JP2006154290A - 蛍光顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】２種類の蛍光像を同時に観察可能な蛍光顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】本発明による蛍光顕微鏡システムは、蛍光物質を含む標本（Ｓ）と、前記標本を支持するガラスプレート（Ｇ）と、前記標本の照明に用いられる照明光源（Ｉ_L ）と、前記照明による像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズ（Ｏｂ）を含む顕微鏡光学系（Ｍ）を備えている。照明光学系は、前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本の第１および第２の照明をする。光束制御装置である、マイクロミラーを含むＤＭＤは、前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、前記第１および第２の照明のために照明光を分離し、前記照明により形成された第１および第２の像光を分離する。
【選択図】図１

Description

本発明は、同一の標本について異なる照明による蛍光像の同時取得を可能にした蛍光顕微鏡システムに関する。

同一の対物レンズや、照明系を異なった目的で使用する顕微鏡技術が数多く提案されている。特許文献１記載の走査型近接場光学顕微鏡の発明は、走査型近接場光学顕微鏡であって、ケーラー照明系とエバネッセント波発生系を備え、可動全反射ミラー（ＤＭＤ）を光路上に配置したり、そこから外したりすることによってケーラー照明系とエバネッセント波発生系の切り替えを行う記述を開示している。
特許文献２記載の観察対象の立体像を生成する方法および立体観察装置の発明は、観察対象物からの光をＤＭＤにより時分割で左右に振り分ける技術を開示している。
特許文献３記載の発明は、光源から出た光がＤＭＤのオン素子により反射され対物平面に焦点を結ぶ技術を開示している。対物平面で励起された蛍光光は同一の光路を経てＤＭＤに戻り、半透明ミラーで反射されて一方のカメラに達する。焦点が外れた位置から発生した光はオフ素子によりミラーで反射され他方のカメラに達する。
特許文献４記載の照明光学系及び照明光学系を備えた顕微鏡の発明は、光ファイバの出射端の位置を移動させることにより落射照明とエバネッセント照明が行える技術を開示している。
特許文献５記載の走査型顕微鏡、走査型顕微鏡法における結像のための光学装置および方法の発明はレーザー光をマイクロミラーで反射させて標本に当て、反射された光を検出する共焦点走査型顕微鏡を開示している。
特許文献６記載のレーザー顕微鏡は、走査型と全反射型との両方の機能を選択的に使用できるレーザー顕微鏡であって、ビームの光路上に集光レンズと平行平面版とからなる挿脱装置を置くことによりビームを結像レンズの中央から所定距離オフセットさせた位置に入射させ、対物レンズを経てカバーガラスに斜めから照射させ、標本との界面で全反射させる。また、ビームの光路上から前記挿脱装置を除くことにより走査型として使用する。
特許文献７記載の顕微鏡システムは、共焦点走査型レーザー顕微鏡および全反射蛍光顕微鏡として同時に使用する場合、ダイクロイックミラーを用い、共焦点走査型レーザー顕微鏡用として波長４８８ｎｍの発振線が標本に照射され、全反射蛍光顕微鏡用として波長５４３ｎｍの発振線が標本に照射される技術を開示している。
特開平０８−２２０１１３ 特開平１０−１３３３０７ 特開平１１−１９４２７５ 特開２００１−２７２６０６ 特開２００２−１３１６４９ 特開２００３−０２９１５３ 特開２００３−２７０５３８

前記特許文献７記載の顕微鏡は多岐にわたる用途を示しているが可動部分が多く設けられている。前記特許文献３記載の発明は対物平面で励起された蛍光光をＤＭＤのオン素子により一方のカメラに導き、焦点が外れた位置から発生した光をＤＭＤのオフ素子により他方のカメラに導く技術が開示しているが、エバネッセンス法におよんでいない。
また前述の特許文献を含めてＤＬＰ（Digital Light Processing）技術の共焦点顕微鏡への応用に関する提案は数多くなされている。
ＤＬＰ共焦点顕微鏡は、共焦点顕微鏡の基本原理であるニプコウ円盤のピンホールを、ＤＬＰの根幹を成すＤＭＤ（Digital Micromirror Device）上の個々の微小ミラーに代替させることによって成立している。
その結果、光源からの光はその一部のみを標本に照射しているに過ぎない（ＤＭＤ上の“ＯＮ" 状態の微小ミラーのみが標本を照射）。それゆえ、残りの光（ＤＭＤ上の“ＯＦＦ" 状態の微小ミラーからの光; 光源の光の９０％以上）は利用されていないことになる。他方のカメラに導く技術が開示しているが、エバネッセンス法におよんでいない。

蛍光顕微鏡が、医療の診断のために広く用いられている（特許文献８〜１０）。
特表平１１−５０５５２６ 特表２００２−５３０７１５ 特表２００２−５４１４８２

蛍光顕微鏡には様々な方式があり、それぞれの方式によって得られる像の性質に違いがあるため、観察したい対象の特徴に応じて、顕微鏡の方式を選択する必要があった。
ひとつの方式を実現するには、照明の光路と観察の光路の設け方を一定のものとする必要がある。
異なる方式とするには、その組み合わせを取り替えるために、これまでは、光学素子の交換などの操作を必要とした。したがって、二つの異なる蛍光顕微鏡方式を重ねて、異なる性質の蛍光像を同時に複数得るということはできなかった。
一般的に用いられている蛍光顕微鏡の方式としては、
１）落射照明蛍光法、
２）共焦点蛍光法、
３）全反射照明蛍光法（別名エバネッセンス顕微鏡法）、
４）斜光照明蛍光法
などがある。
１）は単純な光学系で明るい像が得られる。
２）は１）より暗いが、被写界深度の浅い像、すなわち観察対象を光軸に垂直な面で光学的に薄く切断した様な像が得られる。３）は細胞膜など光学系の最終端にあるガラスに接着した対象をきわめて薄く切断した様な画像が得られ、背景光が最も低くなるため、一分子からの蛍光像も得られる。４）は細胞などの内部を観察するものであるが、像の光学切断性は２）と３）の中間の性能となる。この方式でも辛うじて一分子像が観察できる。

本発明では、画素であるマイクロミラーを多数２次元的に配列したデジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）を用い、異なる方式の蛍光顕微鏡法を同時に実現するものである。
特に、共焦点蛍光顕微鏡法と全反射照明蛍光法、または、
共焦点蛍光顕微鏡法と斜入照明顕微鏡法を同時に実現することにより、常に２種類の異なる蛍光顕微鏡像を連続、経時的に得られるようにしたものである。

本発明の基本的な目的は、光束制御装置を用いて、顕微鏡観察の光源及び像面を、各々二つに分けることにより同一の標本の異なる照明によるそれぞれの像を同時に観察することができる顕微鏡システムを提供することにある。
本発明の目的は、同一の標本のエバネッセンス像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時に観察を可能にした２像同時観察を可能にする蛍光顕微鏡システムを提供することにある。
本発明のさらに詳細な目的は、蛍光顕微鏡において同一の標本の斜入光照明像と共焦点像を同一の対物レンズを介して２像同時観察を可能にする蛍光顕微鏡システムを提供することにある。

前記目的を達成するために本発明による請求項１記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本の照明光を発生する照明光源と、
前記照明光による像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に第１および第２の照明をする照明光学系と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、前記第１および第２の照明のために照明光を分離するとともに前記分離された照明光により形成された第１および第２の像光を分離する光束制御装置と、
前記第１および第２の像光を結像して第１および第２の像を得る結像光学系と、
から構成されている。
前記構成によれば、前記第１および第２の像光を選択的にまたは同時に観察することができる。

本発明による請求項２記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本のエバネッセンス照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記エバネッセンス照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光とエバネッセンス照明光を分離しさらに共焦点像光とエバネッセンス像光を分離する光束制御装置と、
前記光束制御装置で分離された前記エバネッセンス照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて全反射エバネッセンス照明光が発生するよう投射するエバネッセンス照明光学系と、
前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
分離された前記エバネッセンス像光を結像するエバネッセンス像結像レンズと、
分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
から構成されている。
前記構成によれば、エバネッセンス像と共焦点像を選択的にまたは同時に観察することができる。

本発明による請求項３記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項２記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記照明光源の光軸は前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交叉するものである。
本発明による請求項４記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記エバネッセンス照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる軸上に配置されている。
本発明による請求項５記載の蛍光顕微鏡システムは、請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
前記共焦点照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる照明光軸とダイクロイックミラーの位置で交わる他の軸上に配置されている。

本発明による請求項６記載の蛍光顕微鏡システムは、
蛍光物質を含む標本と、
前記標本を支持するガラスプレートと、
前記標本の斜入照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
前記斜入照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光と斜入照明光を分離しさらに共焦点像光と斜入像光を分離する光束制御装置と、
前記光束制御装置で分離された前記斜入照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて斜入照明光が発生するよう投射する斜入照明光学系と、
前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
分離された前記斜入像光を結像する斜入像結像レンズと、
分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
から構成されている。
前記構成によれば、斜入像結像と共焦点像結像を同時にまたは選択的に観察できる。
本発明による請求項７記載の蛍光顕微鏡システムは、
請求項１〜６記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、前記光束制御装置をＤＭＤとしたものである。

本発明によれば、同一の標本のエバネッセンス像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時にまたは選択的に観察が可能である。また、蛍光顕微鏡において同一の標本の斜入光照明像と共焦点像を同一の対物レンズを介して同時にまた選択的に観察することも可能になった。

以下図面等を参照して本発明による装置の実施形態を説明する。
図１は、本発明による蛍光顕微鏡システムの基本構成を示すブロック図である。ガラスプレート（Ｇ）の上に標本（Ｓ）が搭載されている。この標本（Ｓ）は後述するように２種類の像すなわち、第１の照明と第２の照明の各像を形成するように照明される。顕微鏡光学系（Ｍ）は前記標本（Ｓ）の第１の照明と第２の照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズ（Ｏｂ）を含んでいる。
前記対物レンズ（Ｏｂ）を含む顕微鏡光学系（Ｍ）の光軸上に光束制御装置が配置されている。光束制御装置は、前記第１および第２の照明のために照明光を分離し、前記分離された照明光により形成された第１および第２の像光を分離するために用いられる。前記光束制御装置は、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、それらの変化を高速でかつ連続的に変更できる装置である。

ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は前記光束制御装置として適している。
このディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は前記第１および第２の照明像の取得のために駆動される多数のマイクロミラーを含んでいる。ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）は、外部の制御回路（ＣＰＵ）により任意のマイクロミラーがオンオフ制御される。オフ状態のマイクロミラーが第１の照明（およびこの照明により形成された像の取得）に寄与する。他方オン状態のマイクロミラーが第２の照明（およびこの照明により形成された像の取得）に寄与する。

照明光源（Ｉ_L ）は、前述の第１の照明のための照明光と第２の照明のための照明光を含んでおり、前記ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）に向けて照明光を放出する。
この照明光はディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）で第１の照明光と第２の照明光に分離されそれぞれ標本の第１の像と第２の像の形成に利用される。それぞれの光で照明された標本（Ｓ）において、第１の像と第２の像を形成する。これらの像はそれぞれ顕微鏡光学系（Ｍ）で拡大され、第１および第２の結像光学系でそれぞれの画像センサ（Ｉ_s1, Ｉ_s2) に結像させてそれぞれディスプレイ（Ｄ_i1, Ｄ_i2）により表示される。
つまり、ＤＬＰ技術を利用し、例えば共焦点法とエバネッセンス法の同時観察を可能にするものである。（なお他の組み合わせもある。）要するに今回のアイデアの本質的な部分は、ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）のマイクロミラーを駆動して顕微鏡観察の光源及び像面を、各々二つに分けることができるというところである。ディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）により分光された光源を、既存の顕微鏡観察法の光源として利用することにより、様々な顕微鏡観察法との同時観察が可能になる。

図２は、本発明による蛍光顕微鏡システムの実施例の略図である。図３は前記顕微鏡の実施例のエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光学要素および光束を取り出して示した略図である。図４は前記顕微鏡の実施例の共焦点顕微鏡動作に関連する光学要素および光束を取り出して示した略図である。本発明ではエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光学要素を利用して、若干の配置の修正等により、前記標本の斜入照明と共焦点照明の各像を取得することができる。まず始めに光学系について説明する。

各図において、顕微鏡の主軸または光軸（ＯＡ₁ ）に沿って、カバーガラス６、対物レンズを構成する第２レンズ５、結像用のレンズである第１レンズ４およびディジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）がこの順で配置されている。カバーガラス６の上には励起光により蛍光を発する物質を含む標本（または試料）３０が配置される。
標本３０の例として、緑色蛍光蛋白とインスリンの融合蛋白を分泌顆粒内に発現した細胞を挙げることができる。
光束制御装置であるディジタルマイクロミラー装置はそのマイクロミラーがオフの状態の光路に着目してＤＭＤ１（マイクロミラーがオフの状態）、そのマイクロミラーがオンの状態の光路に着目してＤＭＤ２（マイクロミラーがオンの状態）と表すものとする。

照明光源の主軸または光軸（ＯＡ₂ ）に沿って、前述のＤＭＤ、ダイクロイックミラー１１、集光レンズ８、照明光源１５がこの順で配置されている。
照明光源として、レーザ光源（波長５３２ｎｍ、４８８ｎｍ等を含む）とか水銀灯、またはメタルハライド等を使用できる。分光特性はレーザ照明の場合は単色であり、他の場合はフィルタを用いて制限する。各フィルタ１８，１９，２０はそのために用いられる。
ダイクロイックミラー１１で反射された像光（図２，図４）はフィルタ１８、共焦点用の第２結像レンズ１２を介して２次元光検出器１３上に結像される。
ダイクロイックミラー１１は光源からの照明光を透過し、試料３０からの共焦点蛍光像光をフィルタ１８、レンズ１２方向に反射する。

図３に示すように、照明光源１５から、光軸（ＯＡ₂ ）に沿って供給された照明光の内ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）により光路が変更された照明光は補助レンズ１６、光路ミラー３を通過し、一旦集束され、第２レンズ５の周縁で屈折され、カバーガラス６と標本の界面に向けられる。
ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）により光路が変更された像光は、視野絞り１４を介し、第１結像レンズ９、フィルタ２０を介して、光検出器１０にもたらされる。

以下、さらに詳細な構成を動作と共に説明する。ＤＭＤのマイクロミラー素子へ向かって集束するような照明光束を当てる。
ＤＭＤのマイクロミラー素子（画素対応）がすべてオフ状態すなわちＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラー）では照明光束は一定の角度で緩やかに発散する。
この光束を補助レンズ１６とミラー３等によって変える。この光束の軸が、光学系の主軸（ＯＡ₁ ）に対してやや傾くようにミラー３を設置しておく。補助レンズ１６により、照明用の光束は、第２レンズ５の後側焦点に一度集束してから発散するような光束となる。

第２レンズ５の位置は、使用目的に応じて変えることができるが、一例として、その前方焦点がカバーガラス６の表面から離れた点に来るような位置に置かれているものとする。なお後述するようにカバーガラス６と第２レンズ５の間には、浸漬油（オイル）２８を浸積して使用する（図５参照）。
得られた光束は第２レンズ５の周辺とそれに近い領域を通過してから強く屈折し、第２レンズ５の前方焦点よりレンズに近い点で光軸と交差する平行光となり、カバーガラス６の表面で全反射する光となる。この全反射に際してカバーガラス６の表面にエバネッセント光が生じ、これによってカバーガラス表面とそのごく近傍（〜１００ｎｍ）にある標本中の蛍光分子の励起ができる。

このような標本中の蛍光分子より生じた蛍光は、第２レンズ５によって集められ、ＤＭＤの上に集光されるが、その集束点は正確にはＤＭＤ上には無く、ＤＭＤのオフ状態のミラー群（ＤＭＤ１）によって反射されたあとに一点に集束し、続いて発散する。
これを第１結像レンズ９で集め、２次元光検出器１０へ送ると、エバネッセント光によって励起された蛍光の像、すなわち、エバネッセンス像が得られる。

前述のような光学系において、今度は、ＤＭＤの任意のマイクロミラーをオン状態にする。すなわち、ＤＭＤ２（マイクロミラーがオンの状態）にすると、このマイクロミラーを仮想的な点光源とする光束が生じ、これは、第１レンズ４の中心領域を通過する光束として平行光に変換される。
この平行光は、第２レンズ５の中心領域を通って、第２レンズ５の前方焦点に集光する。前方焦点はカバーガラス６表面（図４中上表面）から上に離れたところに置かれており、その領域に蛍光分子があればこれを励起する。
この領域で生じた蛍光は第２レンズ５によって集光されて平行光に変換され、第１レンズ４を通って、仮想光源であった前述のオン状態のマイクロミラー（蛍光の発生点と共役位置）に集光される。集光された蛍光は、オン状態のマイクロミラーによって反射され、発散光となる。そしてダイクロイックミラー１１によって反射させると、励起光の光路から分離された蛍光となり、第２結像レンズ１２によって２次元検出器１３に導かれ点像を形成する。

ＤＭＤのマイクロミラーのオンの状態（ＤＭＤ２）は、従来の共焦点光学系の回転ディスクのピンホールの作用をし、その位置と数を高速に制御することにより、標本内に蛍光励起能力のある光の輝点を走査でき、実用上の短時間における走査の後に、２次元検出器１３上に蛍光像を形成する。

大部分のＤＭＤのマイクロミラーをオフ状態（ＤＭＤ１）にしてエバネッセンス像を得る光学系とするが、特定の少数のマイクロミラーのみをオン状態（ＤＭＤ２）になるように選ぶと、カバーガラス６上のエバネッセント光励起によって生ずる蛍光は大部分が、オフ状態のミラー（ＤＭＤ１）で反射される方向へ向かう。

わずかな部分は、オン状態のミラー（ＤＭＤ２）によって反射されるものとは別の方向へ向かうが、その割合は小さい（全光量の５％以下となる）ので、共焦点蛍光像へのエバネッセント光励起による蛍光の混入は小さく、かつそれぞれの像面の位置（レンズからの距離）も異なるので、像の形成に影響を与えることはなく、わずかな背景光のレベルの増大にとどまる。

一方、第２レンズ５の前方焦点面上の一点から発する蛍光は、その共役点であり励起光が発散してくる仮想的な点光源であるオン状態のマイクロミラーＤＭＤ２に集束されるので、共焦点効果が生ずる。ＤＭＤ２によって効率よく反射され、共焦点像の形成に寄与する。
第２レンズ５の前方焦点面より上下にずれた面からの蛍光は、オンミラー上に完全には集光されず、オンミラーでの反射効率が下がるため、共焦点像への焦点面外からの蛍光の混入が妨げられる。

共焦点蛍光光学系における照明光が、第２レンズ５の中心領域を含む広い部分を通過して標本内に集束すると、これは、エバネッセント光によって照明されているカバーガラス面上の視野中心領域をも通過することになる。
これは、エバネッセント光の照明と重なり、エバネッセント光の持つ光強度分布と異なる特徴の光強度分布をもたらす。そこで、第２レンズ５の片側においてその中心に光を遮蔽するマスク７を置き、カバーガラス６の視野中心領域には共焦点光学系の照明光が通過しないようにする。これによって、カバーガラス６上にはエバネッセント光が、カバーガラス表面から離れたところに共焦点光学系の集束光が独立に存在することになる。
以上の光学系により、カバーガラス６上のエバネッセント光により励起された蛍光像と、共焦点光学系による蛍光像が、ＤＭＤにおけるオンミラーの順次選択終了後（走査時間）に同時的に観察でき、エバネッセンス顕微鏡像と共焦点蛍光像が同時に観察できる蛍光顕微鏡が成立する。

（エバネッセンス顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時観察）
図５は、本発明による顕微鏡システムのエバネッセンス顕微鏡および共焦点顕微鏡動作時の試料部分の拡大図である。図左側は照明光の経路、右側は蛍光発光点からの光の経路を示している。対物レンズ５とカバーガラス６の間には浸漬油２８があり、いわゆる油浸光学系となっている。対物レンズは油浸超高開口数（ＮＡ＝１．４５ またはＮＡ＝１．６５）のものを使用している。したがって、対物レンズからカバーガラスまでの屈折率は一定で、光はこの間を直進するのと同等である。カバーガラスの表面を斜めに横切る光（左図の共焦点励起光と右図の１からの蛍光）は屈折する。図において３０は細胞等の蛍光標本（観察対象）であり７は光を遮るマスクである。
右図において、共焦点励起の蛍光（蛍光発光点１）はレンズ５を通って光軸に平行な光線となる。エバネッセンス光励起により発生した蛍光（右図の２）は、レンズ５を通って少し広がる光となる。

（斜入照明顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時観察）
図６は、本発明による顕微鏡システムの斜入顕微鏡および共焦点顕微鏡動作時の試料部分の拡大図である。図左側は照明光の経路、右側は蛍光発光点からの光の経路を示している。先に説明したエバネッセンス顕微鏡および共焦点顕微鏡動作用の蛍光顕微鏡を僅かに変更することにより、斜入照明顕微鏡像と共焦点蛍光像の同時に観察することができる。
図２または図３に示すミラー３の位置を変えることにより、斜入照明用の光束を対物レンズ１５の後方焦点面に集束し、そこから光軸にわずかに傾いた角度（図６左側の図）でレンズ５の左側の縁に入射して、カバーガラスの６の表面で屈折し、光軸に斜めになる方向に投影される。光軸中心では、この光束はカバーガラス６の表面から少し離れた所を通過し、カバーガラス６には必ずしも接着しない蛍光物質（右の図の２の示す位置を占める）を励起する。共焦点光学系の照明光はレンズの中側（マスク７を除く）を通過して、蛍光物質（右の図の１の示す位置を占める）を励起する。

次に図６の右側の励起された蛍光発光点１，２からの像光の経路を説明する。蛍光発光点１（共焦点像）からの蛍光はレンズ５を通過して光軸に平行な光線となる。斜入によって励起された蛍光発光点２からの光はレンズ５を通過して少し広がる光となる。なお、この斜入照明蛍光光学系の基本的な考え方については、本件発明者のひとりが特願２００３−１８７１４２号ですでに示している。

本発明による蛍光顕微鏡システムは、２種類の像を同時に観察できるので、生命科学の研究分野等で広く利用できる。

本発明による蛍光顕微鏡システムのブロック図である。 本発明による蛍光顕微鏡システムの実施例の略図である。 前記顕微鏡の実施例のエバネッセンス顕微鏡動作に関連する光束を取り出して示した略図である。 前記顕微鏡の実施例の共焦点顕微鏡動作に関連する光束を取り出して示した略図である。 本発明による顕微鏡のエバネッセンス照明動作と共焦点照明動作を同時に行うときの試料部の拡大図である。 本発明による顕微鏡の斜入照明動作と共焦点照明動作を同時に行うときの試料部の拡大図である。

符号の説明

１，２ 標本（試料）内の蛍光物質の発光点
ＤＭＤ１（オフの状態のマイクロミラーの機能的な表現）
ＤＭＤ２（オンの状態のマイクロミラーの機能的な表現）
３ ミラー
４ 第１レンズ（結像用）
５ 第２レンズ（対物レンズ）
６ カバーガラス
７ 視野中心の光を遮るマスク
８ 集光レンズ
９ 第１結像レンズ
１０ ２次元光検出器（エバネッセンス）
１１ ダイクロイックミラー
１２ 第２結像レンズ
１３ ２次元光検出器（共焦点）
１４ 視野絞り
１５ 光源
１６ 補助レンズ
１８，１９，２０ フィルタ
２８ 浸漬油（オイル）
３０ 標本（試料）

Claims (7)

1. 蛍光物質を含む標本と、
   前記標本を支持するガラスプレートと、
   前記標本の照明光を発生する照明光源と、
   前記照明光による像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
   前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に第１および第２の照明をする照明光学系と、
   前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、前記第１および第２の照明のために照明光を分離するとともに前記分離された照明光により形成された第１および第２の像光を分離する光束制御装置と、
   前記第１および第２の像光を結像して第１および第２の像を得る結像光学系と、
   を含む蛍光顕微鏡システム。
2. 蛍光物質を含む標本と、
   前記標本を支持するガラスプレートと、
   前記標本のエバネッセンス照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
   前記エバネッセンス照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
   前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光とエバネッセンス照明光を分離しさらに共焦点像光とエバネッセンス像光を分離する光束制御装置と、
   前記光束制御装置で分離された前記エバネッセンス照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて全反射エバネッセンス照明光が発生するよう投射するエバネッセンス照明光学系と、
   前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
   分離された前記エバネッセンス像光を結像するエバネッセンス像結像レンズと、
   分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
   前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
   から構成した蛍光顕微鏡システム。
3. 請求項２記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
   前記照明光源の光軸は前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交叉するものである蛍光顕微鏡システム。
4. 請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
   前記エバネッセンス照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる軸上に配置されている蛍光顕微鏡システム。
5. 請求項３記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、
   前記共焦点照明像用の結像レンズは、前記対物レンズの光軸と前記光束制御装置の位置で交わる照明光軸とダイクロイックミラーの位置で交わる他の軸上に配置されている蛍光顕微鏡システム。
6. 蛍光物質を含む標本と、
   前記標本を支持するガラスプレートと、
   前記標本の斜入照明と共焦点照明の各像を取得するために前記標本に向けられている対物レンズを含む顕微鏡光学系と、
   前記斜入照明と前記共焦点照明のための照明光を発生する照明光源と、
   前記照明光と前記顕微鏡光学系の各光軸の交差領域に配置され、光束を分割可能で分割領域の位置、大きさの割合の変化を外部から指定でき、前記変化を高速でかつ連続的に変更でき、共焦点照明光と斜入照明光を分離しさらに共焦点像光と斜入像光を分離する光束制御装置と、
   前記光束制御装置で分離された前記斜入照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズの周縁から前記標本と前記ガラスプレートに向けて斜入照明光が発生するよう投射する斜入照明光学系と、
   前記光束制御装置で分離された前記共焦点照明光を前記顕微鏡光学系の対物レンズを介して前記標本に向けて投射する共焦点照明光学系と、
   分離された前記斜入像光を結像する斜入像結像レンズと、
   分離された前記共焦点像光を結像する共焦点像結像レンズと、
   前記各結像レンズで形成される像の位置に配置されているイメージセンサと、
   から構成した蛍光顕微鏡システム。
7. 請求項１〜６記載の蛍光顕微鏡システムにおいて、前記光束制御装置をＤＭＤとした蛍光顕微鏡システム。

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