der Oberseite der Mulde gesetzt oder gepasst. Zusätzliche LCM-Kappen 310, die jeweils eine selektierte Probe 218 enthalten, können auf unterschiedliche Mulden der Mikrotiterplatte (z.B. auf einander benachbarte Mulden der Mikrotiterplatte oder auf Mulden, die durch eine dazwischenliegende Mulde getrennt sind) gesetzt werden. Nachdem sie auf die Mikrotiterplatte gesetzt wurden, können die selektierten Proben 218 jeweils vorbereitet oder verarbeitet werden wie hierin weiter unten beschrieben (z.B. können die selektierten Proben 218 zusammen in den Inkubator 525 gesetzt werden, beispielsweise, um einen Lyse-Assay an den Proben 218 durchzuführen).
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Zusätzlich oder alternativ dazu kann eine andere Verarbeitung der selektierten Probe 218 (alleine oder mit zusätzlichen Proben 218) innerhalb eines Volumens durchgeführt werden wie weiter unten ausführlicher erörtert wird. Während der Verarbeitung der selektierten Probe 218 innerhalb des Volumens 505, das von der LCM-Kappe 310 und dem Behälter 500 definiert wird, kann die LCM-Kappe 310 entfernt und nach Bedarf erneut angebracht werden (wie von dem Doppelpfeil in der Mitte von 5A angegeben ist), um je nach Vorgabe oder nach Bedarf andere Reagenzien oder Lösungen hinzuzufügen. Sobald die Vorbereitung und Verarbeitung der Probe 218 abgeschlossen wurde, kann die LCM-Kappe 310 entfernt werden, und die Probe 218 kann in einem Instrument 520 platziert oder befestigt werden, um einen folgenden Assay, Versuch oder Test an der Probenlösung 512 vorzunehmen, die nun die verarbeitete Version der zu Anfang selektierten Probe 218 enthält. Vorteilhafterweise findet der gesamte Prozess von der Gewinnung der selektierten Probe 218 bis zur Durchführung eines Assays, Versuchs oder Tests an der verarbeiteten Probenlösung 512 statt, während die selektierte Probe 218 an einer Oberfläche 312 der LCM-Kappe 310 und/oder im Volumen 505 des Behälters 500 gehalten wird.
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Das obige Beispiel für die Verarbeitung und Vorbereitung einer selektierten Probe betraf in erster Linie eine System 200 und ein Substrat einer LCM-Kappe 310. Es sei jedoch klargestellt, dass zumindest Teile der vorangehenden Absätze auf Systeme 100a, 100b und auf Substrate 110a, 110b und 210 angewendet werden können, um selektierte Proben vorzubereiten, beispielsweise selektierte Proben 118a oder 118b. Zum Beispiel können eine selektierte Probe (z.B. die selektierte Probe 118a oder 118b oder die selektierte Probe 218, die unter Verwendung des Substrats 210 selektiert wird) und eine Lysemischung miteinander in Kontakt gebracht werden, wenn (wie z.B. oben mit Bezug auf 1, 4A und 4B erörtert worden ist) eine selektierte Probe in einen Behälter abgesenkt, fallen oder schweben gelassen wird.
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In der obigen Ausführungsform, in der die LCM-Kappe 310 verwendet wird, oder in Ausführungsformen, die auf der Verwendung der Substrate 110a, 110b oder 210 basieren, kann eine Lysemischung in den Behälter (z.B. den Behälter 400, 500 und/oder die Behälterkappe 412) gegeben werden, wenn die selektierte Probe so gewonnen wird. Alternativ dazu kann die Lysemischung vor der Gewinnung der selektierten Probe in den Behälter gegeben werden. Die Lysemischung kann ein Puffersystem umfassen, das dafür ausgelegt ist, einen Workflow bereitzustellen, wo das Lysat direkt an eine qPCR geht. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die Lysemischung ein Puffersystem umfassen, das dafür ausgelegt ist, einen Workflow bereitzustellen, wo das Lysat direkt an einen Sequenzierungs-Assay geht.
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Wie in 6 gezeigt ist, weist in bestimmten Ausführungsformen ein Verfahren 600 zur Verarbeitung einer selektierten Probe (z.B. von selektierten Proben 118a, 118b oder 218), die (z.B. im Behälter 400, 500) eine oder mehrere Nukleinsäuren enthält, ein Element 610 auf, das die Bereitstellung einer selektierten Probe, die eine oder mehrere biologische Zellen umfasst, einschließt. Das Verfahren 600 weist ferner ein Element 620 auf, das die Platzierung, Anordnung oder Übertragung der selektierten Probe in ein(em) Innenvolumen eines Behälters umfasst (z.B. wie oben in Bezug auf die selektierten Proben 118a, 118b oder 218 erörtert, beispielsweise in dem bzw. in das Innenvolumen 505 des Behälters 500 oder in dem bzw. in das Innenvolumen des Behälters 400).
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Das Verfahren 600 schließt außerdem ein Element 630 ein, welches das Inkontaktbringen der selektierten Probe mit einer Lysemischung (z.B. der Lysemischung 510) unter Verwendung eines Protokolls zur Ausbildung oder Bereitstellung einer Probenlösung (z.B. der Probenlösung 512, die durch die selektierte Probe 218 und die Lysemischung 510 gebildet wird) innerhalb des Innenvolumens des Behälters umfasst. Das Protokoll kann Reagenzien und Vorgehensweisen für die Lyse der selektierten Probe einschließen. Wie nachstehend erörtert wird, kann das Protokoll auch andere Reagenzien und Vorgehensweisen für die Verarbeitung und Vorbereitung der selektierten Probe für spätere Assays, Versuche oder Tests einschließen. Die Lysemischung kann eines oder mehrere der Folgenden umfassen:
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- • Eine Proteinase K.
- • Eine Lysemischung weist ein Volumen auf, das 10 Mikroliter oder weniger beträgt.
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Beispielsformulierungen für Lysemischungen schließen unter anderem diejenigen ein, die im
US-Patent Nummer US7964350 erörtert sind. Es wurde festgestellt, dass Ausführungsformen, in denen das Volumen der Lysemischung
10 Mikroliter oder weniger beträgt, nützlich sind, wenn die selektierte Probe nur eine oder nur wenige Zellen enthält und/oder in Kombination mit einem Behälter (z.B. dem Behälter
400 oder
500), der ein Volumen von etwa 0,2 Milliliter oder weniger aufweist. In solchen Ausführungsformen wurde festgestellt, dass die Durchführung aller Prozess in einem einzigen Behälter große Vorteile hat.
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In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Protokoll gemäß dem Verfahren 600 die Erwärmung der Probenlösung (z.B. der Probenlösung 512) auf eine erste Temperatur, die höher ist als 37 Grad Celsius und die höchstens 75 Grad Celsius beträgt. Wie sich während Versuchen gezeigt hat, die nachstehend erörtert werden, und wie in 9, 10, 12 und 14-18 gezeigt ist, wurde festgestellt, dass Lyse-Assays, die bei einer Temperatur von über 37 Grad Celsius durchgeführt werden, die Ausbeute an Target-DNA oder RNA aus einer selektierten Probe erhöhen. Dies wurde experimentell nachgewiesen durch einen Ct-Wert (z.B. eine Durchschnittszahl thermischer Zyklen in einem qPCR-Amplifizierungsprozess) für Assays, die bei Temperaturen von über 37 Grad Celsius durchgeführt wurden, der niedriger war im Vergleich zu Ct-Werten von Assays, die bei 37 Grad Celsius durchgeführt wurden. In einer bestimmten Ausführungsform wurde festgestellt, dass die Ausbeute an sowohl DNA als auch RNA bei Lyse-Assay-Temperaturen von 65 Grad Celsius oder von etwa 65 Grad Celsius (z.B. 65 Grad Celsius ±1 Grad Celsius) höher war als bei Temperaturen unterhalb oder oberhalb dieser Temperaturbedingung. In bestimmten Sätzen von ausgeführten Lyseprotokollen wurde festgestellt, dass eine Lysetemperatur von mindestens 45 Grad Celsius oder 55 Grad Celsius und höchstens 75 Grad Celsius eine bessere DNA- und/oder RNA-Ausbeute lieferte als wenn der Lyse-Assay entweder oberhalb oder unterhalb dieser Temperaturbedingungen durchgeführt wurde,
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In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Protokoll des Elements 630 des Verfahrens 600 eine erste Inkubation für einen Assay an der selektierten Probe, die über eine erste Inkubationszeit und bei der ersten Temperatur (z.B. bei einer Temperatur von etwa 65 Grad Celsius) durchgeführt wird. Die erste Inkubationszeit dauert höchstens 2 Stunden oder höchstens 1 Stunde. Versuche gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die nachstehend erörtert werden, werden allgemein über einer Inkubationszeit von etwa 1 Stunde durchgeführt und bieten den Vorteil erhöhter DNA- und RNA-Ausbeuten. Kürzere Inkubationszeiten erlauben vorteilhafterweise die Verarbeitung von mehr Target-Proben über einer vorgegebenen Zeitspanne.
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In bestimmten Ausführungsformen kann das Protokoll gemäß dem Verfahren 600 ein Element 640 umfassen, in dem die Probenlösung (z.B. die Probenlösung 512) auf eine zweite Temperatur erwärmt wird, die höher ist als die erste Temperatur, beispielsweise eine Temperatur von mindestens 85 Grad Celsius. Das Element 640 kann ferner eine auf die erste Inkubation folgende zweite Inkubation bei der erhöhten Temperatur umfassen, wobei die zweite Inkubationszeit mindestens 15 Minuten oder etwa 15 Minuten (z.B. 15 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten oder 60 Minuten) lang ist. Die Dauer der zweiten Inkubation kann so ausgewählt werden, dass Anforderungen in Bezug auf die Erhöhung der Ausbeute und einen höheren Verarbeitungsdurchsatz für eine bestimmte Anwendung erfüllt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die zweite Inkubation bei der höheren Temperatur verwendet werden, um eine molekulare Vernetzung von Säuremolekülen innerhalb der Probenlösung zu verringern.
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In manchen Ausführungsformen weist das Verfahren 600 außerdem ein Element 650 auf, das die Zugabe einer Desoxyribonuklease (DNase) und/oder einer Ribonuklease (RNase) zu der Probenlösung (z.B. der Probenlösung 512) umfasst, was zu einer modifizierten oder größeren Probenlösung (z.B. der Probenlösung 512) führen kann. In manchen Ausführungsformen wird die Temperatur der Probenlösung entweder vor oder nach der Zugabe der DNase und/oder RNase von der ersten Temperatur (die während der Lyse verwendet wird) aus gesenkt, Zum Beispiel kann eine Lösungstemperatur auf eine Temperatur von unter 40 Grad Celsius gesenkt werden (z.B. auf eine Temperatur von 37 Grad Celsius oder von etwa 37 Grad Celsius oder auf eine Temperatur, die unter 37 Grad liegt, beispielsweise Raumtemperatur). In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Probenlösung sowohl ein DNA-Molekül als auch ein RNA-Molekül, und unterschiedliche Teile der Lösung werden entweder mit RNase oder mit DNase behandelt. In solchen Ausführungsformen kann die Lösung im Behälter (z.B. im Behälter 400 oder im Behälter 500) aufgeteilt werden, um einen ersten Teil der Probenlösung, der im Behälter verbleibt, und einen Teil, der in einen zweiten Behälter übertragen (z.B. gegossen oder pipettiert wird) bereitzustellen. Ein RNase-Wirkstoff kann entweder zum ersten Teil oder zum zweiten Teil gegeben werden, wobei ein DNA-Assay, - Versuch oder -Test an diesem Teil durchgeführt werden kann. Ein DNase-Wirkstoff kann zum anderen Teil gegeben werden, so dass ein RNA-Assay, -Versuch oder - Test an diesem Teil durchgeführt werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann zumindest ein Teil des ersten und/oder des zweiten Teils für die die gleiche Probenvorbereitung und/oder den gleichen folgenden Assay, Test oder Versuch wie beim ersten oder zweiten Teil in einen dritten Behälter übertragen werden. Alternativ dazu kann der dritte Teil anders verarbeitet werden als der erste oder der zweite Teil und/oder kann in einen anderen folgenden Assay, Test oder Versuch aufgenommen werden als der erste oder der zweite Teil.
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In bestimmten Ausführungsformen kann das Verfahren
600 ferner ein Element
660 aufweisen, das die Zugabe einer Stopplösung zu der Probenlösung (z.B. der Probenlösung
512) umfasst. Im Falle von RNA-Proben kann das Verfahren
600 auch ein Element
670 aufweisen, das die Zugabe einer reversen Transkriptase zu der Probenlösung (z.B. zum Umwandeln von RNA-Molekülen in cDNA-Moleküle) umfasst. Das Verfahren
600 kann außerdem ein Element
670 aufweisen, das die Durchführung eines Präamplifikations-Assays an der Probenlösung vor der Durchführung des Assays, Versuchs oder Tests an der Probenlösung umfasst. In manchen Ausführungsformen (z.B. wo nur eine kleine Menge oder Zahl von Molekülen einer bestimmten Art, zum Beispiel von RNA- oder DNA-Target-Molekülen) vorhanden ist, kann das Verfahren
600 ein Element
680 aufweisen, das die Durchführung eines Präamplifikations-Assays an der Probenlösung vor der Durchführung eines Assays, Versuchs oder Tests an der Probenlösung, zum Nachweisen, Analysieren, Quantifizieren eines oder mehrerer Moleküle aus der abgetrennten Probe umfasst. Beispiele für Lösungen und Assays für die Verarbeitung der selektierten Probe schließen unter anderem diejenigen ein, die im
US-Patent Nummer US7964350 erörtert sind.
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In verschiedenen Ausführungsformen kann das Verfahren 600 ein Element 690 einschließen, das die Durchführung eines oder mehrerer Assays, Versuche oder Tests im gleichen Behälter (z.B. im Behälter 400 oder 500), der zu Anfang verwendet wurde, um die selektierte Probe (z.B. die selektierte Probe 118a, 118b oder 218) zu lysieren, umfasst. Der Assay, -Versuch oder -Test kann eine oder mehrere der Folgenden einschließen:
- • Einen Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einen quantitativen PCR(qPCR)-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einen digitalen PCR-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einen Genotypisierungs-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einen Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test.
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Der Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test kann einen Kapillarelektrophorese-Assay, -Versuch oder -Test oder einen Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test der nächsten Generation umfassen.
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Der Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test der nächsten Generation umfasst einen oder mehrere von:
- • Einem Einzelmolekül-Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einem lonenhalbleiter-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einem Pyrosequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einem Sequenzierung-durch-Synthese-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einem Sequenzierung-durch-Ligation-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einem Kettenabbruchs-Assay, -Versuch oder -Test.
- • Einen Sanger-Sequenzierungs-Assay, -Versuch oder -Test.
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In bestimmten Ausführungsformen kann eine Probenlösung eine erste Population eines ersten Moleküls und eine zweite Population eines seltenen Moleküls umfassen, wobei die zweite Population kleiner ist als die erste Population. In solchen Ausführungsformen umfasst der Assay, Versuch oder Test einen Assay, Versuch oder Test zum Nachweisen, Analysieren oder Quantifizieren des seltenen Moleküls.
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Eines oder mehrere der genannten Elemente des Verfahrens 600 können weggelassen oder modifiziert werden. Zum Beispiel kann das Element 670 (die Hinzufügung einer reversen Transkriptase) weggelassen werden, wenn ein DNA-Assay, -Versuch oder -Test an der Probenlösung durchgeführt werden soll. In anderen Ausführungsformen kann das Element 640 (die Verarbeitung bei einer Temperatur oberhalb der nominalen Lysetemperatur) weggelassen werden. In einer noch anderen Ausführungsform kann das Element 690 weggelassen werden und die gesamte Probenlösung oder ein Teil davon kann für einen folgenden Assay, Versuch oder Test in einen anderen Behälter übertragen werden.
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Beispiele:
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Bestätigungen für zumindest einige von den beanspruchten und/oder offenbarten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch verschiedene Versuche und Tests, die nachstehend erörtert werden und die in 7-18 gezeigt sind, gestützt.
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Offenbarte Workflows, die offenbart und/oder experimentell geprüft werden, kombinieren drei Komponenten, die in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können, um eine effiziente Lyse und/oder Extraktion von RNA aus LCMerfassten frischen und/oder FFPE-Gewebe-/Zelllysaten zu ermöglichen.
- 1) Eine LCM-Kappe wurde so gestaltet, dass sie an Behältern mit kleinen Volumina (z.B. Behältern mit einem Volumen von etwa 0,2 Milliliter oder weniger) angebracht werden konnte (siehe die vorläufige US-Anmeldung Nummer 62/203,311 f ür geeignete Ausführungsformen einer LCM-Kappe).
- 2) Pufferformulierungen für eine direkte FFPE-Lyse in einem kleinen Volumen (z.B. einem Behältervolumen von 0,2 Millilitern und/oder einem Lysemischungsvolumen von höchstens oder gleich 10 Mikrolitern oder etwa 10 Mikrolitern),
- 3) Vorgegebene Lysebedingungen für FFPE (Inkubationstemperatur und -zeit) (z.B. 7).
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Zusammen ermöglichen diese Komponenten einen Extraktions-Workflow, der in einem einzigen Sammelröhrchen vollendet werden kann. Darüber hinaus sind diese Elemente kompatibel mit einem Einzelröhrchen-qPCR-Workflow (8).
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Zum Beispiel zeigt 9 Ergebnisse für eine LCM-Kappe, die in Kombination mit einem Behälter mit kleinem Volumen (0,2 Milliliter) mittels der Durchführung von qPCR an FFPE-LCM-isolierter RNA mit spezifischen NSCLC-Targets (Lungenkrebs-FFPE-Gewebeblock > 1 Jahr alt) verwendet werden.
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Die LCM-Kappe, die mit einem 0,2 ml fassenden PCR-Behälter kompatibel ist, wurde verwendet, um LCM-FFPE-Zell-/Gewebeisolate - aus einer Probengewinnung durch Detektion - in einem einzigen Röhrchen zu verarbeiten, wodurch Probenverluste in Verbindung mit Workflows, für die mehrere Röhrchen verwendet werden, minimiert werden (beispielsweise eine LCM-Kappe, die mit einem 0,2 Milliliter fassenden Behälter kompatibel ist). Außerdem ermöglicht die Flexibilität, welche die Verwendung eines kleinen Lysevolumens (10 Mikroliter) erlaubt, unseren Kunden die Erhöhung einer Probenkonzentration ebenso wie eine Sensibilität folgender Workflows, was besonders dann von Vorteil ist, wenn mit sehr kleinen LCM-Proben, beispielsweise einzelnen Zellen, gearbeitet wird. Unsere Lösung in Form eines Workflows, der auf Lyse basiert, erleichtert die Cells-to-Ct-Pufferformulierung, wobei es sich um ein auf reinigungsaktiven Substanzen basierendes Puffersystem mit geringer lonenstärke handelt, das für einen Workflow geeignet ist wo das Lysat direkt an eine qPCR geht. Zahlreiche Literaturstellen geben an, dass die Ausbeute und der Gewinn von RNA bei höheren Temperaturen und kürzerer Inkubation besser werden. In diesem vorgeschlagenen Workflow wurde die Zelllysebedingung durch Erwärmen des mikrodissektierten LCM-FFPE-Zellen- oder Gewebelysats bei 65 Grad Celsius für ≤ 1 Stunde statt bei 37 Grad Celsius über Nacht (16 Stunden) erreicht. Ein zusätzlicher Vorteil der Lyse der LCM-mikrodissektierten Zellen bei 65 Grad Celsius besteht darin, dass ein vereinheitlichter Workflow mit mehreren Analyten möglich ist, um DNA und RNA aus dem gleichen LCM-Gewebelysat zu extrahieren. Alternativ dazu kann der vorgeschlagene Workflow verwendet werden, um RNA und genomische DNA alleine aus LCM-FFPE-Gewebelysat zu isolieren. Die Erhöhung der Temperatur der Zelllysebedingung von 37 Grad Celsius auf 65 Grad Celsius zeigte Verbesserungen bei der RNA-Ausbeute (9). Da FFPE-Proben eine erhebliche RNA-Vernetzung aufweisen, die sich auf die Wirksamkeit des RT-Enzyms auswirken könnte, empfehlen wir die Erwärmung der Probe für 15 min bei 85 Grad Celsius nach dem Zelllyseschritt, um die Rückgängigmachung molekularer Vernetzungen zu verbessern. Eine Inkubationszeitoptimierungsstudie mit einem Schritt mit 85 Grad Celsius (15 Minuten, 30 Minuten und 1 Stunde) zeigte keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Proben.
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Wie in 9 gezeigt ist, wurden LCM-Gewebeträger aus einem > 1 Jahr alten Lungen(NSCLC)-Block und einem > 2 Jahre alten Brustkrebs-FFPE-Block hergestellt. Eine Vorab-Workflow-Eignung wurde durch Durchführen einer RT-qPCR mit krebsspezifischen Assays erreicht, die mit RNA getestet wurden, die aus LCM-Gewebelysat, das bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubiert wurde, und mit unserem verbesserten LCM-FFPE-Gewebe-RNA-Extraktionsprotokoll (65 Grad Celsius für 1 Stunde und 85 Grad Celsius für 15 min - 1 h) erhalten wurde. Der vorgeschlagene LCM-FFPE-Zellextraktions-Workflow (65 Grad Celsius für 1 h und 85 Grad Celsius für 15 min - 1 h) ergab für die Mehrheit der Assays (Kontrolle und Target), die in dieser Studie getestet wurden, eine bessere/vergleichbare Leistung in Bezug auf ein existierendes Protokoll (37 Grad C über Nacht) an (9 und 10). Der verbesserte Workflow gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nutzt eine LCM-Kappe, die mit einem 0,2 Milliliter fassenden Behälter kompatibel ist, was die Flexibilität bietet, ein geringes Volumen zu verwenden, und Kompatibilität mit einem Einzelröhrchen-qPCR-Workflow bereitstellt. Eignungsdaten mit einem verbesserten Zellextraktionsprotokoll zeigten eine erfolgreiche Extraktion von aus qPCR und aus NGS stammender RNA aus mikrodissektierten LCM-FFPE-Zellen oder -Geweben mit einer kürzeren Durchlaufzeit (> 80 %) im Vergleich zu einem heutigen Zellextraktionsprotokoll (37 Grad Celsius über Nacht), was für eine moderne Genomanalyse sehr erstrebenswert ist.
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Wie in 10 gezeigt ist, wurde eine Studie unter Verwendung eines 7 Mikrometer starken FFPE-Schnitts von einem ein Jahr alten NSCLC-FFPE-Block durchgeführt, und eine qPCR-Analyse wurde an RNA-Proben durchgeführt, die aus einer 200 Mikrometer starken FFPE-Region aufbereitet wurden, die unter Verwendung einer LCM-Kappe, die mit einem 0,2 ml fassenden PCR-Röhrchen kompatibel war, mikrodissektiert worden war. Optimierte FFPE-RNA-Protokolle mit einer Lyse über 2 Stunden zeigten ein vergleichbares Ergebnis wie eine heutige Inkubation bei 37 Grad Celsius O/N (16 Stunden). Alle für NSCLC-Lungenkarzinom getesteten Kontroll- und Target-Assays wurden sowohl mit unserem heutigen als auch dem verbesserten FFPE-RNA-Extraktionsverfahren nachgewiesen. Jeder Balken stellt zweifache Probenpräparate und vierfache PCR-Replikate dar.
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Wie in 11 und 12 gezeigt ist, wurde eine Studie unter Verwendung eines 7 Mikrometer starken FFPE-Schnitts von einem > 2 Jahre alten Brust-FFPE-Block durchgeführt, und eine qPCR-Analyse wurde an RNA-Proben durchgeführt, die aus einer 150, 500 und 4000 Mikrometer messenden FFPE-Region aufbereitet wurden, die unter Verwendung einer LCM-Kappe, die mit einem 0,2 ml fassenden PCR-Röhrchen kompatibel war, mikrodissektiert worden war. Optimierte FFPE-RNA-Protokolle mit einer Lyse von 2 Stunden zeigten ein vergleichbares/besseres Ergebnis in Bezug auf eine heutige Inkubation bei 37 Grad Celsius über Nacht (16 Stunden). Jeder Balken stellt dreifache Probenpräparate und vierfache PCR-Replikate dar.
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In 14-16 sind Ergebnisse von RNA-qPCR-Versuchen gezeigt:
- • FFPE-Brustgewebelysat wurde bei einer Temperatur inkubiert, die in der Tabelle genannt ist.
- • Verwendeter Lysatpuffer: Cells-to-Ct-Puffer
- • Nach 1 Stunde Inkubationsreaktion (für jeden Zeitpunkt) wurde das Lysat mit DNase behandelt
- • Die Reaktion wurde durch Zufügen einer Stopplösung gestoppt
- • Die Probe wurde durch RT-PCR-Assay analysiert
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In 17-19 sind Ergebnisse von DNA-qPCR-Versuchen gezeigt:
- • FFPE-Brustgewebelysat wurde bei einer Temperatur inkubiert, die in der Tabelle genannt ist.
- • Verwendeter Lysatpuffer: Cells-to-Ct-Puffer
- • Nach 1 Stunde Inkubationsreaktion (für jeden Zeitpunkt) wurde das Lysat mit RNase behandelt
- • Die Reaktion wurde durch Zufügen einer Stopplösung gestoppt
- • Die Probe wurde durch PCR-Assay analysiert
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16 und 19:
- • Boundary-Test für 65 °C: Die Probenlysate wurden bei ±1 °C (64 °C und 66 °C) getestet.
- • Eine Tukey-Kramer-Analyse deutete darauf hin, dass weder bei der DNAnoch bei der RNA-Ausbeute ein nennenswerter Unterschied zwischen 64 °C, 65 °C und 66 °C besteht, (überlappende Kreise - kein nennenswerter Unterschied)
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Die obige Beschreibung stellt in so vollständigen, klaren, deutlichen und exakten Begriffen die Art und Weise, die als die beste zur Ausführung der vorliegenden Erfindung betrachtet wird, und die Art und Weise und die Vorgehensweise zu deren Herstellung und Verwendung dar, dass jeder Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet in der Lage sein wird, die Erfindung herzustellen und anzuwenden. Auf die Erfindung können jedoch Modifikationen und alternative Konstruktionen gegenüber den oben erörterten vorgenommen werden, die diesen vollständig gleichwertig sind. Infolgedessen soll die Erfindung nicht auf die konkreten offenbarten Ausführungsformen beschränkt werden. Die Erfindung soll vielmehr Modifikationen und alternative Konstruktionen abdecken, die im Gedanken und Bereich der Erfindung liegen, wie sie allgemein von den folgenden Ansprüchen ausgedrückt werden, die den Gegenstand der Erfindung konkret hervorheben und abgrenzen.
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Die folgenden US-Patente sind jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gänze hierin aufgenommen:
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Zitierte Patentliteratur
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- US 62203311 [0001]
- US 62303227 [0001]
- US 62341563 [0001]
- US 5859699 [0019, 0053]
- US 7075640 [0019, 0053]
- US 6690470 [0019, 0053]
- US 8346483 [0019, 0053]
- US 7456938 [0019, 0053]
- US 8722357 [0019, 0053]
- US 6528248 [0019, 0053]
- US 7776273 [0019, 0053]
- US 7229595 [0019, 0053]
- US 7749388 [0019, 0053]
- US 6469779 [0019, 0053]
- US 7964350 [0030, 0035, 0053]
- US 62203311 f [0042]
- US 8828664 [0053]
- US 6157446 [0053]
- US 6887703 [0053]
- US 7473401 [0053]
- US 8288106 [0053]
- US 9279152 [0053]
- US 7049558 [0053]
- US 7556733 [0053]
- US 6495195 [0053]
- US 8715955 [0053]
