DE112012001802T5

DE112012001802T5 - Nichtlineares optisches Mikroskop und Nichtlineare optische Mikroskopie

Info

Publication number: DE112012001802T5
Application number: DE112012001802.8T
Authority: DE
Inventors: Keisuke Isobe; Katsumi Midorikawa
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2014-03-13
Also published as: JPWO2012127907A1; WO2012127907A1; JP5930220B2

Abstract

Bei einem nichtlinearen optischen Mikroskop zum Messen des aus dem nicht linearen optischen Vorgang erzeugten Signallichtes, welcher mit mehreren Anregungslichtern durchgeführt wird, wird die Position des Schwerpunktes des Lichtkonzentrationspunktes von mehreren Anregungslichtern mit einer bestimmten Frequenz moduliert und die von der Modulationsfrequenz abhängige Frequenzkomponente aus dem Signallicht extrahiert. Vorzugsweise ist die zu extrahierende Frequenzkomponente die mit einer geraden Zahl multiplizierte Modulationsfrequenz. Als Maßnahmen zur Positionsmodulation ist bevorzugt, wenn der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bzw. spiralförmig oder in Richtung der optischen Achse geradlinig bewegt wird.

Description

Gebiet der Technik
Die Erfindung betrifft eine Methode zum Erhöhen der räumlichen Auflösung eines nichtlinearen optischen Mikroskops.
Stand der Technik
Ein n-Photon-Anregungsfluoreszenzmikroskop mittels einer Anregungswellenlänge λ_n ≈ n·λ_ex, die ca. n-fach länger ist als die Anregungswellenlänge λ_ex eines Ein-Photon-Anregungsfluoreszenzmikroskops, regt das fluoreszierende Molekül an. Die Intensität des Signallichtes von der n-Photon-Anregung ist proportional zur n-ten Potenz von der Intensität des Anregungslichtes. Somit wird ein Signal nur in der Nähe von dem Lichtkonzentrationspunkt erzeugt, in dem die Intensität des Anregungslichtes hoch ist, wenn das Anregungslicht durch eine Objektivlinse (Anzahl der Öffnungen: NA) konzentriert wird. Folglich wird die räumliche Auflösung im Vergleich mit der räumlichen Auflösung 0,61λ_n/NA, die durch die Ein-Photon-Anregung mit der gleichen Wellenlänge erzielt wird, auf n^1/2-fach [(0,61·λ_n)/(n^1/2·NA)] erhöht.
Eine nichtlineare optische Mikroskopie ist auch verwendet, bei der das aus dem nichtlinearen optischen Vorgang (die nichtausgeartete Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz, die Summenfrequenzerzeugung, die Vier-Wellen-Mischung, die nichtausgeartete Zwei-Photonen-Absorption, die stimulierte Raman-Streuung usw.), der von einer Wellenlängenkomponente mit zwei oder mehr Wellenlängen verursacht wird, erzeugende Signallicht detektiert wird. Bei solchen Methoden ist es möglich, die räumliche Auflösung zu erhöhen, da das von dem nichtlinearen optischen Vorgang verursachte Signal lediglich in der Nähe von dem Lichtkonzentrationspunkt, in der die Intensität des Anregungslichtes hoch ist, erzeugt wird.
Relevante Dokumente des Standes der Technik
Patentliteratur

Patentliteratur 1: WO2005/113772A

Nichtpatentliteraturen

Nichtpatentliteratur 1: Stefan W. Hell and Jan Wichmann, ”Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy Opt. Lett. 19, 780–782 (1994)
Nichtpatentliteratur 2: Christian W. Freudiger, et al., ”Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy”, Science 322, 1857 (2008)

Offenbarung der Erfindung
Technische Aufgabe
Bei einem n-Photon-Anregungsfluoreszenzmikroskop ist die räumliche Auflösung im Vergleich mit einer Ein-Photon-Anregung bei einer gleichen Wellenlänge verbessert. Die Anregungswellenlänge der n-Photon-Anregung ist jedoch n-fach von der Wellenlänge der Ein-Photon-Anregung (λ_n ≈ n·λ_ex), falls mittels der unterschiedlichen Wellenlängen die Anregung auf den gleichen Energiezustand durchgeführt wird und die daraus erzeugte Fluoreszenz detektiert wird. Somit wird praktisch die räumliche Auflösung auf 1/n^1/2-fach [(0,61·n^1/2·λ_ex)/NA)].
Die Intensität des Signallichtes im nichtlinearen optischen Vorgang, welches durch die Wellenlängenkomponente mit zwei oder mehr Wellenlängen angeregt wird, ist proportional zum Flächeninhalt der räumlichen Überlagerung des Anregungslichtes mit zwei Wellenlängen. Somit ist es Problem, dass die Strahlenspots von zwei Anregungslichtern fluktuieren, da dadurch der Flächeninhalt der räumlichen Überlagerung geändert wird und daher die Intensität des Signallichtes fluktuiert. Bei solchen nichtlinearen optischen Mikroskopen ist die Erhöhung der räumlichen Auflösung nicht möglich, insofern der Strahlenspot des Anregungslichtes mit zwei Wellenlängen nicht stabilisiert ist. Bisher wurden verschiedene Maßnahmen zur Stabilisierung des Strahlenspots ergreift. Es ist jedoch schwierig, den Strahlenspot zu stabilisieren.
Der Erfindung liegt daher die Aufgaben zugrunde, ein Multi-Photon-Anregungsmikroskop zu schaffen, das einfach konstruiert ist und jedoch eine hohe Auflösung aufweist.
Technische Lösung
Bei der vorliegenden Erfindung wird die von der Modulationsfrequenz abhängige Frequenzkomponente aus dem Signallicht extrahiert, indem bei dem nichtlinearen optischen Mikroskop zum Messen des Signallichtes im nichtlinearen optischen Vorgang, welches mit der Wellenlängenkomponente von mehr als zwei Wellenlängen angeregt wird, die Position des Schwerpunktes des Lichtkonzentrationspunktes von mehreren Anregungslichtern mit einer bestimmten Frequenz moduliert wird.
Konkreterweise weist das erfindungsgemäße nichtlineare optische Mikroskop ein erstes optisches System, das ein erstes Anregungslicht auf eine Probe konzentriert, ein zweites optisches System, das ein zweites Anregungslicht auf die Probe konzentriert, ein Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition, welches mit einer bestimmten Modulationsfrequenz die Lichtkonzentrationspositionen des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes relativ zueinander moduliert, und ein Signalextrahierungsmittel, das eine von der Modulationsfrequenz abhängige Frequenzkomponente aus dem von der Probe erzeugten Signallicht extrahiert, auf.
Da die Intensität des Signallichtes proportional zum Produkt von Anregungsintensitäten ist, tritt die Fluktuation der Signalintensität mit der Modulation der Lichtkonzentrationsposition auf. Dabei ist das aus der Mitte des Lichtkonzentrationspunktes erzeugte Signal hinsichtlich einer mit einer geraden Zahl multiplizierten Komponente der Modulationsfrequenz im Signallicht herrschend. Somit ist die Erhöhung der räumlichen Auflösung dadurch möglich, dass die mit einer geraden Zahl multiplizierte Komponente der Modulationsfrequenz aus dem Signallicht extrahiert wird. Je mehr die Oberwellenkomponente extrahiert wird, desto besser wird die räumliche Auflösung. Es ist jedoch bevorzugt, die Frequenzkomponente, die 2-fach von der Modulationsfrequenz ist, zu extrahieren, da bei einer Oberwellenkomponente die Signalintensität schwächer ist.
Als Maßnahmen zur Modulation der Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes ist denkbar, dass die Schwerpunkte von mehreren Anregungslichtern in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bzw. spiralförmig oder in eine senkrecht zur optischen Achse gerichtete Richtung geradlinig bewegt werden, und diese kombiniert werden.
Beispielsweise ist es denkbar, dass das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition die Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes fixiert und die Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bzw. spiralförmig oder in Richtung der optischen Achse geradlinig bewegt.
Es ist auch möglich, dass das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition die Lichtkonzentrationspositionen des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes bewegt und hierdurch der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bzw. spiralförmig oder in Richtung der optischen Achse geradlinig bewegt wird.
Zum Bewegen der Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene ist eine Strahlenspot-Modulationseinheit, wie elektro-optische (EO) Elemente, akustooptische (AO) Elemente, Galvanoscanner usw. verwendbar. Zum Bewegen der Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes in eine senkrecht zur optischen Achse gerichtete Richtung ist eine die Divergenzwinkel des Strahls zu steuernde Wellenfront-Modulationseinheit, wie elektro-optische Elemente, variable Spiegel usw. verwendbar.
Es ist bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt, als Anregungslicht einen Pulslaserstrahl zu verwenden. Es ist auch bevorzugt, dass ein zeitverzögerndes optisches System zur zeitlichen Überlagerung der Lichtkonzentrationsposition von mehreren Anregungslichtern vorgesehen ist.
Die Anzahl des Anregungslichtes kommt nicht in Frage, sofern sie zwei oder mehr als zwei ist, und ändert sich in Abhängigkeit vom zu betrachtenden nichtlinearen optischen Vorgang. Auch wenn drei oder mehr Anregungslichter verwendet werden, wird die räumliche Auflösung durch die Modulation des Schwerpunktes der Lichtkonzentrationsposition der Anregungslichter erhöht. Werden mehrere Anregungslichter verwendet, ist es denkbar, dass die Position lediglich eines Anregungslichtes moduliert und die Lichtkonzentrationsposition der anderen Anregungslichter fixiert wird. Es ist auch möglich, dass die Position von zwei oder mehr (bzw. allen) Anregungslichtern moduliert wird.
Die vorliegende Erfindung kann als ein nichtlineares optisches Mikroskop, das zumindest ein von den o. g. Mitteln aufweist, verstanden werden. Die vorliegende Erfindung kann auch als eine nichtlineare optische Mikroskopie, die zumindest eine von den. o. g. Verarbeitungen umfasst, verstanden werden. Durch die Kombination der o. g. Mittel und Verarbeitungen kann die vorliegende Erfindung konstruiert werden.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Durch das erfindungsgemäße nichtlineare optische Mikroskop kann die räumliche Auflösung erhöht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen
[1] (a) eine schematische Darstellung der Systemkonstruktion des nichtlinearen optischen Mikroskops gemäß der vorliegenden Ausführungsform, (b) eine Darstellung zur Erklärung der Spot-Modulationseinheit, (c) eine Darstellung zum Erklärung der Wellenfront-Modulationseinheit.
[2] eine Darstellung, die konkrete Konstruktion des nichtlinearen optischen Mikroskops zeigt.
[3] (a) eine Darstellung zur Erklärung der Positionsmodulation eines Anregungslichtpulses, (b) eine Darstellung, die Intensität des aus der Mitte der Probe und der Außenseite davon erzeugten Signallichtes zeigt.
[4] (a) bis (c) Darstellungen, die jeweils die Intensität des einfallenden Anregungslichtes, die Intensität des Anregungslichtes nach der TPA (Zwei-Photonen-Absorption), die Intensität des Anregungslichtes nach der SRS (stimulierte Raman-Streuung) gemäß der herkömmlichen Methode zeigen, (d) bis (f) Darstellungen, die jeweils die Intensität des einfallenden Anregungslichtes, die Intensität des Anregungslichtes nach der TPA die Intensität des Anregungslichtes nach der SRS gemäß der vorliegenden Methode zeigen.
[5] ein Ergebnis der numerischen Berechnung, welches die Frequenzcharakteristik des SFG-Signals bei der mit 10 kHz durgeführten Modulation der Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes gemäß der vorliegenden Methode zeigt. Die dicke Linie zeigt die Frequenzcharakteristik des SFG-Signals an der Mittelstellung und die dünne Linie zeigt die Frequenzcharakteristik an der Außenstellung.
[6] ein Ergebnis der numerischen Berechnung, das die Verteilung des punktförmigen Objektes zeigt, wobei die Oberseite die Verteilung des punktförmigen Objektes auf der senkrecht zur optischen Achse liegenden Fläche zeigt und die Unterseite die Verteilung des punktförmigen Objektes auf der die optische Achse umfassenden Fläche zeigt.
[7] (a) eine Darstellung, die das Intensitätsprofil des Signallichtes in Richtung der optischen Achse zeigt, (b) eine Darstellung, die die Intensitäten der aus den verschiedenen Tiefen erzeugten Signallichter bei der Verwendung von einer Streuprobe.
[8] eine Darstellung, die die Rückmeldung des Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops in Richtung der optischen Achse gemäß der vorliegenden Methode, wobei (a) eine lineare Anzeige der Intensität ist, und wobei (b) eine logarithmische Anzeige der Intensität ist.
[9] die Zwei-Photonen-Fluoreszenzbilder der fluoreszierenden Kügelchen, wobei (a) gemäß der herkömmlichen Methode, (b) gemäß der vorliegenden Methode (X-Modulation), (c) gemäß der vorliegenden Methode (XY-Modulation).
[10] eine Darstellung, die das Intensitätsprofil des Signallichtes des Vier-Wellen-Mischung-Mikroskops in Richtung der optischen Achse zeigt.
[11] eine Darstellung zum Erklärung eines Beispiels von einem nichtlinearen optischen Vorgang, auf den die vorliegende Methode anwendbar ist.
[12] eine Darstellung zum Erklärung eines Beispiels von einem nichtlinearen optischen Vorgang, auf den die vorliegende Methode anwendbar ist.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
<Prinzip>
Das erfindungsgemäße nichtlineare optische Mikroskop detektiert ein Lichtsignal im nichtlinearen optischen Vorgang, welches durch ein 2 oder mehr als 2 Wellenlängen aufweisendes Anregungslicht verursacht wird. Verschiedene Arten vom nichtlinearen optischen Vorgang sind vorhanden, das Prinzip der vorliegenden Erfindung wird im vorliegenden Fall bei einem Summenfrequenzerzeugungsmikroskop (SFG-Mikroskop, Sum Frequency Generation: SFG) als ein Beispiel erklärt.
Bei einem SFG-Mikroskop werden zwei Pulse, die jeweils die Frequenz ω1 und ω2 aufweisen, als Anregungslicht verwendet. Die zeitdurchschnittliche Lichtintensitätsverteilung I_SFG(r) beim SFG-Mikroskop wird unter Verwendung von den Lichtintensitätsverteilungen Iω₁(r, t) und I_w2(r, t) von zwei Anregungslichtpulsen am Lichtkonzentrationspunkt wie folgt gezeigt: I _SFG(r)∝∫I_ω1(r, t)I_ω2(r, t)dt [Formel 1]
Je die räumliche Überlappungsgrundfläche von zwei Anregungslichtpulsen größer ist, desto höher wird die Summenfrequenzlichtintensität und schmaler wird die Erzeugungsverteilung. Falls die Lichtkonzentrationspositionen von zwei Pulsen zeitlich fluktuieren, breitet sich die zeitdurchschnittliche Lichtintensitätsverteilung des Summenfrequenzlichtes räumlich aus, und somit wird die Fluktuation der Signallichtsintensität hervorgerufen. Bei einem konventionellen SFG-Mikroskop wird dieses Mikroskop benutzt, und zwar in solchem Zustand, in dem die Lichtkonzentrationspositionen von zwei Anregungspulsen fixiert sind, damit die räumliche Überlappungsgrundfläche größer wird. Ferner ist das konventionelle SFG-Mikroskop vorgesehen, dass eine zeitliche Fluktuation nicht hervorgerufen wird. Bei der vorliegenden Erfindung werden die Lichtkonzentrationspositionen von zwei Pulsen dagegen zeitlich moduliert und die Signalkomponente, die durch die Modulation fluktuiert wird, wird detektiert. Auf diese Weise wird die fluktuierende Komponente des Summenfrequenzlichtes bei der vorliegenden Erfindung als Messobjekt gemessen, dazu die Lichtkonzentrationsposition des Pulses aktiv bewegt wird.
Wie z. B. in 3(a) gezeigt ist, ist nun vorgestellt, dass die Lichtkonzentrationsposition (gestrichelte Linie) des Anregungslichtpulses 2 in r = 0 festgestellt ist, wobei die Position (durchgehende Linie) des Anregungslichtpulses 1 zwischen r = +δ und r = –δ mit der Frequenz f periodisch bewegt wird. Die SFG-Intensität ist hierbei wie folgt gezeigt: I_SFG(r)∝∫I_ω1(r + δ cos2πft)I_ω2(r, t)dt [Formel 2]
Die Summenfrequenzlichtintensitäten I_SFG(0, t), I_SFG(–δ, t) und I_SFG(+δ, t) an den jeweiligen Positionen r = 0, –δ und +6 bei der Bewegung des Anregungslichtpulses 1 um einen Zyklus (+δ → 0 → –δ → 0 → +δ) sind in 3(b) gezeigt. An der Position r = 0 weist das Signal eine zwei-zyklische Änderung auf, und die Signale an den Positionen r = +δ und r = –δ weisen eine ein-zyklische Änderung auf. Das heißt, dass beim Signal an der Position r = 0 die Frequenz 2f herrschend ist und bei den Signalen an den Positionen r = +δ, –δ die Frequenz f herrschend ist, falls die Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtpulses 1 mit der Frequenz f moduliert wird. Auf diese Weise ist die Frequenzcharakteristik an der Mitte und an der Außenseite des Lichtkonzentrationspunktes unterschiedlich. Es ist deshalb möglich, ein Signal des räumlich schmaleren Bereichs als die Größe des Lichtkonzentrationspunktes zu extrahieren, indem das Signal, das die Frequenz 2f aufweist, extrahiert wird. Da die Änderung des durch die Modulation der Lichtkonzentrationsposition erzeugten Signals keine vollständige Sinuswelle darstellt, entstehen auch die Frequenzkomponenten 4f, 6f, 8f, ..., die die Oberwellen sind, an der Position r = 0. Je mehr die Oberwellenkomponente wird, desto aus räumlich schmalerem Bereich kommt das Signal. Somit ist es möglich, durch Extrahieren der Oberwellenkomponenten die Auflösung zu erhöhen.
Auf die Messung der Zwei-Photonen-Absorption (Two-Photon Absorption: TPA) und der stimulierten Raman-Streuung (Stimulated Raman Scattering: SRS) ist die vorliegende Erfindung anwendbar. Bei der Messung der solchen nichtlinearen optischen Vorgänge wird der Betrag einer Änderung der Intensität des Anregungslichtes gemessen. Bei der konventionellen Methode wird eine Modulation der Intensität, mit welcher die Intensität zeitlich mit der Frequenz f geändert wird, einem (ω1) der Anregungslichter, die jeweils die Frequenz ω1 und ω2 aufweisen, gegeben. Die einfallende Intensität des anderen Anregungslichtes (ω2) ist konstant. Die Intensitätsänderung von ω1 wirkt jedoch über die TPA und SRS Vorgänge auf die Intensität des Anregungslichtes ω2 ein. Somit wird das Anregungslicht von ω2 mit der Frequenz f geändert. Auf diese Weise wird die Komponente der Frequenz f der Intensität des dessen Intensität nicht modulierten Anregungslichtes gemessen. 4(a) zeigt die Intensität des einfallenden Anregungslichtes, 4(b) zeigt die Intensität des Anregungslichtes nach der TPA, und 4(c) zeigt die Intensität des Anregungslichtes nach der SRS.
Wenn die vorliegende Erfindung auf die TPA und SRS angewendet wird, ist die Modulation der Intensität dagegen nicht erforderlich, sondern die Position eines der Anregungslichter wird mit der Frequenz f moduliert. Folglich entsteht die Komponente bei den beiden Intensitäten der Anregungslichter von ω1 und ω2, welche mit der Frequenz 2f geändert wird. Diese Komponente wird dann gemessen. Die 4(d) bis 4(f) zeigen jeweils die Intensität des einfallenden Anregungslichtes, die Intensität des Anregungslichtes nach der TPA und die Intensität des Anregungslichtes nach der SRS bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung. Da gemäß der vorliegenden Erfindung die Änderungen der Intensitäten der Anregungslichter von den Frequenzen ω1 und ω2 gleichzeitig gemessen werden können, ist es auch möglich, durch die Mittelwertbildung der beiden Signale usw. das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Bei der SRS wird die Intensität des Anregungslichtes von Frequenz ω2 erhöht, welches ein Stokeslicht ist, falls die Intensität des Anregungslichtes von Frequenz ω1 vermindert wird, welches ein Pumpstrahl ist, und somit, falls die Abweichung zwischen diesen beiden Anregungslichtern erfasst wird, wird die Intensität zweifach und das aus der äußeren Umwelt entstehende Geräusch wird kompensiert. Dadurch wird die Empfindlichkeit im Vergleich mit der konventionellen Methode erhöht. Selbstverständlich ist es auch möglich, auch die Lichtkonzentrationsposition dadurch zu modulieren, dass das Anregungslicht, wie bei konventioneller Methode, zeitlich moduliert wird.
Die prinzipielle Erklärung der vorliegenden Erfindung wurde mit den Beispielen von der Summenfrequenzerzeugung (SFG), der Zwei-Photonen-Absorption (TPA), der induzierten Raman-Streuung (SRS) usw. durchgeführt. Es sollte für den durchschnittlichen Fachmann verständlich sein, dass die obige Erklärung auch auf die anderen Mikroskope, in denen nichtlineare optische Vorgänge verwendet werden, in denen das Anregungslicht von zwei (oder mehr) Wellenlängen benutzt wird.
Die obige Positionsmodulation ist lediglich zum Zweck der Erklärung. Konkreterweise sind verschiedene Verfahren zur Positionsmodulation verwendbar.
Beispielsweise ist ein Verfahren (X-Modulation) vorhanden, in welchem die Modulation derart durchgeführt wird, dass sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses 1 und des Anregungslichtpulses 2 in einer zur optischen Achse senkrecht verlaufenden Ebene auf einer geraden Linie bewegt. In diesem Fall ist die Intensität jedes Anregungslichtpulses wie folgt gezeigt: I_ω1(x, y, z) → I_ω1(x + δ₁ cos2πft, y + δ₂ cos2πft, z) I_ω2(x, y, z) → I_ω2(x + δ₃ cos2πft, y + δ₄ cos2πft, z) [Formel 3]
Allerdings δ₁ ≠ δ₃ oder δ₂ ≠ δ₄. Wenn diese Bedingung erfüllt wird, kann δ_n = 0 (n = 1, 2, 3, 4) sein. Bei solcher Modulation bewegt sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses auf der in Richtung von [δ₁ – δ₃, δ₂ – δ₄]^T verlaufender gerader Linie. Bei solcher Modulationsart wird die Frequenzkomponente von 2jf detektiert (das j ist eine Ganzzahl). Dadurch wird die räumliche Auflösung bezüglich der Richtung der geraden Linie, auf der sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes bewegt, erhöht. Auch wird die räumliche Auflösung bezüglich der Richtung der optischen Achse erhöht.
Ein solches Verfahren (XY-Modulation) ist vorhanden, in welchem die Modulation derart durchgeführt wird, dass sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses 1 und des Anregungslichtpulses 2 in einer zur optischen Achse senkrecht verlaufenden Ebene auf einer Spirale bewegt. In diesem Fall wird die Lichtintensität jedes Anregungslichtpulses wie folgt gezeigt: I_ω1(x, y, z) → I_ω1(x + δ₁ cos2πft cos2πf₀t, y + δ₂ cos2πft sin2πf₀t, z) I_ω2(x, y, z) → I_ω2(x + δ₃ cos2πft cos2πf₀t, y + δ₄ cos2πft sin2πf₀t, z) [Formel 4]
Allerdings δ₁ ≠ δ₃ oder δ₂ ≠ δ₄, 2f < f₀. Wenn diese Bedingung erfüllt wird, kann δ_n = 0 (n = 1, 2, 3, 4) sein. Bei solcher Modulation bewegt sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses spiral. Bei solcher Modulationsart wird die Frequenzkomponente von 2jf detektiert (das j ist eine Ganzzahl). Dadurch wird die räumliche Auflösung in einer zur optischen Achse senkrecht verlaufenden Ebene und bezüglich der Richtung der optischen Achse, d. h. bezüglich der allen Richtungen erhöht.
Ein solches Verfahren (Z-Modulation) ist vorhanden, in welchem die Modulation derart durchgeführt wird, dass sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses 1 und des Anregungslichtpulses 2 in Richtung der optischen Achse auf einer geraden Linie bewegt. In diesem Fall wird die Lichtintensität jedes Anregungslichtpulses wie folgt gezeigt: I_ω1(x, y, z) → I_ω1(x, y, z + δ₁ cos2πft) I_ω2(x, y, z) → I_ω2(x, y, z + δ₂ cos2πft) [Formel 5]
Allerdings δ₁ ≠ δ₂. Wenn diese Bedingung erfüllt wird, kann δ_n = 0 (n = 1, 2) sein. Bei solcher Modulation bewegt sich der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtpulses auf einer in der Richtung der optischen Achse verlaufenden geraden Linie. Bei solcher Modulationsart wird die Frequenzkomponente von 2jf detektiert (das j ist eine Ganzzahl). Dadurch wird die räumliche Auflösung in Richtung der optischen Achse erhöht.
Modulationsverfahren, in denen die X-Modulation und die Z-Modulation kombiniert sind, oder die XY-Modulation und Z-Modulation kombiniert sind, sind auch denkbar.
Bei der obigen Erklärung wurden lediglich zwei Anregungslichtpulse als Beispiel gegeben. Auch bei drei oder mehr Anregungslichtpulse kann der Schwerpunkt des Lichtkonzentrationspunktes auf gleiche Art bewegt werden.
<Beispiel eines nichtlinearen optischen Vorgangs, auf den die vorliegende Methode anwendbar ist>
Im Folgenden wird ein Beispiel eines nichtlinearen optischen Vorgangs, auf den die vorliegende Methode anwendbar ist, erklärt.
(1) Nichtausgeartete Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (nondegenerate two-photon excitation fluorescence: TPEF)
Wie in 11(a) gezeigt ist, absorbiert ein Molekül gleichzeitig zwei Photonen von Frequenzen (ω1 und ω2 und wird dadurch von einem Grundzustand in einen angeregten Zustand übergeführt. Danach wird das Molekül durch Ausstrahlung der Fluoreszenz von dem angeregten Zustand in den Grundzustand übergeführt. Die hierbei ausstrahlende Fluoreszenz ist die nichtausgeartete Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz. Da die Intensität der nichtausgearteten Zwei-Photonen Anregungsfluoreszenz proportional zur Quadrierung der Intensität des Anregungslichtes ist, kann die in Richtung der optischen Achse gerichtete Auflösung durch eine feste Lichtkonzentration des Anregungslichtes erreicht werden. Somit ist eine 3D-Bildgebung ohne konfokale Aperturblende möglich. Die Verfärbung und der Lichtschaden werden auf die Nähe des Lichtkonzentrationspunktes begrenzt. Bei einem Ein-Photon-Anregungsfluoreszenzmikroskop wird das UV-Licht oder das sichtbare Licht als Anregungslicht verwendet. Dagegen wird bei einem Zwei-Photonen Anregungsfluoreszenzmikroskop das Nahinfrarotlicht verwendet. Da bei dem Nahinfrarotlicht die Streuung und die Ein-Photon-Absorption in einer biologischen Probe wenig sind, kann das Anregungslicht bis Tiefe in die Probe erreichen und daher ist eine Tiefe-Bildgebung möglich. Ferner ist die Trennung von Anregungslicht und Fluoreszenz auch einfach, da die Wellenlänge des Anregungslichtes und die Wellenlänge der Fluoreszenz voneinander weitgehend abweichend sind.
(2) Summenfrequenzerzeugung (Sum frequency generation: SFG) und Frequenzverdopplung (Second harmonic generation: SHG)
Wie in 11(b) gezeigt ist, ist die SFG der Zwei-Photonen Anregung ein sekundärer nichtlinearer optischer Vorgang, in dem zwei Photonen, die jeweils die Frequenz ω₁ und ω₂ aufweisen, in ein Photon, das die Frequenz ω₃ = ω₁ + ω₂ aufweist, umgewandelt wird. Diese SFG ist ein Phänomen, das nur bei Molekülen und Medien auftritt, welche keine Inversionssymmetrie aufweisen. Folglich kann bei dem SFG-Mikroskop die Orientierungsstruktur und die Gewebestruktur in einer biologischen Probe visualisiert werden.
(3) Differenzfrequenzerzeugung (Difference frequency generation: DFG)
Wie in 11(c) gezeigt ist, ist die DFG ein sekundärer nichtlinearer optischer Vorgang, in dem zwei Photonen, die jeweils die Frequenz ω₁ und ω₂ aufweisen, in ein Photon, das die Frequenz ω₁ = ω₁ – ω₂ aufweist, umgewandelt wird. Diese DFG ist ein Phänomen, das nur bei Molekülen und Medien auftritt, welche keine Inversionssymmetrie aufweisen. Ein von der chemischen Komponente und dem thermodynamischen Zustand der Probe ausgehender Vibrationskontrast dadurch erzielt werden, dass die Frequenzdifferenz mit der Raman-Frequenz übereinstimmt.
(4) Frequenzverdreifachung (Third harmonic generation: THG)
Wie in 11(d) gezeigt ist, ist die SFG der Drei-Photonen Anregung ein tertiärer nichtlinearer optischer Vorgang, in dem drei Photonen, die jeweils die Frequenz ω₁, ω₂ und ω₃ aufweisen, in ein Photon, das die Frequenz ω₄ = ω₁ + ω₂ + ω₃ aufweist, umgewandelt wird. Diese THG ist ein Phänomen, das bei allen Molekülen und Medien auftritt. Allerdings ist die Erfüllung einer Phase-matching-Bedingung sehr schwierig, da durch große Verschiedenheit der Wellenlänge des Anregungslichtes und des Signallichtes die Verschiedenheit des Brechungsindexes erhöht wird. Daher Die THG wird im Allgemeinen nicht im Medium, in welchem der Brechungsindex gleichmäßig verteilt ist, sondern im Medium, in welchem die Brechungsindexverteilung ungleichmäßig (eine Grenze zwischen Medien, die einen voneinander unterschiedlichen Brechungsindex aufweisen) ist, erzeugt. Der Fall, bei dem drei Photonen als einfallendes Licht jeweils gleiche Frequenz aufweisen, ist als THG genannt.
(5) Vier-Wellen-Mischung (Four-wave mixing: FWM)
Ein tertiärer nichtlinearer optischer Vorgang, in dem durch Wechselwirkung zwischen den drei Einfallsfelder der Frequenzen ω₁, ω₂, ω₃ und dem Medium ein neues Licht von ω₄ = ω₁ – ω₂ + ω₃ erzeugt wird, ist als FWM-Vorgang genannt. In Abhängigkeit von der Reihenfolge der Felder, in denen die Wechselwirkung durchgeführt wird, sind zwei Vorgänge der FWM, die in 11(e) und (f) gezeigt sind, vorhanden. Bei dem nicht-resonanten FWM-Mikroskop ist die Messung der Verteilung des Brechungsindexes möglich.
(6) Kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (Coherent anti-Stokes Raman scattering: CARS)
Wie in 12(a) gezeigt ist, wird der FWM-Vorgang verstärkt, wenn bei dem FWM-Vorgang die Frequenzdifferenz ω₁ – ω₂ zwischen zwei Anregungslichtern der Raman-Frequenz W_R näher kommt. Der durch eine Vibrations-Resonanz verstärkte FWM-Vorgang ist als CARS-Vorgang genannt. Je näher die Frequenzdifferenz ω₁ – ω₂ zwischen der Frequenz ω₁ des Pumpstrahls und der Frequenz ω₂ des Stokeslichtes der Raman-Frequenz W_R kommt, desto stärker wird die CARS-Intensität. Somit kann bei dem CARS-Mikroskop ein von der chemischen Komponente und dem thermodynamischen Zustand der Probe ausgehender Vibrationskontrast erzielt werden.
(7) Stimulierte parametrische Emission (Stimulated parametric emission: SPE)
Wie in 12(b) gezeigt ist, wird der FWM-Vorgang verstärkt, wenn bei dem FWM-Vorgang die Summe der Frequenzen ω₁ + ω₃ von zwei Anregungslichtern der Eelektronresonanz-Frequenz W_e näher kommt. Der FWM-Vorgang, der durch Zwei-Photonen Elektronresonanz verstärkt wird, ist als SPE-Vorgang genannt. Je näher die Summe der Frequenzen ω₁ + ω₃ der Elektronresonanz-Frequenz W_e kommt, desto stärker wird die SPE-Intensität. Somit kann bei dem SPE-Mikroskop ein von der Absorption des Mediums ausgehender Kontrast erzielt werden.
(8) Nichtausgeartete Zwei-Photonen-Absorption (nondegenerate two-photon absorption: TPA)
Die TPA wird von der durch die Intensität eines ultrakurzen Lichtpulses selbst hervorgerufenen Änderung des Absorptionskoeffizienten verursacht. Die TPA wird durch die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen von einem Grundzustand in einen angeregten Zustand übergeführt. Wie in 12(c) gezeigt ist, wird bei einem TPA-Mikroskop die Anregung von zwei Wellenlängen des ersten Photons und des zweiten Photons, die jeweils voneinander unterschiedliche Frequenz aufweisen, durchgeführt, um den durch die Absorption hervorgerufenen geringfügigen Betrag der Änderung der Intensität des Anregungslichtes zu messen. Nur die Lichtintensität einer der beiden Frequenz (ω₂) wird mit der Frequenz f moduliert verwendet und die andere Frequenz (ω₁) wird nicht moduliert verwendet. Wenn die TPA auftritt, wird die Lichtintensität der Frequenz ω₁ hinsichtlich der Intensität des Anregungslichtes dem Betrag der Reduktion der Lichtintensität der Frequenz ω₂ entsprechend reduziert. Herkömmlich wird das Signal mit der Frequenz f, welches in dem Anregungslicht von ω1 erzeugt wird, gemessen, indem die Intensität des Anregungslichtes von ω₂ moduliert wird. Dagegen, wie oben erläutert wurde, ist die Modulation der Intensität nicht erforderlich, falls die vorliegende Methode zur Anwendung kommt. Bei dem TPA-Mikroskop kann der Absorptionskontrast erzielt werden.
(9) Stimulierte Raman-Streuung (Stimulated Raman scattering: SRS)
Der SRS-Vorgang ist ein Vorgang, in dem bei dem Einfallen des die Frequenz ω₁ aufweisenden Pumpenstrahls und des die Frequenz ω₂ aufweisenden Stokeslichtes in ein Raman-aktives Medium durch die Raman-Streuung der Pumpenstrahl in das Stokeslicht umgewandelt wird (12(d)). Herkömmlich wird bei einem SRS-Mikroskop auch wie bei einem TPA-Mikroskop die Intensität eines der beiden Anregungslichter moduliert, um den durch die SRS hervorgerufenen geringfügigen Betrag der Änderung der Intensität des Pumpenstrahls und des Stokeslichtes zu messen. Allerdings ist die Modulation der Intensität nicht erforderlich, falls, wie oben erklärt, die vorliegende Methode zur Anwendung kommt. Bei dem SRS-Mikroskop kann der Vibrationskontrast erzielt werden.
<Verifikation der Methode durch die numerische Berechnung>
In 5 ist eine Fourier-Transformation eines Signals bei der um 100 nm (δ = 100 nm) mit der Frequenz f = 10 kHz durchgeführten Modifikation des Lichtkonzentrationspunktes des Anregungslichtes 1 mittels der numerischen Berechnung gezeigt. Die horizontale Achse der 5 zeigt die Frequenz (kHz) und die vertikale Achse zeigt die Intensität des Signallichtes per beliebige Einheit in Log-Maßstab.
Bei der numerischen Berechnung ist so ausgesetzt, dass die ein gaußsches räumliches Strahlprofil mit Strahlradius von 3 mm (1/e²) aufweisenden zwei Anregungspulse, die jeweils die Zentralwellenlänge von 800 nm (Anregungslicht 1) und von 1015 nm (Anregungslicht 2) aufweisen, durch eine Objektivlinse mit Brennweite von 4,5 mm gebündelt werden, und die SFG erzeugt wird.
In 5 zeigt die dicke Linie die Frequenzkomponente des SFG-Lichtes an der zentralen Position (r = 0) und die dünne Linie zeigt die Frequenzkomponente des SFG-Lichtes an der von der zentralen Position abweichenden, außenliegenden Position (r = 250 nm). Die Intensität des Signals an der außenliegenden Position bei der Frequenz 2n × 10 kHz (das n ist eine Ganzzahl) ist mit dem Pfeil gezeigt. Aus der Figur ist ersichtlich, dass die Frequenzkomponente an der zentralen Position bei den Frequenzen, die eine gerade Zahl mit der Modulationsfrequenz f multipliziert sind, groß ist und dass die Frequenzkomponente an der von der zentralen Position abweichenden Position bei den Frequenzen, die eine ungerade Zahl mit der Modulationsfrequenz f multipliziert sind, groß ist. Ferner ist ersichtlich, dass die der eine gerade Zahl multiplizierten Modulationsfrequenz entsprechende Komponente durch das hauptsächlich von der zentralen Position ausgehende SFG-Licht hervorgerufen wird. Beispielsweise ist die Frequenzkomponente von 2f bei dem an der zentralen Position erzeugenden SFG-Licht um 10¹fach bis 10²fach größer ist, als bei dem an der von der zentralen Position abweichenden Position. Weiterhin erscheint die Frequenzkomponente höherer Ordnung als Verzerrungskomponente aus der Sinuswelle, da die räumliche Intensitätsverteilung des Anregungslichtes keine vollständige Sinuswelle darstellt. Somit ist die Frequenzcharakteristik auch bei der Komponente höherer Ordnung an der zentralen Position und an der von der zentralen Position abweichenden Position unterschiedlich. Folglich ist verständlich, dass das in der Nähe von der zentralen Position erzeugte SFG-Licht dadurch spezifisch extrahiert werden kann, dass die Frequenzkomponente der mit einer geraden Zahl multiplizierten Modulationsfrequenz detektiert wird.
In 6 ist die durch die numerische Berechnung erzielte Verteilungsfunktion des punktförmigen Objektes gezeigt. Die Oberseite der 6 zeigt die Verteilung des punktförmigen Objektes auf der senkrecht zur optischen Achse liegenden xy-Fläche. Die Unterseite der 6 zeigt die Verteilung des punktförmigen Objektes auf der parallel zur optischen Achse liegenden xz-Fläche.
Hierzu wurde die numerische Berechnung hinsichtlich der Modulation der Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes 1 derart durchgeführt, dass die Lichtkonzentrationsposition spiralförmig beweglich moduliert wird, um in der senkrecht zur optischen Achse liegenden xy-Fläche die Symmetrie zu erreichen. Das heißt, die SGF-Lichtintensität wurde durch die folgende Formel gerechnet: I_SFG(x, y, z, r) ∝∫I_ωi(x + δ cos2πft cos2πf₀t, y + δ cos2πft sin2πf₀t, z)I_ω2(s, y, z)dt [Formel 6]
Allerdings ist f₀ eine Winkelfrequenz der spiralförmigen Drehung, und f ist eine Modulationsfrequenz des Radius der Spirale, sowie f₀ >> f. Auf diese Weise wird die Symmetrie in der xy-Fläche gewährleistet.
In 6 ist die Ausbreitung der Verteilungsfunktion des punktförmigen Objektes von Frequenz 2f kleiner als bei der herkömmlichen Methode (DC-Komponente). Je höher ist die zu erfassende Frequenz, desto kleiner ist die Ausbreitung der Verteilungsfunktion des punktförmigen Objektes. Das heißt, es ist gezeigt, dass durch die vorliegende Erfindung die räumliche Auflösung erhöht wird. Die Ausbreitung der Verteilung des punktförmigen Objektes sowohl in der xy-Fläche als auch in der xz-Fläche verkleinert ist. Daraus wird ersichtlich, dass sowohl die horizontale Auflösung als auch die vertikale Auflösung erhöht sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Signal, das außer dem Lichtkonzentrationspunkt vorliegt, hinsichtlich der vertikalen Richtung unterdrückt werden. Somit kann das Hintergrundlicht, das im nahen Bereich der Oberfläche des Messobjektes erzeugt wird, unterdrückt werden. Daher wird die Betrachtungstiefe im Vergleich mit der herkömmlichen Methode verbessert. 7(a) zeigt die in Richtung der optischen Achse (z) gerichtete Signalintensität hinsichtlich der erfindungsgemäßen Methode und der herkömmlichen Methode. Auf diese Weise ist es ersichtlich, dass das Betrachtungssignal erfindungsgemäß auf die Nähe des Lichtkonzentrationspunktes begrenzt wird.
Falls die zu betrachtende Probe ohne Streuung ist, ist die 7(a) die aus jeweiliger Tiefe kommende Signalintensität, wobei die Signalintensität, die an der Lichtkonzentrationspunkt erzeugt wird, am größten ist und das Hintergrundlicht aus den anderen Bereichen weitestgehend klein und daher vernachlässigbar ist. Jedoch wird die Intensität des Anregungslichtes bei der Probe mit einer großen Streuung mit der Tiefe wie folgt abgeschwächt: I(r) ∝ exp[–(z – z₀)/ls] [Formel 7]
Allerdings ls: Streulänge, z: Position in Richtung der optischen Achse, z₀: Position der Probenoberfläche.
Folglich, bei der Probe mit einer großen Streuung ist die Intensität, die durch Multiplizieren der in 7 gezeigten Signalintensität mit der von der Tiefe abhängigen Intensität des Anregungslichtes errechnet wird, die aus jeweiliger Tiefe kommende Signalintensität. In 7(b) sind die aus jeweiliger Tiefe kommenden Signalintensitäten jeweils mit und ohne Streuung gezeigt. Bei der Betrachtung der Probe mit Streuung ist die Betrachtung einer Tiefe, die tiefer als eine bestimmte Tiefe ist, nicht möglich, da die Signalintensität aus der Probenoberfläche stärker ist als die Signalintensität aus der Nähe des Lichtkonzentrationspunktes. Bei der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Betrachtungstiefe zu verbessern, da die Signalintensität aus dem Bereich, der außer dem Lichtkonzentrationspunkt vorliegt, ausreichend unterdrückt werden kann.
<Systemüberblick des nichtlinearen optischen Mikroskops>
In 1(a) ist eine begriffliche Figur gezeigt, welche eine Systemkonstruktion des nichtlinearen optischen Mikroskops nach der vorliegenden Ausführungsform darstellt.
Bei dem nichtlinearen optischen Mikroskop nach der vorliegenden Ausführungsform ist ein nichtlinearer optischer Vorgang verwendet, welcher durch ein zwei oder mehr Wellenlängen aufweisendes Anregungslicht verursacht. Als ein nichtlinearer optischer Vorgang sind die Multi-Photonen Anregungsfluoreszenz, die Summenfrequenzerzeugung (Frequenzverdopplung), die Differenzfrequenzerzeugung, die Frequenzverdreifachung, die Vier-Wellen-Mischung, die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung, die Stimulierte parametrische Emission, die Multi-Photonen-Absorption, die Simulierte Raman-Streuung usw. vorhanden.
Zwei Lasererzeugungsvorrichtungen 101, 102 werden verwendet, um als Anregungslicht zur Anregung der Molekülen ein zwei oder mehr Wellenlängen aufweisendes Laserlicht zu verwenden. Wenn ein zwei oder mehr Wellenlängen aufweisenden Laserlicht erzielt werden kann, ist es auch möglich, lediglich eine Lasererzeugungsvorrichtung zu verwenden. Falls, beispielsweise eine Lasererzeugungsvorrichtung gleichzeitig mehrere Wellenlägen abgeben kann, ist es möglich, diese Lasererzeugungsvorrichtung geteilt zu verwenden. Es ist auch möglich, bei lediglich einer Lasererzeugungsvorrichtung mittels eines Wellenlängen-Umwandlers mehrere unterschiedliche Wellenlängen zu erzielen.
Die Strahlenposition-Modulationseinheit 103 dient zum Bewegen der Lichtkonzentrationsposition eines Anregungslichtes (Anregungslicht 1) relativ zu der Lichtkonzentrationsposition des anderen Anregungslichtes (Anregungslicht 2). Um die Lichtkonzentrationsposition, wie in 1(b) gezeigt, in einer vertikalen Ebene relativ zur optischen Achse zu bewegen, kann eine einen Strahlenspot zu steuernde Strahlenspot-Modulationseinheit, wie elektro-optische (EO) Elemente, akustooptische (AO) Elemente, Galvanoscanner usw., verwendet werden. Um die Lichtkonzentrationsposition, wie in 1(c) gezeigt, in Richtung der optischen Achse zu bewegen, kann eine den Divergenzwinkel des Strahls zu steuernde Wellenfront-Modulationseinheit, wie elektro-optische Elemente, variable Spiegel usw. verwendet werden. Ferner kann die Lichtkonzentrationsposition mittels sowohl der Strahlenspot-Modulationseinheit als auch der Wellenfront-Modulationseinheit dreidimensional bewegt werden. Es ist auch möglich, mehrere Lichtkonzentrationspositionen individuell zu steuern, insofern die Lichtkonzentrationspositionen jedes Anregungslichtes relativ zueinander bewegt werden.
Das zeitverzögernde optische System 104 dient zur zeitlichen Überlagerung der Anregungslichter 1 und 2 am Lichtkonzentrationspunkt.
Das Laser-Scanning-Mikroskop 105 extrahiert die von der Modulationsfrequenz der Positionsmodulation abhängige Frequenzkomponente aus dem Signal, das durch die Spot-Modulation oder die Wellenfront-Modulation erzeugt wird. Konkreterweise wird die mit einer geraden Zahl multiplizierte Frequenzkomponente der Modulationsfrequenz extrahiert.
<Vorrichtungskonstruktion>
In 2 ist eine konkrete Konstruktion des in dem Versuch verwendeten, nichtlinearen optischen Mikroskops gezeigt. Hierzu wird der Laserpuls mittels eines als Lichtquelle dienenden Titan-Saphir-Laseroszillators 11 mit der Wellenlänge von 775 nm oszilliert. Der Laserpuls wird dann durch Dünnfilm-Polarisationsplatte (Strahlteiler) 12 geteilt, wobei eins davon unverändert als Anregungslichtpuls 2 verwendet wird sowie der andere davon als Anregungslichtpuls 1, der durch den parametrischen Oszillator (Wellenlängenumwandlungsmittel) 13 in die Wellenlänge von 1000 nm umgewandelt wird, verwendet wird.
Der Anregungslichtpuls 1 und der Anregungslichtpuls 2 werden mittels des dichroitischen Spiegels 15 räumlich überlagert, wobei diese Überlagerung bei dem Anregungslichtpuls 1 nach dem Durchgang des Galvanoscanners (Position-Modulationseinheit) 14 und bei dem Anregungslichtpuls 2 nach dem Durchgang des zeitverzögernden optischen Systems 16 durchgeführt wird. Die überlagerten Anregungspulse 1 und 2 werden durch die Objektivlinse 18 auf den Innenbereich der Probe 19 konzentriert. Da das Diaglas, an dem die Probe 19 fixiert ist, durch die dreiaxiale Piezo-Positioniervorrichtung bewegt werden kann, kann die Probe 19 dreidimensional abgetastet werden.
Das von der Probe 19 reflektierte Lichtsignal fällt nach der Beseitigung des Anregungslichtes durch Anregungslicht-Cut-Off-Filter 20 über den dichroitischen Spiegel 17 usw. in die Photo-Multiplier-Tube (PMT: Photomultiplier tube) 20 ein. Das durch die Probe 19 durchgehende Lichtsignal fällt auch nach der Beseitigung des Anregungslichtes durch Anregungslicht-Cut-Off-Filter 23 in die Photo-Multiplier-Tube 24 ein. Um die digitale Signalverarbeitung zum Extrahieren einer bestimmten Frequenzkomponente aus dem in den PMT 20, 24 detektierten Signal wegzulassen, wird bei dem vorliegenden Beispiel des Versuchs die von der Frequenz der Positionsmodulation durch den Galvanoscanner abhängige Frequenzkomponente mittels eines Lock-in-Verstärkers extrahiert. Das durch den Lock-in-Verstärker extrahierte Signal wird z. B. einem Computer übermittelt und dort verarbeitet, d. h. angezeigt, gespeichert usw..
• Versuchsergebnis 1
Um zu bestätigen, dass durch die vorliegende Methode die Auflösung in Richtung der optischen Achse erhöht wird, wurde ein Versuch durchgeführt. Bei dem vorliegenden Versuchsbeispiel wurde die Lichtkonzentrationsposition mittels des Galvanoscanners derart moduliert, dass sich die Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes 1 relativ zur Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes 2 in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene auf einer geraden Linie bewegt. Dabei war die Modulationsfrequenz 1 kHz. Das heißt, wenn die Richtung der Positionsmodulation des Anregungspulses 1 die x-Achse ist, wird die Lichtkonzentrationsposition des Anregungspulses 1 wie folgt gezeigt. Nachfolgend wird solches Modulationsverfahren als X-Modulation bezeichnet, bei welchem sich die Lichtkonzentrationspositionen von zwei Anregungspulsen in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene relativ zueinander geradlinig bewegen. I_ωl(x, y, z) → I_ωl(x + δ cos2πft, y, z) [Formel 8]
Die Rückmeldung in Richtung der optischen Achse des Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops wurde gemessen, wobei eine Spekulum-Platte mit der Dicke von 70 μm als eine Probe verwendet wurde, in welche cyan fluoreszierendes Protein verschlossen ist. In 8 ist eine Signalerzeugungsverteilung in der Nähe von der Grenze zwischen dem cyan fluoreszierenden Protein und dem Diaglas gezeigt. 8(a) zeigt die Rückmeldung in Richtung der optischen Achse in dem linearen Maßstab, wobei rechts oben der Figur die Nähe der Grenze vergrößert dargestellt ist. In 8 zeigen die dünne Linie und die dicke Linie jeweils das durch die herkömmliche Methode erzielende Ergebnis und die durch die vorliegende Methode erzielende Komponente von 2f (2 kHz). Bei der vorliegenden Methode ist die Rückmeldung in der Nähe von der Grenze steiler. Daraus wird ersichtlich, dass die Auflösung in Richtung der optischen Achse erhöht ist. Bei einer logarithmischen Anzeige, wie in 8(b) gezeigt ist, ist es erkennbar, dass die Intensität der Zwei-Photonen-Fluoreszenz, die aus dem von dem Lichtkonzentrationspunkt abweichenden Bereich erzeugt wird, auch unterdrückt werden kann. Die Signalintensität der unterbrochenen Daten in 8(b) ist in dem Rauschniveau. Der Grund davon ist, dass das Signal negativ ist.
• Versuchsergebnis 2
Als Nächstes wurde ein Versuch durchgeführt, um zu bestätigen, dass durch die vorliegende Methode die Auflösung in der senkrecht zur optischen Achse liegende Ebene erhöht wird. Die 9 zeigt die Zwei-Photonen-Fluoreszenzbilder der fluoreszierenden Kügelchen mit Durchmesser von 40 nm.
Die 9(a) zeigt ein durch die herkömmliche Methode erzielendes Betrachtungsergebnis. Bei der 9(b) wurde die Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtpulses 1 in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene relativ zur Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtpulses 2 geradlinig bewegt. In der Figur entspricht diese Bewegungsrichtung der vertikalen Richtung (y-Richtung). Die Erhöhung der Auflösung in Modulationsrichtung (y-Richtung) ist dadurch erkennbar, dass die Frequenzkomponente 2f (2 kHz), die zweifach von Modulationsfrequenz f ist, extrahiert wird. Da die Positionsmodulation bezüglich der x-Richtung nicht durchgeführt ist, ist die Auflösung in x-Richtung nicht erhöht.
Die 9(c) zeigt ein Betrachtungsergebnis im Falle der spiralförmigen Bewegung der Lichtkonzentrationsposition des Anregungspulses 1, welche für Erhöhung der Auflösung auch der x-Richtung vorgenommen wird. Hierbei wird die Lichtkonzentrationsposition des Anregungspulses 1 wie folgt moduliert: I_ω1(x, y, z) → I_ω1(x + δ₁ cos2πft cos2πf₀t, y + δ₂ cos2πft sin2πf₀t, z) [Formel 9]
Allerdings ist das als Betrachtungssignal zu extrahierende Signal die Komponente der Frequenz 2f. Bezüglich der jeweiligen Frequenz f₀ der spiralförmigen Rotation ist f₀ > 2f. Aus 9(c) wird ersichtlich, dass durch die spiralförmige Bewegung der Lichtkonzentrationsposition bezüglich der x-Richtung und der y-Richtung die Auflösung in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene erhöht ist.
• Versuchsergebnis 3
Anschließend wurde das Signal der Vier-Wellen-Mischung (FWM: Four-wave Mixing) an der Grenze zwischen dem Glas und der Luft gemessen, um zu bestätigen, dass die Auflösung auch bei dem anderen Multi-Photon-Anregungsvorgang außer der Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz erhöht wird. Die FWM ist ein tertiärer nichtlinearer optischer Vorgang, in dem durch die Wechselwirkung zwischen den drei Einfallsfelder der Frequenzen ω1, ω2, ω3 und dem Medium ein Licht von ω4 = ω1 – ω2 + ω3 erzeugt wird. Im vorliegenden Versuch wurden drei Anregungspulse in die Probe bestrahlt, wobei ein Anregungspuls davon mit der Modulationsfrequenz f in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bewegt wurde.
In 10 ist eine Signalerzeugungsverteilung in der senkrecht zur optischen Achse gerichteten Richtung gezeigt. Die dünne Linie zeigt ein Messergebnis gemäß der herkömmlichen Methode und die dicke Linie zeigt die 2f-Komponente gemäß der vorliegenden Methode. Bei der vorliegenden Methode ist, wie bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenz, die Änderung in der Nähe von der Grenze steiler. Daraus wird ersichtlich, dass die Auflösung in Richtung der optischen Achse erhöht ist.
<Effekte und Wirkungen der vorliegenden Methode>
Wie oben erwähnt, kann die räumliche Auflösung in Richtung der senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene und in Richtung der optischen Achse erhöht werden, indem bei dem nichtlinearen optischen Mikroskop, das ein Signallicht in einem nichtlinearen optischen Vorgang mißt, die Lichtkonzentrationsposition des Anregungslichtes moduliert wird und die mit der geraden Zahl multiplizierte Modulationsfrequenzkomponente des Signallichtes extrahiert wird. Da das Signallicht, das aus dem von dem Lichtkonzentrationspunkt abweichenden Bereich erzeugt wird, unterdrückt werden kann, ist es möglich, dass im Vergleich mit der herkömmlichen Methode die Bildbildung eines tieferen Teils durchgeführt wird.
Bezugszeichenliste

11: Lasererzeugungsvorrichtung
12: Strahlteiler (Dünnfilm-Polarisationsplatte)
13: Licht-parametrischer Oszillator
14: Galvanoscanner (Spot-Modulationseinheit)
15: dichroitischer Spiegel
16: Zeitverzögerungsphase
17: dichroitischer Spiegel
18: Objektivlinse
19: Probe
20: Anregungslicht-Cut-Off-Filter
21: Photo-Multiplier-Tube
22: Objektivlinse
23: Anregungslicht-Cut-Off-Filter
24: Photo-Multiplier-Tube

Claims

Nichtlineares optisches Mikroskop, das versehen ist mit: einem ersten optischen System, das ein erstes Anregungslicht auf eine Probe konzentriert, einem zweiten optischen System, das ein zweites Anregungslicht auf die Probe konzentriert, einem Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition, welches mit einer bestimmten Modulationsfrequenz die Lichtkonzentrationspositionen des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes relativ zueinander moduliert, und einem Signalextrahierungsmittel, das eine von der Modulationsfrequenz abhängige Frequenzkomponente aus dem von der Probe erzeugten Signallicht extrahiert.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach Anspruch 1, wobei das Signalextrahierungsmittel die mit einer geraden Zahl multiplizierten Frequenzkomponente der Modulationsfrequenz aus dem Signallicht extrahiert.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene spiralförmig bewegt.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bewegt.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in Richtung der optischen Achse geradlinig bewegt.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition eine Spot-Modulationseinheit umfasst, die die Lichtkonzentrationspositionen des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene bewegt.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach Anspruch 5, wobei das Modulationsmittel der Lichtkonzentrationsposition eine Wellenfront-Modulationseinheit umfasst, die die Lichtkonzentrationspositionen des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes in Richtung der optischen Achse bewegt.
Nichtlineares optisches Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das erste Anregungslicht und das zweite Anregungslicht jeweils ein Pulslaserstrahl sind, und wobei ferner ein zeitverzögerndes optisches System zur zeitlichen Überlagerung des ersten Anregungslichtes und des zweiten Anregungslichtes vorgesehen ist.
Nichtlineare optische Mikroskopie umfassend: einen Lichtkonzentrationsschritt, in dem mit einer bestimmten Modulationsfrequenz die Lichtkonzentrationspositionen eines ersten Anregungslichtes und eines zweiten Anregungslichtes relativ zueinander moduliert werden sowie das erste Anregungslicht und das zweite Anregungslicht auf eine Probe konzentriert werden, und einen Extrahierungsschritt, in dem eine von der Modulationsfrequenz abhängige Frequenzkomponente aus dem von der Probe erzeugten Signallicht extrahiert wird.
Nichtlineare optische Mikroskopie nach Anspruch 9, wobei in dem Extrahierungsschritt die mit einer geraden Zahl multiplizierte Frequenzkomponente der Modulationsfrequenz aus dem Signallicht extrahiert wird.
Nichtlineare optische Mikroskopie nach Anspruch 9 oder 10, wobei in dem Lichtkonzentrationsschritt die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene spiralförmig bewegt werden.
Nichtlineare optische Mikroskopie nach Anspruch 9 oder 10, wobei in dem Lichtkonzentrationsschritt die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in einer senkrecht zur optischen Achse liegenden Ebene geradlinig bewegt werden.
Nichtlineare optische Mikroskopie nach einem der Ansprüche 9 bis 12, wobei in dem Lichtkonzentrationsschritt die Schwerpunkte der Lichtkonzentrationsposition des ersten Anregungslichtes und der Lichtkonzentrationsposition des zweiten Anregungslichtes in Richtung der optischen Achse geradlinig bewegt werden.