DE112008002458T5

DE112008002458T5 - Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derselben

Info

Publication number: DE112008002458T5
Application number: DE112008002458T
Authority: DE
Inventors: Christophe Reuzeau; Ana Isabel Sanz Molinero; Valerie Frankard; Ramon Serrano Salom; Jose Miguel Mulet Salort
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2007-09-14
Filing date: 2008-09-15
Publication date: 2011-06-01
Also published as: MX2010002753A; CN101855355B; US20110061133A1; EP2205748A1; EP2537940A3; CN101855355A; RU2010114527A; AU2008297099A1; CA2699066A1; AR069824A1; WO2009034188A1; EP2537940A2; US9617557B2; RU2503721C2

Abstract

Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
– Wachstumsregulierender Faktor(GRF)-Polypeptid,
– RAA1-ähnliches Polypeptid,
– SYR-Polypeptid
– ARKL-Polypeptid
– und
– YTP-Polypeptid
und gegebenenfalls Selektieren nach Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und betrachtet ein Verfahren zur Erhöhung verschiedener den Pflanzenertrag betreffender Eigenschaften, indem die Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, in einer Pflanze erhöht wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit erhöhter Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAM-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid, und YTP Polypeptid, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Die Erfindung sieht außerdem Konstrukte vor, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Die stetig anwachsende Weltbevölkerung und die schwindende Reserve an anbaufähigem Land, das für die Landwirtschaft zur Verfügung steht, treibt die Forschung hin zur Erhöhung der Effizienz der Landwirtschaft voran. Herkömmliche Methoden für Verbesserungen bei Nutzpflanzen und Gartenpflanzen wenden selektive Züchtungstechniken zum Identifizieren von Pflanzen mit wünschenwerten Merkmalen an. Allerdings weisen derartige selektive Züchtungstechniken mehrere Nachteile dahingehend auf, dass diese Techniken typischerweise arbeitsintensiv sind und zu Pflanzen führen, welche häufig heterogene genetische Komponenten enthalten, welche nicht immer dazu führen, dass die erwünschte Eigenschaft von Elternpflanzen weitergegeben wird. Die Fortschritte in der Molekularbiologie haben es der Menschheit erlaubt, das Keimplasma von Tieren und Pflanzen zu modifizieren. Die gentechnische Manipulation von Pflanzen beinhaltet die Isolierung und Manipulierung von genetischem Material (typischerweise in der Form von DNA oder RNA) und die anschließende Einbringung dieses genetischen Materials in eine Pflanze. Diese Technologie weist das Vermögen auf, Nutzpflanzen oder Pflanzen mit verschiedenen verbesserten wirtschaftlichen, landwirtschaftlichen oder gärtnerischen Eigenschaften zur Verfügung zu stellen.
Eine Eigenschaft von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist ein erhöhter Ertrag. Der Ertrag ist normalerweise als der messbare Gewinn von ökonomischem Wert aus einer Nutzpflanze definiert. Dies kann in Bezug auf die Quantitiät und/oder Qualität definiert sein.
Der Ertrag ist direkt von mehreren Faktoren, wie zum Beispiel der Anzahl und Größe der Organe, der Pflanzenarchitektur (z. B. der Anzahl an Verzweigungen), der Samenproduktion, der Blatt-Seneszenz und sonstigem, abhängig. Wurzelentwicklung, Nährstoffaufnahme, Stresstoleranz und frühe Wuchskraft können ebenfalls bedeutende Faktoren bei der Bestimmung des Ertrags sein. Das Optimieren der oben erwähnten Faktoren kann daher zu einer Steigerung des Nutzpflanzenertrags beitragen.
Der Samenertrag ist ein besonders wichtiges Merkmal, da die Samen vieler Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung wichtig sind. Nutzpflanzen, wie Mais, Reis, Weizen, Canola und Sojabohne machen über die Hälfte der gesamten menschlichen Kalorienaufnahme aus, ob durch direkten Verzehr der Samen selbst oder durch Verzehr von Fleischprodukten, welche auf Grundlage verarbeiteter Samen erzeugt wurden. Sie stellen ebenfalls eine Quelle für Zucker, Öle und viele Arten von Metaboliten, die in industriellen Verfahren verwendet werden, dar. Samen enthalten einen Embryo (die Quelle von neuen Sprossen und Wurzeln) sowie ein Endosperm (die Quelle von Nährstoffen für das Embryowachstum während der Keimung und während des frühen Wachstums der Setzlinge). Die Entwicklung eines Samen beteiligt zahlreiche Gene und erfordert den Transfer von Metaboliten aus den Wurzeln, Blättern und Stengeln in den wachsenden Samen. Das Endosperm assimiliert im Besonderen die Stoffwechselvorläufer von Kohlehydraten, Ölen und Proteinen und synthetisiert sie zu Speicher-Makromolekülen, um das Korn auszufüllen.
Die Pflanzenbiomasse ist der Ertrag für Futterpflanzen, wie Alfalfa, Silomais und Heu. Bei Getreidepflanzen hat man zahlreiche Vertreter für den Ertrag verwendet. Am bedeutendsten unter diesen sind die Schätzungen der Pflanzengröße. Die Pflanzengröße kann auf vielen Wegen gemessen werden, abhängig von der Spezies und der Entwicklungsstufe, beinhaltet jedoch das Gesamtpflanzen-Trockengewicht, das oberirdische Trockengewicht, das oberirdische Frischgewicht, die Blattfläche, das Stengelvolumen, die Pflanzenhöhe, den Rosettendurchmesser, die Blattlänge, Wurzellänge, Wurzelmasse, die Triebzahl und die Blattzahl. Viele Spezies halten ein konservatives Verhältnis zwischen der Größe der verschiedenen Teile der Pflanze bei einer gegebenen Entwicklungsstufe ein. Diese allometrischen Beziehungen werden verwendet, um aus einem dieser Größenmaße auf ein anderes zu schließen (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). Die Pflanzengröße bei einem frühen Entwicklungsstadium wird typischerweise mit der Pflanzengröße später in der Entwicklung korrelieren. Eine größere Pflanze mit einer größeren Blattfläche kann in der Regel mehr Licht und Kohlendioxid absorbieren als eine kleinere Pflanze, und wird deshalb wahrscheinlich während derselben Zeittauer ein größeres Gewicht gewinnen (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50: 39). Dies kommt zusätzlich zu der potentiellen Fortdauer des mikroumgebungsbezogenen oder genetischen Vorteils hinzu, den die Pflanze hatte, um anfänglich die höhere Größe zu erreichen. Es existiert eine starke genetische Komponente hinsichtlich Pflanzengröße und Wachstumsrate (z. B. ter Steege et al., 2005, Plant Physiology 139: 1078), und daher besteht, für eine Auswahl an diversen Genotypen, wahrscheinlich eine Korrelation der Pflanzengröße unter einer Umweltbedingung mit der Größe unter einer anderen (Hittalmani et al., 2003, Theoretical Applied Genetics 107: 679). Auf diese Weise wird eine Standardumgebung als Stellvertreter für die vielfältigen und dynamischen Umgebungen benutzt, welche von Nutzpflanzen auf dem Feld an unterschiedlichen Örtlichkeiten und Zeiten angetroffen werden.
Eine andere bedeutende Eigenschaft für viele Nutzpflanzen ist die Früh-Wuchskraft. Die Verbesserung der Früh-Wuchskraft ist ein wichtiges Ziel bei modernen Reis-Züchtungsprogrammen sowohl in gemäßigten als auch tropischen Reis-Kultivaren. Lange Wurzeln sind wichtig für eine korrekte Bodenverankerung bei in Wasser ausgesätem Reis. Falls Reis direkt in überflutete Ackerfelder ausgesät wird, und falls die Pflanzen rasch durch das Wasser auftauchen müssen, stehen längere Sprosse bzw. Triebe mit der Wuchskraft in Zusammenhang. Wo eine Aussaat mit Drillvorrichtung praktiziert wird, sind längere Mesokotyle und Koleoptile für eine günstige Setzlingsemergenz bedeutsam. Die Fähigkeit, Früh-Wuchskraft künstlich in Pflanzen einzubringen, wäre für die Landwirtschaft von großer Bedeutung. Zum Beispiel war eine geringe Früh-Wuchskraft eine Einschränkung bei der Einführung von Mais(Zea Mais L.)-Hybriden auf Basis von ”Corn Belt”-Keimplasma im europäischen Atlantikraum.
Der Ernteindex, das Verhältnis von Samenertrag zu oberirdischem Trockengewicht, ist unter vielen Umweltbedingungen verhältnismäßig stabil, und somit kann häufig eine beständige Korrelation zwischen Pflanzengröße und Kornertrag erhalten werden (z. B. Rebetzke et al., 2002, Crop Science 42: 739). Diese Prozesse sind intrinsisch verknüpft, weil die Mehrheit der Kornbiomasse von der aktuellen oder gespeicherten photosynthetischen Produktivität seitens der Blätter und des Stengels der Pflanze abhängig ist (Gardener et al., 1985, Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, S. 68–73). Deshalb ist das Selektieren hinsichtlich der Pflanzengröße sogar bei frühen Entwicklungsstadien, als ein Indikator für den zukünftigen potentiellen Ertrag verwendet worden (z. B. Tittonell et al., 2005, Agric Ecosys & Environ 105: 213). Beim Testen hinsichtlich der Auswirkung von genetischen Unterschieden auf die Stresstolerenz ist die Fähigkeit zur Standardisierung von Bodeneigenschaften, Temperatur, Wasser- und Nährstoffverfügbarkeit sowie Lichtintensität ein spezifischer Vorteil von Gewächshaus- oder Pflanzenwachstumskammer-Umgebungen im Vergleich zu Feldbedingungen. Allerdings können künstliche Beschränkungen hinsichtlich des Ertrags aufgrund geringer Bestäubung wegen des Fehlens von Wind oder Insekten oder wegen ungenügendem Raum für die reife Wurzel oder das Laubkronenwachstum (canopy growth), die Anwendung dieser regulierten Umgebungen zum Testen von Ertragsunterschieden einschränken. Deshalb sind Messungen der Pflanzengröße in der frühen Entwicklung unter standardisierten Bedingungen in einer Wachstumskammer oder einem Gewächshaus Standardpraktiken, um Hinweise auf potentielle genetische Ertragsvorteile zu erhalten.
Ein anderes Merkmal von Bedeutung ist jenes der verbesserten Toleranz gegenüber abiotischem Stress. Abiotischer Stress ist eine Hauptursache für weltweiten Ernteverlust, wobei die Durchschnittserträge für die meisten wichtigen Nutzpflanzen um mehr als 50% reduziert werden (Wang et al. (2003) Planta 218: 1–14). Abiotische Stressformen können durch Dürre, Salzgehalt, Temperatur-Extreme, chemische Toxizität, Überschuss oder Mangel an Nährstoffen (Makroelemente und/oder Mikroelemente), Strahlung und oxidativen Stress verursacht werden. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Pflanzentoleranz gegenüber abiotischem Stress wäre weltweit für Landwirte von großem wirtschaftlichen Vorteil und würde den Anbau von Nutzpflanzen während ungünstigen Bedingungen und in Territorien gestatten, auf welchen eine Kultivierung von Nutzpflanzen ansonsten nicht möglich sein könnte.
Der Nutzpflanzenertrag kann daher durch Optimieren von einem der oben erwähnten Faktoren erhöht werden.
Abhängig von der Endanwendung kann die Modifikation bestimmter Ertragseigenschaften gegenüber anderen bevorzugt sein. Beispielsweise kann für Anwendungen, wie Futtermittel- oder Holzproduktion, oder Biotreibstoff-Ressourcen, ein Zuwachs bei den vegetativen Teilen einer Pflanze wünschenswert sein, und für Anwendungen, wie Mehl-, Stärke- oder Ölproduktion kann ein Anstieg hinsichtlich der Samenparameter besonders erwünscht sein. Sogar unter den Samenparametern können, abhängig vom Verwendungszweck, manche gegenüber anderen bevorzugt werden. Verschiedene Mechanismen können zur Erhöhung des Samenertrags beitragen, ungeachtet dessen, ob diese in Form einer erhöhten Samengröße oder einer erhöhten Samenzahl erfolgt.
Eine Vorgehensweise zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften (Samenertrag und/oder Biomasse) in Pflanzen kann durch Modifikation der inhärenten Wachstumsmechanismen einer Pflanze erfolgen, wie etwa dem Zellzyklus oder verschiedenen Signalleitungswegen, welche beim Pflanzenwachstum oder an Abwehrmechanismen beteiligt sind.
Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen gesteigert werden können, indem man die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Growth-Regulating-Factor(GRF)-Polypeptid codiert, in einer Pflanze erhöht. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehrere aus: erhöhte Früh-Wuchskraft, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhter Ernteindex und erhöhtes Tausendkerngewicht.
Es ist nun festgestellt worden, das verschiedene Wachstumsmerkmale in Pflanzen verbessert werden können, indem die Expression, einer Nukleinsäure, die einen ”RAA1-like” (Root Architecture Associated 1) in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert wird.
Es ist jetzt festgestellt worden, dass verschiedene Wachstumsmerkmale, insbesondere erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress, in Pflanzen verbessert werden können, indem die Expression einer Nukleinsäure, die ein ”Seed Yield Regulator”(SYR)-Protein codiert, in einer Pflanze moduliert wird.
Es ist nun festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem der Expression einer Nukleinsäure, die ein ARKL(ARADIA-Like)-Polypeptid in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert wird.
Es ist nun festgestellt worden, dass verschiedene ertragsbezogene Eigenschaften in Pflanzen verbessert werden können, indem die Expression von einer Nukleinsäue, welche ein YTP (Yield Transmembrane Protein) in einer Pflanze codiert, in einer Pflanze moduliert wird.
Hintergrund
DNA-bindende Proteine sind Proteine, welche beliebige von vielen DNA-Bindungs-Domänen umfassen und daher eine spezifische oder allgemeine Affinität zu DNA aufweisen. Zu DNA-Bindungs-Proteinen gehören beispielsweise Transkriptionsfaktoren, welche den Vorgang der Transkription modulieren, Nucleasen, welche DNA-Moleküle spalten, sowie Histone, welche an der DNA-Verpackung im Zellkern beteiligt sind.
Transkriptionsfaktoren sind üblicherweise als Proteine definiert, welche eine sequenzspezifische DNA-Bindungs-Affinität zeigen, und welche zum Aktivieren und/oder Reprimieren der Transkription befähigt sind. Das Arabidopsis-thaliana-Genom codiert mindestens 1533 transkriptionelle Regulatoren, was ~5,9% von dessen geschätzter Gesamtzahl an Genen ausmacht (Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105–2109). Die Datenbank von Reis-Transkriptions-Faktoren (DRTF) ist eine Sammlung von bekannten und vorhergesagten Transkriptionsfaktoren von Oryza sativa L. ssp. indica und Oryza sativa L. ssp. japonica, und enthält derzeit 2025 vermutete Transkriptionsfaktoren(TF)-Genmodelle in indica und 2384 in japonica, welche über 63 Familien verteilt sind (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10): 1286–7).
Eine dieser Familien ist die Growth-Regulating-Factor(GRF)-Familie der Transkriptionsfaktoren, welche für Pflanzen spezifisch ist. Mindestens neun GRF-Polypeptide sind in in Arabidopsis thaliana identifiziert worden (Kim et al. (2003) Plant J. 36: 94–104), und mindestens zwölf in Oryza sativa (Choi et al. (2004) Plant Cell Physiol 45(7): 897–904). Die GRF-Polypeptide sind durch das Vorhandensein von mindestens zwei hochkonservierten Domänen in ihrer N-terminalen Hälfte gekennzeichnet, welche nach den am stärksten konservierten Aminosäuren innerhalb jeder Domäne benannt sind: (i) eine QLQ-Domäne (InterPro-Zugangsnummer IPR014978, PFAM-Zugangsnummer PF08880), wobei die am stärksten konservierten Aminosäuren der Domäne Gln-Leu-Gln sind; sowie (ii) eine WRC-Domäne (InterPro-Zugangsnummer IPR014977, PFAM-Zugangsnummer PF08879), worin die am stärksten konservierten Aminosäuten der Domäne Trp-Arg-Cys sind. Die WRC-Domäne enthält ferner zwei charakteristische Strukturmerkmale, nämlich dahingehend, dass die WRC-Domäne hinsichtlich basischer Aminosäuren Lys und Arg angereichert ist und weiterhin drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H), umfasst, welche als die ”Effector of Transkription”(ET)-Domäne bezeichnet wird (Ellerstrom et. al. (2005) Plant Molec Biol 59: 663–681). Die konservierte Anordnung von Cystein- und Histidin-Resten in der ET-Domäne erinnert an (zinkbindende) Zinkfinger-Proteine. Darüber hinaus ist üblicherweise ein Kernlokalisationssignal bzw. nukleares Lokalisationssignal (NLS) in den GRF-Polypeptidsequenzen enthalten.
Die Wechselwirkung mancher GRF-Polypeptide mit einer kleinen Familie von Transkriptions-Coaktivatoren, GRF-interagierenden-Faktoren (GIF1 bis GIF3; ebenfalls bezeichnet als Synovial-Sarkom-Translokation(SYT)-Polypeptide, SYT1 bis SYT3), wurde mit Hilfe eines Hefe-Zwei-Hybrid-Interaktionsassays gezeigt (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 13374–13379).
Der Name GRF ist auch einem anderen Typ von Polypeptiden gegeben worden, welche der 14-3-3-Familie von Polypeptiden angehören (de Vetten & Ferl (1994) Plant Physiol. 106: 1593–1604), welche mit den GRF-Polypeptiden, die bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, vollkommen unverwandt sind.
Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen, welche mit einem Reis-GRF-Polypeptid (OsGRF1) unter der Steuerung eines konstitutiven viralen 35S-CaMV-Promotors transformiert waren, zeigten gekrauste Blätter, stark verringerte Elongation der primären Infloreszenz und eine verzögerte Blütensprossbildung (van der Knapp et al. (2000) Plant Physiol. 122: 695–704). Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen, welche mit einem der zwei Arabidopsis-GRF-Polypeptide (AtGRF1 und AtGRF2) transformiert waren, entwickelten größere Blätter und Kotyledonen, zeigten eine verzögerte Blütensprossbildung und waren teilweise steril (wegen des Fehlens von lebensfähigen Pollen) im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen (Kim et al. (2003) Plant J. 36: 94–104).
In der U.S.-Patentanmeldung US2006/0048240 wird ein Arabidopsis thaliana-GRF-Polypeptid als SEQ ID NR: 33421 identifiziert. In der U.S.-Patentanmeldung US 2007/0022495 wird ein Arabidopsis thaliana-GRF-Polypeptid als SEQ ID NR: 1803 identifiziert (und darin ebenfalls als G1438 bezeichnet). Transgene Arabidopsis-Pflanzen, welche G1438 mit Hilfe des 35S-CaMV-Promotors überexprimieren, weisen dunkelgrüne Blätter auf.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, umfassend das Erhöhen der Expression eine Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze. Die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften umfassen eines oder mehreres von: erhöhte Früh-Wuchskraft, erhöhte oberirdische Biomasse, erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhter Ernteindex und erhöhtes Tausendkerngewicht.
Es ist wenig über die Molekularbiologie der Wurzelbindung in monokotyledonen Pflanzen bekannt. Bislang sind nur einige wenige Gene identifiziert worden, welche die Wurzelentwicklung beeinflussen: Beispiele sind die rt1-Mutante, welche wenige oder gar keine Kron- und Stützwurzeln bildet (Jenkins, J. Hered. 21: 79–80, 1930), die asr1-Mutante, welche mangelhafte Keimwurzeln zeigt (De Miranda et al., Maize Genet. Coop. Neves Lett. 54: 18–19, 1980), die rtcs-Mutante, der nodale Wurzeln (Adventivwurzeln) fehlen (Hetz et al., Plant J. 10: 845–857, 1996), die slr1-Mutante und slr-2-Mutante mit verkürzten Lateralwurzeln (Hochholdinger et al., Plant Physiol. 125: 1529–1539, 2001), oder rum1, welche hinsichtlich der lateralen Initiation in der Primärwurzel aber auch hinsichtlich Initiation der Keimwurzelbindung beeinträchtigt ist (Woll et al., Plant Physiol., 139, 1255–1267, 2005). Liu et al. (Proteomics 6, 4300–4308, 2006) nahmen einen proteomischen Vergleich zwischen Primärwurzeln von Wildtyp- und rum1-Setzlingen vor und identifizierten weitere 12 Gene, welche differenziell reguliert waren und welche an der Lignin-Biosynthese, der Abwehr und dem Citrat-Zyklus beteiligt waren.
Ein anderes Gen, welches an der Wurzelbildung in monokotyledonen Pflanzen beteiligt ist, ist raa1, das zuerst aus Reis isoliert wurde (Ge et al., Plant Physiol. 135, 1502–1513, 2004): das Gen codiert ein 12,0 kD großes Protein mit 58% Homologie zu Arabidopsis-FPF1 (Flowering Promoting Factor 1). In Reis wurde RAA1 spezifisch im Apikalmeristem, der Elongationszone der Wurzelspitze, den Stelen der Verzweigungszone und der jungen Lateralwurzel exprimiert. Die konstitutive Überexpression erhöhte die Anzahl von Adventivwurzeln, aber das Primärwurzelwachstum wurde verringert. Darüber hinaus war der endogene Auxingehalt erhöht. OsRAA1 wurde auch von Auxin induziert; was nahelegt, dass eine positive Rückkopplungs-Regulierung zwischen RAA1 und Auxin bei der Reiswurzelentwicklung besteht (Ge et al., 2004). Ferner hatten Pflanzen, welche OsRAA1 überexprimierten, längere Blätter und sterile Blütchen (Ge et al., 2004). WO 2006/067219 offenbart die Verwendung von FPF1 und verwandten Proteinen zur Erhöhung der Produktion von Kohlenhydraten in Pflanzen, aber Transgene, welche FPF1 überexprimieren, zeigten keinen erhöhten Samenertrag, und es wurden keine Auswirkungen auf das Wurzelwachstum berichtet.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches bzw. ”RAA1-like”-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, welche verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung von erntebezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen vorgesehen, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure umfasst, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verbesserten ertragsbezogenen Eigenschaften beinhalteten eine gesteigerte Höhe, Spross/Wurzel-Index, Wurzeldicke, Grünheits-Index, Anzahl von Blüten pro Rispe und ein erhöhtes Tausendkerngewicht. Verbesserte ertragsbezogene Eigenschaften wurden unter normalen Wachstumsbedingungen sowie unter Stressbedingungen beobachtet.
”Seed Yield Regulator” (SYR) ist ein neues Protein, das bisher nicht charakterisiert worden ist. SYR zeigt eine gewisse Homologie (ungefähr 48% Sequenzidentität auf DNA-Ebene, ungefähr 45% auf Proteinebene) zu einem Arabidopsis-Protein mit dem Namen ARGOS (Hu et al., Plant Cell 15, 1951–1961, 2003; US 2005/0108793 ). Hu et al. postulierten, dass ARGOS ein Protein mit einer einzigartigen Funktion ist und von einem einzelnen Gen codiert wird. Die Hauptphänotypen der ARGOS-Überexpression in Arabidopsis sind eine erhöhte Blatt-Biomasse und eine verzögerte Blütenbildung. Im Gegensatz dazu erhöht die Überexpression von SYR in Reis hauptsächlich den Samenertrag, wohingegen die Blattbiomasse und die Blütezeit nicht offensichtlich beeinflusst werden.
Es ist jetzt überraschenderweise festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein ”Seed Yield Regulater”-Protein (hierin nachstehend bezeichnet als SYR) codiert, in einer Pflanze, Pflanzen ergibt, welche bei Kultivierung unter abiotischen Stressbedingungen eine verstärkte Toleranz gegenüber abiotischem Stress im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Deshalb sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
ARKL-Polypeptide umfassen eine RING-Fingerdomäne, welche derjenigen ähnelt, die im Mausprotein ARKADIA gefunden wird, einer E3-Ubiquitin-Ligase, welche an der Nodal-Signalleitung während der Embryogenese beteiligt ist (Mavrakis et al. 2007; PLoS Biol. 2007 Mar; 5(3): e67).
Die Ubiquitinylierung, ein Prozess, bei dem ein Protein durch kovalentes Anheften von Ubiquitin modifiziert wird, ist ein zentraler und wesentlicher Teil verschiedener zellulärer Prozesse in Eukaryoten. In Pflanzen bewirken Fehler in diesem Weg zahlreiche Entwicklungsstörungen, eine veränderte Antwort auf externe Reize, und modifizieren Zellzyklus- und Wachstumsmuster. Ubiquitinylierte Proteine sind als Zielobjekte für den Abbau auf einem von 26S-Proteasom abhängigen oder unabhängigen Weg vorbestimmt. Die Ubiquitin-Modifikation spielt bei der Aktivierung von Signalleitungsproteinen, der Endozytose, der Sortierung und der Histonmodifikation eine Rolle.
Das Schicksal der ubiquitinylierten Proteine wird von der Natur der Ubiquitin-Bindung bestimmt. Einzelnes oder meherere Ubiquitine können an das Ziel angehefetet sein (Mono- und Polyubiqutinylierung; der zur Bildung der Ubiquitinkette verwendete, spezifische Lys-Rest kann das letztendliche Schicksal des modifizierten Proteins beeinflussen, beispielsweise, ob es sich um Abbau oder Aktivierung handelt).
Die Anheftung von Ubiquitin an Proteine geschieht in einem Mehrstufen-Vorgang, der drei Enzyme beinhaltet, welche E1, E2, E3 genannt werden (Glikcman und Ciechanover (2000) Physiol. Rev. 82: 377–482). Anfänglich wird das Ubiquitin auf ATP-abhängige Weise an das Protein gebunden, welches dann auf einen Cysteinakzeptor im E2-Protein übertragen wird, wodurch ein E2-Ubiquitin-Intermediat gebildet wird, welches als ein Ubiquitin-Spender für das Zielprotein in einer Reaktion wirkt, die von der Ubiquitin-Ligase vermittelt wird, welche ebenfalls als E3-Ligase oder E3-Enzym bezeichnet wird. Es gibt mehrere Typen von E3-Ligasen. Die E3-Ligasen vom RING-Typ sind durch das Vorhandensein einer konservierten Proteindomäne gekennzeichnet, welche als RING-Finger oder RING-ZnF (Really Interesting New Gene – Zinc Finger) bezeichnet werden.
Zink-Bindungsmotive sind stabile Strukturen und sie unterliegen selten Konformationsänderungen beim Binden ihres Zieles. Die meisten ZnF-Proteine enthalten mehrere Fingerähnliche Ausstülpungen, die tandemartige Kontakte mit ihrem Zielmolekül aufnehmen, wobei oftmals ausgedehnte Substrate erkannt werden. Der RING-Finger ist eine spezialisierte zinkbindende Domäne, welche vermutlich in Protein-Protein-Wechselwirkungen funktioniert. Der RING-Finger ist 40 bis 60 Reste lang und koordiniert zwei Zinkatome. Er unterscheidet sich von anderen Zinkfingern dadurch, dass die acht Metallligand-Aminosäurereste, welche das Zinkion koordinieren, in einer spezifischen Struktur befindlich sind, welche als die ”Crossbrace”-Struktur bezeichnet wird (Borden (2000). J. Mol. Biol. 295: 1103–1112). Die Anordnung der Cysteine/Histidine, welche die Zinkionen in einer derartigen Domäne koordinieren, ist C-x(2)-C-x(9 bis 39)-C-x(1 bis 3)-H-x(2 bis 3)-C-x(2)-C-x(4 bis 48)-C-x(2)-C. Die Metallliganden-Paare 1 und 3 koordinieren zur Bindung eines Zinkions, während die Paare 2 und 4 das zweite binden. Es gibt zwei unterschiedliche Varianten, den C3HC4-Typ und einen C3H2C3-Typ, welche trotz des unterschiedlichen Cystein/Histidin-Musters deutlich verwandt sind. Der letztgenannte Typ wird manchmal als 'RING-H2-Finger' bezeichnet. In dem letztgenannten wird die Koordination des Zinkions durch 6 Cysteine und 2 Histidine vermittelt, während sie im C3HC4 durch 7 Cysteine und ein Histidin vermittelt wird.
In Arabidopsis thaliana gibt es mindestens 477 vermutliche RING-Domänen enthaltende Proteine. Einige enthalten mehrere RING-Finger-Domänen. Die RING-Domänen sind basierend auf dem vorliegenden Metalliganden-Rest und/oder der Anzahl an Aminosäuren zwischen ihnen in acht Typen klassifiziert worden (Stone at al. 2005) (Plant Phys. 137, 13–30). Die RING-H2-Klasse ist die größte Klasse in Arabidopsis. Basierend auf der Natur der Domänen und ihrer Organisation, sind die Arabidopsis-RING-Finger-Proteine weiter in 30 Gruppen klassifiziert worden, nämlich die Gruppe 1 bis Gruppe 30. Untergruppen innerhalb mancher der Gruppen wurden ebenfalls erkannt, z. B. die Subgruppe 2.1 und 2.2 von Gruppe 2 (Stone et al. 2005). Die Gruppe I wurde als Gruppe von RING-Finger-Protein, dem früher beschriebene Domänen fehlen, bezeichnet. Diese Sequenzanalyse dieser Proteine enthüllte Regionen der Ähnlichkeit zwischen einigen wenigen Proteinen außerhalb der RING-Domäne, welche als DAR1 bis DAR3 bezeichnet wurden (Domäne, Assoziiert mit RING). DAR1 und DAR3 weisen eine Länge von ungefähr 40 Aminosäuren, und DAR2 von 120 Aminosäuren auf. DAR1 tritt berichtetermaßen nur in Proteinen von pflanzlichem Ursprung auf (Stone et al. 2005). Die Gegenwart von gemeinsamen konservierten Domänen verwies auf eine verwandte Funktion für die Proteine, welche die Domänen enthalten.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, die verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere einen erhöhten Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Verbesserung oder Verstärkung von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Alle eukaryotischen Zellen enthalten ausgeklügelte Systeme aus inneren Membranen, welche verschiedene Membran-umschlossene Kompartimente innerhalb der Zelle aufbauen. Das Endomembransystem ist eine Ansammlung von membranösen Strukturen, welche am Transport innerhalb der Zelle beteiligt sind. Die Hauptkomponenten des Endomembransystems sind das endoplasmatische Retikulum, Golgi-Körper, Vesikel, die Zellmembran und die Zellkernhülle. Mitglieder des Endomembransystems leiten Materialien untereinander oder durch die Verwendung von Vesikeln weiter. Ein universelles Merkmal aller Zellen ist eine äußere begrenzende Membran, welche als die Plasmamembran bezeichnet wird.
Zellmembranen sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaut. Die Assoziation der Proteine an die Membran kann über eine kovalente Bindung erfolgen, durch welche das Protein an die Lipide der Membran angeheftet ist. Im Falle der sogenannten Transmembranproteine reichen Polypeptidketten des Proteins tatsächlich quer durch die Lipid-Doppelschicht. Die Assoziierung an die Membran kann auch durch eine Assoziation des Proteins, eines sogenannten peripheren Proteins, mittels nicht-kovalenter Bindungen an die herausragenden Abschnitte von integralen Membranproteinen erfolgen.
Transmembranproteine (TM-Proteine) besitzen eine amphiphile Beschaffenheit mit hydrophoben TM-Segmenten (TMSs) und hydrophilen Schleifen. In Transmembranproteinen besteht der Bereich innerhalb der Lipiddoppelschicht vorwiegend aus hydrophoben Aminosäuren. Diese sind üblicherweise in einer Alpha-Helix so angeordnet, dass die polaren Carboxy(-C=O)- und Amino(-NH)-Gruppen an den Peptidbindungen eher miteinander als mit ihrer hydrophoben Umgebung wechselwirken können. Diejenigen Bereiche des Polypeptids, welche aus der Doppelschicht herausragen, neigen dazu, einen hohen Prozentsatz an hydrophilen Aminosäuren aufzuweisen. Weiterhin sind diejenigen, welche in den extrazellulären Raum hineinragen, üblicherweise glykosyliert.
Die Transmembran-Topologie eines Proteins ist auf Basis von experimenteller Röntgenstrahl-Kristallographie, NMR, Genfusions-Technik, dem ”Substituiertes-Cystein-Zugänglichkeits”-Verfahren (substituted cysteine accessibility method), dem Asp(N)-verknüpften Glykosylierungs-Experiment und anderen biochemischen Verfahren bestimmt worden. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Verfahren zur Vorhersage der Transmembrantopologie entwickelt worden, um die Struktur und Funktion von TM-Proteinen aus deren Aminosäurensequenzen zu ermitteln (Möller et al., 2001; Ikeda et al., 2002; Chen et al., 2002).
Die Analyse der Proteinsequenzähnlichkeit zwischen Proteinen hat von Entwicklungen auf dem Gebiet der Genomik profitiert. Eine Anzahl von Domänen, die zwischen zwei oder mehr Proteinen konserviert sind, denen bislang keine Funktion zugewiesen worden ist, kann unter Anwenden spezifischer Algorithmen durchgeführt bzw. bestimmt werden. Eine derartige konservierte Domäne ist die sogenannte DUF221-Domäne (Domäne von Unbekannter Funktion 221), wie sie in Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251) beschrieben ist. Diese Domäne wird in einer Familie von hypothetischen Transmembranproteinen gefunden, von denen keines irgendeine bekannte Funktion hat, wobei die alignierte Region eine maximale Länge von 538 Resten aufweist. Die Domäne tritt in einigen Proteinen von eukaryotischem Ursprung auf. Die Expression eines Arabidopsis-Gens, EDR4, das ein Protein codiert, welches eine DUF221 umfasst, wird berichtetermaßen kurz nach einer Dehydratations-Behandlung ausgeprägt (Kiyosue et al; Plant Mol. Biol. 1994 25(5): 791–8). Eine Arabidopsis-Knockout-Mutante, gfs10, in einem Gen, welches ein anderes, Protein mit DUF221-Domäne codiert, weist berichtetermaßen einen Phänotyp auf, der ähnlich zu demjenigen von vakuolären Sortierungs-Mutanten ist (Fuji et al; 2007. Plant Cell. 2007. 19(2): 597–609).
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass die Modulierung der Expression einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, die verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften, insbesondere erhöhten Ertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Steigerung (Verbesserung) von ertragsbezogenen Eigenschaften einer Pflanze im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereitgestellt, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Definitionen
Polypeptide(e)/Protein(e)
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet und betreffen Aminosäuren in einer polymeren Form von beliebiger Länge, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind.
Polynukleotid(e)/Nukleinsäure(n)/Nukleinsäuresequenz(en)/Nukleotidsequenz(en)
Die Begriffe ”Polynukleotid(e)”, ”Nukleinsäuresequenz(en)”, ”Nukleotidsequenz(en)”, ”Nukleinsäure(n)”, ”Nukleinsäuremolekül” werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf Nukleotide, entweder Ribonukleotide oder Desoxyribonukleotide oder eine Kombination von beiden in einer polymeren, unverzweigten Form von beliebiger Länge.
Kontrollpflanze(n)
Die Auswahl von geeigneten Kontrollpflanzen ist ein routinemäßiger Teil eines experimentellen Ansatzes und kann entsprechende Wildtyp-Pflanzen oder entsprechende Pflanzen ohne das Gen von Interesse einschließen. Die Kontrollpflanze stammt typischerweise aus der gleichen Pflanzenart oder sogar aus der gleichen Varietät, wie die zu untersuchende Pflanze. Die Kontrollpflanze kann eine Nullizygote der zu untersuchenden Pflanze sein. Nullizygoten sind Individuen, denen das Transgen aufgrund von Segregation fehlt. Eine ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich nicht nur auf ganze Pflanzen, sondern auch auf Pflanzenteile, einschließlich Samen und Samenteilen.
Homolog(e)
”Homologe” eines Proteins umfassen Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, Proteine und Enzyme, welche Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen im Vergleich zum betreffenden unmodifizierten Protein aufweisen und eine ähnliche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind, besitzen.
Eine Deletion bezieht sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren aus einem Protein.
Eine Insertion bezieht sich darauf, dass ein oder mehrere Aminosäurereste in eine vorherbestimmte Stelle in einem Protein eingeführt werden. Insertionen können N-terminale und/oder C-terminale Fusionen sowie Intra-Sequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren umfassen. Im Allgemeinen werden Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz kleiner sein als N- oder C-terminale Fusionen, und zwar in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Resten. Zu Beispielen für N- oder C-terminale Fusionsproteine oder -peptide zählen die Bindungsdomäne oder Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators, wie im Hefe-Zwei-Hybrid-System verwendet, Phagen-Hüllproteine, (Histidin)-6-Tag, Glutathion-S-Transferase-Tag, Protein A, Maltose-Bindungsprotein, Dihydrofolatreduktase, Tag·100-Epitop, c-myc-Epitop, FLAG^®-Epitop, lacZ, CMP (Calmodulin-bindendes Peptid), HA-Epitop, Protein-C-Epitop und VSV-Epitop.

Eine Substitution bezieht sich auf die Ersetzung von Aminosäuren des Proteins mit anderen Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (wie etwa einer ähnlichen Hydrophobizität, Hydrophilizität, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder Aufbrechung von α-helikalen Strukturen oder β-Blatt-Strukturen). Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise an Einzelresten vorhanden, aber können abhängig von den funktionellen Vorgaben, welche dem Polypeptid auferlegt sind, gehäuft vorliegen; Insertionen werden üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten vorliegen. Die Aminosäuresubstitutionen sind vorzugsweise konservative Aminosäuresubstitutionen. Tabellen hinsichtlich der konservativen Substitution sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Hrsg.) sowie die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für konservierte Aminosäuresubstitutionen

Rest	Konservative Substitutionen	Rest	Konservative Substitutionen
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und/oder -Insertionen können mit Hilfe von auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Peptidsynthesetechniken, wie etwa der Festphasen-Peptidsynthese und dergleichen, oder durch rekombinante DNA-Manipulation, leicht ausgeführt werden. Verfahren für die Manipulierung von DNA-Sequenzen zur Erzeugung von Substitutions-, Insertions- oder Deletionsvarianten eines Proteins sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Zum Beispiel sind Techniken zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in der DNA dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt und schließen M13-Mutagenese, T7-Gen-in-vitro-Mutagenese (USB, Cleveland, OH), Quick-Change-ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, San Diego, CA), PCR-vermittelte ortsgerichtete Mutagenese oder sonstige ortsgerichtete Mutagenese-Protokolle ein.
Derivate
”Derivate” beinhalten Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche im Vergleich zur Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Form des Proteins, wie dem Protein von Interesse, Substitutionen von Aminosäuren mit nicht-natürlichen vorkommenden Aminosäureresten, oder Additionen von nicht-natürlich vorkommenden Aminosäureresten, umfassen. ”Derivate” eines Proteins beinhalten außerdem Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, welche natürlich vorkommende, veränderte (glykosylierte, acylierte, prenylierte, phosphorylierte, myristylierte, sulfatierte, etc.) oder nicht-natürlich veränderte Aminosäurereste, im Vergleich zur der Aminosäuresequenz einer natürlich vorkommenden Form des Polypeptids umfassen. Ein Derivat kann außerdem eine oder mehrere Nicht-Aminosäure-Substituenten oder -Additionen im Vergleich zu der Aminosäuresequenz, aus der es abgeleitet ist, wie z. B. ein Reportermolekül oder einen anderen Ligand, der kovalent oder nicht-kovalent an die Aminosäuresequenz gebunden ist, wie etwa ein Reportermolekül, das gebunden ist, um dessen Nachweis zu erleichtern, sowie nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste im Vergleich zur Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Proteins, umfassen.
Ferner zählen zu ”Derivaten” ebenfalls Fusionen der natürlich vorkommenden Form des Proteins mit Tagging-Peptiden, wie FLAG, HIS6 oder Thioredoxin (für einen Übersichtsartikel über Tagging-Peptide, siehe Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523–533, 2003).
Ortholog(e)/Paralog(e)
Orthologe und Paraloge umfassen evolutionäre Konzepte, die zum Beschreiben der ancestralen Beziehungen von Genen verwendet werden. Paraloge sind Gene innerhalb derselben Spezies, welche durch Duplikation eines ancestralen Gens hervorgegangen sind; Orthologe sind Gene aus anderen Organismen, welche durch Speziation hervorgegangen sind und ebenfalls aus einem gemeinsamen ancestralen Gen abgeleitet sind.
Domäne
Der Begriff ”Domäne” bezieht sich auf einen Satz von Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen entlang einem Alignment von Sequenzen von evolutionär verwandten Proteinen konserviert sind. Während Aminosäuren an anderen Positionen zwischen Homologen variieren können, deuten Aminosäuren, welche an spezifischen Positionen hochkonserviert sind, auf Aminosäuren, die wahrscheinlich in der Struktur, Stabilität oder Funktion eines Proteins wesentlich sind. Identifiziert durch das hohe Ausmaß ihrer Konservierung in alignierten Sequenzen einer Familie von Proteinhomologen, können sie als Identifikatoren verwendet werden, um zu ermitteln, ob ein beliebiges, fragliches Polypeptid einer früher identifizierten Polypeptidfamilie angehört.
Motiv/Consensus-Sequenz/Signatur
Der Begriff ”Motiv” oder ”Consensus-Sequenz” oder ”Signatur” bezieht sich auf eine kurze, konservierte Region in der Sequenz von evolutionär verwandten Proteinen. Motive sind häufig hochkonservierte Teile von Domänen, aber können ebenfalls lediglich einen Teil der Domäne einschließen oder außerhalb einer konservierten Domäne liegen (wenn alle der Aminosäuren des Motives außerhalb einer definierten Domäne liegen).
Hybridisierung
Der Begriff ”Hybridisierung”, wie hierin definiert, ist ein Verfahren, wobei im wesentlichen homologe, komplementäre Nukleotidsequenzen miteinander annealen bzw. sich aneinander anlagern. Das Hybridisierungsverfahren kann vollständig in Lösung stattfinden, d. h. beide komplementären Nukleinsäuremoleküle liegen in Lösung vor. Das Hybridisierungsverfahren kann ebenfalls stattfinden, wobei eines der komplementären Nukleinsäuremoleküle an eine Matrix, wie magnetische Kügelchen, Sepharose-Kügelchen oder ein beliebiges anderes Harz, immobilisiert ist. Das Hybridisierungsverfahren kann ferner stattfinden, wobei eines der komplementären Nukleinsäuremoleküle an einem festen Träger immobilisiert ist, wie etwa einer Nitrozellulose- oder Nylonmembran, oder z. B. durch Photolithografie beispielsweise an einen silikatischen Glasträger immobilisiert ist (wobei letzteres als Nukleinsäuresequenz-Arrays oder -Mikro-Arrays oder als Nukleinsäuresequenz-Chips bekannt ist). Um zu ermöglichen, dass eine Hybridisierung stattfindet, werden die Nukleinsäuremoleküle im Allgemeinen thermisch oder chemisch denaturiert, um einen Doppelstrang in zwei Einzelstränge aufzuschmelzen und/oder Haarnadeln oder andere Sekundärstrukturen aus einzelsträngigen Nukleinsäuremolekülen zu entfernen.
Der Begriff ”Stringenz” bezieht sich auf die Bedingungen, unter denen eine Hybridisierung stattfindet. Die Strigenz einer Hybridisierung wird von Bedingungen, wie der Temperatur, Salzkonzentration, Ionenstärke und der Hybridisierungspufferzusammensetzung, beeinflusst. Im Allgemeinen werden Niederstringenzbedingungen so gewählt, dass sie um etwa 30°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH-Wert sind. Mittlere Stringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 20°C unterhalb von T_m ist, und Hochstringenzbedingungen liegen vor, wenn die Temperatur 10°C unterhalb der T_m liegt. Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen werden in der Regel zum Isolieren von hybridisierenden Sequenzen angewandt, die eine hohe Sequenzähnlichkeit zur Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweisen. Allerdings können Nukleinsäuresequenzen hinsichtlich der Sequenz abweichen und immer noch ein im Wesentlichen identisches Polypeptid codieren, und zwar aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes. Deshalb können manchmal mittelstringente Hybridisierungsbedingungen erforderlich sein, um derartige Nukleinsäuresequenz-Moleküle zu identifizieren.
Die T_m ist die Temperatur bei definierter Ionenstärke und pH, bei welcher 50% der Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. Die T_m ist von den Lösungsbedingungen und der Basenzusammensetzung sowie der Länge der Sonde abhängig. Zum Beispiel hybridisieren längere Sequenzen spezifisch bei höheren Temperaturen. Die maximale Rate der Hybridisierung wird bei etwa 16°C bis 32°C unter der T_m erhalten. Das Vorhandensein von einwertigen Kationen in der Hybridisierungslösung verringert die elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Nukleinsäuresequenz-Strängen, wodurch die Hybridbildung gefördert wird. Dieser Effekt ist für Natriumkonzentrationen von bis zu 0,4M sichtbar (für höhere Konzentrationen kann dieser Effekt vernachlässigt werden). Formamid senkt die Schmelztemperatur von DNA-DNA und DNA-RNA-Doppelsträngen um 0,6 bis 0,7°C für jedes Prozent an Formamid, und die Zugabe von 50% Formamid gestattet, dass die Hybridisierung bei 30 bis 45°C durchgeführt werden kann, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der Hybridisierung vermindert wird. Basenpaar-Fehlpaarungen verringern die Hybridisierungsrate und die thermische Stabilität der Duplizes. Im Durchschnitt, und für große Sonden, sinkt die T_m um etwa 1°C je Prozent an Basenfehlpaarung. Die T_m kann mit Hilfe der folgenden Gleichungen, abhängig von den Typen der Hybride, berechnet werden:

1) DNA-DNA-Hybride (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem., 138: 267–284, 1984): T_m = 81,5°C + 16,6xlog₁₀[Na⁺]^a + 0,41x%[G/C^b] – 500x[L^c]^–1 – 0,61x% Formamid
2) DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybride: T_m = 79,8 + 18,5(log₁₀[Na⁺]^a) + 0,58(%G/C^b) + 11,8(%G/C^b)² – 820/L^c
3) Oligo-DNA- oder Oligo-RNA^d-Hybride: Für < 20 Nukleotide: T_m = 2(l_n) Für 20–35 Nukleotide: T_m = 22 + 1,46(l_n) ^aoder für sonstiges einwertiges Kation, aber nur exakt im Bereich von 0,01–0,4 M. ^bnur exakt für %GC im Bereich von 30% bis 75%. ^cL = Länge des Duplex in Basenpaaren. ^dOligo, Oligonukleotid; l_n, = effektive Länge des Primers = 2 × (Anz. v. G/C) + (Anz. v. A/T).

Nicht-spezifische Bindung kann unter Anwendung einer von vielen bekannten Techniken reguliert werden, wie z. B. Blockieren der Membran mit proteinhaltigen Lösungen, Zusetzungen von heterologer RNA, DNA und SDS zum Hybridisierungspuffer und Behandlung mit Rnase. Für nicht-homologe Sonden kann eine Serie von Hybridisierungen durchgeführt werden mittels Variieren von einem von (i) progressivem Senken der Annealing-Temperatur (z. B. von 68°C auf 42°C) oder (ii) progressivem Senken der Formamid-Konzentration (z. B. von 50% auf 0%). Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während einer Hybridisierung verändert werden können, und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Neben den Hybridisierungsbedingungen hängt auch die Spezifität der Hybridisierung in der Regel von der Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten ab. Um den aus nichtspezifischer Hybridisierung resultierenden Hintergrund zu entfernen, werden Proben mit verdünnten Salzlösungen gewaschen. Zu den kritischen Faktoren bei derartigen Waschschritten zählen die Ionenstärke und Temperatur der letztendlichen Waschlösung: je niedriger die Salzkonzentration und je höher die Waschtemperatur, umso höher ist die Stringenz des Waschschritts. Die Waschbedingungen werden typischerweise bei oder unter der Hybridisierungsstringenz durchgeführt. Eine positive Hybridisierung ergibt ein Signal, welches mindestens das Zweifache von demjenigen des Hintergrundes ist. Im Allgemeinen sind geeignete Stringenzbedingungen für Nukleinsäuresequenz-Hybridisierungsassays oder Genamplifikations-Nachweisverfahren wie oben angegeben beschaffen. Auch können mehr oder weniger stringente Bedingungen gewählt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt verschiedene Parameter, welche während des Waschens abgeändert werden können und welche die Stringenzbedingungen entweder aufrechterhalten oder verändern.
Zum Beispiel umfassen typische Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, die Hybridisierung bei 65°C in 1 × SSC oder bei 42°C in 1 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 65°C in 0,3 × SSC. Beispiele von Mittelstringenz-Hybridisierungsbedingungen für DNA-Hybride, die länger als 50 Nukleotide sind, umfassen Hybridisierung bei 50°C in 4 × SSC oder bei 40°C in 6 × SSC und 50% Formamid, gefolgt von Waschen bei 50°C in 2 × SSC. Die Länge des Hybrids ist die vorhergesehene Länge für die hybridisierende Nukleinsäure. Wenn Nukleinsäuremoleküle von bekannter Sequenz hybridisiert werden, kann die Hybridlänge bestimmt werden durch Alignieren der Sequenzen und Identifizieren der hierin beschriebenen konservierten Regionen. 1 × SSC steht für 0,15 M NaCl and 15 mM Natriumcitrat; die Hybridisierungslösung und Waschlösungen können zusätzlich 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5–1,0% SDS, 100 μg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 0,5% Natriumpyrophosphat, enthalten.
Für die Zwecke des Definierens der Höhe der Stringenz kann auf Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, oder auf Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 und jährliche Aktualisierungen) Bezug genommen werden.
Splice-Variante
Der Begriff ”Splice-Variante” wie hierin verwendet, umfasst Varianten einer Nukleinsäuresequenz, in welchen ausgewählte Introns und/oder Exons herausgeschnitten, ersetzt, verschoben oder hinzugefügt worden sind, oder in welchen Introns verkürzt oder verlängert worden sind. Derartige Varianten werden solche sein, in denen die biologische Aktivität des Proteins im Wesentlichen beibehalten wird; dies kann durch selektives Beibehalten von funktionellen Segmenten des Proteins bewirkt werden. Derartige Splice-Varianten können in der Natur vorgefunden oder vom Menschen erzeugt sein. Verfahren zum Vorhersagen und Isolieren derartiger Splice-Varianten sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z. B. Foissac and Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25).
Allelische Variante
Allele oder allelische Varianten sind alternative Formen eines gegebenen Gens, welche an der gleichen chromosomalen Position lokalisiert sind. Allelische Varianten umfassen Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), sowie ”Kleine Insertion-Deletions-Polymorphismen” (INDELs). Die Größe von INDELs beträgt in der Regel weniger als 100 bp. SNPs und INDELs bilden die größte Gruppe an Sequenzvarianten in natürlich vorkommenden polymorphen Stämmen der meisten Organismen.
Gen-Shuffling/gerichtete Evolution
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution besteht aus Iterationen des DNA-Shuffling, gefolgt von einem geeigneten Screening und/oder Selektieren, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen oder Abschnitten davon zu erzeugen, welche Proteine mit einer modifizierten biologischen Aktivität codieren (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151–4; U.S.-Patente 5 811 238 und 6395547 ).
Regulatorisches Element/Steuerungssequenz/Promotor
Die Begriffe ”regulatorisches Element”, ”Steuerungssequenz” und ”Promotor” werden hierin alle austauschbar verwendet und beziehen sich, wobei sie in einem weiten Kontext zu verstehen sind, auf regulatorische Nukleinsäuresequenzen, die zum Bewirken der Expression der Sequenzen in der Lage sind, an welche sie ligiert sind. Der Begriff ”Promotor” bezieht sich typischerweise auf eine Nukleinsäuresequenz-Steuerungssequenz, welche sich stromaufwärts vom transkriptionellen Start eines Gens befindet und welche an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen Proteinen beteiligt ist, wodurch die Transkription einer funktionsfähig verknüpfen Nukleinsäure gesteuert wird. Bei den zuvor erwähnten Begriffen sind transkriptionelle regulatorische Sequenzen eingeschlossen, die aus einem klassischen eukaryotischen genomischen Gen abgeleitet sind (einschließend die TATA-Box, welche für eine exakte Transkriptionsinitiation erforderlich ist, mit oder ohne einer CCAAT-Box-Sequenz) sowie weitere regulatorische Elemente (d. h. ”Upstream-Aktivierende Sequenzen”, ”Increaser” und ”Silencer”), welche die Genexpression in Antwort auf entwicklungsmäßige und/oder externe Stimuli oder in einer gewebespezifischen Weise verändern. Ebenfalls innerhalb des Begriffs eingeschlossen ist eine transkriptionelle regulatorische Sequenz eines klassischen prokaryotischen Gens, wobei er in diesem Fall eine –35-Box-Sequenz und/oder transkriptionsregulierende –10-Box-Sequenzen einschließen kann. Der Begriff ”regulatorisches Element” beinhaltet außerdem ein synthetisches Fusionsmolekül oder Derivat, welches die Expression eines Nukleinsäuresequenz-Moleküls in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ herbeiführt, aktiviert oder erhöht.
Ein ”Pflanzenpromotor” umfasst regulatorische Elemente, welche die Expression eines codierenden Sequenzsegments in Pflanzenzellen vermitteln. Folglich muss ein Pflanzenpromotor nicht von pflanzlichem Ursprung sein, sondern kann aus Viren oder Mikroorganismen stammen, beispielsweise aus Viren, welche Pflanzenzellen angreifen. Der ”Pflanzenpromotor” stammt vorzugsweise aus einer Pflanzenzelle, z. B. aus der Pflanze, welche mit der Nukleinsäuresequenz transformiert wird, die im erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden soll und hierin beschrieben ist. Dies gilt auch für andere regulatorische ”Pflanzen”-Signale, wie etwa ”Pflanzen”-Terminatoren. Die Promotoren stromaufwärts der Nukleotidsequenzen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch eine oder mehrere Nukleotidsubstitution(en), -Insertion(en) und/oder -Deletion(en) modifiziert sein, ohne die Funktionalität oder Aktivität von entweder den Promotoren, dem offenen Leserahmen (ORF) oder der 3'-regulatorischen Region, wie Terminatoren oder sonstigen 3'-regulatorischen Regionen, welche sich entfernt vom ORF befinden, zu stören. Es ist ferner möglich, dass die Aktivität der Promotoren durch Modifikation ihrer Sequenz erhöht wird, oder dass sie vollständig durch aktivere Promotoren, sogar Promotoren aus heterologen Organismen, ersetzt werden. Für die Expression in Pflanzen muss das Nukleinsäuresequenz-Molekül, wie oben beschrieben, funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden sein oder diesen umfassen, welcher das Gen zum richtigen Zeitpunkt und beim erforderlichen räumlichen Expressionsmuster exprimiert.
Für die Identifizierung von funktionell äquivalenten Promotoren können die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster eines Kandidaten-Promotors analysiert werden, zum Beispiel durch funktionsfähiges Verknüpfen des Promotors an ein Reportergen und Testen des Expressionsspiegels und -musters des Reportergens in verschiedenen Geweben der Pflanze.
Zu geeigneten, allgemein bekannten Reportergenen zählen zum Beispiel Beta-Glucoronidase oder Beta-Galactosidase. Die Promotoraktivität wird durch Messen der enzymatischen Aktivität der Beta-Glucoronidase oder Beta-Galactosidase getestet. Die Promotorstärke und/oder das Expressionsmuster können dann mit denjenigen eines Referenzpromotors verglichen werden (wie etwa jenem, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird). Alternativ kann die Promotorstärke durch Quantifizieren von mRNA-Spiegeln oder durch Vergleich von mRNA-Spiegeln der, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten, Nukleinsäuresequenz mit mRNA-Spiegeln von Haushaltsgenen, wie etwa 18S-rRNA, geassayt werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren, wie Northern-Blotting mit densitometrischer Analyse von Autoradiogrammen, quantitative Echtzeit-PCR oder RT-PCR (Neid et al., 1996 Genome Methods 6: 986–994) zur Anwendung kommen. Mit ”schwacher Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz auf einem geringen Spiegel antreibt. Mit ”geringer Spiegel” werden Spiegel von etwa 1/10000 Transkripten bis etwa 1/100000 Transkripte, bis etwa 1/5000000 Transkripten pro Zelle gemeint. Demgegenüber treibt ein ”starker Promotor” die Expression einer codierenden Sequenz bei einem hohen Spiegel oder bei etwa 1/10 Transkripte bis etwa 1/100 Transkripte bis etwa 1/1000 Transkripte pro Zelle an. Mit ”mittelstarker Promotor” wird im Allgemeinen ein Promotor bezeichnet, der die Expression einer codierenden Sequenz bei einem Spiegel antreibt, welcher in allen Fällen unterhalb desjenigen liegt, der unter der Steuerung eines 35S-CaMV-Promotors erhalten wird.
Funktionsfähig verbunden
Der Begriff ”funktionsfähig verbunden”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine funktionale Verknüpfung zwischen der Promotorsequenz und dem Gen von Interesses, so dass die Promotorsequenz in der Lage ist, die Transkription des Gens von Interesses zu initiieren.
Konstitutiver Promotor

Ein ”konstitutiver Promotor” bezieht sich auf einen Promotor, der während den meisten, aber nicht notwendigerweise allen, Phasen des Wachstums und der Entwicklung sowie unter den meisten Umweltbedingungen, in mindestens einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organ transkriptionell aktiv ist. Die nachstehende Tabelle 2a gibt Beispiele von konstitutiven Promotoren an. Tabelle 2a: Beispiele für konstitutive Pflanzenpromotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
Actin	McElroy et al., Plant Cell, 2: 163–171, 1990
HMGB	WO 2004/070039
GOS2	de Pater et al., Plant J. Nov; 2(6): 837–44, 1992, WO 2004/065596
Ubiquitin	Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675–689, 1992
Reis-Cyclophilin	Buchholz et al., Plant Mol. Biol. 25(5): 837–43, 1994
Mais-H3-Histon	Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276–285, 1992
Alfalfa-H3-Histon	Wu et al. Plant Mol. Biol. 11: 641–649, 1988
Actin 2	An et al., Plant J. 10(1); 107–121, 1996
kleine Rubisco-Untereinheit	U.S. 4 962 028
OCS	Leisner (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(5): 2553
SAD1	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
SAD2	Jain et al., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696
V-ATPase	WO 01/14572
G-Box-Proteine	WO 94/12015
CAMV 35S	Odell et al., Nature, 313: 810–812, 1985
CaMV 19S	Nilsson et al., Physiol. Plant. 100: 456–462, 1997
34S FMV	Sanger et al., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433–443
nos	Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831–7846

Ubiquitärer Promotor
Ein ubiquitärer Promotor ist im Wesentlichen in allen Geweben oder Zellen eines Organismus aktiv.
Entwicklungs-regulierter Promotor
Ein entwicklungsmäßig regulierter Promotor ist während bestimmter Entwicklungsstadien oder in Teilen der Pflanze, die entwicklungsbedingten Änderungen unterliegen, aktiv.
Induzierbarer Promotor
Ein induzierbarer Promotor zeigt induzierte oder erhöhte Transkriptionsinitiation in Antwort auf eine Chemikalie (zur Übersicht siehe Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 89–108), einen umweltmäßigen oder physikalischen Stimulus, oder kann ”stressinduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze verschiedenen Stressbedingungen ausgesetzt wird, oder ”pathogeninduzierbar” sein, d. h. aktiviert werden, wenn eine Pflanze der Exposition an verschiedene Pathogene ausgesetzt wird.
Organspezifischer/gewebespezifischer Promotor
Ein organspezifischer oder gewebespezifischer Promotor ist ein solcher, der fähig ist, Transkription in bestimmten Organen oder Geweben präferentiell zu initiieren, wie etwa Blättern, Wurzeln, Samengewebe etc. Zum Beispiel ist ein ”wurzelspezifischer Promotor” ein Promotor, der vorwiegend in Pflanzenwurzeln transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Promotoren, die zum Initiieren der Transkription nur in bestimmten Zellen fähig sind, werden hierin als ”zellspezifisch” bezeichnet.

Beispiele wurzelspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2b aufgeführt: Tabelle 2b: Beispiele von wurzelspezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
Reis-RCc3	Xu et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27(2): 237–48
Arabidopsis-Phosphat-Transporter PHT1	Kovama et al., 2005
Medicago-Phosphat-Transporter	Xiao et al., 2006
Arabidopsis Pyk10	Nitz et al. (2001) Plant Sci. 161(2): 337–346
Tabakwurzelspezifische Gene RB7, RD2, RD5, RH12	Conkling et al. (1990) Plant Phys. 93(3): 1203– 1211
Gerste, wurzelspezifisches Lectin	Lerner & Raikhel (1989) Plant Phys. 91: 124–129
wurzelspezifisches Hydroxyprolin-reiches Protein	Keller & Lamb (1989) Genes & Dev. 3: 1639–1646
Arabidopsis CDC27B/hobbit	Blilou et al. (2002) Genes & Dev. 16: 2566–2575

Ein samenspezifischer Promotor is hauptsächlich in Samengewebe transkriptionell aktiv, jedoch nicht notwendigerweise ausschließlich in Samengewebe (in Fällen von Leckexpression). Der samenspezifische Promotor kann während der Samenentwicklung und/oder während der Keimung aktiv sein. Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle 2c gezeigt. Weitere Beispiele samenspezifischer Promotoren sind in Qing Qu und Takaiwa angegeben (Pflanze Biotechnol. J. 2, 113–125, 2004), wobei diese Offenbarung, als ob sie vollständig dargelegt ist, hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Tabelle 2c: Beispiele samenspezifischer Promotoren

Gen-Quelle	Literatur-Bezugsstelle
samenspezifische Gene	Simon et al., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985;
	Scofield et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.;
	Baszczynski et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.
Paranuss-Albumin	Pearson et al., Plant Mol. Biol. 18: 235–245, 1992.
Legumin	Ellis et al., Plant Mol. Biol. 10: 203–214, 1988.
Glutelin (Reis)	Takaiwa et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15–22, 1986;
	Takaiwa et al., FEBS Letts. 221: 43–47, 1987.
Zein	Matzke et al., Plant Mol. Biol., 14(3): 323–32 1990
NapA	Stalberg et al., Planta 199: 515–519, 1996.
Weizen-LMW- und HMW-Glutenin-1	Mol. Gen. Genet. 216: 81–90, 1989; NAR 17: 461–2, 1989
Weizen SPA	Albani et al., Plant Cell, 9: 171–184, 1997
Weizen α, β, γ-Gliadine	EMBO J. 3: 1409–15, 1984
Gerste Itr1-Promotor	Diaz et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 248(5): 592–8
Gerste B1, C, D, Hordein	Theor. Appl. Gen. 98: 1253–62, 1999; Plant J. 4: 343–55, 1993; Mol. Gen. Genet. 250: 750–60, 1996
Gerste DOF	Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53–62, 1998
blz2	EP99106056.7
Synthetischer Promotor	Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629–640, 1998.
Reis Prolamin NRP33	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis a-Globulin Glb-1	Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885–889, 1998
Reis OSH1	Sato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122, 1996
Reis α-Globulin REB/OHP-1	Nakase et al., Plant Mol. Biol. 33: 513–522, 1997
Reis ADP-Glucose-Pyrophosphorylase	Trans. Res. 6: 157–68, 1997
Mais ESR-Genfamilie	Plant J. 12: 235–46, 1997
Sorghum α-Kafirin	DeRose et al., Plant Mol. Biol 32: 1029–35, 1996
KNOX	Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39: 257–71, 1999
Reis Oleosin	Wu et al., J. Biochem. 123: 386, 1998
Sonnenblume Oleosin	Cummins et al., Plant Mol. Biol. 19: 873–876, 1992
PRO0117, putatives Reis 40S ribosomales Protein	WO 2004/070039
PRO0136, Reis-Alanin-Aminotransferase	Unveröffentlicht
PRO0147, Trypsininhibitor ITR1 (Gerste)	Unveröffentlicht
PRO0151, Reis WSI18	WO 2004/070039
PRO0175, Reis RAB21	WO 2004/070039
PRO005	WO 2004/070039
PRO0095	WO 2004/070039
α-Amylase (Amy32b)	Lanahan et al., Plant Cell 4: 203–211, 1992; Skriver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7266–7270, 1991
Cathepsin β-ähnliches Gen	Cejudo et al., Plant Mol. Biol. 20: 849–856, 1992
Gerste Ltp2	Kalla et al., Plant J. 6: 849–60, 1994
Chi26	Leah et al., Plant J. 4: 579–89, 1994
Mais B-Peru	Selinger et al., Genetics 149; 1125–38, 1998

Ein für grünes Gewebe spezifischer Promotor, wie hierin definiert, ist ein Promotor, der vorwiegend in grünem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine beliebige Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird.

Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2d gezeigt. Tabelle 2d: Beispiele von für grünes Gewebe spezifischen Promotoren

Gen	Expression	Bezugsstelle
Mais, Orthophosphat-Dikinase	Blatt-spezifisch	Fukavama et al., 2001
Mais, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	Blatt-spezifisch	Kausch et al., 2001
Reis, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase	Blatt-spezifisch	Liu et al., 2003
Reis, kleine Rubisco-Untereinheit	Blatt-spezifisch	Nomura et al., 2000
Reis, beta-Expansin EXBP9	Spross-spezifisch	WO 2004/070039
Straucherbse, kleine Rubisco-Untereinheit	Blatt-spezifisch	Panguluri et al., 2005
Erbse, RBCS3A	Blatt-spezifisch

Ein weiteres Beispiel eines gewebespezifischen Promotors ist ein meristemspezifischer Promotor, der vorwiegend in meristematischem Gewebe transkriptionell aktiv ist, im Wesentlichen unter Ausschluß beliebiger sonstiger Teile einer Pflanze, obgleich noch eine gewisse Leckexpression in diesen sonstigen Pflanzenteilen zugelassen wird. Beispiele von meristemspezifischen Promotoren, welche zur Ausführung der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 2e gezeigt. Tabelle 2e: Beispiele von meristemspezifischen Promotoren

Gen-Quelle	Expressionsmuster	Bezugsstelle
Reis-OSH1	Spross-Apikalmeristem, von globulärer Embryostufe bis Keimlingsstadium	Sato et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117–8122
Reis-Metallothionein	meristemspezifisch	BAD87835.1
WAK1 & WAK2	Spross- und Wurzel-Apikalmeristeme, und in expandierenden Blättern und Kelchblättern	Wagner & Kohorn (2001) Plant Cell 13(2): 303–318

Terminator
Der Begriff ”Terminator” beinhaltet eine Steuerungssequenz, welche eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit ist, welche die 3'-Prozessierung und Polyadenylierung eines Primärtranskripts und die Termination der Transkription signalisiert. Der Terminator kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Der hinzuzufügende Terminator kann zum Beispiel aus den Nopalin-Synthase- oder Octopin-Synthase-Genen oder alternativ aus anderen Pflanzengenen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen anderen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Modulierung
Der Begriff ”Modulierung” bedeutet in Bezug auf Expression oder Genexpression ein Verfahren, in welchem der Expressionsspiegel durch die Genexpression im Vergleich zur Kontrollpflanze verändert wird, wobei der Expressionsspiegel erhöht oder verringert werden kann. Die ursprüngliche, nicht modulierte Expression kann jede Art von Expression einer strukturellen RNA (rRNA, tRNA) oder mRNA mit anschließender Translation sein. Der Begriff ”Modulieren der Aktivität” soll jedwede Änderung der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder codierten Proteine bedeuten, welche zu einem erhöhten Ertrag und/oder erhöhtem Wachtsum der Pflanzen führt.
Expression
Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet die Transkription eines spezifischen Gens oder spezifischer Gene oder eines spezifischen genetischen Konstrukts. Der Begriff ”Expression” oder ”Genexpression” bedeutet insbesondere die Transkription von einem Gen oder Genen oder einem gentechnischen Konstrukt zu struktureller RNA (rRNA, tRNA) oder zu mRNA mit oder ohne anschließende Translation der letzteren zu einem Protein. Das Verfahren beinhaltet die Transkription von DNA und die Prozessierung des resultierendens mRNA-Produkts.
Erhöhte Expression/Überexpression
Der Begriff ”erhöhte Expression” oder ”Überexpression” wie hierin verwendet, bedeutet jedwede Form von Expression, welche zusätzlich zum ursprünglichen Wildtyp-Expressionsspiegel erfolgt.
Verfahren zur Erhöhung der Expression von Genen oder Genprodukten sind im Fachgebiet gut dokumentiert und beinhalten zum Beispiel die durch geeignete Promotoren angetriebene Überexpression, die Verwendung von Transkriptions-Enhancern oder von Translations-Enhancern. Isolierte Nukleinsäuren, welche als Promotor- oder Enhancer-Elemente dienen, können in einer geeigneten Position (typischerweise stromaufwärts) einer nicht-heterologen Form eines Polynukleotids eingebracht werden, so dass die Expression einer Nukleinsäure, welche das Polypeptid von Interesse codiert, hochreguliert wird. Beispielsweise können endogene Promotoren in vivo durch Mutation, Deletion und/oder Substitution geändert werden (siehe Kmiec, US 5 565 350 ; Zarling et al., WO9322443 ), oder isolierte Promotoren können in der richtigen Orientierung und im richtigen Abstand zu einem Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle eingebracht werden, so dass die Expression des Gens gesteuert wird.
Wenn eine Polypeptidexpression gewünscht wird, ist es im Allgemeinen wünschenswert, eine Polyadenylierungsregion am 3'-Ende einer codierenden Polynukleotidregion einzuschließen. Die Polyadenylierungsregion kann aus dem natürlichen Gen, aus einer Vielzahl anderer Pflanzengene oder aus T-DNA abgeleitet sein. Die 3'-End-Sequenz, welche hinzugefügt werden soll, kann zum Beispiel aus den Genen für Nopalin-Synthase oder Octopin-Synthase oder alternativ dazu aus einem anderen Pflanzengen, oder, weniger bevorzugt, aus einem beliebigen sonstigen eukaryotischen Gen abgeleitet sein.
Auch eine Intronsequenz kann an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder die codierende Sequenz der partiellen codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert. Der Einschluss eines spleißbaren Introns in der Transkriptionseinheit sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Expressionskonstrukten erhöht gezeigtermaßen die Genexpression sowohl auf der mRNA- als auch Protein-Ebene bis zu 1000-fach (Buchman und Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395–4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1: 1183–1200). Eine derartige Intron-Verstärkung der Genexpression ist typischerweise am größten, wenn sie nahe dem 5'-Ende der Transkriptionseinheit platziert wird. Die Verwendung der Mais-Introns Adh1-S Intron 1, 2 und 6, sowie das Bronze-1-Introns sind im Fachgebiet bekannt. Für allgemeine Informationen siehe: The Maize Handbook, Kapitel 116, Hrsg.: Freeling und Walbot, Springer, N. Y. (1994).
Endogenes Gen
Die Bezugnahme hierin auf ein ”endogenes” Gen bezieht sich nicht nur auf das fragliche Gen, wie es in einer Pflanze in seiner natürlichen Form (d. h. ohne dass irgendein menschlicher Eingriff stattgefunden hat) vorgefunden wird, sondern bezieht sich außerdem auf das gleiche Gen (oder ein(e) im Wesentlichen homologe(s) Nukleinsäure/Gen) in einer isolierten Form, welches anschließend in eine Pflanze (wieder)eingeführt wird (ein Transgen). Zum Beispiel kann eine transgene Pflanze, die ein derartiges Transgen enthält, eine erhebliche Reduktion der Transgen-Expression und/oder eine erhebliche Reduktion der Expression des endogenen Gens erfahren.
Das isolierte Gen kann aus einem Organismus isoliert werden oder vom Menschen, zum Beispiel durch chemische Synthese, erzeugt werden.
Verringerte Expression
Eine Bezugnahme hierin auf ”verringerte Expression” oder ”Reduktion oder wesentliche Eliminierung” von Expression wird verwendet, um eine Verringerung der endogenen Genexpression und/oder der Polypeptidspiegel und/oder der Polypeptidaktivität im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu bezeichnen. Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung beträgt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 10%, 20%, 30%, 40% oder 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, oder 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Verringerung im Vergleich zu derjenigen von Kontrollpflanzen.
Für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wird eine ausreichende Länge von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden einer Nukleinsäuresequenz benötigt. Um ein ”Gensilencing” durchzuführen kann diese so gering wie 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 oder weniger Nukleotide sein, wobei sie alternativ so groß sein kann, wie das gesamte Gen (einschließlich der 5'- und/oder 3'-UTR, entweder zum Teil oder insgesamt). Die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden kann aus der Nukleinsäuresequenz abgeleitet sein, welche das Protein von Interesse codiert (Zielgen), oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist. Vorzugsweise ist die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden in der Lage, Wasserstoffbrücken mit dem Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang) zu bilden, und weiter bevorzugt besitzt die Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% Sequenzidentität zum Zielgen (entweder Sense- oder Antisense-Strang). Eine Nukleinsäuresequenz, welche ein (funktionales) Polypeptid codiert, ist keine Voraussetzung für die verschiedenen, hierin erörterten, Verfahren zur Reduktion oder wesentlichen Eliminierung der Expression eines endogenen Gens.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Anwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines ”Inverted Repeat” bzw. invertierten Repeats einer Nukleinsäuresequenz oder eines Teils davon (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Bildung einer Haarnadelstruktur befähigt ist. Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Einbringung von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (zum Beispiel T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ), oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden. Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von gegen ein endogenes Polypeptid gerichteten Antikörpern zum Inhibieren seiner Funktion in Pflanzen oder zum Eingreifen in den Signalleitungsweg, an welchem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Künstliche und/oder natürliche Mikro-RNAs (miRNAs) können zum Ausknocken der Genexpression und/oder mRNA-Translation verwendet werden. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden.
Diese Reduktion oder wesentliche Eliminierung der Expression kann unter Verwendung von routinemäßigen Hilfsmitteln und Techniken erzielt werden. Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression erfolgt durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, eines genetischen Konstrukts, in welches die Nukleinsäure (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs von irgendeinem der Protein(e) von Interesse in der Lage ist) als ein invertierter Repeat (teilweise oder vollständig), getrennt durch einen Spacer bzw. Abstandhalter (nicht-codierende DNA), einkloniert ist.
In einem bevorzugten derartigen Verfahren wird die Expression des endogenen Gens reduziert oder im Wesentlichen eliminiert durch RNA-vermitteltes Silencing unter Verwendung eines invertierten Repeats einer Nukleinsäure oder eines Teiles davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), welcher vorzugsweise zur Ausbildung einer Haarnadelstruktur fähig ist. Der ”Inverted Repeat” wird in einen Expressionsvektor kloniert, der Steuerungssequenzen umfasst. Eine nicht-codierende DNA-Nukleinsäuresequenz (ein Abstandhalter, zum Beispiel ein Matrix-Anheftungs-Region-Fragment (MAR), ein Intron, ein Polylinker, etc.) ist zwischen den zwei invertierten Nukleinsäuren, welche den ”Inverted Repeat” bilden, befindlich. Nach der Transkription des Inverted Repeat wird eine chimäre RNA mit einer selbst-komplementären Struktur gebildet (teilweise oder vollständig). Diese doppelsträngige RNA-Struktur wird als die Haarnadel-RNA (hpRNA) bezeichnet. Die hpRNA wird von der Pflanze zu siRNAs prozessiert, welche in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut werden. Der RISC spaltet die mRNA-Transkripte weiter, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, die in Polypeptide translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Für weitere allgemeine Einzelheiten, siehe beispielsweise Grierson et al. (1998) WO 98/53083 ; Waterhouse et al. (1999) WO 99/53050 ).
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung beruht nicht auf dem Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem genetischen Konstrukt, in welches die Nukleinsäure als ein ”Inverted Repeat” kloniert ist, sondern es können ein oder mehrere beliebige von einigen, allgemein bekannten ”Gen-Silencing”-Verfahren zur Anwendung kommen, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Ein derartiges Verfahren für die Reduktion der endogenen Genexpression ist das RNA-vermittelte Silencing von Genexpression (Herunterregulieren). Das Silencing wird in diesem Fall in einer Pflanze von einer doppelsträngigen RNA-Sequenz (dsRNA) ausgelöst, welche im Wesentlichen ähnlich zum endogenen Zielgen ist. Diese dsRNA wird von der Pflanze zu etwa 20 bis etwa 26 Nukleotiden weiterprozessiert, welche als kurze interferierende RNAs (siRNAs) bezeichnet werden. Die siRNAs werden in einen RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) eingebaut, welcher das mRNA-Transkript des endogenen Zielgens spaltet, wodurch die Anzahl von mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Vorzugsweise entspricht die doppelsträngige RNA-Sequenz einem Zielgen.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen oder Teilen davon (in diesem Fall einer Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist) in einer Sense-Orientierung in eine Pflanze. ”Sense-Orientierung” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche homolog zu einem mRNA-Transkript davon ist. Deswegen wird man in eine Pflanze. mindestens eine Kopie der Nukleinsäuresequenz einführen. Die zusätzliche Nukleinsäuresequenz wird die Expression des endogenen Gens verringern, was zur Entstehung eines Phänomens führt, welches als Co-Suppression bekannt ist. Die Reduktion der Genexpression wird noch erheblicher sein, wenn mehrere zusätzliche Kopien einer Nukleinsäuresequenz in die Pflanze eingebracht werden, da eine positiver Korrelation zwischen hohen Transkriptspiegeln und der Auslösung von Co-Suppression besteht.
Ein anderes Beispiel eines RNA-Silencing-Verfahrens beinhaltet die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen. Eine ”Antisense”-Nukleinsäuresequenz umfasst eine Nukleotidsequenz, welche zu einer ”Sense”-Nukleinsäuresequenz, die ein Protein codiert, komplementär ist, d. h. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Transkriptsequenz ist. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise komplementär zu dem endogenen Gen, welches stummgemacht bzw. gesilenct werden soll. Die Komplementarität kann in der ”codierenden Region” und/oder in der ”nicht-codierenden Region” eines Gens lokalisiert sein. Der Begriff ”codierende Region” bezieht sich auf eine Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden. Der Begriff ”nicht-codierende Region” bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche die codierende Region flankieren und welche transkribiert, jedoch nicht in Aminosäuren translatiert werden (ebenfalls bezeichnet als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen).
Antisense-Nukleinsäuresequenzen können gemäß den Regeln der Watson-und-Crick-Basenpaarung entworfen werden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann zur gesamten Nukleinsäuresequenz komplementär sein (in diesem Fall eine Strecke von im Wesentlichen zusammenhängenden Nukleotiden, abgeleitet aus dem Gen von Interesse, oder aus einer beliebigen Nukleinsäure, die zum Codieren eines Orthologs, Paralogs oder Homologs des Proteins von Interesse in der Lage ist), aber kann ebenfalls ein Oligonukleotid sein, welches den Antisense zu lediglich einem Teil der Nukleinsäuresequenz (einschließlich der 5'- und 3'-UTR der mRNA) darstellt. Zum Beispiel kann die Antisense-Oligonukleotidsequenz komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle eines mRNA-Transkripts umgibt, das ein Polypeptid codiert. Die Länge einer geeigneten Antisense-Oligonukleotidsequenz ist im Fachgebiet bekannt und kann bei etwa 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 oder 10 Nukleotiden Länge oder weniger beginnen. Eine Antisense-Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung kann unter Anwendung von chemischer Synthese sowie enzymatischer Ligationsreaktionen mit Hilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäuresequenz (z. B. eine Antisense-Oligonukleotidsequenz) chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschiedenartig modifizierte Nukleotide verwendet werden, entworfen zur Erhöhung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Erhöhung der physikalischen Stabilität des zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuresequenzen gebildeten Duplex, wobei z. B. Phosphorthioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden können. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche zum Erzeugen der Antisense-Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können, sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Zu bekannten Nukleotidmodifikationen zählen Methylierung, Zyklisierung und „Caps” sowie Substitution von einem oder mehreren der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analog, wie etwa Inosin. Andere Modifikationen von Nukleotiden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in welchem eine Nukleinsäuresequenz in einer Antisense-Orientierung subkloniert worden ist (d. h., die von der inserierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer Zielnukleinsäure von Interesse eine Antisense-Orientierung aufweisen). Vorzugsweise findet die Erzeugung von Antisense-Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen mittels eines stabil integrierten Nukleinsäurekonstrukts statt, das einen Promotor, ein funktionsfähig verknüpftes Antisense-Oligonukleotid und einen Terminator umfasst.
Die zum Silencing in den Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuremoleküle (ob in eine Pflanze eingeführt oder in situ erzeugt) hybridisieren oder binden an ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte und/oder genomische DNA, um dadurch die Expressions des Proteins zu inhibieren, z. B. durch Inhibieren von Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Duplex erfolgen, oder, zum Beispiel im Fall einer Antisense-Nukleinsäuresequenz, welche an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Antisense-Nukleinsäuresequenzen können durch Transformation oder direkte Injektion an einer spezifischen Gewebestelle in eine Pflanze eingebracht werden. Alternativ dazu können Antisense-Nukleinsäuresequenzen modifiziert sein, um ausgewählte Zellen anzuzielen, und dann systemisch verabreicht werden. Für die systemische Verabreichung können Antisense-Nukleinsäuresequenzen zum Beispiel so modifiziert werden, dass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, binden, z. B. durch Verknüpfen der Antisense-Nukleinsäuresequenz an Peptide oder Antikörper, welche an Zelloberflächen-Rezeptoren oder -Antigene binden. Die Antisense-Nukleinsäuresequenzen können auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen zugeführt werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts ist die Antisense-Nukleinsäuresequenz eine a-anomere Nukleinsäuresequenz. Eine a-anomere Nukleinsäuresequenz bildet spezfisiche, doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in welchen, gegenüber den gewöhnlichen b-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15: 6625–6641). Die Antisense-Nukleinsäuresequenz kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al. (1987) Nucl. Ac. Res. 15, 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327–330) umfassen.
Die Reduktion oder wesentliche Eliminierung der endogenen Genexpression kann auch unter Verwendung von Ribozymen durchgeführt werden. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche zum Spalten einer einzelsträngigen Nukleinsäuresequenz, wie einer mRNA, zu der sie eine komplementäre Region besitzen, in der Lage sind. Somit können Ribozyme (z. B. Hammerkopf-Ribozyme; beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334, 585–591) verwendet werden, um ein Polypeptid codierende mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, wodurch die Anzahl an mRNA-Transkripten, welche in ein Polypeptid translatiert werden sollen, wesentlich verringert wird. Ein Ribozym mit Spezifität für eine Nukleinsäuresequenz kann entworfen werden (siehe zum Beispiel: Cech et al., U.S.-Patent Nr. 4 987 071 ; und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5116742 ). Alternativ dazu können mRNA-Transkripte, welche einer Nukleinsäuresequenz entsprechen, verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren (Bartel und Szostak (1993) Science 261, 1411–1418). Die Verwendung von Ribozymen für das Gen-Silencing in Pflanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt (z. B., Atkins et al. (1994) WO 94/00012 ; Lenne et al. (1995) WO 95/03404 ; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619 ; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 und Scott et al. (1997) WO 97/38116 ).
Gen-Silencing kann auch durch Insertionsmutagenese (beispielsweise T-DNA-Insertion oder Transposon-Insertion) oder durch Strategien erzielt werden, wie sie unter anderem von Angell und Baulcombe ((1999) Plant J. 20(3): 357–62), (Amplicon VIGS WO 98/36083 ) oder Baulcombe ( WO 99/15682 ) beschrieben werden.
Gen-Silencing kann auch auftreten, wenn eine Mutation auf einem endogenen Gen und/oder eine Mutation auf einem isolierten Gen/Nukleinsäure, welche(s) anschließend in eine Pflanze eingebracht wird, vorhanden ist. Die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung kann durch ein nicht-funktionelles Polypeptid verursacht werden. Zum Beispiel kann das Polypeptid an verschiedene interagierende Proteine binden; eine oder mehrere Mutation(en) und/oder Verkürzung(en) können daher ein Polypeptid vorsehen, das noch zum Binden an interagierende Proteine (wie etwa Rezeptorproteine) in der Lage ist, aber seine normale Funktion nicht aufzeigen kann (wie etwa Signalgebungs-Ligand).
Ein weiteres Vorgehen für das Gen-Silencing besteht im Ziellenken von Nukleinsäuresequenzen, welche zur regulatorischen Region des Gens (z. B. dem Promotor und/oder Enhancer) komplementär sind, wodurch tripelhelikale Strukturen gebildet werden, welche die Transkription des Gens in Zielzellen verhindern. Siehe Helene, C., Anticancer Drug Res. 6, 569–84, 1991; Helene et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 660, 27–36 1992; und Maher, L. J., Bioassays 14, 807–15, 1992.
Andere Verfahren, wie etwa die Verwendung von Antikörpern, die gegen ein endogenes Polypeptid gerichtet sind, zum Inhibieren von dessen Funktion in Pflanzen oder Eingreifen in den Signalleitungsweg, an dem ein Polypeptid beteiligt ist, werden dem Fachmann allgemein bekannt sein. Insbesondere kann es in Betracht gezogen werden, dass vom Menschen geschaffene Moleküle zum Inhibieren der biologischen Funktion eines Zielpolypeptids oder zur Störung des Signalleitungsweges, an dem das Zielpolypeptid beteiligt ist, nützlich sein können.
Alternativ dazu kann ein Screening-Programm angesetzt werden, um natürliche Varianten eines Gens in einer Pflanzenpopulation zu identifizieren, wobei die Varianten Polypeptide mit verringerter Aktivität codieren. Solche natürlichen Varianten können beispielsweise auch zur Ausführung von homologer Rekombination angewandt werden.
Künstliche und/oder natürliche MikroRNAs (miRNAs) können verwendet werden, um Genexpression und/oder mRNA-Translation auszuknocken. Endogene miRNAs sind einzelsträngige, kleine RNAs mit einer Länge von typischerweise 19–24 Nukleotiden. Sie funktionieren vorwiegend zum Regulieren der Genexpression und/oder mRNA-Translation. Die meisten pflanzlichen MikroRNAs (miRNAs) weisen eine perfekte oder beinahe perfekte Komplementarität zu ihren Zielsequenzen auf. Allerdings gibt es natürliche Ziele mit bis zu fünf Fehlpaarungen. Sie werden aus längeren nicht-codierenden RNAs mit charakteristischen Rückfaltungsstrukturen durch Doppelstrang-spezifische RNAsen der Dicer-Familie prozessiert. Nach der Prozessierung werden sie in den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) durch Binden an dessen Hauptkomponente, ein Argonaute-Protein, eingebaut. MiRNAs dienen als die Spezifitätskomponenten des RISC, da sie mit Zielnukleinsäuren im Cytoplasma, vorwiegend mRNAs, eine Basenpaarung aufnehmen. Anschließende regulatorische Ereignisse beinhalten die Ziel-mRNA-Spaltung und -Zerstörung und/oder die Translationsinhibition. Effekte der miRNA-Überexpression spiegeln sich deshalb häufig in verringerten mRNA-Spiegeln von Zielgenen.
Artifizielle MikroRNAs (amiRNAs), welche typischerweise eine Länge von 21 Nukleotiden besitzen, können in spezifischer Weise gentechnisch erzeugt werden, um die Genexpression von einzelnen oder mehreren Genen von Interesse negativ zu regulieren. Determinanten der Pflanzen-MikroRNA-Zielauswahl sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Empirische Parameter für die Zielerkennung sind definiert worden und können eingesetzt werden, um beim Entwurf von spezifischen amiRNAs zu helfen (Schwab et al., (2005) Dev. Cell 8(4): 517–27). Zweckdienliche Hilfsmittel für den Entwurf und die Erzeugung von amiRNAs und ihren Vorläufern sind ebenfalls öffentlich verfügbar (Schwab et al., (2006) Plant Cell 18(5): 1121–33).
Für eine optimale Leistung erfordern die Gen-Silencing-Techniken, die zum Reduzieren der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze angewandt werden, die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen aus monokotyledonen Pflanzen für die Transformation monokotyledoner Pflanzen, und aus dikotyledonen Pflanzen für die Transformation dikotyledoner Pflanzen. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäuresequenz aus einer beliebigen gegebenen Pflanzenspezies in diese selbe Spezies eingebracht. Zum Beispiel wird eine Nukleinsäuresequenz aus Reis in eine Reispflanze transformiert. Allerdings ist es kein absolutes Erfordernis, dass die einzuführende Nukleinsäuresequenz aus derselben Pflanzenspezies stammt, wie die Pflanze, in welche sie eingeführt werden soll. Es ist ausreichend, dass eine wesentliche Homologie zwischen dem endogenen Zielgen und der einzuführenden Nukleinsäuresequenz besteht.
Beispiele verschiedener Verfahren für die Reduzierung oder wesentliche Eliminierung der Expression eines endogenen Gens in einer Pflanze wurden oben beschrieben. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird ohne Weiteres in der Lage sein, die oben genannten Verfahren zum Silencing so anzupassen, dass eine Reduzierung der Expression eines endogenen Gens in einer gesamten Pflanze oder in Teilen davon erreicht wird, beispielsweise durch die Verwendung eines geeigneten Promotors.
Selektierbares Marker(gene)/Reportergen
Unter ”selektierbarer Marker”, ”selektierbares Markergen” oder ”Reportergen” ist ein beliebiges Gen eingeschlossen, welches einen Phänotyp an eine Zelle vermittelt, in der es/er exprimiert wird, so dass die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen erleichtert wird, die mit einem Nukleinsäuresequenz-Konstrukt der Erfindung transfiziert oder transformiert sind. Diese Markergene ermöglichen die Identifizierung eines erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenz-Moleküle durch eine Reihe unterschiedlicher Prinzipien. Geeignete Marker können aus Markern ausgewählt werden, welche Antibiotikum- oder Herbizid-Resistenz vermitteln, welche eine neue metabolische Eigenschaft einbringen oder welche eine visuelle Selektion zulassen. Zu Beispielen von selektierbaren Markergenen zählen Gene, die Resistenz gegen Antibiotika (wie etwa nptII, das Neomycin und Kanamycin phosphoryliert, oder hpt, das Hygromycin phosphoryliert, oder Gene, welche Resistenz zum Beispiel gegen Bleomycin, Streptomycin, Tetracyclin, Chlorampenicol, Ampicillin, Gentamycin, Geneticin (G418), Spectinomycin oder Blasticidin vermitteln) sowie gegen Herbizide vermitteln (zum Beispiel bar, das Resistenz gegen Basta^® vermittelt; aroA oder gox, welche Resistenz gegen Glyphosat vermitteln, oder die Gene, welche zum Beispiel Resistenz gegen Imidazolinon, Phosphinothricin oder Sulfonylharnstoff vermitteln), oder Gene, die ein metabolisches Merkmal bereitstellen (wie etwa manA, das Pflanzen gestattet, Mannose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwenden, oder Xylose-Isomerase für die Verwertung von Xylose, oder antinutritive Marker, wie die Resistenz gegen 2-Desoxyglucose). Die Expression von visuellen Markergenen führt zur Bildung von Farbe (zum Beispiel β-Glucuronidase, GUS, oder β-Galactosidase mit seinen gefärbten Substraten, beispielsweise X-Gal), Lumineszenz (wie das Luciferin/Luciferase-System) oder Fluoreszenz (Grün-fluoreszierendes Protein, GFP, und Derivate davon). Diese Liste repräsentiert nur eine kleine Anzahl von möglichen Markern. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit derartigen Markern vertraut. Es werden, abhängig von dem Organismus und dem Selektionsverfahren, unterschiedliche Marker bevorzugt.
Es ist bekannt, dass bei einer stabilen oder transienten Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt und, falls gewünscht, diese in ihr Genom integriert, was vom verwendeteten Expressionsvektor und der angewandten Transfektionstechnik abhängig ist. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird überlicherweise ein Gen, das für einen selektierbaren Marker codiert (wie denjenigen, die oben beschrieben sind), zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenz-Moleküle, die einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem getrennten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben).
Da die Markergene, insbesondere Gene für Resistenz gegen Antibiotika und Herbizide, in der transgenen Wirtszelle nicht länger erforderlich oder unerwünscht sind, sobald die Nukleinsäuresequenzen erfolgreich eingebracht worden sind, wendet das erfindungsgemäße Verfahren zum Einbringen der Nukleinsäuresequenzen in vorteilhafter Weise Techniken an, welche die Entfernung oder Exzision dieser Markergene ermöglichen. Ein derartiges Verfahren ist die sogenannte Co-Transformation. Das Co-Transformations-Verfahren verwendet zwei Vektoren gleichzeitig für die Transformation, wobei ein Vektor die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz trägt und ein zweiter die Markergen(e) trägt. Ein großer Anteil an Transformanten erhält oder, im Fall von Pflanzen, umfasst (bis zu 40% oder mehr der Transformanten) beide Vektoren. Im Fall der Transformation mit Agrobakterien empfangen die Transformanten in der Regel nur einen Teil des Vektors, d. h. die von der T-DNA flankierte Sequenz, welche üblicherweise die Expressionskassette darstellt. Die Markergene können anschließend aus der transformierten Pflanze durch Ausführung von Kreuzungen entfernt werden. In einem anderen Verfahren werden in ein Transposon integrierte Markergene für die Transformation gemeinsam mit der gewünschten Nukleinsäuresequenz verwendet (bekannt als Ac/Ds-Technologie). Die Transformanten können mit einer Transposase-Quelle gekreuzt werden, oder die Transformanten werden mit einem Nukleinsäuresequenz-Konstrukt, welches die Expression einer Transposase vermittelt, transient oder stabil transformiert. In einigen Fällen (ungefähr 10%), springt das Transposon aus dem Genom der Wirtszelle heraus, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und geht verloren. In einer weiteren Anzahl von Fällen springt das Transposon an eine andere Stelle. In diesen Fällen muss das Markergen durch Ausführen von Kreuzungen elimiert werden. In der Mikrobiologie wurden Techniken entwickelt, welche das Aufspüren derartiger Ereignisse ermöglichen oder erleichtern. Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren beruht auf sogenannten Rekombinationssystemen; deren Vorteil besteht darin, dass auf die Eliminierung durch Kreuzung verzichtet werden kann. Das am besten bekannte System dieses Typs ist das sogenannte Cre/Lox-System. Cre1 ist eine Rekombinase, welche die zwischen den loxP-Sequenzen befindlichen Sequenzen entfernt. Wenn das Markergen zwischen die loxP-Sequenzen integriert ist, wird es entfernt, sobald die Transformation erfolgreich stattgefunden hat, und zwar durch die Expression der Rekombinase. Weitere Rekombinationssysteme sind das HIN/HIX-, FLP/FRT- und REP/STB-System (Tribble et al., J. Biol. Chem., 275, 2000: 22255–22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553–566). Eine ortsspezifische Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in das Pflanzengenom ist möglich. Selbstverständlich können diese Verfahren auch auf Mikroorganismen, wie Hefe, Pilze oder Bakterien, angewandt werden.
Transgenisch/Transgen/Rekombinant
Für die Zwecke der Erfindung bedeuten ”transgenisch”, ”Transgen” oder ”rekombinant”, zum Beispiel in Hinsicht auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette, ein Genkonstrukt oder einen Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz, oder einen Organismus, der mit den Nukleinsäuresequenzen, Expressionskassetten oder Vektoren gemäß der Erfindung transformiert ist, wobei alle diese Konstruktionen durch rekombinante Verfahren bewerkstelligt werden, in welchen entweder

(a) die Nukleinsäuresequenzen, welche in den Verfahren der Erfindung nützliche Proteine codieren, oder
(b) genetische Steuerungsequenz(en), welche funktionsfähig mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz verknüpft sind, wie beispielsweise ein Promotor, oder
(c) a) und b)

US 5 565 350

WO 00/15815

Eine transgene Pflanze versteht sich für die Absichten der Erfindung daher, dass wie oben gemeint ist, dass die im Verfahren der Erfindung verwendeten Nukleinsäuresequenzen nicht an ihrem natürlichen Genort im Genom der Pflanze vorliegen, wobei es möglich ist, dass die Nukleinsäuresequenzen homolog oder heterolog exprimiert werden. Wie erwähnt, bedeutet ”transgen” jedoch ebenfalls, dass, obwohl die erfindungsgemäße oder im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Nukleinsäuresequenz(en) an ihrer natürlichen Position im Genom einer Pflanze vorliegt, die Sequenz in Bezug auf die natürliche Sequenz modifiziert worden ist und/oder dass die regulatorischen Sequenzen der natürlichen Sequenzen modifiziert worden sind. Es versteht sich, dass ”transgen” vorzugsweise die Expression der Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung an einem unnatürlichen Genort im Genom, d. h. homolog, bedeutet, oder dass vorzugsweise eine heterologe Expression der Nukleinsäuresequenzen stattfindet. Bevorzugte transgene Pflanzen sind hierin erwähnt.
Transformation
Der Begriff ”Einbringung” oder ”Transformation”, wie hierin darauf Bezug genommen wird, beinhaltet den Transfer eines exogenen Polynukleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des für den Transfer verwendeten Verfahrens. Pflanzengewebe, das zur anschließenden klonalen Vermehrung in der Lage ist, ob durch Organogenese oder Embryogenese, kann mit einem genetischen Konstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert, und eine gesamte Pflanze daraus regeneriert werden. Das gewählte, jeweilige Gewebe wird von den klonalen Propagationssystemen abhängen, welche für die zu transformierende jeweilige Spezies verfügbar und am besten geeignet sind. Beispielhafte Gewebeziele schließen Blattscheiben, Pollen, Embryonen, Kotyledonen, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, existierendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (z. B. Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem) ein. Das Polynukleotid kann transient oder stabil in einer Wirtszelle eingebracht und kann nicht-integriert, zum Beispiel als ein Plasmid, beibehalten werden. Alternativ dazu kann es in das Wirtsgenom integriert werden. Die resultierende, transformierte Pflanzenzelle kann dann zum Regenerieren einer transformierten Pflanze auf eine Weise, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, verwendet werden.
Der Transfer von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation von Pflanzenspezies ist heutzutage eine durchaus routinemäßige Technik. In vorteilhafter Weise kann ein beliebiges von mehreren Transformationsverfahren angewandt werden, um das Gen von Interesse in eine geeignete Vorfahrenzelle einzubringen. Die für die Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen beschriebenen Verfahren können für transiente oder für stabile Transformationen angewandt werden. Transformationsverfahren beinhalten die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, welche die Aufnahme freier DNA erhöhen, direkte Injektion der DNA in die Pflanze, Beschuss mit einer Partikelkanone, Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen sowie Mikroinjektion. Man kann Verfahren auswählen unter dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., (1982) Nature 296, 72–74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol. Biol. 8: 363–373); der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al. (1985) Bio/Technol. 3, 1099–1102); der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial hinein (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet. 202: 179–185); dem Beschuss mit DNA- oder RNA-beschichteten Teilchen (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70); der Infektion mit (nicht-integrierenden) Viren und dergleichen. Transgene Pflanzen, einschließlich transgener Nutzpflanzen, werden vorzugsweise mittels Agrobacterium-vermittelter Transformation hergestellt. Ein vorteilhaftes Transformationsverfahren ist die Transformation in planta. Zu diesem Zweck ist es zum Beispiel möglich, den Agrobakterien zu gestatten, auf Pflanzensamen einzuwirken, oder das Pflanzenmeristem mit Agrobakterien zu inokulieren. Es hat sich gemäß der Erfindung als besonders zweckmäßig erwiesen, zu gestatten, dass eine Suspension transformierter Agrobakterien auf die intakte Pflanze oder zumindest auf die Blütenanlagen einwirkt. Die Pflanze wird anschließend weiter wachsen gelassen, bis die Samen der behandelten Pflanze erhalten werden (Clough und Bent, Plant J. (1998) 16, 735–743). Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Reis schließen allgemein bekannte Verfahren für die Reistransformation ein, wie etwa diejenigen, welche in einem beliebigen aus Folgendem beschrieben sind: Europäische Patentanmeldung EP 1198985 A1 , Aldemita und Hodges (Planta 199: 612–617, 1996); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 22 (3): 491–506, 1993), Hiei et al. (Plant J. 6 (2): 271–282, 1994), wobei diese Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargelegt wären. Im Falle von Mais-Transformation ist das bevorzugte Verfahren beschaffen, wie entweder in Ishida et al. (Nat. Biotechnol. 14(6): 745–50, 1996) oder Frame et al. (Plant Physiol. 129(1): 13–22, 2002) beschrieben, deren Offenbarungen hier und durch den Bezug darauf einbezogen sind, als ob sie vollständig dargestellt wären. Die Verfahren sind in beispielartiger Weise weiterhin beschrieben in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128–143, sowie in Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205–225). Die Nukleinsäuresequenzen oder das Konstrukt, welche(s) exprimiert werden sollen, wird vorzugsweise in einen Vektor kloniert, der zum Transformieren von Agrobacterium tumefaciens geeignet ist, zum Beispiel pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem derartigen Vektor transformierte Agrobakterien können dann auf bekannte Weise für die Transformation von Pflanzen verwendet werden, wie etwa Pflanzen, welche als Modell herangezogen werden, wie Arabidopsis (Arabidopsis thaliana wird innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung nicht als Nutzpflanze betrachtet) oder Nutzpflanzen, wie zum Beispiel Tabakpflanzen, beispielsweise durch Eintauchen von zerquetschten Blättern oder zerhackten Blättern in einer Agrobakterienlösung und danach Kultivieren derselben in geeigneten Medien. Die Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium tumefaciens ist zum Beispiel von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, beschrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Zusätzlich zur Transformation von somatischen Zellen, welche dann zu intakten Pflanzen regeneriert werden müssen, ist es ebenfalls möglich, die Zellen von Pflanzenmeristemen und insbesondere diejenigen Zellen, welche sich zu Gameten entwickeln, zu transformieren. In diesem Fall folgen die transformierten Gameten der natürlichen Pflanzenentwicklung, wodurch es zur Entstehung transgener Pflanzen kommt. So werden beispielsweise Samen von Arabidopsis mit Agrobakterien behandelt, und Samen werden aus den sich entwickelnden Pflanzen erhalten, von denen ein gewisser Anteil transformiert und somit transgen ist [Feldman, KA und Marks MD (1987). Mol. Gen Genet. 208: 274–289; Feldmann, K., (1992). In: C. Koncz, N-H. Chua und J. Shell, Hrsg., Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, S. 274–289]. Alternative Verfahren basieren auf der wiederholten Entfernung der Infloreszenzen und der Inkubation der Schnittstelle im Zentrum der Rosette mit transformierten Agrobakterien, wodurch in ähnlicher Weise transformierte Samen zu einem späteren Zeitpunkt erhalten werden können (Chang (1994). Plant J. 5: 551–558; Katavic (1994). Mol. Gen Genet, 245: 363–370). Ein besonders effektives Verfahren ist jedoch das Vakuuminfiltrationsverfahren mit seinen Modifikationen, wie dem ”floral dip”-Verfahren. Im Falle von Vakuuminfiltration von Arabidopsis werden intakte Pflanzen unter verringertem Druck mit einer Agrobakteriensuspension behandelt [Bechthold, N. (1993). C. R. Acad. Sci. Paris Life Sci., 316: 1194–1199], wohingegen im Fall des ”floral dip”-Verfahrens das sich entwickelnde Blütengewebe kurz mit einer tensidbehandelten Agrobakteriensuspension inkubiert wird [Clough, SJ, und Bent, AF (1998) The Plant J. 16, 735–743]. In beiden Fällen wird ein gewisser Anteil an transgenen Samen geerntet, und diese Samen können von nicht-transgenen Samen durch Kultivieren unter den oben beschriebenen selektiven Bedingungen unterschieden werden. Darüber hinaus besitzt die stabile Transformation von Plastiden Vorteile, weil Plastiden in den meisten. Nutzpflanzen maternal vererbt werden, was das Risiko eines Transgen-Flusses durch Pollen verringert oder eliminiert. Die Transformation des Chloroplastengenoms wird im Allgemeinen durch ein Verfahren bewirkt, das in Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2), 225–229] schematisch geschildert worden ist. Kurz gesagt, werden die zu transformierenden Sequenzen zusammen mit einem selektierbaren Markergen zwischen flankierende Sequenzen, die homolog zum Chloroplastengenom sind, kloniert. Plastidale Transformation ist für viele verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden, und eine Übersicht erhält man in Bock (2001) "Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology". J. Mol. Biol., 21. Sep. 2001; 312 (3): 425–38, oder Maliga, P (2003) "Progress towards commercialization of plastid transformation technology". Trends Biotechnol. 21, 20–28. In jüngster Zeit ist über einen weiteren biotechnologischen Fortschritt in Form von markerfreien Plastidentransformanten, welche mittels eines transienten, cointegrierten Markergens hergestellt werden können, berichtet worden (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225–229).
T-DNA-Aktivierungs-Tagging
T-DNA-Aktivierungs-Tagging (Hayashi et al. Science (1992) 1350–1353) beinhaltet die Insertion von T-DNA, üblicherweise enthaltend einen Promotor (es kann sich auch um einen Translations-Inceaser oder einen Intron handeln), in die genomische Region des Gens von Interesse oder 10 kb stromaufwärts oder stromabwärts der codierenden Region eines Gens in einer derartigen Konfiguration, dass der Promotor die Expression des angezielten Gens steuert. Typischerweise wird die Regulierung der Expression des angezielten Gens durch seinen natürlichen Promotor zerstört, und das Gen kommt unter die Kontrolle des neu eingebrachten Promotors. Der Promotor ist typischerweise in einer T-DNA eingebettet. Diese T-DNA wird statistisch in das Pflanzengenom inseriert, zum Beispiel durch Agrobacterium-Infektion, und führt zur modifizierten Expression von Genen nahe der inserierten T-DNA. Die resultierenden transgenen Pflanzen zeigen dominante Phänotypen aufgrund der modifizierten Expression von Genen nahe dem eingebrachten Promotor.
TILLING
Der Begriff ”TILLING” ist eine Abkürzung für ”Targeted Induced Local Lesions In Genomes” und bezieht sich auf eine Mutagenesetechnologie, die zum Erzeugen und/oder Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen nützlich ist, welche Proteine mit modifizierter Expression und/oder Aktivität codieren. TILLING erlaubt auch die Selektion von Pflanzen, welche derartige Mutantenvarianten tragen. Diese Mutantenvarianten können eine modifizierte Expression aufzeigen, entweder hinsichtlich Stärke oder Lokalisierung oder Zeitgebung (wenn die Mutationen zum Beispiel den Promotor betreffen). Diese Mutantenvarianten können eine höhere Aktivität aufzeigen, als sie von dem Gen in seiner natürlichen Form aufgewiesen wird. TILLING vereinigt Hochdichte-Mutagenese mit Hochdurchsatz-Screeningverfahren. Die beim TILLING typischerweise befolgten Schritte sind: (a) EMS-Mutagenese (Redei GP und Koncz C (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, Hrsg., Singapur, World Scientific Publishing Co, S. 16–82; Feldmann et al., (1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR, Hrsg., Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. 137–172; Lightner J und Caspar T (1998) In J Martinez-Zapater, J Salinas, Hrsg., Methods an Molecular Biology, Bd. 82. Humana Press, Totowa, NJ, S. 91–104); (b) DNA-Präparation und Vereinigen bzw. Poolen der Individuen; (c) PCR-Amplifikation einer Region von Interesse; (d) Denaturieren und Annealen, um die Bildung von Heteroduplexen zu gestatten; (e) DHPLC, wobei die Gegenwart eines Heteroduplex in einem Pool als ein Extrapeak im Chromatogramm nachgewiesen wird; (f) Identifikation des Mutanten-Individuums; und (g) Sequenzieren des Mutanten-PCR-Produkts. Verfahren für TILLING sind im Fachgebiet allgemein bekannt (McCallum et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 455–457; übersichtmäßig zusammengefasst von Stemple (2004) Nat. Rev. Genet. 5(2): 145–50).
Homologe Rekombination
Homologe Rekombination gestattet die Einbringung einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz an einer definierten gewählten Position in einem Genom. Homologe Rekombination ist eine Standardtechnologie, die in den biologischen Wissenschaften für niedere Organismen, wie Hefe oder das Moos Physcomitrella, routinemäßig angewandt wird. Verfahren zur Durchführung homologer Rekombination in Pflanzen sind nicht nur für Modellpflanzen beschrieben worden (Offringa et al. (1990) EMBO J. 9(10): 3077–84) sondern auch für Nutzpflanzen, zum Beispiel Reis (Terada et al. (2002) Nat. Biotech. 20(10): 1030–4; Iida und Terada (2004) Curr. Opin. Biotech. 15(2): 132–8), und es existieren Vorgehensweisen, welche, ungeachtet des Zielorganismus, allgemein anwendbar sind (Miller et al., Nature Biotechnol. 25, 778–785, 2007).
Ertrag
Der Begriff ”Ertrag” bedeutet im Allgemeinen einen messbaren Gewinn von wirtschaftlichem Wert, typischerweise in Bezug auf eine spezifizierte Nutzpflanze, ein Gebiet und eine Zeitperiode. Individuelle Pflanzenteile tragen auf Basis ihrer Anzahl, Größe und/oder Gewicht direkt zum Ertrag bei, oder die tatsächliche Ausbeute ist der Ertrag pro Quadratmeter für eine Nutzpflanze und pro Jahr, was mittels Dividieren der Gesamtproduktion (einschließlich sowohl geernteter und geschätzter Produktion) durch die bepflanzten Quadratmeter bestimmt wird. Der Begriff ”Ertrag” von einer Pflanze kann sich auf vegetative Biomasse (Wurzel- und/oder Sprossbiomasse), auf die reproduktiven Organe und/oder auf Fortpflanzungskeime (wie Samen) dieser Pflanze beziehen.
Früh-Wuchskraft
”Früh-Wuchskraft” bezieht sich auf aktives gesundes, richtig ausgewogenes Wachstum, insbesondere während der frühen Stadien des Pflanzenwachstums, und kann aus einer erhöhten Pflanzenfitness resultieren, beispielsweise aufgrund dessen, dass die Pflanzen besser an ihre Umgebung angepasst sind (d. h. Optimieren der Verwendung von Energieresourcen und Aufteilung zwischen Spross und Wurzel). Pflanzen mit Früh-Wuchskraft zeigen außerdem erhöhtes Setzlings-Überleben und eine bessere Hervorbringung der Nutzpflanze, was häufig zu sehr gleichmäßigen Feldern (wobei die Nutzpflanze in gleichmäßiger Weise wächst, d. h. die Mehrheit der Pflanzen die verschieden Stadien der Entwicklung im Wesentlichen zur gleichen Zeit erreicht) und oftmals zu einem besserem und höheren Ertrag führt. Deshalb kann die Früh-Wuchskraft durch Messen verschiedener Faktoren, wie etwa Tausendkerngewicht, Prozentsatz der Keimung, Prozentsatz der Emergenz, Setzlingswachstum, Setzlingshöhe, Wurzellänge, Wurzel- und Sprossbiomasse und vielen anderen, bestimmt werden.
Erhöhen/Verbessern/Verstärken
Die Begriffe ”erhöhen”, ”verbessern” oder ”Erhöhung” sind austauschbar und sollen im Sinn der Patentanmeldung mindestens 5%, 6%, 7%, 8%, 9% oder 10%, vorzugsweise mindestens 15% oder 20%, weiter bevorzugt 25%, 30%, 35% oder 40% mehr Ertrag und/oder Wachstum im Vergleich zu Kontrollpflanzen bedeuten, wie hierin definiert.
Samenertrag
Erhöhter Samenertrag kann sich als eines oder mehrere der folgenden manifestieren: a) eine Erhöhung der Samenbiomasse (Gesamtsamengewicht), welche auf Einzel-Samen-Basis und/oder pro Pflanze und/oder pro Hektar oder 'Acre' bzw. Morgen bezogen sein kann; b) erhöhte Anzahl von Blüten pro Rispe und/oder pro Pflanze; c) erhöhte Anzahl von (gefüllten) Samen; d) erhöhte Samen-Füllrate (welche als das Verhältnis zwischen der Zahl gefüllter Samen, dividiert durch die Gesamtzahl an Samen ausgedrückt wird); e) erhöhter Ernteindex, der als Verhältnis des Ertrags an erntefähigen Teilen, wie Samen, dividiert durch die Gesamtbiomasse, ausgedrückt wird); f) erhöhte Anzahl von Hauptrispen; (g) erhöhtes Tausendkerngewicht (TKW), welches aus der gezählten Zahl an gefüllten Samen und deren Gesamtgewicht extrapoliert wird. Ein erhöhtes TKW kann aus erhöhter Samengröße und/oder erhöhtem Samengewicht resultieren, und kann auch aus einer Erhöhung der Embryo- und/oder Endospermgröße resultieren.
Eine Erhöhung im Samenertrag kann sich auch als eine Erhöhung in Samengröße und/oder Samenvolumen manifestieren. Ferner kann eine Erhöhung des Ertrags sich auch als eine Erhöhung bei Samenfläche und/oder Samenlänge und/oder Samenbreite und/oder Samenumfang manifestieren. Erhöhter Samenertrag kann auch zu modifierter Architektur führen, oder kann wegen einer modifierten Architektur auftreten.
Grünheits-Index
Der ”Grünheits-Index”, wie hierin verwendet, wird aus Digitalbildern von Pflanzen berechnet. Für jeden Pixel, der zu dem Pflanzenobjekt auf dem Bild gehört, wird das Verhältnis des Grünwerts gegenüber dem Rotwert (im RGB-Modell zum Codieren von Farbe) berechnet. Der Grünheits-Index wird als der Prozentsatz an Pixeln ausgedrückt, für den das Grün-zu-Rot-Verhältnis einen gegebenen Schwellenwert übersteigt. Unter normalen Wachstumsbedingungen, unter Salzstress-Wachstumsbedingungen und unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit wird der Grünheits-Index von Pflanzen in der letzten Abbildung vor dem Aufblühen gemessen. Im Gegensatz dazu wird der Grünheits-Index von Pflanzen unter Dürrestress-Wachstumsbedingungen in der ersten Abbildung nach der Dürre gemessen.
Pflanze
Der Begriff ”Pflanze”, wie hierin verwendet, umfasst ganze Pflanzen, Vorfahren und Nachkommen der Pflanzen sowie Pflanzenteile, einschließlich Samen, Sprosse, Stengel, Blätter, Wurzeln (einschließlich Knollen), Blüten und Gewebe und Organe, wobei jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäuresequenz von Interesse umfasst. Der Begriff ”Pflanze” beinhaltet außerdem Pflanzenzellen, Suspensionskulturen, Callusgewebe, Embryonen, meristematische Regionen, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen, wobei wiederum jedes der zuvor genannten das Gen/die Nukleinsäuresequenz von Interesse umfasst.
Zu Pflanzen, welche in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen, einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäume oder Sträucher, ausgewählt aus der Liste, umfassend, unter anderem, Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allrum spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (z. B. Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (z. B. Brassica napus, Brassica rapa ssp. [Canola, Ölsamenraps, Rübsen]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (z. B. Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (z. B. Glycine max, Soja hispida oder Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (z. B. Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (z. B. Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (z. B. Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (z. B. Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (z. B. Solanum tuberosum, Solanum integrifolium oder Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticale sp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (z. B. Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum oder Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es ist nun überraschend festgestellt worden, dass das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze zu Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen führt. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein GRF-Polypeptid, besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Jegliche hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass in einer Ausführungsform ein GRF-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäuresequenz” versteht sich so, dass eine Nukleinsäuresequenz gemeint ist, die zum Codieren eines derartigen GRF-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäuresequenz, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäuresequenz, welche den Typ von Polypeptid codiert, der nun beschrieben wird, und wird hierin nachstehend ebenfalls als ”GRF-Nukleinsäuresequenz” oder ”GRF-Gen” bezeichnet.
Ein ”GRF-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 115; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 116 repräsentiert.
Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”GRF-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, umfassend: (i) eine QLQ-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014978 (PFAM-Zugangsnummer PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014977 (PFAM-Zugangsnummer PF08879); und (iii) eine Effector-of-Transcription(ET)-Domäne, welche drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H) umfasst.
Alternativ oder zusätzlich dazu, bezieht sich ein ”GRF-Polypeptid”, wie hierin definiert, auf ein beliebiges Polypeptid, das in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zum GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A hierin aufgeführten Vollängen-Polypeptidsequenzen aufweist.
Alternativ oder zusätzlich dazu, interagiert ein ”GRF-Polypeptid” mit GRF-interagierenden-Faktor(GIF)-Polypeptiden (ebenfalls bezeichnet als Synovial-Sarkom-Translokation(SYT)-Polypeptide) in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Interaktionsassay.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, welche verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass in einer Ausführungsform ein RAA1-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jedwede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, welche zum Codieren eines derartigen RAA1-ähnlichen Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, welche den Typ von Protein, der nun beschrieben wird, codiert, welche hierin nachstehend ebenfalls als ”RAA1-ähnliche Nukleinsäure” oder ”RAA1-ähnliches Gen” bezeichnet wird.
Ein ”RAA1-ähnliches Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, das von SEQ ID NR: 121 repräsentiert wird, sowie Orthologe und Paraloge davon. RAA1-ähnliche Proteine sind kleine (MG zwischen 10 und 21 kDA) und basische Polypeptide (pl über 8,5), und weisen in der Regel keinen oder einen Cys-Rest in der Sequenz, welche mit SEQ ID NR: 121 aligniert, auf, wenn ein standardmäßiges Needleman-Wunsch-Alignment-Programm mit Vorgabe-Einstellungen angewandt wird.
Vorzugsweise umfasst das RAA1-ähnliche Polypeptid zwei oder mehr der folgenden konservierten Sequenzmotive:
SEQ ID NR: 162, Motiv 1: GVW(V/L)F
SEQ ID NR: 163, Motiv 2: LGW(E/S)RY(Y/F)
SEQ ID NR: 164, Motiv 3: (D/H)L(L/I)S(I/V/L)P(R/K/A)(S/D)F
SEQ ID NR: 165, Motiv 4: (H/Y)(F/M)YD(V/I)WK(N/T)(R/P)
Alternativ dazu weist das Homolog eines RAA1-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der Aminosäure[sequenz] auf, die durch SEQ ID NR: 121 repräsentiert wird, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die konservierten Motive 1 (a, b, c oder d), 2 und 3 sowie die Leucin-reiche Domäne, wie oben geschildert, umfasst. Die Gesamt-Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, ermittelt.
Bei Heranziehung zur Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie etwa demjenigen, der in 8 abgebildet ist (Ge et al., 2004), lässt sich die Polypeptidsequenz vorzugsweise eher bei der Gruppe von RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die von SEQ ID NR: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen bzw. Clustern.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze zu Pflanzen führt, welche bei Kultivieren unter abiotischen Stressbedingungen gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in unter abiotischen Stressbedingungen kultivierten Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer, ein SYP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass in einer Ausführungsform ein SYR-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines derartigen SYR-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und daher bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der nun beschrieben wird, und welche hierin nachstehend ebenfalls als ”SYR-Nukleinsäure” oder ”SYR-Gen” bezeichnet wird.
Der Begriff ”SYR-Protein oder Homolog davon” wie hierin definiert, bezieht sich auf ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, umfassend (i) eine Leucin-reiche Domäne, welche einem Leucin-Zipper ähnelt, in der C-terminalen Hälfte des Proteins, wobei der Leucin-reichen Domäne (ii) ein Tripeptid mit der Sequenz YFS (konserviertes Motiv 5a, SEQ ID NR: 173) oder YFT (konserviertes Motiv 5b, SEQ ID NR: 174) oder YFG (konserviertes Motiv 5c, SEQ ID NR: 175) oder YLG (konserviertes Motiv 5d, SEQ ID NR: 176) vorangeht und (iii) ein konserviertes Motiv 6 ((V/A/I) LAFMP (T/S), SEQ ID NR: 177) nachfolgt. Vorzugsweise ist das konservierte Motiv 6 (A/V) LAFMP (T/S), am stärksten bevorzugt ist das konservierte Motiv VLAFMPT. Das ”SYR-Protein oder Homolog davon” besitzt außerdem vorzugsweise ein konserviertes C-terminales Peptid, das mit dem konservierten Motiv 7 (SYL oder PYL, SEQ ID NR: 178) endet. Die Leucin-reiche Domäne des SYR-Proteins oder seines Homologs ist etwa 38 bis 48 Aminosäuren lang, beginnt unmittelbar hinter dem konservierten Motiv 5 und endet unmittelbar vor dem konservierten Motiv 6 und umfasst mindestens 30% Leucin. Die Leureiche Domäne weist vorzugsweise ein Motiv auf, welches dem Leucin-Zipper-Motiv ähnelt (L-X₆-L-X₆-L-X₆-L, wobei X₆ eine Abfolge von 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren ist). Ein bevorzugtes Beispiel eines SYR-Proteins wird von SEQ ID NR: 169 repräsentiert, und ein Überblick über seine Domänen ist in der 11 angegeben.
Weiter bevorzugt besitzen SYR-Proteine zwei Transmembran-Domänen, wobei der N-terminale Teil und der C-terminale Teil des Proteins im Inneren lokalisiert sind, und der Teil zwischen den Transmembran-Domänen im Äußeren lokalisiert ist.
Alternativ dazu besitzt das Homolog eines SYR-Proteins, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der Aminosäure[sequenz], welche von SEQ ID NR: 169 repräsentiert wird, mit der Maßgabe, dass das homologe Protein die konservierten Motive 5 (a, b, c oder d), 6 und 7 sowie die Leucin-reiche Domäne, wie oben geschildert, umfasst. Die Gesamt-Sequenzidentität wird unter Verwendung eines globalen Alignierungsalgorithmus, wie etwa dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise bei Standardparametern, ermittelt. Verglichen zur Gesamt-Sequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn lediglich konservierte Domänen oder Motive betrachtet werden.
Überraschenderweise ist nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, codierend ein ARKL-Polypeptid, Pflanzen ergibt, welche verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass ein ARKL-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jede hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützliche Nukleinsäure” versteht sich so, dass eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines derartigen ARKL-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist) ist eine beliebige Nukleinsäure, die den Typ von Protein codiert, welcher nun beschrieben wird, und die hierin nachstehend ebenfalls als ”ARKL-Nukleinsäure” oder ”ARKL-Gen” bezeichnet wird.
Ein ”ARKL-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf jedwedes Polypeptid, das eine konservierte Domäne des Zinkfinger-RING-Typs und gegebenenfalls eine DAR1-Domäne umfasst. Der im ARKL-Polypeptid vorgefundene RING-Typ-Zinkfinger umfasst einen kanonischen C3H2C3-Zinkfinger-Domänentyp. Er kann ferner in den RING-H2-Typ innerhalb der Gruppe I, wie definiert von Stone et al., 2005, klassifiziert werden.
Eine Consensus-Sequenz, welche die RING-H2-Domäne repräsentiert, wird berichtetermaßen durch CX(2)CX(9-39)CX(1-3)HX(2-3)HX(2)CX(4-48)CX(2)C (SEQ ID NR: 400) repräsentiert. Die Länge der variablen Schleifen in den ARKL-Polypeptiden beträgt typischerweise 14 bis 15 Aminosäuren zwischen den Metall-Liganden 2 und 3 sowie 10 Aminosäuren zwischen den Metall-Liganden 6 und 7 (1). Spezifische Aminosäurereste, welche von denjenigen verschieden sind, die bei der direkten Koordinierung von Zn2+-Ionen impliziert werden, sind in der RING-H2-Domäne von ARKL-Polypeptiden hochkonserviert (1). SEQ ID NR: 401 repräsentiert eine Consensus-Sequenz, welche unter der Mehrzahl von ARKL-Polypeptiden konserviert ist.
Ein in den Verfahren der Erfindung nützliches, bevorzugtes ARKL-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid, welches eine ZfC3H2C3-Zink-Finger-RING-Domäne umfasst, wobei eine derartige Domäne durch SEQ ID NR: 400 repräsentiert wird, oder ein Polypeptid, das, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der ZfC3H2C3-Domänen, wie durch SEQ ID NR: 306 bis SEQ ID NR: 351 repräsentiert, aufweist. Weiter bevorzugt umfasst das ARKL-Polypeptid der Erfindung eine ZfC3H2C3-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 401 repräsentiert.
ARKL-Polypeptide umfassen typischerweise eine zusätzliche Domäne, welche DAR1 (Domain Associated with RING) genannt wird, welche nach früheren Beschreibungen in einigen wenigen RING-Proteinen von pflanzlichem Ursprung außerhalb der RING-Domäne vorkommt (Stone et al. 2005). Die DAR1-Domäne wird typischerweise am N-Terminus der RING-Domäne gefunden. In der Regel umfassen DAR1-Domänen eine konservierte Aminosäuresignatur, wie durch SEQ ID NR. 399 repräsentiert (Motiv 8).
Ein weiteres bevorzugtes ARKL-Polypeptid, das in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, bezieht sich auf ein Polypeptid, umfassend eine DAR1-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der DAR1-Domänen, wie sie durch SEQ ID NR: 352 bis SEQ ID NR. 398 repräsentiert werden. Noch weiter bevorzugt umfasst die das ARKL-Polypeptid der Erfindung das Motiv 8, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 399.
Zinkfinger-RING-Typ- sowie DAR1-Domänen können in Proteindatenbanken gefunden werden, welche auf Proteinfamilien, -Domänen und funktionale Stellen spezialisiert sind, wie Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251) oder InterPro, welche die folgenden Proteinsignatur-Datenbanken integriert: PROSITS, PRINTS, ProDom, Pfam, SMART, TIGRFAMs, PIRSF, SUPERFAMILY, Gene3D und PANTHER (Mulder et al. 2007 Nucleic Acids Research, 2007, Band 35, Database Issue D224–D228). Pfam stellt eine große Sammlung von multiplen Sequenz-Alignments und versteckten Markov-Modellen (HMM) zusammen, die viele häufige Proteindomänen und Familien abdeckt, und ist über das Sanger-Institut in Großbritannien verfügbar. Zuverlässige Übereinstimmungen (trusted matches), wie in der Pfam-Datenbank erachtet, sind diejenigen Sequenzen, welche eine höhere Punktwertung erzielen als den Ansammlungs-Ausschluß-Schwellenwert (gathering cut-off threshold). Der ”gathering cutoff threshold” der RING-H2-Domäne (Pfam-Zugangsnummer: PF00097) beträgt 16,0 im Pfam HMM_fs-Verfahren und beträgt 15,2 im Pfam HMM_Is-Verfahren. Allerdings können potentielle Übereinstimmungen, welche tatsächliche Domänen der RING-H2-Domäne umfassen, immer noch unter dem ”gathering cut-off” liegen. Vorzugsweise handelt es sich bei einem in den Verfahren der Erfindung nützlichen ARKL-Polypeptid um (ein) Protein(e) mit einer oder mehreren Domänen in ihrer Sequenz, welche den ”gathering cut-off” der Pfam-Proteindomänenfamilie PF000097, ebenfalls bekannt als Zinkfinger, C3HC4-Typ (RING-Finger)-Familiendomäne, übersteigen.
Alternativ dazu können Zinkfinger-RING-Typ- und DAR1-Domänen in einem Polypeptid durch Ausführen eines Sequenzvergleichs mit bekannten Polypeptiden, welche einen Zinkfinger-RING-Typ und/oder DAR1-Domänen umfassen, und Nachweisen der Ähnlichkeit in der Region der Domänen identifiziert werden. Die Sequenzen können unter Verwendung eines beliebigen der im Fachgebiet bekannten Verfahren, wie etwa Blast-Algorithmen, aligniert werden. Die Wahrscheinlichkeit, dass die Alignierung mit einer gegebenen Sequenz auftritt, wird als Grundlage für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide herangezogen. Ein Parameter, welcher typischerweise angewandt wird, um eine derartige Wahrscheinlichkeit wiederzugegeben, ist der sogenannte e-Wert. Der E-Wert ist ein Maß der Zuverlässigkeit der S-Wertung (S score). Die S-Wertung ist ein Maß der Ähnlichkeit des Suchgegenstands (query) zur gezeigten Sequenz. Der e-Wert beschreibt, wie oft erwartet wird, dass eine gegebene S-Wertung rein zufällig auftritt. Der e-Wert-Ausschluss kann so hoch wie 1,0 sein. Der typische Schwellenwert für einen zuverlässigen e-Wert aus einer BLAST-Suchausgabe unter Verwendung eines ARKL-Polypeptids als Suchsequenz ist geringer als e–5(= 10–5), 1.e–10, 1.e–15, 1.e–20, 1.e–25, 1.e–50, 1.e–75, 1.e–100, 1.e–200, 1.e–300, 1.e–400, 1.e–500, 1.e–600, 1.e–700 und 1.e–800. Vorzugsweise umfassen in den Verfahren der Erfindung nützliche ARKL-Polypeptide eine Sequenz mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, der geringer als e–5(= 10–5), 1.e–10, 1.e–15, 1.e–20, 1.e–25, 1.e–50, 1.e–75, 1.e–100, 1.e–200, 1.e–300, 1.e–400, 1.e–500, 1.e–600, 1.e–700 und 1.e–800 ist, in einem Alignment mit einem Zinkfinger-RING-Typ und/oder DAR1-Domänen, wie sie in bekannten ARKL-Polypeptiden vorgefunden werden, wie zum Beispiel SEQ ID NR: 213.
Beispiele von in den Verfahren der Erfindung nützlichen ARKL-Polypeptiden sind in der Tabelle A angegeben. Eine Sequenz, welche die RING-H2- und DAR1-Domänen umfasst, wie sie in den repräsentativen ARKL-Polypeptiden von Tabelle A vorhanden sind, ist in SEQ ID NR: 306 bis SEQ ID NR: 351 bzw. SEQ ID NR: 352 bis SEQ ID NR: 398 angegeben. Die Aminosäurekoordinaten der Position von RING-H2- und DAR1-Domänen, wie sie in einer Auswahl von ARKL-Polypeptiden von Tabelle A vorhanden sind, werden im Beispiel 4 angebeben.
Weitere in den Verfahren der Erfindung nützliche, bevorzugte ARKL-Polypeptide sind diejenigen mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98% oder mehr Sequenzidentität zu einem beliebigen der in Tabelle A angegebenen Polypeptide.
Überraschenderweise ist es nun festgestellt worden, dass das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, Pflanzen ergibt, die verstärkte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verstärkung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Modulieren (vorzugsweise Erhöhen) der Expression einer Nukleinsäure, codierend ein YTP-Polypeptid, besteht im Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze.
Eine beliebige, hierin nachstehende Bezugnahme auf ein ”in den Verfahren der Erfindung nützliches Protein” versteht sich so, dass in einer Ausführungsform ein YTP-Polypeptid, wie hierin definiert, gemeint ist. Jegliche hierin nachstehende Bezugnahme auf eine ”in den Verfahren der Erfindung nützlichen Nukleinsäure” versteht sich so, das eine Nukleinsäure gemeint ist, die zum Codieren eines derartigen YTP-Polypeptids in der Lage ist. Die Nukleinsäure, welche in eine Pflanze eingebracht werden soll (und deshalb bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist), ist eine beliebige Nukleinsäure, welche den Typ von Protein codiert, der nun beschrieben wird, und welche hierin nachstehend ebenfalls als ”YTP-Nukleinsäure” oder ”YTP-Gen” bezeichnet wird.
Ein ”YTP-Polypeptid”, wie hierin definiert, bezieht sich auf ein Polypeptid, das mindestens eine Transmembran-Domäne und einen Abschnitt von mindestens 50 zusammenhängenden Aminosäuren einer DUF221-Domäne umfasst. Außerdem kann das YTP-Polypeptid das Motiv 9, wie durch die SEQ ID NR: 546 repräsentiert, umfassen.
Transmembranproteine besitzen eine amphiphile Struktur mit hydrophoben Segmenten, die quer durch die Membranen reichen, und hydrophilen Schleifen, die auf jeder Seite der Membran lokalisiert sein können (siehe 20). Schleifen sind die Segmente (Regionen) eines Proteins, welche zwischen zwei TM-Domänen lokalisiert sind. Schleifen von durchschnittlicher Größe, welche auf der Innenraumseite der Membran angeordnet sind, sind typischerweise negativer geladen als diejenigen auf der Außenseite der Membran.
Eine Transmembran-Domäne bildet eine Sekundärstruktur (üblicherweise eine Alpha- oder Beta-Helix) von typischerweise 12–35 Aminosäureresten. Die Schleifen zwischen den Transmembrandomänen sind typischerweise kürzer als 60 Aminosäurereste, obwohl lange globuläre Regionen ebenfalls vorkommen können. Die Anzahl von Transmembran-Domänen in einem YTP-Polypeptid ist variabel, beträgt jedoch in der Regel zwischen 2 und 20.
Die Transmembran-Domäne, welche in YTP-Polypeptiden gefunden wird, weist vorzugsweise zwischen 8 und 50 Aminosäuren auf, am stärksten bevorzugt 8, 12, 14, 16, 18, 2, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35 oder 36 Aminosäuren. Eine Schleife, welche in YTP-Polypeptiden vorgefunden wird, weist bevorzugt über 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100 Aminosäurereste auf.
Ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches, YTP-Polypeptid umfasst, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mehr als 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12 Transmembran-Domänen.
Transmembran-Domänen sind stark hydrophobe Proteine, welche reich an nicht-polaren Aminosäuren sind. Die Tabelle 3 zeigt eine Klassifizierung der Aminosäuren gemäß den Seitenketteneigenschaften. Hydrophobe Aminosäuren sind angegeben. Der hydrophobe Charakter eines Peptids kann durch im Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren ermittelt werden, wie zum Beispiel berichtet von Kyte und Doolittle (1982) J. Mol. Biol., 157: 105–132.

In den Verfahren der Erfindung nützliche YTP-Polypeptide umfassen vorzugsweise Transmembran-Domänen, welche mindestens 20%, 30%, 40%, 50%, 60% oder mehr nicht-polare Aminosäuren enthalten. Die Tabelle 3 gibt die Polarität der 20 essentiellen Aminosäuren an. Tabelle 3: Klassifizierung von Aminosäuren gemäß den Seitenketteneigenschaften.

Aminosäure	3-Buchstaben	1-Buchstabe	Seitenketten-Polarität	Seitenketten-Azidität oder -Basizität	Hydropathie-Index
Arginin	Arg	R	polar	basisch	–4,5
Asparagin	Asn	N	polar	neutral	–3,5
Asparaginsäure	Asp	D	polar	sauer	–3,5
Cystein	Cys	C	polar	neutral	2,5
Glutamin	Glu	E	polar	sauer	–3,5
Glutaminsäure	Gln	Q	polar	neutral	–3,5
Histidin	His	H	polar	basisch	–3,2
Lysin	Lys	K	polar	basisch	–3,9
Serin	Ser	S	polar	neutral	–0,8
Threonin	Thr	T	polar	neutral	–0,7
Tyrosin	Tyr	Y	polar	neutral	–1,3
Alanin	Ala	A	nicht-polar	neutral	1,8
Glycin	Gly	G	nicht-polar	neutral	–0,4
Isoleucin	Ile	I	nicht-polar	neutral	4,5
Leucin	Leu	L	nicht-polar	neutral	3,8
Methionin	Met	M	nicht-polar	neutral	1,9
Phenylalanin	Phe	F	nicht-polar	neutral	2,8
Prolin	Pro	P	nicht-polar	neutral	–1,6
Tryptophan	Trp	W	nicht-polar	neutral	–0,9
Valine	Val	V	nicht-polar	neutral	4,2

Eine Transmembran-Domäne in einem Protein kann unter Anwendung einer Reihe von Techniken identifiziert werden, welche im Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie etwa Röntgenstrahl-Kristallographie, NMR, Genfusionstechniken, ”substituted cysteine accessibility”-Methoden, Asp(N)-verknüpfte Glykosylierungs-Experimente. Zusätzlich oder alternativ dazu können Computer-Algorithmen eingesetzt werden, um Transmembran-Domänen vorherzusagen. Beispiele derartiger Domänen sind beschrieben worden und sind bei Institutionen erhältlich, welche Bioinformatik-Dienstleistungen bereitstellen (Möller et al., 2001. Bioinformatics 17, 646). Die Verwendung von einem derartigen Algorithmus zur Vorhersage der Transmembran-Domänen in einem YTP-Polypeptid ist hierin im Abschnitt ”Beispiele” gezeigt.
DUF221-Domäne bezieht sich auf eine konservierte Aminosäuresequenz, die in manchen Proteinen von eukaryotischen Ursprung gefunden wird. DUF221-Domänen sind üblicherweise 350 bis 550 Reste lang. Beispiele von DUF221-Domänen, welche in YTP-Polypeptiden enthalten sind, die aus Arabidopsis thaliana und Oryza sativa stammen, werden durch SEQ ID NR: 518 bis SEQ ID NR: 543 repräsentiert. Eine Consensus-Sequenz, welche die Sequenz SEQ ID NR: 518 bis SEQ ID NR: 543 repräsentiert, ist in SEQ ID NR: 544 angegeben.
Ein bevorzugtes YTP-Polypeptid der Erfindung umfasst mindestens 50 zusammenhängende Aminosäuren einer DUF221-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, oder 100% Sequenzidentität zu einer beliebigen der Domänen, die von SEQ ID NR: 518 bis SEQ ID NR: 544 repräsentiert werden. Die Sequenzähnlichkeit wird vorzugsweise in einem lokalen Alignment unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Algorithmen, wie Blast, nachgewiesen.
Ein YTP-Polypeptid kann leicht durch Suchen in Spezialdatenbanken, die konservierte Proteindomänen enthalten, wie Pfam, (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34: D247–D251), identifiziert werden. Nützliche Hilfsmittel zum Durchsuchen derartiger Datenbanken sind im Fachgebiet allgemein bekannt, zum Beispiel INTERPRO (European Bioinformatics Institute, UK), welches das gleichzeitige Durchsuchen mehrerer Proteindomänen-Datenbanken gestattet.
Eine DUF221-Domäne kann durch Sequenzvergleich mit bekannten Polypeptiden, welche eine DUF221-Domäne umfassen, und Ermitteln der prozentualen Ähnlichkeit über die Region der DUF221-Domäne hinweg identifiziert werden. Die Sequenzen können unter Anwendung eines beliebigen der auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren, wie etwa den Algorithmen Blast (für örtliches Alignment) oder BestFit (für globales Alignment), aligniert werden. Die Wahrscheinlichkeit der Alignierung mit einer gegebenen Sequenz wird als Grundlage für die Identifizierung ähnlicher Polypeptide herangezogen. Ein Parameter, der typischerweise zum Darstellen einer solchen Wahrscheinlichkeit verwendet wird, wird als e-Wert bezeichnet. Der e-Wert ist ein Maß der Zuverlässigkeit der Wertung ”S”. ”S” ist ein Maß der Ähnlichkeit zwischen den zwei alignierten Sequenzen. Der e-Wert beschreibt, wie oft eine gegebene ”S”-Wertung erwartungsgemäß rein zufällig auftritt. Der e-Wert-Ausschluss kann so hoch wie 1,0 sein. Die typische Schwelle für einen zuverlässigen (echten) Treffer bzw. Übereinstimmungsfall, der eine signifikante Sequenzhomologie zur Suchsequenz zeigt und aus einer BLAST-Suche resultiert, ist geringer als 1.e–5, wobei in einigen Fällen ein noch niedrigerer Schwellenwert herangezogen wird, beispielsweise 1.e^–10, oder sogar geringer.
Vorzugsweise umfassen YTP-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, mindestens 50 zusammenhängende Aminosäuren einer DUF221-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, einem e-Wert, geringer als 1.e^–5, 1.e^–10, 1.e^–15, 1.e^–20, 1.e^–25, 1.e^–50, 1.e^–75, 1.e^–100, 1.e^-200, 1.e^-300, 1.e^–400, 1.e^–500, 1.e^–600, 1.e^–700 und 1.e^–800 in einem lokalen Alignment mit einer DUF221-Domäne, die in einem bekannten YTP-Polypeptid, wie etwa einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A, vorgefunden wird.
Es versteht sich, dass die Nukleinsäure(n) codierend ein YTP-Polypeptid gemäß der Erfindung nicht auf Sequenzen von natürlichem Ursprung eingeschränkt sind. Die Nukleinsäure kann ein ”de novo” entworfenes YTP-Polypeptid codieren.
Alternativ oder zusätzlich dazu besitzt das YTP-Protein, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Gesamt-Sequenzidentität zu der Aminosäure, die durch SEQ ID NR: 409 repräsentiert wird.
Die Gesamt-Sequenzidentität wird unter Anwendung eines globalen Alignment-Algorithmus, wie dem Needleman-Wunsch-Algorithmus im Programm GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys), vorzugsweise mit Standardparametern, bestimmt. Verglichen zur Gesamt-Sequenzidentität wird die Sequenzidentität im Allgemeinen höher sein, wenn nur konservierte Domänen oder Motive in Betracht gezogen werden.
Bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 21 abgebildet ist, lässt sich eine YTP-Polypeptidsequenz vorzugsweise eher bei der Gruppe 1, umfassend die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz, einordnen, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2.
Der Begriff ”Domäne” sowie ”Motiv” ist im Abschnitt ”Definitionen” hierin definiert. Spezialdatenbanken existieren für die Identifizierung von Domänen, wie zum Beispiel SMART (Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857–5864; Letunic et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, 242–244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315–318), Prosite (Sucher und Bairoch (1994), A generalized Profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology. Hrsg.: Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., S. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32: D134–D137, (2004)), oder Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1): 276–280 (2002). Eine Auswahl an Werkzeugen für die Analyse von Proteinsequenzen in silico ist auf dem ExPASy-Proteomics-Server (Schweizer Institut für Bioinformatik; Gasteiger et al., "ExPASy: the Proteomics server for in-depth Protein knowledge and analysis", Nucleic Acids Res. 31: 3784–3788(2003)) verfügbar.
Die Analyse der Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 wird nachstehend in den Beispielen 2 und 4 hierin dargestellt. Beispielsweise umfasst ein GRF-Polypeptid, wie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert, eine QLQ-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014978 (PFAM Zugangsnummer PF08880) und eine WRC-Domäne mit einer Inter-Pro-Zugangsnummer IPR014977 (PFAM Zugangsnummer PF08879) in der InterPro-Domänen-Datenbank. Domänen können auch unter Anwendung von Routinetechniken identifiziert werden, wie durch Sequenz-Alignment. Ein Alignment der QLQ-Domäne der Polypeptide von Tabelle A hierin ist in 2 gezeigt, und ein Alignment der WRC-Domäne der Polypeptide von Tabelle A hierin ist in 3 gezeigt. Derartige Alignierungen sind nützlich zum Identifizieren der am stärksten konservierten Aminosäuren zwischen den GRF-Polypeptiden, wie etwa den QLQ- und WRC-Aminosäureresten.
Verfahren für das Alignieren von Sequenzen zum Vergleich sind im Fachgebiet allgemein bekannt, wobei GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA zu solchen Verfahren zählen. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453) zur Ermittlung des globalen (d. h. die vollständigen Sequenzen überspannenden) Alignments von zwei Sequenzen, welcher die Anzahl von Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Lücken minimiert. Der BLAST-Algorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10) berechnet die prozentuale Sequenzidentität und führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen den zwei Sequenzen durch. Die Software zum Ausführen der BLAST-Analyse ist über das National Centre for Biotechnology Information (NCBI) öffentlich verfügbar. Homologe können leicht identifiziert werden, indem beispielsweise der ClustalW-Multiple-Sequenz-Alignment-Algorithmus (Version 1.83) mit den vorgegebenen paarweisen Alignmentparametern und einer Wertungsmethode in Prozent angewandt wird. Die globalen Prozentwerte der Ähnlichkeit und Identität können auch unter Anwendung eines der Verfahren ermittelt werden, die im MatGAT-Software-Paket (Campanella et al., (2003) BMC Bioinformatics, 10: 29. MatGAT an application that generstes similarity/identity matrices using Protein or DNA sequences.) verfügbar sind. Zur Optimierung des Alignments zwischen konservierten Motiven kann eine geringfügige Editierung von Hand ausgeführt werden, wie es dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein wird. Darüber hinaus können, anstatt der Verwendung von Volllängen-Sequenzen zur Identifizierung von Homologen, auch spezifische Domänen verwendet werden. Die Sequenzidentitätswerte können über die gesamte Nukleinsäuresequenz oder Polypeptidsequenz hinweg oder über ausgewählte Domänen oder konservierte Motiv(e) hinweg bestimmt werden, wobei die oben erwähnten Programme unter Verwendung der Standardparameter verwendet werden.
Für lokale Alignments ist der Smith-Waterman-Algorithmus besonders nützlich (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195–7).
Außerhalb der QLQ-Domäne und der WRC-Domäne weisen die GRF-Polypeptide angeblich eine geringe Aminosäure-Sequenzidentität auf. Das Beispiel 3 beschreibt hierin in Tabelle B die prozentuale Identität zwischen dem GRF-Polypeptid, wie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert, und den in Tabelle A aufgeführten GRF-Polypeptiden, welche so gering wie 15% Aminosäure-Sequenzidentität sein kann. Der Prozentsatz der Identität kann erheblich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der QLQ-Domäne SEQ ID NR: 2 (wie durch SEQ ID NR: 115 repräsentiert, die in SEQ ID NR: 2 enthalten ist; QLQ-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A, wiedergegeben in 2) und den QLQ-Domänen der in der Durchführung der Erfindung nützlichen Polypeptide ausgeführt wird. In ähnlicher Weise kann der Prozentsatz der Identität erheblich gesteigert werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der WRC-Domäne SEQ ID NR: 2 (wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 116, enthalten in SEQ ID NR: 2; WRC-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A, wiedergegeben in 3) und den WRC-Domänen der in der Durchführung der Erfindung nützlichen Polypeptide ausgeführt wird. Der Prozentsatz der Identität über die QLQ-Domäne hinweg liegt, unter den bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlichen Polypeptidsequenzen, im Bereich zwischen 25% und 99% Aminosäure-Identität, und der Prozentsatz der Identität über die WRC-Domäne hinweg liegt, unter den bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlichen Polypeptidsequenzen, im Bereich zwischen 60% und 99% Aminosäure-Identität. Wie ebenfalls in der 3 beobachtet werden kann, ist die WRC-Domäne unter den verschiedenen GRF-Polypeptiden besser konserviert als die QLQ-Domäne, wie es in der 2 gezeigt wird.
Die Aufgabe der Vorhersage der subzellulären Lokalisierung eines Proteins ist wichtig und gut untersucht. Die Kenntnis der Lokalisierung eines Proteins hilft dabei, seine Funktion aufzuklären. Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisation bis zum Tagging von Proteinen unter Einsatz von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder beta-Glucoronidase (GUS). Derartige Verfahren sind exakt, wenngleich arbeitsintensiv im Vergleich zu computergestützten Verfahren. Kürzlich sind große Fortschritte bei der computergestützten Vorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten gemacht worden. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Swiss Institute for Bioinformatics (Schweizer Institut für Bioinformatik) bereitgestellt werden, zum Beispiel PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale und andere verfügbar.
Ferner weisen die, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen, GRF-Polypeptide (wenigstens in ihrer nativen Form) typischerweise, aber nicht notwendigerweise, eine transkriptionale regulatorische Aktivität und die Fähigkeit zum Interagieren mit anderen Proteinen auf. Deshalb können GRF-Polypeptide mit verringerter transkriptioneller regulatorischer Aktivtät, ohne transkriptionelle regulatorische Aktivität, mit verringerter Protein-Protein-Wechselwirkungs-Fähigkeit oder mit überhaupt keiner Protein-Protein-Wechselwirkungs-Fähigkeit gleichermaßen in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sein. DNA-Bindungs-Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo mit Hilfe von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken bestimmt werden (zum Beispiel in Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994) Current Protocols,). GRF-Polypeptide sind zur transkriptionellen Aktivierung von Reportergenen in Hefezellen befähigt (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101(36): 13374–13379). GRF-Polypeptide sind außerdem zum Wechselwirken mit GRF-interacting-factor-Polypeptiden (GIF1 bis GIF3; ebenfalls bezeichnet als Synovial-Sarkom-Translokation(SYT)-Polypeptide, SYT1 bis SYT3) in vivo in Hefezellen befähigt, wobei ein Hefe-Zwei-Hybrid-Protein-Protein-Interaktions-Assay (Kim & Kende, siehe oben) zur Anwendung kommt. Auch In-vitro-Bindungs-Assays werden angewandt, um zu zeigen, dass GRF-Polypeptide und GIF(ebenfalls bezeichnet als SYT)-Polypeptide wechselwirkende Partner sind (Kim & Kende, siehe oben).
Die vorliegende Erfindung wird in einer Ausführungsform durch Transformieren von Pflanzen mit der durch die SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die GRF-Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 2 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert, in vorteilhafter Weise durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird in einer Ausführungsform durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 120 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 121 codiert, veranschaulicht. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung einer beliebigen ”RAA1-like” codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen RAA1-ähnlichen Polypeptids, wie hierin definiert, in vorteilhafter Weise ausgeführt werden.
Darüber hinaus ergeben RAA-1-ähnliche Polypeptide, bei Expression in Reis gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen dargestellt, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem Wurzel/Spross-Index, erhöhter Blütenzahl pro Rispe und erhöhtem Tausendkerngewicht.
Transmembran-Domänen sind etwa 15 bis 30 Aminosäuren lang und in der Regel aus hydrophoben Resten aufgebaut, welche eine Alpha-Helix bilden. Sie werden üblicherweise auf der Grundlage der Hydrophobizität vorhergesagt (zum Beispiel Klein et al., Biochim. Biophys. Acta 815, 468, 1985; oder Sonnhammer et al., in: J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff und C. Sensen, Herausgeber, "Proceedings of the Sixth International Conference an Intelligent Systems for Molecular Biology", Seiten 175–182, Menlo Park, CA, 1998. AAAI Press.).
Beispiele von Proteinen, welche von der Definition von ”SYR-Polypeptid oder ein Homolog davon” abgedeckt sind, werden in der Tabelle A des Beispielabschnitts angegeben und beinhalten Sequenzen aus verschiedenen monocotyledonen Pflanzen, wie Reis (SEQ ID NR: 169, SEQ ID NR: 179 und SEQ ID NR: 180), Mais (SEQ ID NR: 181), Weizen (SEQ ID NR: 182), Gerste (SEQ ID NR: 183), Zuckerrohr (SEQ ID NR: 184 und SEQ ID NR: 185), Sorghum (SEQ ID NR: 186); sowie aus dicotyletonen Pflanzen, wie Arabidopsis (SEQ ID NR: 187 und SEQ ID NR: 188), Weintraube (SEQ ID NR: 189), Citrus (SEQ ID NR: 190) oder Tomate (SEQ ID NR: 191 und SEQ ID NR: 192). Es wird in Betracht gezogen, dass die Leu-reiche Domäne wichtig für die Funktion des Proteins ist, weswegen Proteine mit der Leu-reichen Domäne, aber ohne die konservierten Motive 5 oder 6 ebenfalls in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sein können; Beispiele derartiger Proteine sind in SEQ ID NR: 201 und 202 angegeben.
Es versteht sich, dass der Begriff ”SYR-Polypeptid oder ein Homolog davon” nicht auf die Sequenz, die durch SEQ ID NR. 169 repräsentiert ist, oder die Homologe, die als SEQ ID NR: 170 bis SEQ ID NR: 192 aufgelistet sind, beschränkt ist, sondern dass ein beliebiges Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, welches die Kriterien erfüllt, dass es eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, aufweist, der das konservierte Tripeptid-Motiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und der das konservierte Motiv 6 und vorzugsweise auch das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder welches mindestens 38% Sequenzidentität zur Sequenz von SEQ ID NR: 169 aufweist, zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung geeignet sein kann.
Die Aktivität eines SYR-Proteins oder eines Homologs davon kann durch Exprimieren des SYR-Proteins oder eines Homologs davon unter der Steuerung eines GOS2-Promotors in Oryza sativa getestet werden, was zu Pflanzen mit gesteigerter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag ohne Verzögerung in der Blütezeit, bei Kultivieren unter Bedingungen von Stickstoffmangel oder unter Dürrestressbedingungen und im Vergleich zu entsprechenden Wildtyp-Pflanzen, führt. Diese Erhöhung hinsichtlich des Samenertrags kann auf mehrere Weisen gemessen werden, zum Beispiel als eine Erhöhung des Gesamtsamengewichts, der Anzahl von gefüllten Samen, der Füllrate, des Ernteindex oder des Tausendkerngewichts.
Die vorliegende Erfindung wird in einer Ausführungsform durch Transformieren von Pflanzen mit der durch SEQ ID NR: 168 repräsentierten Nukleinsäuresequenz veranschaulicht, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 169 codiert. Allerdings ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen eingeschränkt: die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung einer beliebigen SYR-codierenden Nukleinsäure oder eines beliebigen SYR-Polypeptids, wie hierin definiert, in vorteilhafter Weise durchgeführt werden.
Ferner besitzen ARKL-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) typischerweise E3-Ubiquitin-Proteinligase-Aktivität. Hilfsmittel und Techniken zum Messen der E3-Ubiquitin-Proteinligase-Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt ( US-Patent 6737244 ; WO/2001/075145 ; Miura et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102(21): 7760–7765; Kawasaki et al. (2005) The Plant Journal 44, 258–270). Kurz gesagt, kann die E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität eines ARKL-Polypeptids geassayt werden durch Inkubieren des ARKL-Proteins mit einem E1 und E2-Proteinen und getaggtem Ubiquitin. Die ubiquitinylierten Proteine können nach SDS-PAGE-Elektrophrese und Blotten unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Tag des Ubiquitins nachgewiesen werden. Beispiele von E1- und E2-Proteinen, die im Assay nützlich sein können, sind das Weizen-E1- und das Arabidopsis thaliana-AtUBC1-E2-Protein. Getaggtes Ubiquitin mit Histidin und Antikörper zum Nachweis desselben sind kommerziell erhältlich (Calbiochem, San Diego, CA, USA).
Darüber hinaus ergeben ARKL-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie dargestellt in den Beispielen, in Reis exprimiert werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere Tausendkerngewicht, Gesamt-Samenertrag, Früh-Wuchskraft und/oder Ernteindex.
Die vorliegende Erfindung wird, in einer Ausführungsform, durch das Transformieren von Pflanzen mit der Nukleinsäuresequenz, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212, codierend die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 213, veranschaulicht. Jedoch ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können vorteilhaft unter Verwendung einer/eines beliebigen ARKL-codierenden Nukleinsäure oder ARKL-Polypeptids, wie hierin definiert, durchgeführt werden.
Ferner besitzen YTP-Polypeptide typischerweise Aktivität zur Steigerung des Samenertrags. Hilfsmittel und Techniken zum Messen der ertragssteigernden (oder -verbessernden) Aktivität sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Weitere Einzelheiten sind hierin im Abschnitt ”Beispiele” angegeben.
Darüber hinaus ergeben YTP-Polypeptide, wenn sie gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie in den Beispielen 10 bis 15 dargestellt, in Reis exprimiert und phänotypisch ausgewertet werden, Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere einem oder mehreren von Gesamt-Samengewicht, Tausendkerngewicht, Zahl der Blüten pro Rispe, Samen-Füllrate und Ernteindex.
Die vorliegende Erfindung wird, in einer Ausführungsform, durch das Transformieren von Pflanzen mit der durch die SEQ ID NR: 408 repräsentierten Nukleinsäuresequenz, welche die Polypeptidsequenz von SEQ ID NR: 409 codiert, veranschaulicht. Jedoch ist die Ausführung der Erfindung nicht auf diese Sequenzen beschränkt; die Verfahren der Erfindung können unter Verwendung einer/eines beliebigen YTP-codierenden Nukleinsäure oder YTP-Polypeptids, wie hierin definiert, vorteilhaft durchgeführt werden.
Beispiele von Nukleinsäuresequenzen, welche Polypeptide der Erfindung codieren, sind in der Tabelle A von Beispiel 1 hierin angegeben, insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
GRF-Polypeptide, wie angegeben in Tabelle A1,
RAA1-ähnliche Polypeptide, wie angegeben in Tabelle A2,
SYR-Polypeptide, wie angegeben in Tabelle A3,
ARKL-Polypeptide, wie angegeben in Tabelle A4, bzw.
YTP-Polypeptide, wie angegeben in Tabelle A5.
Derartige Nukleinsäuresequenzen sind bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen sind Beispielsequenzen von Orthologen und Paralogen des Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP, repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, 121, 169, 213 bzw. 409, wobei die Begriffe ”Orthologe” und ”Paraloge” wie hierin definiert gemeint sind. Weitere Orthologe und Paraloge können leicht durch Ausführen einer sogenannten reziproken Blast-Suche identifiziert werden. Typischerweise beinhaltet dies einen ersten BLAST, der das BLASTen einer Suchsequenz (zum Beispiel unter Verwendung einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 aufgeführten Sequenzen) gegen eine beliebige Sequenzdatenbank, wie der öffentlich verfügbaren NCBI-Datenbank, mit sich bringt. BLASTN oder TBLASTX (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte) werden im Allgemeinen angewandt, wenn von einer Nukleotidsequenz aus begonnen wird, und BLASTP oder TBLASTN (unter Verwendung standardmäßiger Vorgabewerte), wenn von einer Proteinsequenz aus begonnen wird. Die BLAST-Ergebnisse können gegebenenfalls gefiltert werden. Die Volllängensequenzen entweder der gefilterten Ergebnisse oder nicht-gefilterten Ergebnisse werden dann zurück geBLASTet (zweiter BLAST) gegen Sequenzen aus dem Organismus, aus dem die Suchsequenz abgeleitet ist (falls die Suchsequenz SEQ ID NR: 1, 120, 168, 212 bzw. 408 oder SEQ ID NR: 2, 121, 169, 213 bzw. 409 ist, erfolgt der zweite BLAST daher gegen Arabidopsis thaliana-Sequenzen). Die Ergebnisse der ersten und zweiten BLASTs werden dann verglichen. Ein Paralog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer bzw. ”hit” aus dem ersten Blast aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, wobei ein zurückgerichteter BLAST danach idealerweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt; ein Ortholog wird identifiziert, wenn ein hoch-eingestufter Übereinstimmungstreffer im ersten BLAST nicht aus derselben Spezies stammt, wie jene, aus der die Suchsequenz abgeleitet ist, und bei zurückgerichtetem BLAST vorzugsweise dazu führt, dass die Suchsequenz zu den höchsten Übereinstimmungstreffern zählt.
Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A”, ist als den Inhalt von Tabelle A1, A2, A3, A4 und/oder A5 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A1” ist als den Inhalt von Tabelle A1 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A2” ist als den Inhalt von Tabelle A2 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A3” ist als den Inhalt von Tabelle A3 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A4” ist als den Inhalt von Tabelle A4 angebend aufzufassen. Der in dieser Beschreibung verwendete Begriff ”Tabelle A5” ist als den Inhalt von Tabelle A5 angebend aufzufassen. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A1. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A2. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A3. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A4. In einer bevorzugten Ausführungsform, bedeutet der Begriff ”Tabelle A” die Tabelle A5.
Hoch-eingestufte Treffer bzw. Übereinstimmungen sind diejenigen mit einem niedrigen E-Wert. Je niedriger der E-Wert, umso signifikanter die Wertung (oder in anderen Worten, umso niedriger die Wahrscheinlichkeit, dass der Treffer durch Zufall gefunden wurde). Die Berechnung des E-Werts ist im Fachgebiet allgemein bekannt. Zusätzlich zu E-Werten, werden Vergleiche auch durch den Prozentsatz der Identität bewertet. Der Prozentsatz der Identität bezieht sich auf die Zahl an identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei über eine bestimmte Länge hinweg verglichenen Nukleinsäuresequenzen (oder Polypeptidsequenzen). Im Fall von großen Familien kann ClustalW eingesetzt werden, gefolgt von einem Nachbarkopplungs- bzw. Neighbour-joining-Baum, um bei der Visualisierung der Einordnung bzw. Clusterung verwandter Gene zu helfen und Orthologe und Paraloge zu identifizieren.
Auch Nukleinsäurevarianten können bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sein. Zu Beispielen solcher Varianten zählen Nukleinsäuresequenzen, die Homologe und Derivate von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codieren, wobei die Begriffe ”Homolog” und ”Derivat” beschaffen sind, wie es hierin definiert ist. Außerdem sind Nukleinsäuresequenzen in den Verfahren der Erfindung nützlich, welche Homologe und Derivate von Orthologen oder Paralogen von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codieren. Homologe und Derivate, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, besitzen im Wesentlichen die gleiche biologische und funktionelle Aktivität wie das unmodifizierte Protein, aus dem sie abgeleitet sind.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein bevorzugtes, in den Verfahren der Erfindung nützliches Derivat ein ARKL-Polypeptid, wobei ein Cysteinrest an der Position von Ligand 5 (siehe 15) in der RING-Finger-Domäne eines der Zinkionen koordiniert. Ein anderes, in den Verfahren der Erfindung nützliches, bevorzugtes Derivat ist ein ARKL-Polypeptid, das sieben Cysteine und ein Histidin (ZfC3HC4) als Reste an den Zinkion-Ligandpositionen aufweist.
Zu weiteren Nukleinsäurevarianten, die bei der Ausübung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, zählen Abschnitte von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, Nukleinsäuresequenzen, die hybridisieren an Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, Splice-Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, allelische Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, sowie Varianten von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, welche durch Gen-Shuffling erhalten werden. Die Begriffe hybridisierende Sequenz, Splice-Variante, allelische Variante und Gen-Shuffling sind wie hierin beschrieben beschaffen.
Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptiden, RAA1-ähnlichen Polypeptiden, SYR-Polypeptiden, ARKL-Polypeptiden bzw. YTP-Polypeptiden, müssen nicht Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge sein, da die Ausführung der Verfahren der Erfindung nicht auf die Verwenden von Nukleinsäuresequenzen mit Volllänge angewiesen ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einem Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einem Abschnitt von einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert.
Ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz kann zum Beispiel durch Vornehmen einer oder mehrerer Deletionen an der Nukleinsäuresequenz hergestellt werden. Die Abschnitte können in isolierter Form verwendet werden oder sie können an andere codierende (oder nicht-codierende) Sequenzen fusioniert sein, um zum Beispiel ein Protein zu erzeugen, das mehrere Aktivitäten vereint. Sofern es an andere codierende Sequenzen fusioniert ist, kann das resultierende Polypeptid, das nach Translation produziert wird, größer sein als jenes, das für den Proteinabschnitt vorhergesagt wird.
Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren, in einer Ausführungsform, ein GRF-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in der Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, eine Länge von mindestens 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1190 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A1 von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt einer Nukleinsequenz, die eine Polypeptidsequenz codiert, wobei das Polypeptid umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 115 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 116 repräsentiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt von der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1.
Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren, in einer Ausführungsform, ein RAA1-ähnliches Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in der Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A2 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 120. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, welche(s) sich, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe einordnen lässt.
Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren, in einer Ausführungsform, ein SYR-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise Weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 aufeinander folgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A3 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 168. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, welches eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, umfasst, der das konservierte Tripeptidmotiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und der das konservierte Motiv 6 und vorzugsweise auch das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder welches mindestens 38% Sequenzidentität zur Sequenz von SEQ ID NR: 169 aufweist.
Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren, in einer Ausführungsform, ein ARKL-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A4 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 212. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, welche sich, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von ARKL-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 213 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe, wie etwa jener, die durch die Musmu_Goliath-Sequenz repräsentiert wird, einordnen lässt.
Abschnitte, die in den Verfahren der Erfindung nützlich sind, codieren, in einer Ausführungsform, ein YTP-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen auf. Vorzugsweise ist der Abschnitt ein Abschnitt von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuren, oder ist ein Abschnitt von einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Vorzugsweise weist der Abschnitt eine Länge von mindestens 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000 aufeinanderfolgenden Nukleotiden auf, wobei die aufeinanderfolgenden Nukleotide aus einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen sind, oder aus einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A5 von Beispiel 1 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Am stärksten bevorzugt ist der Abschnitt ein Abschnitt der Nukleinsäure von SEQ ID NR: 408. Vorzugsweise codiert der Abschnitt ein Fragment einer Aminosäuresequenz, welche(s) sich, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 21 dargestellt ist, eher bei der Gruppe 1, umfassend die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2 einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Nukleinsäuresequenz, die unter Bedingungen verringerter Stringenz, vorzugsweise unter stingenten Bedingungen, zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin definiert, oder mit einem Abschnitt, wie hierin definiert, in der Lage ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen in der Lage ist, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz, die zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen codiert.
In den Verfahren der Erfindung nützliche hybridisierende Sequenzen codieren ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin definiert, und weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie die in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen auf. Vorzugsweise ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder einen Abschnitt von einer beliebigen dieser Sequenzen, in der Lage, wobei ein Abschnitt wie oben definiert beschaffen ist, oder wobei die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren an eine Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, die ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert. In einer Ausführungsform ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz in der Lage, die eine Polypeptidsequenz codiert, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 115 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 116 repräsentiert. Am stärksten bevorzugt ist die hybridisierende Sequenz zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäuresequenz, wie durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert, oder einem Abschnitt derselben, in der Lage.
In einer Ausführungsform ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren an eine Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 120, oder einen Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, sofern in Volllänge und in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe einordnen lässt.
In einer Ausführungsform ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 168, oder einem Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, umfassend eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, der das konservierte Tripeptidmotiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und der das konservierte Motiv 6 und bevorzugt auch das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder aufweisend mindestens 38% Sequenzidentität zur Sequenz von SEQ ID NR: 169.
In einer Ausführungsform ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 212, oder einem Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche(s) sich, sofern in Volllänge und in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von ARKL-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 213 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe, wie etwa jener, repräsentiert durch die Musmu_Goliath-Sequenz, einordnen lässt.
In einer Ausführungsform ist die hybridisierende Sequenz vorzugsweise zum Hybridisieren mit einer Nukleinsäure, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 408, oder einem Abschnitt davon, in der Lage.
Vorzugsweise codiert die hybridisierende Sequenz ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich, sofern in Volllänge und in der Erstellung eines phylogenetischen Baums verwendet, wie demjenigen, der in 21 dargestellt ist, eher bei der Gruppe 1, umfassend die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2 einordnen lässt.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in den Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine Splice-Variante, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin obenstehend definiert, wobei eine Splice-Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Splice-Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder von einer Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert.
Bevorzugte Splice-Varianten sind in einer Ausführungsform Splice-Varianten einer von SEQ ID NR: 1 repräsentierten Nukleinsäuresequenz oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise ist die Splice-Variante eine Splice-Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend eine Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 115; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 116.
Bevorzugte Splice-Varianten sind in einer Ausführungsform Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 120, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 121 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe einordnen.
Bevorzugte Splice-Varianten sind in einer Ausführungsform Splice-Varianten einer Nukleinsäure, die durch SEQ ID NR: 168 repräsentiert wird, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 169 codiert. Vorzugsweise ist die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, umfassend eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, der das konservierte Tripeptidmotiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und der das konservierte Motiv 6 und vorzugsweise auch das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder aufweisend mindestens 38% Sequenzidentität zur Sequenz von SEQ ID NR: 169.
Bevorzugte Splice-Varianten sind in einer Ausführungsform Splice-Varianten einer Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212, oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 213 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von ARKL-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 213 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe, wie etwa jener, die durch die Musmu_Goliath-Sequenz repräsentiert wird, einordnen.
Bevorzugte Splice-Varianten sind in einer Ausführungsform Splice-Varianten einer durch SEQ ID NR: 408 repräsentierten Nukleinsäure oder eine Splice-Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 409 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der Splice-Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 21 dargestellt ist, eher bei der Gruppe 1, umfassend die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2 einordnen.
Eine andere Nukleinsäuresequenzvariante, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich ist, ist eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin oben definiert, wobei eine allelische Variante wie hierin definiert beschaffen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer allelischen Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert.
Die allelischen Varianten, die in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das GRF-Polypeptid von SEQ ID NR: 2 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Polypeptidsequenzen auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 1 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 2 codiert. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von einer Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einer QLQ Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 115 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 116 repräsentiert.
Die allelischen Varianten, die in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das RAA1-ähnliche Polypeptid von SEQ ID NR: 121 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 120 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 121 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 dargestellt ist, eher bei den RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID Nr: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe einordnen.
Die allelischen Varianten, die in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das SYR-Polypeptid von SEQ ID NR: 169 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 168 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 169 codiert. Vorzugsweise ist die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, welches eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, umfasst, der das konservierte Tripeptidmotiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und der das konservierte Motiv 6 und vorzugsweise auch das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder welches mindestens 38% Sequenzidentität zur Sequenz von SEQ ID NR: 169 aufweist.
Die allelischen Varianten, die in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das ARKL-Polypeptid von SEQ ID NR: 213 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 212 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 213 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 dargestellt ist, eher bei der Gruppe von ARKL-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 213 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei irgendeiner anderen Gruppe, wie etwa jener, die durch die Musmu_Goliath-Sequenz repräsentiert wird, einordnen.
Die allelischen Varianten, die in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nützlich sind, weisen im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das YTP-Polypeptid von SEQ ID NR: 409 und eine beliebige der in Tabelle A von Beispiel 1 abgebildeten Aminosäuren auf. Allelische Varianten existieren in der Natur, und so ist die Verwendung dieser natürlichen Allele innerhalb der Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Vorzugsweise ist die allelische Variante eine allelische Variante von SEQ ID NR: 408 oder eine allelische Variante einer Nukleinsäure, die ein Ortholog oder Paralog von SEQ ID NR: 409 codiert. Vorzugsweise lässt sich die von der allelischen Variante codierte Aminosäuresequenz, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 21 dargestellt ist, eher bei der Gruppe 1, welche die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz umfasst, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2 einordnen.
Gen-Shuffling oder gerichtete Evolution können ebenfalls verwendet werden, um Varianten von Nukleinsäuresequenzen zu erzeugen, welche ein Polypeptid codieren, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptiden, wie oben definiert, wobei der Begriff ”Gen-Shuffling” wie hierin definiert ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften bereitgestellt, umfassend das Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Nukleinsäuresequenzen, oder umfassend das Einbringen und Expemieren, in einer Pflanze, von einer Variante einer Nukleinsäuresequenz, die ein Ortholog, Paralog oder Homolog von einer beliebigen der in Tabelle A von Beispiel 1 angegebenen Polypeptidsequenzen codiert, wobei die Varianten-Nukleinsäuresequenz durch Gen-Shuffling erhalten wird.
In einer Ausführungsform codiert die durch Gen-Shuffling erhaltene Varianten-Nukleinsäuresequenz vorzugsweise eine Polypeptidsequenz, umfassend: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einer QLQ-Domäne, wie durch SEQ ID NR: 115 repräsentiert; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenz-Identität zu einer WRC-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 116 repräsentiert.
In einer Ausführungsform lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 8 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von RAA1-ähnlichen Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 121 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe einordnen.
In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz, codiert von der Varianten-Nukleinsäure, welche durch Gen-Shuffling erhalten wird, vorzugsweise ein Polypeptid von etwa 65 bis etwa 200 Aminosäuren, welches eine Leucin-reiche Domäne, wie oben definiert, umfasst, der das konservierte Tripeptid-Motiv 5 (a, b, c oder d) vorangeht und das konservierte Motiv 6 und vorzugsweise ebenfalls das konservierte Motiv 7 nachfolgt; oder welches mindestens 38% Sequenzidentität zu der Sequenz von SEQ ID NR: 169 aufweist.
In einer Ausführungsform lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 17 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe von ARKL-Polypeptiden, umfassend die durch SEQ ID NR: 213 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei einer beliebigen anderen Gruppe, wie etwa derjenigen, repräsentiert durch die PF00097Musmu_Goliath-Sequenz, einordnen.
In einer Ausführungsform lässt sich die Aminosäuresequenz, die von der durch Gen-Shuffling erhaltenen Varianten-Nukleinsäure codiert wird, bei Verwendung in der Erstellung eines phylogenetischen Baums, wie demjenigen, der in 21 abgebildet ist, vorzugsweise eher bei der Gruppe 1, umfassend die durch SEQ ID NR: 409 repräsentierte Aminosäuresequenz, als bei den YTP-Polypeptiden in Gruppe 2 einordnen.
Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenz-Varianten außerdem durch ortsgerichtete Mutagenese erhalten werden. Es sind mehrere Verfahren verfügbar, um eine ortsgerichtete Mutagenese zu bewirken, wobei die häufigsten PCR-basierende Verfahren sind (Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Eds.).
GRF-Polypeptide codierende Nukleinsäuresequenzen können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäuresequenz kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die, ein GRF-Polypeptid codierende, Nukleinsäuresequenz aus einer Pflanze, weiter bevorzugt einer dicotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana.
RAA1-ähnliche Polypeptide codierende Nukleinsäuren können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die RAA1-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monocotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
SYR-Polypeptide codierende Nukleinsäure können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die SYR-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monocotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
ARKL-Polypeptide codierende Nukleinsäure können aus einer beliebigen natürlichen oder künstlichen Quelle abgeleitet werden. Die Nukleinsäure kann von ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert werden. Vorzugsweise stammt die ARKL-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monocotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
YTP-Polypeptide codierende Nukleinsäuren können auch von einem de novo entworfenen YTP-Polypeptid, d. h. nicht abgeleitet aus einer natürlichen Quelle, codiert sein. Die Nukleinsäure kann aus ihrer nativen Form hinsichtlich Zusammensetzung und/oder genomischer Umgebung durch absichtlichen menschlichen Eingriff modifiziert sein. Vorzugsweise stammt die YTP-Polypeptid codierende Nukleinsäure aus einer Pflanze, weiter bevorzugt aus einer monocotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, und am stärksten bevorzugt stammt die Nukleinsäure aus Oryza sativa.
Die Ausführung der Verfahren der Erfindung ergibt, in einer Ausführungsform, Pflanzen mit gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften. Insbesondere ergibt die Ausführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” werden hierin ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt, in einer Ausführungsform, Pflanzen mit erhöhter Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress (oder abiotischer Stress-Toleranz, wobei die Begriffe austauschbar verwendet werden), was sich beim Anbau unter abiotischem Stress in Form gesteigerter ertragsbezogener Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen auswirkt. Insbesondere ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, speziell erhöhtem Samenertrag und einer erhöhten Biomasse im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Die Begriffe ”Ertrag” und ”Samenertrag” sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben.
Es versteht sich, dass die Bezugnahme hierin auf gesteigerte ertragsbezogene Eigenschaften eine Erhöhung der Biomasse (Gewicht) von einem oder mehreren Teilen einer Pflanze bedeutet, welche oberirdische (erntefähige) Teile und/oder (erntefähige) Teile unterhalb des Erdbodens einschließen kann.
In einer Ausführungsform sind derartige erntefähige Teile Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche einen erhöhten Samenertrag im Vergleich zum Samenertrag von Kontrollpflanzen ausweisen.
In einer Ausführungsform sind derartige erntefähige Teile Wurzeln, Blüten und/oder Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag im Verhältnis zum Samenertrag von Kontrollpflanzen aufweisen.
In einer Ausführungsform sind derartige erntefähige Teile Samen, und die Durchführung der Verfahren der Erfindung führt zu Pflanzen, welche erhöhten Ertrag, erhöhtes Gesamtsamengewicht, erhöhte Samen-Füllrate, erhöhte Anzahl an Blüten (oder Blütchen), erhöhten Ernteindex und erhöhtes Tausendkerngewicht im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen.
Wenn man Mais als ein Beispiel heranzieht, kann sich die Ertragserhöhung, unter anderem, als eines oder mehreres der folgenden manifestieren: Erhöhung der Anzahl an Pflanzen, welche pro Hektar oder Morgen aufgezogen werden, eine Erhöhung der Anzahl von Ähren pro Pflanze, eine Erhöhung der Anzahl an Ackerreihen, Anzahl der Kerne pro Reihe, des Kerngewichts, Tausendkerngewichts, der Ährenlänge/Durchmesser, Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit hundert ist). Wenn man Reis als Beispiel heranzieht, kann sich eine Ertragserhöhung als eine Erhöhung bei einem oder mehreren der folgenden manifestieren:
Anzahl an Pflanzen pro Hektar oder Morgen, Anzahl an Rispen pro Pflanze, Anzahl an Ährchen pro Rispe, Anzahl an Blüten (Blütchen) pro Rispe (welche ausgedrückt wird als ein Verhältnis der Anzahl an gefüllten Samen gegenüber der Anzahl an Hauptrispen), Erhöhung der Samen-Füllrate (welche die Anzahl an gefüllten Samen dividiert durch die Gesamtzahl an Samen und multipliziert mit hundert ist), Erhöhung des Tausendkerngewichts, und andere.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: GRF-Polypeptid und RAA1-ähnliches Polypeptid, wobei das Polypeptid jeweils wie hierin definiert ist.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung der abiotischen Stress-Resistenz von Pflanzen vor, was zu einem erhöhten Ertrag, insbesondere Samenertrag, und/oder einer erhöhten Biomasse von Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, bei Kultivieren unter Bedingungen mit abiotischem Stress, führt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, vorzugsweise das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, umfasst.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, umfasst.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags, insbesondere des Samenertrags von Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, vor, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, umfasst.
Da die die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass diese Pflanzen eine erhöhte Wachstumsrate (wenigstens während einem Teil ihres Lebenszyklus) im Vergleich zur Wachstumsrate von Kontrollpflanzen bei einem entsprechenden Stadium in ihrem Lebenszyklus auszeigen.
Neben der erhöhten Ertragskapazität kann auch eine erhöhte Effizienz der Nährstoffaufnahme zu einer Erhöhung des Ertrags beitragen. Es wird beobachtet, dass Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Effizienz bei der Nährstoffaufnahme zeigen. Eine erhöhte Effizienz der Nährstoffaufnahme gestattet ein besseres Wachstum der Pflanze, wenn die Pflanze unter Stress steht. Es wird ebenfalls beobachtet, dass die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung eine erhöhte Dürrestress-Toleranz aufweisen, was den Pflanzen gestattet, unter Bedingungen, die das Wachstum von Kontrollpflanzen verzögern oder hemmen, fortwährend zu wachsen.
Die erhöhte Wachstumsrate kann für einen oder mehrere Teile einer Pflanze (einschließlich Samen) spezifisch sein oder kann im Wesentlichen überall in der gesamten Pflanze herrschen. Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate können einen kürzeren Lebenszyklus aufweisen. Der Lebenszyklus einer Pflanze kann sich so verstehen, dass die Zeit gemeint ist, welche benötigt wird, um von einem trockenen reifen Samen bis zu dem Stadium heranzuwachsen, an welchem die Pflanze trockene reife Samen erzeugt hat, die ähnlich zum Ausgangsmaterial sind. Dieser Lebenszyklus kann von Faktoren, wie Früh-Wuchskraft, Wachstumsrate, Grünheits-Index, Blütezeit und Geschwindigkeit der Samenreifung, beeinflusst werden. Die Erhöhung der Wachstumsrate kann an einer oder mehreren Stufen im Lebenszyklus einer Pflanze oder im Wesentlichen während des gesamten Pflanzenlebenszyklus stattfinden. Eine erhöhte Wachstumsrate während der frühen Stadien im Lebenszyklus einer Pflanze kann eine erhöhte (frühe) Wuchskraft reflektieren. Die Erhöhung in der Wachstumsrate kann den Erntezyklus einer Pflanze verändern, was gestattet, dass Pflanzen später ausgesät und/oder früher abgeerntet werden, als es sonst möglich wäre (ein ähnlicher Effekt kann mit einer früheren Blütezeit erreicht werden; ein verzögertes Aufblühen ist überlicherweise bei Nutzpflanzen keine wünschenswerte Eigenschaft). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht ist, kann sie das weitere Aussäen von Samen derselben Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel Säen und Ernten von Reispflanzen, gefolgt von Säen und Ernten weiterer Reispflanzen, sämtlich innerhalb einer herkömmlichen Wachstumsperiode). Wenn die Wachstumsrate ausreichend erhöht wird, kann sie, in ähnlicher Weise, das weitere Aussäen von Samen anderer Pflanzenspezies ermöglichen (zum Beispiel das Säen und Ernten von Maispflanzen, gefolgt beispielsweise von Säen und gegebenenfalls Ernten von Sojabohne, Kartoffel oder einer beliebigen anderen geeigneten Pflanze). Im Falle mancher Nutzpflanzen kann auch das mehrmalige Abernten vom gleichen Wurzelstock möglich sein. Das Ändern des Erntezyklus einer Pflanze kann zu einer Erhöhung der jährlichen Biomasseproduktion pro Morgen bzw. Acre führen (aufgrund einer Erhöhung der Mehrmaligkeit (z. B. in einem Jahr), bei der eine beliebige jeweilige Pflanze angebaut und geerntet werden kann). Eine Erhöhung der Wachstumsrate kann auch die Kultivierung transgener Pflanzen in einem weiteren geographischen Gebiet als bei ihren Wildtyp-Gegenstücken zulassen, da die territorialen Eingrenzungen für den Anbau einer Nutzpflanze häufig von nachteiligen Umweltbedingungen entweder zur Zeit des Pflanzens (frühe Jahreszeit) oder zur Zeit des Erntens (späte Jahreszeit) bestimmt werden. Derartige nachteilige Bedingungen können vermieden werden, wenn der Erntezyklus verkürzt wird. Die Wachstumsrate kann durch Ableiten verschiedener Parameter aus Wachstumskurven ermittelt werden, wobei es sich bei derartigen Parametern, unter anderem, um T-Mid (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 50% ihrer Maximalgröße zu erreichen) und T-90 (die Zeit, welche Pflanzen benötigen, um 90% ihrer maximalen Größe zu erreichen) handeln kann.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung, ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Wachstumsrate von Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein GRF-Polypeptid oder ein RAA1-ähnliches Polypeptid oder ein YTP-Polypeptid oder ein ARKL-Polypeptid, wie hierin definiert, codiert.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung ergibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen mit einer erhöhten Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollpflanzen beim Kultivieren unter abiotischen Stressbedingungen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate von Pflanzen unter abiotischen Stressbedingungen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression, vorzugsweise das Erhöhen der Expression, in einer Pflanze, von einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, wie hierin definiert, umfasst.
Erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen herangezogen werden, treten ungeachtet dessen auf, ob die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen steht oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. Pflanzen antworten in der Regel auf eine Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von starkem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jedweder Stress, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, definiert, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Mäßiger Stress im Sinne der Erfindung führt zu einer Verringerung des Wachstums der gestressten Pflanzen von weniger als 40%, 35% oder 30%, vorzugsweise weniger als 25%, 20% oder 15%, weiter bevorzugt weniger als 14%, 13%, 12%, 11% oder 10% oder weniger, im Vergleich zur Kontrollpflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizidbehandlungen) werden starke Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als Konsequenz ist das, von mäßigem Stress induzierte, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, welchen eine Pflanze ausgesetzt ist.
Abiotische Stressformen könnten zurückzuführen sein auf Dürre oder überschüssiges Wasser, anaeroben Stress, Salzstress, chemische Toxizität, oxidativen Stress und heiße, kalte oder Frost-Temperaturen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, verursacht von einem Wasserstress (insbesondere wegen Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einem ionischen Stress. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welchen von Pathogenen wie Bakterien, Viren, Pilzen, Nematoden und Insekten hervorgerufen werden. Der Begriff ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen gestatten. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtlichkeit.
Insbesondere können die Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen einer milden Dürre ausgeführt werden, um Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen zu ergeben. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche das Pflanzenwachstum und die Produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürrestress und Stress durch hohen Salzgehalt. Beispielsweise manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung der Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre häufig begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Folge aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stressproteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulation von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Der Ausdruck ”Nicht-Stress”-Bedingungen, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Umweltbedingungen, welche ein optimales Wachstum von Pflanzen zulassen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt normale Bodenbedingungen und klimatische Bedingungen für eine gegebene Örtichkeit.
Im Vergleich zu Kontrollpflanzen findet eine Erhöhung hinsichtlich Ertrag und/oder Wachstumsrate ungeachtet dessen statt, ob die Pflanze unter Nicht-Stress-Bedingungen vorliegt oder ob die Pflanze verschiedenen Stressformen ausgesetzt ist. Pflanzen antworten typischerweise auf die Exposition an Stress, indem sie langsamer wachsen. Bei Bedingungen von schwerem Stress kann die Pflanze das Wachstum sogar vollständig einstellen. Mäßiger Stress ist demgegenüber hierin als jedweder Stress, dem eine Pflanze ausgesetzt ist, definiert, der nicht dazu führt, dass die Pflanze das Wachstum vollständig, ohne Fähigkeit zur Wiederaufnahme des Wachstums, einstellt. Auf Grund der Fortschritte in den landwirtschaftlichen Praktiken (Bewässerungs-, Düngungs-, Pestizid-Behandlungen) werden schwere Stressformen bei kultivierten Nutzpflanzen nicht häufig angetroffen. Als Konsequenz ist das von dem mäßigen Stress ausgelöste, beeinträchtigte Wachstum häufig ein unerwünschtes Merkmal für die Landwirtschaft. Mäßige Stressformen sind die alltäglichen biotischen und/oder abiotischen (umweltbedingten) Stressformen, denen eine Pflanze ausgesetzt ist. Abiotische Stressformen können auf Dürre oder überschüssigem Wasser, anaerobem Stress, Salzstress, chemischer Toxizität, oxidativem Stress und heißen, kalten oder Frost-Temperaturen beruhen. Der abiotische Stress kann ein osmotischer Stress sein, verursacht durch einen Wasser-Stress (insbesondere auf Grund von Dürre), Salzstress, oxidativen Stress oder einen ionischen Stress. Biotische Stressformen sind typischerweise diejenigen Stressarten, welche von Pathogenen, wie Bakterien, Viren, Pilzen und Insekten verursacht werden.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt in einer Ausführungsform Pflanzen, kultiviert unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter Bedingungen von mäßigem Stress, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in, unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter mäßigen Stressbedingungen kultivierten Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führt dazu, dass Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die unter vergleichbaren Stressbedingungen kultiviert wurden. Wie in Wang et al. (Planta (2003) 218: 1–14) berichtet, führt abiotischer Stress zu einer Reihe von morphologischen, physiologischen, biochemischen und molekularen Veränderungen, welche Pflanzenwachstum und -produktivität nachteilig beeinflussen. Dürre, Salzgehalt, extreme Temperaturen und oxidativer Stress sind bekanntermaßen miteinander verbunden und können Wachstums- und Zellschaden durch ähnliche Mechanismen herbeiführen. Rabbani et al. (Plant Physiol. (2003) 133: 1755–1767) beschreibt ein besonders hohes Ausmaß an ”Wechselverbindung” zwischen Dürre-Stress und Stress durch hohen Salzgehalt. Zum Beispiel manifestieren sich Dürre und/oder Versalzung hauptsächlich als osmotischer Stress, was zur Zerstörung von Homeostase und Ionenverteilung in der Zelle führt. Oxidativer Stress, welcher Stress durch hohe oder niedrige Temperatur, Salzgehalt oder Dürre oft begleitet, kann die Denaturierung von funktionellen und strukturellen Proteinen verursachen. Als Konsequenz aktivieren diese verschiedenartigen umweltbedingten Stressformen häufig ähnliche Zell-Signalwege und zelluläre Antworten, wie etwa die Produktion von Stress-Proteinen, die Heraufregulierung von Antioxidantien, die Akkumulierung von kompatiblen gelösten Stoffen und einen Wachstumsstillstand. Da verschiedenartige umweltbedingte Stressformen ähnliche Wege aktivieren, sollte die beispielhafte Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung mit Dürrestress nicht als eine Einschränkung auf Dürrestress sondern eher als eine Sichtweise angesehen werden, um die Beteiligung von GRF-Polypeptiden, wie oben definiert, an der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufzuzeigen, welche bei vergleichbaren Stressbedingungen, im Allgemeinen unter abiotischen Stressformen, kultiviert werden.
Der Begriff ”abiotischer Stress”, wie hierin definiert, wird verwendet, um ein beliebiges oder mehrere von Folgendem zu bedeuten: Wasserstress (auf Grund von Dürre oder überschüssigem Wasser), anaeroben Stress, Salzstress, Temperaturstress (auf Grund von heißen, kalten oder frostbedingenden Temperaturen), Stress durch chemische Toxizität und oxidativer Stress. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, ausgewählt aus Wasserstress, Salzstress, oxidativem Stress und ionischem Stress. Vorzugsweise ist der Wasserstress ein Dürrestress. Der Begriff ”Salz-Stress” ist nicht auf gewöhnliches Salz (NaCl) eingeschränkt, sondern es kann sich um einen beliebigen Stress handeln, der von einem oder mehreren von, unter anderem NaCl, KCl, LiCl, MgCl₂, CaCl₂ verursacht wird.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften unter abiotischen Stressbedingungen im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, die bei vergleichbaren Stressbedingungen kultiviert werden. Deshalb wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der abiotische Stress ein osmotischer Stress, der aus einem oder mehreren der folgenden ausgewählt ist: Wasser-Stress, Salz-Stress, oxidativer Stress und ionischer Stress.
Ein weiteres Beispiel für abiotischen Umweltstress ist die verringerte Verfügbarkeit von einem oder mehreren Nährstoffen, welche von den Pflanzen für das Wachstum und die Entwicklung assimiliert werden müssen. Wegen des starken Einflusses der Nährstoffverwertungseffizienz auf den Pflanzenertrag und die Produktqualität wird eine gewaltige Menge an Düngemitteln über Feldern verteilt, um Pflanzenwachstum und -qualität zu optimieren. Die Produktivität von Pflanzen wird gewöhnlicherweise von drei Hauptnährstoffen limitiert, nämlich Phosphor, Kalium und Stickstoff, der, unter diesen dreien, gewöhnlich das geschwindigkeitslimitierende Element beim Pflanzenwachstum ist. Deshalb ist das für Pflanzenwachstum erforderliche, hauptsächliche Nährstoff-Element der Stickstoff (N). Er ist ein Bestandteil von zahlreichen wichtigen Verbindungen, welche in lebenden Zellen angetroffen werden, einschließlich Aminosäuren, Proteinen (Enzymen), Nukleinsäuren und Cholorphyll. Stickstoff macht 1,5% bis 2% der Pflanzen-Trockensubstanz und ungefähr 16% des gesamten Pflanzenproteins aus. Somit ist die Stickstoffverfügbarkeit ein hauptsächlicher limitierender Faktor für Nutzpflanzenwachstum und -produktion (Frink et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(4): 1175–1180) und besitzt außerdem einen größeren Einfluss auf die Proteinakkumulation und Aminosäurezusammensetzung. Daher sind Nutzpflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften bei Kultivierung unter Stickstoff-limitierenden Bedingungen von großem Interesse.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung ergibt Pflanzen, welche bei Kultivierung unter Bedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, insbesondere unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit, erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, welche unter Bedingungen von verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise von verringerter Stickstoffverfügbarkeit, kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Die verringerte Nährstoffverfügbarkeit kann aus einem Mangel oder Überschuss an Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphate und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren. Vorzugsweise handelt es sich bei der verringerten Nährstoffverfügbarkeit um eine verringerte Stickstoffverfügbarkeit.
In einer Ausführungsform gibt die Durchführung der Verfahren der Erfindung Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, die unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt, in einer Ausführungsform, Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten oder anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, die unter abiotischen Stressbedingungen, wie etwa mäßigen bis starken Dürrebedingungen, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in unter abiotischen Stressbedingungen, wie etwa milden bis schweren Dürrebedingungen, kultivierten Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Der Begriff ”starke Dürrebedingungen” oder ”schwerer Dürrestress”, wie hierin verwendet, bezeichnet diejenigen Dürrebedingungen, welche eine Ertragsverringerung von 50% oder mehr in den Kontrollpflanzen verursachen, verglichen mit dem Ertrag der unter Nicht-Stress-Bedingungen kultivierten Kontrollpflanzen.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt, in einer Ausführungsform, Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in, unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultivierten, Pflanzen bereitgestellt, wobei das Verfahren das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt, in einer Ausführungsform, Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann aus einem Fehlen von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und anderen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, welche unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vertrag zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung des Ertrags in Pflanzen, welchen unter Nicht-Stress-Bedingungen oder unter milden Dürre-Bedingungen kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
Die Durchführung der Verfahren der Erfindung gibt Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel, insbesondere unter Bedingungen von Stickstoffmangel, kultiviert werden, einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welche unter vergleichbaren Bedingungen kultiviert werden. Deshalb wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrags in Pflanzen, welche unter Bedingungen von Nährstoffmangel kultiviert werden, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Modulieren der Expression einer Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst. Nährstoffmangel kann aus einem Mangel von Nährstoffen, wie unter anderem Stickstoff, Phosphaten und sonstigen phosphorhaltigen Verbindungen, Kalium, Calcium, Cadmium, Magnesium, Mangan, Eisen und Bor, resultieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst Pflanzen oder Teile davon (einschließlich Samen) oder Zellen davon, die durch die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlich sind. Die Pflanzen oder Teile davon oder Zellen davon umfassen ein Nukleinsäuretransgen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie oben definiert.
Die Erfindung sieht außerdem genetische Konstrukte und Vektoren zum Erleichtern des Einbringens und/oder der erhöhten Expression von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzen vor, welche ein Polypeptid codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid. Die Genkonstrukte können in Vektoren inseriert werden, welche kommerziell erhältlich sein können, die für das Transformieren des Gens von Interesse in Pflanzen hinein und für die Expression desselben in den transformierten Zellen geeignet sind. Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines Genkonstrukts, wie hierin definiert, in den Verfahren der Erfindung vor.
Im Genaueren sieht die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Konstrukt vor, umfassend:

(a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein GRF-Polypeptid, wie oben definiert;
(b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Erhöhen der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(c) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, welche ein GRF-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Vorzugsweise ist eine der Steuerungssequenzen eines Konstruktes ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert ist. Ein Beispiel eines konstitutiven Pflanzenpromotors ist ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein Reis-GOS2-Promotor, weiter bevorzugt ein GOS2-Promotor, wie durch SEQ ID NR: 117 repräsentiert.
Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Konstrukt bereit, umfassend:

(d) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein RAA1-ähnliches Polypeptid, wie oben definiert;
(e) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
(f) eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Konstrukt bereit, umfassend:

1. eine Nukleinsäure, codierend ein SYR-Polypeptid, wie oben definiert;
2. eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
3. eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein SYR-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Konstrukt bereit, umfassend:

1. eine Nukleinsäure, codierend ein ARKL-Polypeptid, wie oben definiert;
2. eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
3. eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein ARKL-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform ein Konstrukt bereit, umfassend:

1. eine Nukleinsäure, codierend ein YTP-Polypeptid, wie oben definiert;
2. eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls
3. eine Transkriptionsterminationssequenz.

Vorzugsweise ist die Nukleinsäure, welche ein YTP-Polypeptid codiert, wie oben definiert beschaffen. Die Begriffe ”Steuerungssequenz” und ”Terminationssequenz” sind wie hierin definiert beschaffen.
Pflanzen werden mit einem Vektor transformiert, der eine beliebige der oben beschriebenen Nukleinsäuresequenzen umfasst. Der Fachmann auf dem Gebiet ist mit genetischen Elementen gut vertraut, welche auf dem Vektor vorhanden sein müssen, um Wirtszellen erfolgreich zu transformieren und Wirtszellen, welche die Sequenz von Interesse enthalten, zu selektieren und zu vermehren. Die Sequenz von Interesse ist funktionsfähig an eine oder mehrere Steuerungssequenzen (mindestens an einen Promotor) verknüpft.
In vorteilhafter Weise kann ein beliebiger Typ von Promotor, ob natürlich oder synthetisch, verwendet werden, um die Expression der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen. Ein konstitutiver Promotor ist in den Verfahren besonders nützlich, vorzugsweise ein konstitutiver Promotor, der aus einem Pflanzengenom isoliert wurde. Der konstitutive Pflanzenpromotor treibt die Expression einer codierenden Sequenz bei einem Spiegel voran, welcher in allen Fällen unterhalb von demjenigen liegt, der unter der Steuerung eines viralen 35S CaMV-Promotors erhalten wird.
Andere organspezifische Promotoren, zum Beispiel für die bevorzugte Expression in Blättern, Stengeln, Knollen, Meristemen, Samen (Embryo und/oder Endosperm), sind in der Durchführung der Verfahren der Erfindung nützlich. Für Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
In einer Ausführungsform ist der konstitutive Promotor bevorzugt außerdem ein ubiquitärer Promotor. Für die Definitionen der verschiedenen Promotortypen, siehe den Abschnitt ”Definitionen” hierin.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf eine Nukleinsäuresequenz, welche das GRF-Polypeptid codiert, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, begrenzt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer GRF-Polypeptid codierenden Nukleinsäuresequenz unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die RAA1-ähnliches Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 120, begrenzt ist, noch ist die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer RAA1-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter der Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt.
Die konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor von einer Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 124 ist, wobei der konstitutive Promotor, am stärksten bevorzugt, beschaffen ist, wie durch SEQ ID NR: 124 oder SEQ ID NR: 211 repräsentiert. Gemäß eines anderen bevorzugten Merkmals der Erfindung ist der konstitutive Promotor ein ”High Mobility Group Protein”(HMGP)-Promotor, verzugsweise ein HMGP-Promotor aus Reis, weiter bevorzugt im Wesentlichen ähnlich zu SEQ ID NR: 125, am stärksten bevorzugt identisch zu SEQ ID NR: 125. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von konstitutiven Promotoren.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die SYR-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 168, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer SYR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, welche im Wesentlichen zu SEQ ID NR: 172 oder SEQ ID NR: 211 ähnlich ist, und am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie durch SEQ ID NR: 172 oder SEQ ID NR: 211 repräsentiert. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von nützlichen konstitutiven Promotoren.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die ARKL-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 212, begrenzt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer ARKL-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor oder unter Steuerung durch einen wurzelspezifischen Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich ist zu SEQ ID NR: 406, und am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 406 oder SEQ ID NR: 211. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von nützlichen konstitutiven Promotoren.
Es sollte klar sein, dass die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht auf die YTP-Polypeptid codierende Nukleinsäure, repräsentiert durch SEQ ID NR: 1, beschränkt ist, noch dass die Anwendbarkeit der Erfindung auf die Expression einer YTP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure unter Steuerung durch einen konstitutiven Promotor begrenzt ist.
Der konstitutive Promotor ist vorzugsweise ein GOS2-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor aus Reis. Weiter bevorzugt wird der konstitutive Promotor durch eine Nukleinsäuresequenz repräsentiert, die im Wesentlichen ähnlich ist zu SEQ ID NR: 548, am stärksten bevorzugt ist der konstitutive Promotor beschaffen, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 548 oder SEQ ID NR: 211. Siehe Tabelle 2 im hierin beschriebenen Abschnitt ”Definitionen” für weitere Beispiele von nützlichen konstitutiven Promotoren.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen im Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionelle sowie translationale ”Increaser” einfließen. Der Fachmann auf dem Gebiet wird Terminator- und Increaser-Sequenzen kennen, welche zur Anwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Eine Intron-Sequenz kann ebenfalls an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft, welche sich im Cytosol akkumuliert, zu erhöhen, wie im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben. Andere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Inceaser, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein. Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm leicht erhalten werden.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in das Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, welche im Wesentlichen ähnlich oder identisch zur SEQ ID NR. 166 ist, umfassend den GOS2-Promotor sowie die Nukleinsäure, die das RAA1-ähnliche Polypeptid codiert. In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, welche im Wesentlichen ähnlich oder identisch zur SEQ ID NR: 167 ist, umfassend den HMGP-Promotor sowie die Nuleinsäure, die das RAA1-ähnliche Polypeptid codiert.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, welche im Wesentlichen ähnlich oder identisch zur SEQ ID NR. 407 ist, umfassend den GOS2-Promotor, die Nukleinsäure, die das Orysa_ARKL1-Polypeptid codiert, sowie die T-zein + T-ribisco-Transkriptionsterminator-Sequenz.
Gegebenenfalls können eine oder mehrere Terminatorsequenzen in dem Konstrukt, welches in eine Pflanze eingebracht wird, verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Konstrukt eine Expressionskassette, die im Wesentlichen ähnlich oder identisch zur SEQ ID NR. 549 ist, umfassend den GOS2-Promotor, die Nukleinsäure, die das YTP-Polypeptid codiert, sowie die T-zein + T-ribisco-Transkriptionsterminator-Sequenz.
Weitere regulatorische Elemente können transkriptionelle sowie translationale Enhancer einschließen. Der Fachmann auf dem Gebiet kennt Terminator- und Enhancer-Sequenzen, welche zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können. Außerdem kann eine Intron-Sequenz an die 5'-untranslatierte Region (UTR) oder in der codierenden Sequenz hinzugefügt werden, um die Menge der reifen Botschaft zu erhöhen, welche sich im Cytosol akkumuliert, wie es im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben wird. Andere Steuerungssequenzen (neben Promotor, Enhancer, Silencer, Intron-Sequenzen, 3'UTR- und/oder 5'UTR-Regionen) können Protein- und/oder RNA-stabilisierende Elemente sein.
Derartige Sequenzen sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt oder können von ihm leicht erfahren werden.
Die genetischen Konstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprung-Sequenz enthalten, welche für die Beibehaltung und/oder Replikation in einem spezifischen Zelltyp erfordert wird. Ein Beispiel besteht in dem Fall, dass ein genetisches Konstrukt in einer Bakterienzelle als ein episomales genetisches Element beibehalten werden muss (z. B. Plasmid- oder Cosmid-Molekül). Bevorzugte Replikationsursprünge schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den f1-ori sowie colE1 ein.
Für den Nachweis des erfolgreichen Transfers der Nukleinsäuresequenzen, wie in den Verfahren der Erfindung verwendet, und/oder die Selektion von transgenen Pflanzen, welche diese Nukleinsäuresequenzen umfassen, ist es vorteilhaft, Markergene (oder Reportergene) zu verwenden. Deshalb kann das genetische Konstrukt gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfassen. Selektierbare Marker sind hierin im Abschnitt ”Definitionen” ausführlicher beschrieben.
Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markerentfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Es ist bekannt, dass bei stabiler oder transienter Integration von Nukleinsäuresequenzen in Pflanzenzellen nur eine Minderheit der Zellen die Fremd-DNA aufnimmt, und, falls gewünscht, dieselbe in sein Genom integriert, abhängig von dem verwendeten Expressionsvektor und der angewandten Transformationstechnik. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird üblicherweise ein Gen, codierend für einen selektierbaren Marker (wie diejenigen, welche oben beschrieben wurden) gemeinsam mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Diese Marker können zum Beispiel in Mutanten verwendet werden, in denen diese Gene, beispielsweise aufgrund von Deletion durch herkömmliche Verfahren, nicht funktional sind. Darüber hinaus können Nukleinsäuresequenz-Moleküle, welche einen selektierbaren Marker codieren, auf demselben Vektor, der die Sequenz umfasst, welche die erfindungsgemäßen oder in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Polypeptide codiert, oder ansonsten in einem getrennten Vektor in eine Wirtszelle eingebracht werden. Zellen, welche stabil mit der eingebrachten Nukleinsäuresequenz transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion identifiziert werden (beispielsweise überleben Zellen, welche den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben). Die Markergene können aus der transgenen Zelle entfernt oder herausgeschnitten werden, sobald sie nicht länger benötigt werden. Techniken zur Markergen-Entfernung sind auf dem Fachgebiet bekannt, wobei nützliche Techniken oben im Abschnitt ”Definitionen” beschrieben sind.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren für die Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Einbringen und die Expression, in einer Pflanze, von einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin oben definiert.
Im Besonderen sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen vor, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein GRF-Polypeptid, unter der Steuerung eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäuresequenz von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuresequenzen sein, welche zum Codieren eines GRF-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Genauer gesagt sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten, gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, vor, wobei das Verfahren umfasst:

i) Einbringen und Exprimieren einer RAA1-ähnliches Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, welche zum Codieren eines RAA1-ähnlichen Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Im Besonderen sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag und/oder erhöhter Biomasse, vor, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren einer SYR-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines SYR-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Im Besonderen sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, vor, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Einbringen und Exprimieren einer ARKL-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
(ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines ARKL-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Im Besonderen sieht die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren für die Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhten gesteigerten ertragsbezogenen Eigenschaften, insbesondere erhöhtem (Samen)ertrag, vor, wobei das Verfahren umfasst:

i) Einbringen und Exprimieren einer YTP-Polypeptid codierenden Nukleinsäure in einer Pflanze oder Pflanzenzelle; und
ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.

Die Nukleinsäure von (i) kann eine beliebige der Nukleinsäuren sein, die zum Codieren eines YTP-Polypeptids, wie hierin definiert, in der Lage sind.
Die Nukleinsäuresequenz kann direkt in eine Pflanzenzelle oder in die Pflanze selbst eingebracht werden (einschließlich Einbringung in ein Gewebe, Organ oder einen beliebigen anderen Teil einer Pflanze). Gemäß eines bevorzugten Merkmals der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise durch Transformation in eine Pflanze eingebracht. Der Begriff ”Transformation” ist ausführlicher im Abschnitt ”Definitionen” hierin beschrieben.
Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen können durch alle Verfahren regeneriert werden, mit denen der Fachmann auf dem Gebiet vertraut ist. Geeignete Verfahren können in den oben erwähnten Veröffentlichungen von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Hofgen und Willmitzer gefunden werden.
Im Allgemeinen werden Pflanzenzellen oder Zellgruppierungen, nach Transformation, hinsichtlich des Vorhandenseins eines oder mehrerer Marker selektiert, welche von, mit dem Gen von Interesse cotransferierten, in Pflanzen exprimierbaren Genen codiert werden, wonach das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird. Um transformierte Pflanzen zu selektieren, wird das in der Transformation erhaltene Pflanzenmaterial, in der Regel, selektiven Bedingungen unterworfen, so dass transformierte Pflanzen von nicht-transformierten Pflanzen unterschieden werden können. Zum Beispiel können die in oben beschriebener Weise erhaltenen Samen eingepflanzt und nach einer anfänglichen Wachstumsperiode einer geeigneten Selektion durch Besprühen unterzogen werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Kultivieren der Samen, nötigenfalls nach einer Sterilisierung, auf Agarplatten unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmittels, so dass nur die transformierten Samen zu Pflanzen heranwachsen können. Alternativ dazu durchrastert man die transformierten Pflanzen hinsichtlich des Vorhandenseins eines selektierbaren Markers, wie etwa denjenigen, welche oben beschrieben sind.
Im Anschluss an DNA-Transfer und Regeneration können die vermeintlich transformierten Pflanzen außerdem zum Beispiel unter Anwendung von Southern-Analyse hinsichtlich des Vorhandenseins des Gens von Interesse, der Kopienzahl und/oder der genomischen Organisation untersucht werden. Alternativ oder zusätzlich dazu können die Expressionsspiegel der neu eingebrachten DNA unter Anwenden von Northern- und/oder Western-Analyse überwacht werden, wobei diese beiden Techniken dem Fachmann mit Durchschnittskenntnissen auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die erzeugten, transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Methoden vermehrt werden, wie etwa durch klonale Propagation oder klassische Züchtungstechniken. So kann zum Beispiel eine erste Generation (oder T1) von transformierten Pflanzen geselbstet und homozygote Transformanten der zweiten Generation (oder T2) können selektiert werden, und die T2-Pflanzen können dann durch klassische Züchtungstechniken weitervermehrt werden. Die erzeugten, transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Zum Beispiel können sie Chimären von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen; klonale Transformanten (z. B. wobei alle Zellen transformiert sind, um die Expressionskassette zu enthalten); Propfungen von transformierten und nicht-transformierten Geweben (z. B. in Pflanzen, in denen ein transformierter Wurzelstock an einen nicht-transformierten Spross gepropft wird) sein.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich in deutlicher Weise auf eine beliebige Pflanzenzelle oder Pflanze, welche durch ein beliebiges der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, sowie auf alle Pflanzenteile und Fortpflanzungskeime davon. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich weiterhin dahingehend, dass die Nachkommenschaft eines/einer primären transformierten oder transfizierten Zelle, Gewebes, Organs oder ganzen Pflanze, welche(s) durch ein beliebiges der zuvor erwähnten Verfahren hergestellt worden ist, beinhaltet ist, wobei die einzige Anforderung darin besteht, dass die Nachkommen in den Verfahren gemäß der Erfindung dieselben genotypischen und/oder phänotypischen Merkmal(e) aufzeigen, wie diejenigen, welche von der Elternform hervorgebracht werden.
Die Erfindung umfasst auch Wirtszellen, enthaltend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, wie hierin oben definiert, die funktionsfähig mit einen konstitutiven Pflanzenpromotor verbunden ist. Bevorzugte Wirtszellen gemäß der Erfindung sind Pflanzenzellen. Wirtspflanzen für die Nukleinsäuresequenzen oder den Vektor, welche in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden, die Expressionskassette oder das Konstrukt oder den Vektor sind, im Prinzip, in vorteilhafter Weise alle Pflanzen, welche zum Synthetisieren der im Verfahren der Erfindung verwendeten Polypeptide in der Lage sind.
Die Verfahren der Erfindung sind in vorteilhafter Weise auf eine beliebige Pflanze anwendbar. Zu Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung besonders nützlich sind, zählen alle Pflanzen, die der Superfamilie Viridiplantae angehören, insbesondere monokotyledone und dikotyledone Pflanzen einschließlich Viehfutter- oder Grünfutter-Leguminosen, Zierpflanzen, Nahrungspflanzen, Bäumen oder Sträuchern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Pflanze eine Nutzpflanze. Zu Beispielen von Nutzpflanzen zählen Sojabohne, Sonnenblume, Canola, Alfalfa, Raps, Baumwolle, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weiter bevorzugt ist die Pflanze eine monokotyledone Pflanze. Zu Beispielen von monokotyledonen Pflanzen zählen Zuckerrohr. Weiter bevorzugt ist die Pflanze ein Getreide. Zu Beispielen von Getreiden zählen Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum, Emmer, Dinkel, Secale, Einkorn, Teff, Milo und Hafer.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf erntefähige Teile einer Pflanze, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid (wie hierin oben definiert), die funktionsfähig mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor verbunden ist, wie etwa, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Samen, Blätter, Früchte, Blüten, Stengel, Rhizome, Knollen und Zwiebeln. Die Erfindung betrifft ferner Produkte, die aus einem erntefähigen Teil einer derartigen Pflanze abgeleitet, vorzugsweise direkt abgeleitet sind, wie etwa trockene Pellets oder Pulver, Öl, Fett und Fettsäuren, Stärke oder Proteine.
Gemäß eines bevorzugten Merkmals der Erfindung, ist die modulierte Expression eine erhöhte Expression. Verfahren zur Erhöhung der Expression von Nukleinsäuren oder Genen, oder Genprodukten, sind im Fachgebiet gut dokumentiert, und Beispiele sind im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Wie oben erwähnt, erfolgt ein bevorzugtes Verfahren zur Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, durch Einbringen und Exprimieren, in einer Pflanze, einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid; allerdings können die Effekte der Durchführung des Verfahrens, d. h. die Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, auch unter Verwendung anderer gut bekannten Techniken erzielt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, T-DNA-Aktivierungs-Tagging, TILLING, homologe Rekombination. Eine Beschreibung dieser Techniken ist im Abschnitt ”Definitionen” angegeben.
Die vorliegende Erfindung umfasst, in einer Ausführungsform, ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend GRF-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser GRF-Polypeptide in der Erhöhung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen unter normalen Wachstumsbedingungen, unter abiotischen Stress-Wachstumsbedingungen (vorzugsweise osmotischen Stress-Wachstumsbedingungen) sowie unter Wachstumsbedingungen mit verringerter Nährstoffverfügbarkeit, vorzugsweise unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit.
Die vorliegende Erfindung umfasst, in einer Ausführungsform, ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend RAA1-ähnliche Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser RAA1-ähnlichen Polypeptide in der Verstärkung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst, in einer Ausführungsform, ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend SYR-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser SYR-Polypeptide in der Verstärkung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen, wenn diese unter abiotischen Stressbedingungen kultiviert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst, in einer Ausführungsform, ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend ARKL-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser ARKL-Polypeptide in der Verstärkung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Die vorliegende Erfindung umfasst, in einer Ausführungsform, ebenfalls die Verwendung von Nukleinsäuren, codierend YTP-Polypeptide, wie hierin beschrieben, sowie die Verwendung dieser YTP-Polypeptide in der Verstärkung beliebiger der zuvor erwähnten ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen.
Nukleinsäuresequenzen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, die hierin beschrieben sind, oder die Polypeptide der Erfindung selbst, können Anwendung in Züchtungsprogrammen finden, in denen ein DNA-Marker identifiziert wird, der genetisch an ein GRF-Polypeptid codierendes Gen gekoppelt sein kann. Die Gene/Nukleinsäuresequenzen, oder das GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliche Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, selbst können verwendet werden, um einen molekularen Marker zu definieren. Dieser DNA- oder Proteinmarker kann dann in Züchtungsprogrammen verwendet werden, um Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin oben in den Verfahren der Erfindung definiert, zu selektieren.
Allelische Varianten eines/einer Gens/Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, können außerdem Anwendung in Marker-assistierten Züchtungsprogrammen finden. Solche Züchtungsprogramme erfordern machmal das Einbringen von allelischer Variation durch mutagene Behandlung der Pflanzen, wobei zum Beispiel EMS-Mutagenese angewandt wird; alternativ dazu kann das Programm mit einer Sammlung von allelischen Varianten von, unabsichtlich verursachtem, sogenannten ”natürlichen” Ursprung beginnen. Die Identifizierung allelischer Varianten findet dann zum Beispiel mittels PCR statt. Hierauf folgt ein Schritt zur Selektion von höherwertigen allelischen Varianten der betreffenden Sequenz, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften ergeben. Die Selektion wird in der Regel durch Überwachen der Wachstumsleistung von Pflanzen, die verschiedene allelische Varianten der betreffenden Sequenz enthalten, ausgeführt. Die Wachstumsleistung kann in einem Gewächshaus oder auf dem Feld überwacht werden. Weitere wahlfreie Schritte beinhalten das Kreuzen von Pflanzen, in denen die höherwertige allelische Variante identifiziert worden ist, mit einer anderen Pflanze. Dies könnte beispielsweise angewandt werden, um eine Kombination interessanter phänotypischer Merkmale zu erzeugen.
Nukleinsäuresequenzen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, können ebenfalls als Sonden für die genetische und physikalische Kartierung der Gene, von denen sie ein Teil sind, sowie als Marker für mit diesen Genen gekoppelte Merkmale eingesetzt werden. Derartige Informationen können in der Pflanzenzucht nützlich sein, um Linien mit gewünschten Phänotypen zu entwicklen. Eine derartige Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, erfordert lediglich eine Nukleinsäuresequenz von mindestens 15 Nukleotiden Länge. Die Nukleinsäuresequenzen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid, können als Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus(RFLP)-Marker verwendet werden. Southern-Blots (Sambrook J., Fritsch, EF., und Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) von restriktionsverdauter pflanzlicher genomischer DNA können sondiert werden mit den Nukleinsäuresequenzen, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid bzw. YTP-Polypeptid. Die resultierenden Bandenmuster können dann genetischen Analysen mit Hilfe von Computerprogrammen wie MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174–181) unterzogen werden, um eine genetische Karte zu erstellen. Darüber hinaus können die Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um Southern-Blots zu sondieren, die mit Restriktionsendonuklease behandelte genomische DNAs aus einer Auswahl von Individuen enthalten, welche Eltern und Nachkommen einer definierten genetischen Kreuzung repräsentieren. Die Segregation der DNA-Polymorphismen wird aufgezeichnet und verwendet, um die Position der Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in der genetischen Karte zu berechnen, welche zuvor unter Verwendung dieser Population erhalten wurde (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331).
Die Herstellung und Anwendung von Pflanzengen-abgeleiteten Sonden zur Verwendung in der genetischen Kartierung wird in Bernatzky und Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4: 37–41, beschrieben. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die genetische Kartierung von spezifischen cDNA-Klonen unter Anwenden der oben geschilderten Methodik oder Variationen davon. Zum Beispiel können F2-Interkross-Populationen, Rückkreuzungspopulationen, wahllos gekreuzte Populationen, nah-isogene Linien und andere Individuengruppierungen für die Kartierung verwendet werden. Derartige Methodiken sind dem Fachmann allgemein bekannt.
Die Nukleinsäuresequenz-Sonden können auch für eine physikalische Kartierung verwendet werden (d. h. Platzierung von Sequenzen auf physikalischen Karten; siehe Hoheisel et al. In: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic Press 1996, S. 319–346, und darin zitierte Literaturstellen).
In einer anderen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenz-Sonden bei der direkten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung(FISH)-Kartierung verwendet werden (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149–154). Obwohl derzeitige Verfahren zur FISH-Kartierung die Verwendung großer Klone begünstigen (mehrere kb bis einige hundert kb; siehe Laan et al. (1995) Genome Res. 5: 13–20), können Verbesserungen der Empfindlichkeit eine Ausführung der FISH-Kartierung unter Verwendung kürzerer Sonden erlauben.
Eine Vielzahl von auf Nukleinsäuresequenz-Amplifikation basierenden Verfahren zur genetischen und physikalischen Kartierung kann unter Verwendung der Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden. Zu Beispielen zählen die allelspezifische Amplifikation (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95–96), Polymorphismus von PCR-amplifizierten Fragmenten (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16: 325–332), allelspezifische Ligation (Landegren et al. (1988) Science 241: 1077–1080), Nukleotid-Verlängerungsreaktionen (Sokolov (1990) Nucleic acid sequence Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping bzw. Bestrahlungs-Hybridkartierung (Walter et al. (1997) Nat. Genet. 7: 22–28) und Happy Mapping (Dear und Cook (1989) Nucleic acid sequence Res. 17: 6795–6807). Für diese Verfahren wird die Sequenz einer Nukleinsäuresequenz verwendet, um Primerpaare zur Verwendung in der Amplifikationsreaktion oder in Primerverlängerungsreaktionen zu entwerfen und herzustellen. Das Entwerfen derartiger Primer ist dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt. In Verfahren unter Anwendung von PCR-basierter genetischer Kartierung kann es notwendig sein, DNA-Sequenzunterschiede zwischen den Eltern der Kartierungskreuzung in der Region zu identifizieren, die der vorliegenden Nukleinsäuresequenz entspricht. Dies ist jedoch im Allgemeinen für Kartierungsverfahren nicht notwendig.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen, in einer Ausführungsform, zu Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie weiteren ertragserhöhenden Eigenschaften, Toleranz gegen abiotische und biotische Stressformen, Toleranz gegen Herbizide, Insektizide, sowie Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung führen, in einer Ausführungsform, zu Pflanzen mit verstärkten ertragsbezogenen Eigenschaften, wie hierin zuvor beschrieben. Diese Eigenschaften können auch mit anderen wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften kombiniert werden, wie weiteren ertragsverstärkenden Eigenschaften, Toleranz gegen andere abiotische und biotische Stressformen, und Eigenschaften, die verschiedene architektonische Merkmale und/oder biochemische und/oder physiologische Merkmale modifizieren.
Verfahren zum Gen-Stacking in transgenen Pflanzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe zum Beispiel, einen Übersichtsartikel von Halpin (2005) Plant Biotech. J. (3): 141–155. Gen-Stacking kann durch interaktive Schritte vor sich gehen, wobei zwei oder mehr Transgene sequentiell in eine Pflanze eingebracht werden können durch Kreuzen einer Pflanze, die ein Transgen enthält, mit Individuen, welche andere Transgene enthalten, oder alternativ durch Re-Transformieren (oder Über-Transformieren) einer Pflanze, die ein Transgen enthält, mit neuen Genen. Eine Einschränkung des iterativen Vorgehens beteht darin, dass die Transgene nicht gekoppelt sind und an unterschiedlichen zufälligen Genorten im Pflanzengenom lokalisiert sein werden. Die Konsequenz ist, dass die zwei Genorte in nachfolgenden Generationen auseinander segregieren können, was Auswirkungen auf Züchtungsprogramme hat.
Alternativ dazu, kann Gen-Stacking durch Cotransformation stattfinden, was rascher ist und in einer ganzen Reihe von Transformationstechniken zur Anwendung kommen kann. Wenn zum Beispiel Agrobacterium-Transformation angewandt wird, können die Transgene (mindestens zwei) in einer Anzahl von Konformationen vorliegen:

(i) die codierenden Sequenzen sind fusioniert, wodurch ein einzelnes Polypeptid bei der Translation gebildet wird, und sind unter der Steuerung eines einzigen Promotors angeordnet;
(ii) die codierenden Sequenzen sind sequentiell, stromabwärts eines einzigen Promotors angeordnet, getrennt durch Nukleinsäuresignale, die die mRNA-Synthese (interne Ribosomen-Eintrittsstellen IRES, 2A-Stuttering-Signale, etc..), oder Polypeptidsynthese (durch Protease-Substratstellen getrennte Polyproteine, etc..) beeinflußen;
(iii) die codierenden Sequenzen werden unabhängig von separaten Promotoren gesteuert, und die Kombinationen aus Promotor-codierender Sequenz sind innerhalb derselben T-DNA angeordnet;
(iv) die codierenden Sequenzen werden unabhängig von separaten Promotoren gesteuert, und die Kombinationen aus Promotor-codierender Sequenz sind in verschiedenen T-DNAs auf demselbem Plasmid angeordnet;
(v) die codierenden Sequenzen werden unabhängig von separaten Promotoren gesteuert, und die Kombinationen aus Promotor-codierender Sequenz sind in verschiedenen T-DNAs auf unterschiedlichen Plasmiden angeordnet, die im selben oder in getrennten Agrobacterium-Stämmen beherbergt sind.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, umfassend das Erhöhen der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, und das Modulieren der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein zweites Polypeptid codiert, in der gleichen Pflanze.
Überraschend ist nun festgestellt worden, dass die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze, Pflanzen ergibt, welche erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen aufweisen. Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen bereit, welches die Erhöhung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Gegenstand, der wie folgt zusammengefasst werden kann:

1. Ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Erhöhen der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die ein Wachstums-Reguliender Faktor(GRF)-Polypeptid codiert, wobei das GRF-Polypeptid folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 115; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 116, und gegebenenfalls das Selektieren nach Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, wobei das GRF-Polypeptid folgendes umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014978 (PFAM-Zugangsnummer PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014977 (PFAM-Zugangsnummer PF08879); und (iii) eine Effector-of-Transcription(ET)-Domäne, welche drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H) umfasst.
3. Verfahren gemäß Punkt 1 oder 2, wobei das GRF-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäure-Sequenzidentität zum GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A hierin aufgeführten Polypeptidsequenzen aufweist.
4. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, durch eine beliebige der in Tabelle A aufgeführten Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A aufgeführten Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn befähigt ist, repräsentiert wird.
5. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A aufgeführten Polypeptidsequenz-SEQ ID NRn codiert.
6. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression durch beliebige ein oder mehrere aus Folgendem bewirkt wird: T-DNA-Aktivierungs-Tagging bzw. -Aktivierungsmutagenese, TILLING oder homologe Rekombination.
7. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die erhöhte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
8. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei es sich bei der erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft um eine oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; oder (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
9. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, weiter bevorzugt einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 117.
10. Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana, ist.
11. Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Punkt, wobei die Pflanze, ein Teil davon oder eine Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein GRF-Polypeptid codiert, welches mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor funktionsfähig verbunden ist.
12. Konstrukt, das umfasst: (1) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 1 bis 5 definiert; (2) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (3) eine Transkriptionsterminationssequenz.
13. Konstrukt gemäß Punkt 12, wobei es sich bei der Steuerungssequenz um einen konstitutiven Pflanzenpromotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, weiter bevorzugt einen GOS2-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 117, handelt.
14. Verwendung eines Konstrukts gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei es sich bei den erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften um eine oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; oder (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
15. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Punkt 12 oder 13 transformiert ist.
16. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 1 bis 5 definiert, unter der Steuerung eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
17. Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 1 bis 5 definiert, codiert, das mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor funktionsfähig verbunden ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die/der aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
18. Transgene Pflanze gemäß Punkt 11, 15 oder 17, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide ist, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
19. Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, einer Pflanze gemäß Punkt 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
20. Produkte, abgeleitet aus einer Pflanze gemäß Punkt 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Punkt 19.
21. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein GRF-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Punkte 1 bis 5 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere der folgenden umfassen: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; oder (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Gegenstand, der wie folgt zusammengefasst werden kann.

22. Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, wobei das RAA1-ähnliche Polypeptid zwei oder mehr der folgenden Motive umfasst: (i) Motiv 1: GVW(V/L)F (SEQ ID NR: 162), (ii) Motiv 2: LGW(E/S)RY(Y/F) (SEQ ID NR: 163), (iii) Motiv 3: (D/H)L(L/I)S(IN/L)P(R/K/A)(S/D)F (SEQ ID NR: 164), (iv) Motiv 4: (H/Y)(F/M)YD(V/I)VVK(N/T)(R/P) (SEQ ID NR: 165).
23. Verfahren gemäß Punkt 22, wobei das RAA1-ähnliche Polypeptid ferner ein MG zwischen 10 und 21 KDa und einen pl von über 8,5 aufweist.
24. Verfahren gemäß Punkt 22 oder 23, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, in einer Pflanze ausgeführt wird.
25. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure ist, die in der Lage ist, mit einer solchen Nukleinsäure zu hybridisieren.
26. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von den in der Tabelle A angegebenen Proteinen ist.
27. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften einen erhöhten Ertrag, vorzugsweise eine erhöhte Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
28. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 27, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen ohne Streß erhalten werden.
29. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 22 bis 27, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen eines Stickstoffmangels erhalten werden.
30. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 24 bis 29, wobei die Nukleinsäure mit einem konstitutiven Promotor funktionsfähig verbunden ist.
31. Verfahren gemäß Punkt 30, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor oder ein HMGP-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor oder ein HMGP-Promotor, aus Reis ist.
32. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein RAA1-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise von einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa.
33. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, die durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt erhältlich ist, wobei die Pflanze oder ein Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure umfasst, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert.
34. Konstrukt, das folgendes umfasst: (i) Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
35. Konstrukt gemäß Punkt 34, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor ist.
36. Konstrukt gemäß Punkt 35, wobei der konstitutive Promotor ein GOS2-Promotor oder ein HMGP-Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor oder ein HMGP-Promotor, aus Reis ist.
37. Verwendung von einem Konstrukt gemäß einem beliebigen der Punkte 34 bis 36 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit einem erhöhten Ertrag, vorzugsweise einer erhöhten Biomasse und/oder einen erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
38. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die mit einem Konstrukt gemäß einem beliebigen der Punkte 34 bis 36 transformiert ist.
39. Verfahren zur Herstellung von einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches folgendes umfasst: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die -entwicklung fördern.
40. Transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhter Biomasse und/oder erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der modulierten Expression von einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abstammt.
41. Transgene Pflanze gemäß Punkt 33, 38 öder 39, oder eine davon abstammende transgene Pflanzenzelle, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide ist, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
42. Erntefähige Teile einer Pflanze gemäß Punkt 41, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Wurzelbiomasse und/oder Samen sind.
43. Produkte, die von einer Pflanze gemäß Punkt 41 und/oder von erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß 42 abgeleitet sind.
44. Verwendung von einer Nukleinsäure, die ein RAA1-ähnliches Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Wurzelbiomassee in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

45. Ein Verfahren zur Erhöhung der Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, wobei das SYR-Polypeptid eine Leucin-reiche Domäne umfasst, der das konservierte Tripeptidmotiv 1 (eines von SEQ ID NR: 173, 174, 175 oder 176)) vorangeht und das konservierte Motiv 2 (SEQ ID NR: 177) nachfolgt, wobei die erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz und/oder erhöhte Toleranz gegen Dürrestress im Vergleich zu Kontrollpflanzen ist.
46. Verfahren gemäß Punkt 45, wobei das SYR-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 27%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu dem SYR-Polypeptid, das durch die SEQ ID NR: 169 repräsentiert ist, aufweist.
47. Verfahren gemäß Punkt 45 oder 46, wobei die Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, durch eine beliebige der in der Tabelle A aufgeführten Nukleinsäure-SEQ ID NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A hierin aufgeführten Nukleinsäure-SEQ ID NRs in der Lage ist, repräsentiert wird.
48. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 45 bis 47, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einer beliebigen der SEQ ID NRn, die in Tabelle A angeführt sind, ist.
49. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei das SYR-Protein ferner das konservierte Motiv 7 umfasst (SEQ ID NR: 178).
50. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nährstoffaufnahme-Effizienz zu einem erhöhten Samenertrag und/oder erhöhter Biomasse führt.
51. Verfahren von Punkt 50, wobei der erhöhte Samenertrag mindestens einen erhöhten(s) Gesamt-Samenertrag, Tausendkorngewicht und/oder eine erhöhte Anzahl von gefüllten Samen umfasst.
52. Verfahren von Punkt 50, wobei die erhöhte Biomasse erhöhte Sprossbiomasse und/oder erhöhte Wurzelbiomasse ist.
53. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz unter milden Dürrebedingungen auftritt.
54. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhte Toleranz gegen Dürrestress zu erhöhtem Samenertrag führt.
55. Verfahren von Punkt 54, wobei der erhöhte Samenertrag mindestens erhöhte(s) Samengesamtgewicht, Füllrate und/oder Ernteindex umfasst.
56. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
57. Verfahren gemäß Punkt 56, wobei die Nukleinsäure in funktionsfähiger Weise an einen konstitutiven Promotor, vorzugsweise an einen GOS2-Promotor, gebunden ist.
58. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise von einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, stärker bevorzugt aus der Gattung Oryza, am stärksten bevorzugt aus Oryza sativa.
59. Verwendung von einem Konstrukt bei einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress, wobei das Konstrukt folgendes umfasst: (a) Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, wie in einem beliebigen der Punkte 45 bis 49 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz, und wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, ist und wobei die erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz und/oder erhöhte Toleranz gegen Dürrestress im Vergleich zu Kontrollpflanzen ist.
60. Verwendung von einer Nukleinsäure, die ein SYR-Polypeptid codiert, in einem Verfahren zur Erhöhung der Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei die erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz und/oder erhöhte Toleranz gegen Dürrestress im Vergleich zu Kontrollpflanzen ist.
61. Verwendung gemäß Punkt 60, wobei die erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz zu einem erhöhten Samenertrag und/oder erhöhter Biomasse führt.
62. Verwendung gemäß Punkt 60, wobei die erhöhte Toleranz gegen Dürrestress zu erhöhtem Samenertrag führt. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Gegenstand, der wie folgt zusammengefasst werden kann.
63. Ein Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, welches das Modulieren der Expression von einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze umfasst.
64. Verfahren gemäß Punkt 63, wobei das ARKL-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Domänen umfasst: (i) eine ZfC3H2C3-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 400 repräsentiert, oder eine Domäne mit in steigender Reihenfolge der Preferänz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der ZfC3H2C3-Domänen, wie sie durch die SEQ ID NR: 95 bis SEQ ID NR: 351 repräsentiert werden; und (ii) eine DAR1-Domäne mit in steigender Reihenfolge der Preferänz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der PfamB2828-Domänen, wie sie durch die SEQ ID NR: 352 bis SEQ ID NR: 398 repräsentiert werden.
65. Verfahren gemäß Punkt 63 und 64, wobei das ARKL-Polypeptid eine oder mehrere von folgenden umfasst: (i) eine ZfC3H2C3-Domäne, wie durch die SEQ ID NR: 401 repräsentiert; (ii) ein Motiv 8, wie durch die SEQ ID NR: 399 repräsentiert;
66. Verfahren gemäß Punkt 63 bis 65, wobei die modulierte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, in einer Pflanze ausgeführt wird.
67. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, ein beliebiges der in Tabelle A aufgeführten Proteine codiert oder ein Abschnitt einer solchen Nukleinsäure ist, oder eine Nukleinsäure ist, die zur Hybridisierung mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
68. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A aufgeführten Proteine ist.
69. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
70. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen ohne Stress erhalten werden.
71. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen von Dürrestress erhalten werden.
72. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor, aus Reis verbunden ist.
73. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise aus einer monokotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, am meisten bevorzugt aus Oryza sativa.
74. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, umfasst.
75. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, das in den Punkten 63 bis 65 definiert ist; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression von der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
76. Konstrukt gemäß Punkt 75, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt ein GOS2-Promotor, aus Reis ist.
77. Verwendung von einem Konstrukt gemäß Punkt 75 oder 76 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften, vorzugsweise erhöhtem Ertrag, stärker bevorzugt erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
78. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt gemäß Punkt 75 oder 76.
79. Verfahren zur Herstellung von einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einführen und Exprimieren in einer Pflanze eine Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, wie in Punkt 63 bis 65 definiert; und (ii) Kultivieren the Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
80. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus einer erhöhten Expression von einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid, wie in Punkt 63 bis 65 definiert, codiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
81. Transgene Pflanze gemäß Punkt 74, 78 oder 80, oder eine transgene Pflanzenzelle, die davon abgeleitet ist, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide, such as Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, ist.
82. Erntefähige Teile von einer Pflanze gemäß Punkt 81, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sproßbiomasse und/oder Samen sind.
83. Produkte, die von einer Pflanze gemäß Punkt 81 und/oder von erntefähigen Teilen von einer Pflanze gemäß Punkt 82 abgeleitet sind.
84. Verwendung von einer Nukleinsäure, die ein ARKL-Polypeptid codiert, welches die ertragsbezogenen Eigenschaften erhöht, vorzugsweise erhöhten Ertrag, stärker bevorzugt erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

85. Ein Verfahren zur Erhöhung der ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze von einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, umfassend (i) mindestens eine Transmembrandomäne und (ii) mindestens einen Abschnitt von einer DUF221-Domäne.
86. Verfahren gemäß Punkt 85, wobei der Abschnitt in zunehmender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Sequenzidentität (zu) einer beliebigen der Domänen, die durch die SEQ ID NR: 518 bis SEQ ID NR: 544 repräsentiert sind, besitzt.
87. Verfahren gemäß Punkt 85 oder 86, wobei die YTP der Nukleinsäure ein Polypeptid codiert mit in zunehmender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% Aminosäuren-Sequenzidentität zu einem beliebigen der Polypeptide von Tabelle A besitzt.
88. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei das YTP-Polypeptid ferner das Motiv 9 (SEQ ID NR: 545) umfasst.
89. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die modulierte Expression durch Einbringen und Exprimieren einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, in einer Pflanze ausgeführt wird.
90. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, mindestens ein beliebiges der in der Tabelle A aufgelisteten Proteine codiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder ein Nukleinsäure ist, die zur Hybridisierung mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
91. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog von einem beliebigen der in Tabelle A aufgelisteten Protein codiert, oder ein Teil einer solchen Nukleinsäure ist, oder ein Nukleinsäure ist, die zur Hybridisierung mit einer solchen Nukleinsäure in der Lage ist.
92. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften erhöhten Ertrag, vorzugsweise erhöhten Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen umfassen.
93. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 85 bis 92, wobei die erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften unter Bedingungen ohne Stress erhalten werden.
94. Verfahren gemäß einem beliebigen der Punkte 89 bis 93, wobei die Nukleinsäure in funktionfähiger Weise mit einem konstitutiven Promotor, vorzugsweise mit einem GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt mit einem GOS2-Promotor aus Reis, verbunden ist.
95. Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Poaceae, noch mehr bevorzugt aus der Gattung Oryza, am meisten bevorzugt aus Oryza sativa.
96. Pflanze oder Teil davon, einschließlich Samen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorhergehenden Punkt, wobei die Pflanze oder das Teil davon eine rekombinante Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, umfasst.
97. Konstrukt, umfassend: (i) Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid, wie in den Punkten 85 bis 88 definiert, codiert; (ii) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreiben der Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage ist bzw. sind; und gegebenenfalls (iii) eine Transkriptionsterminationssequenz.
98. Konstrukt gemäß Punkt 97, wobei eine der Steuerungssequenzen ein konstitutiver Promotor, vorzugsweise ein GOS2-Promotor, am meisten bevorzugt ein GOS2-Promotor aus Reis ist.
99. Verwendung von einem Konstrukt gemäß Punkt 97 oder 98 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Ertrag, insbesonder erhöhtem Samenertrag im Vergleich zu Kontrollpflanzen.
100. Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, transformiert mit einem Konstrukt gemäß Punkt 97 oder 98.
101. Verfahren zur Herstellung von einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) das Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid, wie in Punkt 85 bis 88 definiert, codiert; und (ii) das Kultivieren der Pflanzenzelle unter Bedingungen, die das Pflanzenwachstum und die Entwicklung fördern.
102. Transgene Pflanze mit erhöhtem Ertrag, insbesondere erhöhtem Samenertrag, im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus einer modulierten Expression von einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, wie in Punkt 85 bis 88 definiert, oder eine transgene Pflanzenzelle, die von der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
103. Transgene Pflanze gemäß Punkt 96, 100 oder 102, oder eine transgene Pflanzenzelle, die davon abgeleitet ist, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide ist, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer.
104. Erntefähige Teile von einer Pflanze gemäß Punkt 103, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Sprossbiomasse und/oder Samen sind.
105. Produkte, die von einer Pflanze gemäß Punkt 103 und/oder von erntefähigen Teilen von einer Pflanze gemäß 104 abgeleitet sind.
106. Verwendung von einer Nukleinsäure, die ein YTP-Polypeptid codiert, bei der Erhöhung des Ertrags, insbesondere bei der Erhöhung des Samenertrags und/oder der Sprossbiomasse in Pflanzen, im Vergleich zu Kontrollpflanzen.

Beschreibung von Figuren
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Figuren beschrieben, worin:
Die 1 repräsentiert eine Karton-Zeichnung von einem GRF-Polypeptid, wie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert, welche die folgenden Merkmale umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit der InterPro-Zugangsnummer IPR014978 (PFAM-Zugangsnummer PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit der InterPro-Zugangsnummer IPR014977 (PFAM-Zugangsnummer PF08879); und (iii) eine Effektor-of-Transcription(ET)-Domäne, welche drei Cys-Reste und einen His-Reste in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H), die in der WRC Domäne lokalisiert ist, umfasst.
Die 2 zeigt ein AlignX (vom Vektor NTI 10.3, Invitrogen Corporation) Multiples Sequenzalignment der QLQ-Domäne von GRF-Polypeptiden der Tabelle A (wie durch die SEQ ID NR: 115 für SEQ ID NR: 2 repräsentiert). Die konservierten QLQ-Aminosäurereste sind oben in dem Multiplen Alignment lokalisiert. Zwei andere sehr konservierte Reste (in schwarz eingekastet) sind E (Glu) und P (Pro).
Die 3 zeigt ein AlignX (von Vektor NTI 10.3, Invitrogen Corporation) Multiples Sequenzalignment von der WRC-Domäne von GRF-Polypeptiden der Tabelle A (wie durch die SEQ ID NR: 116 für SEQ ID NR: 2 repräsentiert). Die konservierten WRC-Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz fett formatiert. Die drei Cys-Reste und ein His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H), bezeichnet als die Effector-of-Transcription(ET)-Domäne, sind vertikal über das Alignement eingekastet und ebenfalls am Boden des Alignment identifiziert. Das putative bzw. mutmaßliche Kernlokalisationssignal (nuclear localisation signal = NLS), das in der WRC-Domäne beinhaltet ist, ist doppelt unterstrichen.
Die 4 zeigt den binären Vektor für erhöhte Expression in Oryza sativa von einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, unter der Kontrolle von einem GOS2-Promotor (pGOS2) aus Reis.
Die 5 führt detaillierte Beispiele von Sequenzen auf, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Die 6 repräsentiert die Sequenz von einem Reis RAA1-ähnlichen Protein (SEQ ID NR: 121) mit den konservierten Signatursequenzen, die in fett unterstrichen sind.
Die 7 zeigt ein Multiples Alignment von mehreren RAA1-ähnlichen Proteinen. NP_001046787 entspricht Q0E1D7, NP_001052368 entspricht Q0JEF5, AAR97604 entspricht Q6RIBO, NP_001042631 entspricht Q9LGE3, NP_001045304 entspricht Q8LR63, NP_974763 entspricht Q9LXB5, NP_197868 entspricht O23624, NP_194866 entspricht Q5Q0B3, NP_001060595 entspricht Q8H475.
Die 8 zeigt ein phylogenetischen Stammbaum von RAA1-ähnlichen Polypeptiden (Ge et al., 2004). OsRAA1 entspricht SEQ ID NR: 121.
Die 9 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression in Oryza sativa von einer RAA1-Iike codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle von einem Reis GOS2-Promotor (pGOS2).
Die 10 führt detailliert Beispiele von Sequenzen auf, die bei der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Die 11 gibt einen Überblick über die konservierten Motive, die in der SEQ ID NR: 169 vorliegen. Die Leucin-reiche Domäne ist unterstrichen, die konservierten Motive 5, 6 und 7 sind fett markiert, und die Sequenz in Kursivschrift repräsentiert die mutmaßliche N-Glycosylierungsstelle mit der mutmaßlichen Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstelle.
Die 12 zeigt ein Multiples Alignment von verschiedenen SYR-Proteinen. Die Sternchen geben identische Aminosäurereste an, die Doppelpunkte repräsentieren stark konservierte Substitutionen, und die Punkte repräsentieren weniger konservierte Substitutionen. Mit der Information von 11, können die verschiedenen Domänen und konservierten Motive in der SEQ ID NR: 171 leicht in den anderen SYR-Proteinen identifiziert werden.
Die 13 zeigt den binären Vektor pGOS2::SYR zur Transformation und Expression in Oryza sativa von einer Oryza sativa SYR-Nukleinsäure unter der Kontrolle von einem Reis GOS2-Promotor.
Die 14 zeigt detailliert Beispiele von Sequenzen, die bei der Durchführung von Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, oder bei der Isolierung von solchen Sequenzen brauchbar sind. Sequenzen können von öffentlichen EST-Konstruktionen resultieren, mit einer Sequenzierung geringerer Qualität. Als eine Folge können einige Nukleinsäuresubstitutionen erwartet warden. Sowohl 5'- als auch 3'-UTRs können ebenfalls für die Durchführung der Verfahren der Erfindung verwendet warden. Die SEQ ID NR: 193 repräsentiert die ARGOS-Proteinsequenz (GenBank-Zugangsnummer AY305869).
Die 15 repräsentiert die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 213. Die konservierten Domänen pfamB2828 und ZfC3H2C3 (pfam00097) sind in fett deutlich gemacht bzw. Buchstaben sind unterstrichen. Das stark konservierte Motiv 8 ist durch eine gepunktete Linie unterstrichen. Die am stärksten konservierten Aminosäurereste in ARKL-Polypeptiden sind in einen Kasten gesetzt. Die konservierten Amino-Metall-Ligandenpositionen (Nummern) und Zink (Zn² ⁺) koordinierenden Aminosäurepaare sind veranschaulicht.
Die 16 repräsentiert ein Multiples Alignment von ausgewählten ARKL-Polypeptiden. Stark konservierte Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz angegeben. Wie in der Figur gezeigt, ist die Sequenz von dem C-Terminus von ARKL-Polypeptiden is stärker konserviert als der N-Terminus.
Die 17 zeigt einen phylogenetischen Stammbaum von ARKL-Polypeptiden, basierend auf einem Alignment von der RING-Finger (pfam00097)-Domäne, die in ARKL-Polypeptiden beinhaltet ist, wie repräsentiert durch die SEQ ID NR: 306–314, 316–318, 322, 323, 402 (SEQ ID NR: 402 umfasst die pfam00097 (RING-Zinkfinger)-Domäne, die in dem Akadia-Polypeptid von Mus musculus vorliegt, und die SEQ ID NR: 403 repräsentiert die pfam00097-Domäne, wie sie in dem Goliath-Polypeptid von Mus musculus vorliegt. Verwendete Abkürzungen: Os: Oryza sativa (Orysa); Hv: Hordeum vulgare (Horvu); Gm: Glycine max (Glyma); Zr: Zea mays (Zeama); Musmu: Mus musculus.
Die 18 repräsentiert den binären Vektor für erhöhte Expression von OS_ARKL1-Nukleinsäure, wie durch die SEQ ID NR: 212 repräsentiert, unter der Kontrolle von einem Reis GOS2-Promotor (pGOS2).
Die 19 führt detailliert Beispiele von Sequenzen auf, die in der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Die 20 repräsentiert die Sequenz von YTP1 (SEQ ID NR: 409). Transmembrane Domänen sind eingekastet. Ein Teil von einer DUF221-Domäne aus 124 Aminosäureresten ist durch eine Fettformatierung deutlich gemacht worden. Das Motiv 8 ist unterstrichen. Invariable Reste im Motiv 8 sind mit einem größeren Buchstabentyp angegeben. Es wird vorhergesagt, dass die erste und dritte Schlaufe auf der Aussenseite der Membran lokalisiert sind; die zweite Schlaufe an der Innenseite.
Die 21 zeigt einen phylogenetischen Stammbaum einer Auswahl von YTP-Polypeptiden.
Die 22 repräsentiert ein Multiples Alignment von ausgewählten YTP-Polypeptiden. Eine Consensus-Sequenz, wie durch die SEQ ID NR: 544 repräsentiert, ist angeführt. Konservierte Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz angegeben; Leerstellen repräsentieren Regionen mit niedriger Konservierung.
Die 23 repräsentiert den binären Vektor zur erhöhten Expression in Oryza sativa von einer YTP1-codierenden Nukleinsäure unter der Kontrolle von einem Reis GOS2-Promotor (pGOS2).
Die 24 führt detailliert Beispiele von Sequenzen auf, die bei der Durchführung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung brauchbar sind.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche nur zur Veranschaulichung angeführt werden. Die folgenden Beispiele sind nicht dazu gedacht, den Umfang der Erfindung vollständig zu definierten oder ihn in anderer Weise zu begrenzen.
DNA-Manipulation: wenn nichts anderes angegeben ist, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: ein Laborhandbuch, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind, durchgeführt. Standardmaterialien and -verfahren für die molekulare Arbeit mit Pflanzen sind im Pflanze Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, publiziert von BIOS Scientific Publications Ltd (UK) und Blackwell Scientific Publications (UK), beschrieben.
Beispiel 1: Identifizierung von Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, welche in den Verfahren der Erfindung verwendet wird
Sequenzen (Voll-Längen-cDNA, ESTs oder genomisch), die mit der Nukleinsäuresequenz, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, verwandt sind, wurden unter jenen identifiziert, die in der Entrez-Nukleotiden-Datenbank von dem „National Center for Biotechnology Information (NCBI)” bewahrt werden, und zwar unter Verwendung der Datenbank-Sequenzsuchwerkzeuge, wie dem „Basic Local Alignment Tool” (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–410; und Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402). Das Programm wird verwendet, um Regionen von lokaler Ähnlichkeit zwischen Sequenzen zu finden, indem Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen mit Sequenz-Datenbanken verglichen werden und die statistische Signifikanz von Übereinstimmungen errechnet wird. Zum Beispiel wurde das Polypeptid, welches durch die Nukleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung codiert wird, für den TBLASTN-Algorithmus verwendet, und zwar mit Default-Einstellungen bzw. Voreinstellungen und jenem Filter, um die Auslösung durch Sequenzen mit niedriger Komplexität zu ignorieren. Der Output der Analyse geschah durch paarweisen Vergleich und wurde gemäß des Wahrscheinlichkeitswerts (E-Wert) eingestuft, wobei der Wert die Wahrscheinlichkeit reflektiert, dass ein bestimmtes Alignment zufällig auftritt (je kleiner der E-Wert, desto signifikanter der Treffer). Zusätzlich zu den E-Werten wurden Vergleiche ebenfalls durch die prozentuale Identität bewertet. Die prozentuale Identität bezieht sich auf die Anzahl von identischen Nukleotiden (oder Aminosäuren) zwischen den zwei verglichenen Nukleinsäuresequenzen(oder Polypeptid)-Sequenzen über eine bestimmte Länge. In einigen Fällen können die Default-Parameter eingestellt werde, um die Stringenz der Suche zu modifizieren. Zum Beispiel kann der E-Wert erhöht werden, um weniger stringente Übereinstimmungen zu zeigen. Auf diese Weise können kurze, fast exakte Übereinstimmungen identifiziert werden.

Die Tabelle A liefert eine Liste von Nukleinsäure Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz in Bezug stehen, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Tabelle A1: Beispiele von GRF-Polypeptidsequenzen und codierenden Nukleinsäure-Sequenzen:

Name	Quellorganismus	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Polypeptid SEQ ID NR:	Datenbank Zugangsnummer
Arath_GRF_At3G13960.1	Arabidopsis thaliana	1	2	AT3G13960.1
Arath_GRF_At2G06200.1	Arabidopsis thaliana	3	4	At2G06200.1
Arath_GRF_At2G22840.1	Arabidopsis thaliana	5	6	At2G22840.1
Arath_GRF_At2G36400.1	Arabidopsis thaliana	7	8	At2G36400.1
Arath_GRF_At2G45480.1	Arabidopsis thaliana	9	10	At2G45480.1
Arath_GRF_At3G52910.1	Arabidopsis thaliana	11	12	At3G52910.1
Arath_GRF_At4G24150.1	Arabidopsis thaliana	13	14	At4G24150.1
Arath_GRF_At4G37740.1	Arabidopsis thaliana	15	16	At4G37740.1
Arath_GRF_At5G53660.1	Arabidopsis thaliana	17	18	At5G53660.1
Aqufo_GRF	Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens	19	20	DT756681.1 DR946716.1
Brana_GRF	Brassica napus	21	22	CN730217.1 ES922527
Horvu_GRF	Hordeum vulgare	23	24	AK250947.1
Lyces_GRF	Lycopersicon esculentum	25	26	BT013977.1
Medtr_GRF	Medicago truncatula	27	28	AC144645.17
Medtr_GRF like	Medicago truncatula	29	30	AC174350.4
Orysa_GRF_Os02g47280.2	Oryza sativa	31	32	Os02g47280.2
Orysa_GRF_Os02g53690.1	Oryza sativa	33	34	Os02g53690.1
Orysa_GRF_Os03g51970.1	Oryza sativa	35	36	Os03g51970.1
Orysa_GRF_Os04g48510.1	Oryza sativa	37	38	Os04g48510.1
Orysa_GRF_Os04g51190.1	Oryza sativa	39	40	Os04g51190.1
Orysa_GRF_Os06g02560.1	Oryza sativa	41	42	Os06g02560.1
Orysa_GRF_Os11g35030.1	Oryza sativa	43	44	Os11g35030.1
Orysa_GRF_Os12g29980.1	Oryza sativa	45	46	Os12g29980.1
Oyrsa_GRF_Os03g47140.1	Oryza sativa	47	48	Os03g47140.1
Orysa_GRF_gi_115447910_ref_NM_001054270.1	Oryza sativa	49	50	NM_001054270.1
Orysa_GRF_gi_115460325_ref_NM_001060298.1	Oryza sativa	51	52	NM_001060298.1
Orysa_GRF_gi_115471984_ref_NM_001066126.1	Oryza sativa	53	54	NM_001066126.1
Poptr_GRF_Icl_scaff_XIV.39	Populus tremuloides	55	56	Icl_scaff_XIV.39
Poptr_GRF_Icl_scaff_II.1070	Populus tremuloides	57	58	Icl_scaff_II.1070
Poptr_GRF_Icl_scaff_I.1018	Populus tremuloides	59	60	Icl_scaff_I.1018
Poptr_GRF_Icl_scaff_28.10	Populus tremuloides	61	62	Icl_scaff_28.10
Poptr_GRF_Icl_scaff_I.995	Populus tremuloides	63	64	Icl_scaff_I.995
Poptr_GRF_Icl_scaff_III.741	Populus tremuloides	65	66	Icl_scaff_II.741
Poptr_GRF_Icl_scaff_VII.1274	Populus tremuloides	67	68	Icl_scaff_VII.1274
Poptr_GRF_Icl_scaff_XII.277	Populus tremuloides	69	70	Icl_scaff_XII.277
Poptr_GRF_Icl_scaff_XIII.769	Populus tremuloides	71	72	Icl_scaff_XIII.769
Poptr_GRF_Icl_scaff_XIV.174	Populus tremuloides	73	74	Icl_scaff_XIV.174
Poptr_GRF_Icl_scaff_XIV.51	Populus tremuloides	75	76	Icl_scaff_XIV.51
Poptr_GRF_Icl_scaff_XIX.480	Populus tremuloides	77	78	Icl_scaff_XIX.480
Poptr_GRF_Icl_scaff_28.309	Populus tremuloides	79	80	Icl_scaff_28.309
Poptr_GRF_Icl_scaff_I.688	Populus tremuloides	81	82	Icl_scaff_I.688
Sacof_GRF	Saccharum officinarum	83	84	CA084837.1 CA238919.1 CAl22516.1
Vitvi_GRF	Vitis vinifera	85	86	AM468035
Zeama_GRF10_gi_146008494_gb_EF515849.1	Zea mays	87	88	EF515849.1
Zeama_GRF11_gi_146008515_gb_EF515850.1	Zea mays	89	90	EF515850.1
Zeama_GRF12_gi_146008534_gb_EF515851.1	Zea mays	91	92	EF515851.1
Zeama_GRF13_gi_146008539_gb_EF515852.1	Zea mays	93	94	EF515852.1
Zeama_GRF14_gi_146008560_gb_EF515853.1	Zea mays	95	96	EF515853.1
Zeama_GRF1_gi_146008330_gb_EF515840.1	Zea mays	97	98	EF515840.1
Zeama_GRF2_gi_146008352_gb_EF515841.1	Zea mays	99	100	EF515841.1
Zeama_GRF3_gi_146008368_gb_EF515842.1	Zea mays	101	102	EF515842.1
Zeama_GRF4_gi_146008393_gb_EF515843.1	Zea mays	103	104	EF515843.1
Zeama_GRF5_gi_146008412_gb_EF515844.1	Zea mays	105	106	EF515844.1
Zeama_GRF6_gi_146008429_gb_EF515845.1	Zea mays	107	108	EF515845.1
Zeama_GRF7_gi_146008440_gb_EF515846.1	Zea mays	109	110	EF515846.1
Zeama_GRF8_gi_146008461_gb_EF515847.1	Zea mays	111	112	EF515847.1
Zeama_GRF9_gi_146008475_gb_EF515848.1	Zea mays	113	114	EF515848.1

Tabelle A2: Beispiele von RAA1-ähnlichen Polypeptiden:

Pflanzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Q9LGE3	SEQ ID NR: 120	SEQ ID NR: 121
Q8H475	SEQ ID NR: 126	SEQ ID NR: 127
A3BNA1	SEQ ID NR: 128	SEQ ID NR: 129
O23624	SEQ ID NR: 130	SEQ ID NR: 131
Q8LR63	SEQ ID NR: 132	SEQ ID NR: 133
Q9LXB5	SEQ ID NR: 134	SEQ ID NR: 135
Q5Q0B3	SEQ ID NR: 136	SEQ ID NR: 137
Q7XX25	SEQ ID NR: 138	SEQ ID NR: 139
A2WN18	SEQ ID NR: 140	SEQ ID NR: 141
O24340	SEQ ID NR: 142	SEQ ID NR: 143
A2X4J6	SEQ ID NR: 144	SEQ ID NR: 145
Q0E1D7	SEQ ID NR: 146	SEQ ID NR: 147
O49587	SEQ ID NR: 148	SEQ ID NR: 149
A2XRE0	SEQ ID NR: 150	SEQ ID NR: 151
Q6R160	SEQ ID NR: 152	SEQ ID NR: 153
Q9LXB6	SEQ ID NR: 154	SEQ ID NR: 155
Q0JEF5	SEQ ID NR: 156	SEQ ID NR: 157
NP1050091	SEQ ID NR: 158	SEQ ID NR: 159
A5BZJ2	SEQ ID NR: 160	SEQ ID NR: 161

Zusätzlich zu den öffentlich verfügbaren Nukleinsäuresequenzen, die bei dem NCBI erhältlich sind, werden proprietäre Sequenzdatenbanken ebenfalls durchsucht, und zwar nach der gleichen Prozedur, wie hierin oben beschrieben.

Die Tabelle A3 liefert eine Liste von Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz, wie durch die SEQ ID NR: 168 repräsentiert, und der Proteinsequenz, die durch die SEQ ID NR: 169 repräsentiert ist, verwandt sind. Tabelle A3: Nukleinsäuresequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR: 168) verwandt sind, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, und die entsprechenden abgeleiteten Polypeptide.

Name	Quellorganismus	Polypeptid SEQ ID NR:	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Datenbank Zugangsnummer	Status
OsSYR	Oryza sativa	169	168	/	Voll-Länge oder partiell
Reis SYR-Homolog 1	Oryza sativa	179	194	XP_472637	Voll-Länge
Reis SYR-Homolog 2	Oryza sativa	180		AP008218	Voll-Länge
Mais SYR-Homolog	Zea mays	181	195	AY110705	partiell
Weizen SYR-Homolog	Triticum aestivum	182		/	Voll-Länge
Gersten SYR-Homolog	Hordeum vulgare	183	203	CB871444	Voll-Länge
Zuckerrüben SYR-Homolog 1	Saccharum officinarum	184	204	CA165713	partiell
Zuckerrüben SYR-Homolog 2	Saccharum officinarum	185	205	CA242805	Voll-Länge
Sorghum SYR-Homolog	Sorghum bicolor	186	206	CX611532	Voll-Länge
AtSYR-Homolog 1	Arabidopsis thaliana	187	207	NM_115853	Voll-Länge
AtSYR-Homolog 2	Arabidopsis thaliana	188	208	NM_180078	Voll-Länge
Trauben SYR-Homolog	Vitis vinifera	189	196	CF404276	Voll-Länge
Zitrus SYR-Homolog	Citrus reticulata	190	197	CF830612	partiell
Tomaten SYR-Homolog 1	Lycopersicon esculentum	191	199	AI774560	Voll-Länge
Tomaten SYR-Homolog 2	Lycopersicon esculentum	192	198	BG125370	Voll-Länge
Argos	Arabidopsis thaliana	193	209	AY305869	Voll-Länge

Tabelle A4: Beispiele von ARKL-Nukleinsäuren und den jeweils codierten Polypeptiden

Beschreibung*	Pflanzenquelle	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
Orysa_ARKL1	Oryza sativa	212	213
Orysa_ARKL2	Oryza sativa	214	215
Orysa_ARKL3	Oryza sativa	216	217
Orysa_ARKL4	Oryza sativa	218	219
Orysa_ARKL5	Oryza sativa	220	221
Orysa_ARKL6	Oryza sativa	222	223
Orysa_ARKL7	Oryza sativa	224	225
Orysa_ARKL8	Oryza sativa	226	227
Orysa_ARKL9	Oryza sativa	228	229
Zeama_ARKL1	Zea mays	230	231
Zeama_ARKL2	Zea mays	232	233
Horvu_ARKL1	Hordeum vulgare	234	235
Horvu_ARKL2	Hordeum vulgare	236	237
Horvu_ARKL3	Hordeum vulgare	238	239
Lyces_ARKL1	Lycopersicum esculentum	240	241
Lyces_ARKL2	Lycopersicum esculentum	242	243
Lyces_ARKL3	Lycopersicum esculentum	244	245
Glyma_ARKL1	Glycine max	246	247
Glyma_ARKL2	Glycine max	248	249
Zinel_ARKL1	Zinnia elegans	250	251
Lotja_ARKL1	Lotus japonicus	252	253
Arath_ARKL1	Arabidopsis thaliana	254	255
Arath_ARKL2	Arabidopsis thaliana	256	257
Arath_ARKL3	Arabidopsis thaliana	258	259
Arath_ARKL4	Arabidopsis thaliana	260	261
Arath_ARKL5	Arabidopsis thaliana	262	263
Arath_ARKL6	Arabidopsis thaliana	264	265
Arath ARKL7	Arabidopsis thaliana	266	267
Arath_ARKL8	Arabidopsis thaliana	268	269
Arath ARKL9	Arabidopsis thaliana	270	271
Arath_ARKL10	Arabidopsis thaliana	272	273
Arath_ARKL11	Arabidopsis thaliana	274	275
Arath_ARKL12	Arabidopsis thaliana	276	277
Poptr_ARKL1	Populus trichocarpa	278	279
Poptr_ARKL2	Populus trichocarpa	280	281
Poptr_ARKL3	Populus trichocarpa	282	283
Poptr_ARKL4	Populus trichocarpa	284	285
Poptr_ARKL5	Populus trichocarpa	286	287
Poptr_ARKL6	Populus trichocarpa	288	289
Poptr ARKL7	Populus trichocarpa	290	291
Poptr_ARKL8	Populus trichocarpa	292	293
Poptr_ARKL9	Populus trichocarpa	294	295
Poptr_ARKL10	Populus trichocarpa	296	297
Medtr_ARKL1	Medicago truncatula	298	299
Medtr_ARKL2	Medicago truncatula	300	301
Medtr_ARKL3	Medicago truncatula	302	303
Medtr_ARKL4	Medicago truncatula	304	305

*Orysa: Oryza sativa; Zeama: Zea mays; Horvu: Hordeum vulgare; Lyces: Lycopersicum esculentum; Glyma: Glycine max; Zinel: Zinnia elegans; Lotja: Lotus japonicus; Arath: Arabidopsis thaliana; Poptr: Populus thricocarpa; Medtr: Medicago truncatula.

Die Tabelle A5 liefert eine Liste von Nukleinsäure Sequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz verwandt sind, welche in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Tabelle A5: Beispiele von YTP-Nukleinsäuren und -Polypeptiden:

Name	Alternativname	Quellorganismus	Nukleinsäure SEQ ID NR:	Protein SEQ ID NR:
YTP1	YTP1_PARTIAL	Oryza sativa	408	409
YTP2	Os01g0534900 (768)	Oryza sativa	410	411
YTP3	Os01g0950900 (701)	Oryza sativa	412	413
YTP4	Os03g0137400 (792)	Oryza sativa	414	415
YTP5	Os03g0673800 (777)	Oryza sativa	416	417
YTP6	Os03g0726300 (743)	Oryza sativa	418	419
YTP7	Os05g0393800 (767)	Oryza sativa	420	421
YTP8	Os05g0594700 (766)	Oryza sativa	422	423
YTP9	Os07g0150100 (731)	Oryza sativa	424	425
YTP10	Os10g0579100 (810)	Oryza sativa	426	427
YTP11	Os12g0582800 (695)	Oryza sativa	428	429
YTP12	Os12g0633600 (763)	Oryza sativa	430	431
YTP13	AT1G10090 (762)	Arabidopsis thaliana	432	433
YTP14	AT1G11960 (375)	Arabidopsis thaliana	434	435
YTP15	AT1G30360 (724)	Arabidopsis thaliana	436	437
YTP16	AT1G58520 (657)	Arabidopsis thaliana	438	439
YTP17	AT1G62320 (769)	Arabidopsis thaliana	440	441
YTP18	AT1G69450 (711)	Arabidopsis thaliana	442	443
YTP19	AT3G01100 (596)	Arabidopsis thaliana	444	445
YTP20	AT3G21620 (756)	Arabidopsis thaliana	446	447
YTP21	AT3G54510 (617)	Arabidopsis thaliana	448	449
YTP22	AT4G02900 (806)	Arabidopsis thaliana	450	451
YTP23	AT4G04340 (772)	Arabidopsis thaliana	452	453
YTP24	AT4G15430 (761)	Arabidopsis thaliana	454	455
YTP25	AT4G22120 (771)	Arabidopsis thaliana	456	457
YTP26	AT4G35870 (817)	Arabidopsis thaliana	458	459
YTP27	AQGI.2hit1 partiell Aquilegia (PGI) (707)	Aquilegia species	460	461
YTP28	Icl_175_Medicago (712)	Medicago truncatula	462	463
YTP29	Icl_21269_Medicago (790)	Medicago truncatula	464	465
YTP30	Icl_24278_Medicago (766)	Medicago truncatula	466	467
YTP31	Icl_3723_Medicago (461)	Medicago truncatula	468	469
YTP32	Icl_scaff_1405.2 (301)	Populus trichocarpa	470	471
YTP33	Icl_scaff_1405.3 (276)	Populus trichocarpa	472	473
YTP34	Icl_scaff_166.26 (775)	Populus trichocarpa	474	475
YTP35	Icl_scaff_166.27 (774)	Populus trichocarpa	476	477
YTP36	Icl_scaff_29.271 (831)	Populus trichocarpa	478	479
YTP37	Icl_scaff_I.2570 (724)	Populus trichocarpa	480	481
YTP38	Icl_scaff_II.1056 (706)	Populus trichocarpa	482	483
YTP39	Icl_scaff_II.2075 (767)	Populus trichocarpa	484	485
YTP40	Icl_scaff_III.1644 (726)	Populus trichocarpa	486	487
YTP41	Icl_scaff_III.729 (516)	Populus trichocarpa	488	489
YTP42	Icl_scaff_IV.1089 (436)	Populus trichocarpa	490	491
YTP43	Icl_scaff_VIII.848 (714)	Populus trichocarpa	492	493
YTP44	Icl_scaff_XI.92 (546)	Populus trichocarpa	494	495
YTP45	Icl_scaff_XI.94 (708)	Populus trichocarpa	496	497
YTP46	Icl_scaff_XIV.1036 (846)	Populus trichocarpa	498	499
YTP47	Triae_TA80116_4565 (535)	Triticum aestivum	500	501
YTP48	volvox2_104236	Volvox carteri	502	503
YTP49	VOLVOX_95919	Volvox carteri	504	505
YTP50	chlamy-174910 (1129)	Chlamydomonas reinhardtii	506	507
YTP51	chlamy-194774 (1429)	Chlamydomonas reinhardtii	508	509
YTP52	ref_NP_014557.1_ (991)	Schizosaccharomyces pombe	510	511
YTP53	ref_NP_592939.1_ (871)	Ashbya gossypii	512	513
YTP54	ref_NP_984890.1_ (875)	Kluyveromyces lactis	514	515
YTP55	ref_XP_452699.1_ (967)	Saccharomyces cerevisiae	516	517

In einigen Fällen wurden verwandte Sequenzen von Forschungsinstitutionen versuchsweise zusammengefügt und öffentlich bekannt gemacht, wie dem Institut für genomische Forschung (The Institute for Genomic Research (TIGR)). Die ”Eukaryotic Gene Orthologs”(EGO)-Datenbank kann verwendet warden, um solche verwandten Sequenzen zu identifizieren, entweder durch eine Schlüsselwortsuche oder unter Anwendung des BLAST-Algorithmus mit der Nukleinsäuresequenz oder der Polypeptidsequenz von Interesse. In anderen Fällen wurden spezielle Nukleinsäuresequenz-Datenbanken für besondere Organismen kreiert, wie von dem „Joint Genome”-Institut, zum Beispiel für Pappel und Ostreococcus tauri.
Beispiel 2:
a) Alignment von GRF-Polypeptidsequenzen
Multiples Sequenzalignment von allen GRF-Polypeptidsequenzen in Tabelle A wurde unter Verwendung des AlignX-Algorithmus (aus Vector NTI 10.3, Invitrogen Corporation) durchgeführt. Die Ergebnisse des Alignments für die QLQ-Domäne von GRF-Polypeptiden aus der Tabelle A (wie durch die SEQ ID NR: 115 für SEQ ID NR: 2 repräsentiert) sind in der 2 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Die konservierten QLQ-Aminosäurereste sind oben in dem multiplen Alignment lokalisiert. Zwei andere stark konservierte Reste (in schwarz eingekastet) sind E (Glu) und P (Pro). Die Ergebnisse des Alignments für die WRC-Domäne von GRF-Polypeptiden aus der Tabelle A (wie durch die SEQ ID NR: 116 für SEQ ID NR: 2 repräsentiert) sind in 3 der vorliegenden Patentanmeldung gezeigt. Die konservierten WRC-Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz fett formatiert. Die drei Cys-Reste und ein His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H), bezeichnet als die Effector-of-Transcription(ET)-Domäne, sind vertikal über das Alignment eingekastet und ebenfalls am Boden des Alignment identifiziert.
b) Alignment von RAA1-ähnliche-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert (gap open penalty) ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert (gap extension penalty) von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zum weiteren Optimieren des Alignments wurde ein kleinere manuelle Editierung vorgenommen. Die Sequenzkonservierung zwischen RAA1-ähnlichen Polypeptiden liegt im Wesentlichen überall in der gesamten Sequenz vor, mit Ausnahme einer Gly- und/oder Ser-reichen Region in der N-terminalen Hälfte des Proteins. Die RAA1-ähnlichen Polypeptide sind in 7 aligniert.
c) Alignment von SYR_Polypeptidsequenzen
AlignX (Vector NTI, Invitrogen) basiert auf dem weitverbreiteten Clustal-Algorithmus für progressives Alignment (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Ein phylogenetischer Baum kann mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt werden. Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden).
Das Ergebnis des multiplen Sequenzalignments unter Verwendung von Polypeptiden, die zur Identifizierung von jenen relevant sind, die nützlich in der Ausführung der Verfahren der Erfindung sind, ist in 12 gezeigt. Der Leucin-reiche Repeat und die konservierten Motive können in den verschiedenen Sequenzen leicht unterschieden werden.
d) Alignment von ARKL-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zum weiteren Optimieren des Alignments kann ein kleinere manuelle Editierung vorgenommen werden. Die Sequenzkonservierung zwischen ARKL-Polypeptiden liegt im Wesentlichen im C-Terminus entlang der DAR1- und RING-H2-Domäne der Polypeptide vor, wobei die N-terminale Domäne gewöhnlich variabler hinsichtlich Sequenzlänge und -zusammensetzung ist. Die ARKL-Polypeptide sind in 16 aligniert.
Ein phylogenetischer Baum von ARKL-Polypeptiden (17) wurde mit Hilfe eines Neighbour-joining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt ist.
e) Alignment von YTP-Polypeptidsequenzen
Ein Alignment von Polypeptidsequenzen wurde unter Verwendung des Programms AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) durchgeführt, das auf dem weitverbreiteten Clustal W-Algorithmus für progressives Alignment basiert (Thompson et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4876–4882; Chenna et al. (2003). Nucleic Acids Res. 31: 3497–3500). Vorgabewerte sind für den Lückenöffnungsstrafwert ein Wert von 10, für den Lückenerweiterungsstrafwert von 0,1, und die gewählte Wichtungsmatrix ist Blosum 62 (wenn Polypeptide aligniert werden). Zum weiteren Optimieren des Alignments kann ein kleinere manuelle Editierung vorgenommen werden. Eine höhere Sequenzkonservierung zwischen YTP-Polypeptiden liegt im C-Terminus des Proteins von den Polypeptiden entlang der DUF221-Domäne vor. Die N-terminale Domäne ist gewöhnlich variabler hinsichtlich Sequenzlänge und -zusammensetzung. Die YTP-Polypeptide sind in 22 aligniert. Hochkonservierte Aminosäurereste sind in der Consensus-Sequenz angegeben (siehe 22).
Ein phylogenetischer Baum von YTP-Polypeptiden (21) wurde mit Hilfe eines Neighbourjoining-Clusterungsalgorithmus erstellt, wie er im Programm AlignX aus Vector NTI (Invitrogen) bereitgestellt ist. Wie in der 21 gezeigt ist, umfasst Gruppe 1 die YTP-Polypeptide, die sich mit SEQ ID NR: 409 (YTP1 in 21) einordnen lassen.
Beispiel 3: Berechnung der globalen prozentualen Identität zwischen Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Globale Prozentsätze der Ähnlichkeit und Identität zwischen Volllängen-Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind, wurden unter Anwendung eines der im Fachgebiet verfügbaren Verfahren bestimmt, nämlich der MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) Software (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generstes similarity/identity matrices using Protein oder DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; Software bereitgestellt von Ledion Bitincka). Die MatGAT-Software erzeugt Ähnlichkeit/Identitäts-Matrizen für DNA- oder Proteinsequenzen, ohne dass ein Voralignment der Daten benötigt wird. Das Programn vollführt eine Serie von paarweisen Alignments unter Anwendung des ”Myers and Miller”-Global-Alignment-Algorithmus (mit einem Lückenöffnungsstrafwert von 12, und einem Lücken-Erweiterungsstrafwert von 2), berechnet Ähnlichkeit und Identität zum Beispiel mit Hilfe der Blosum 62 (für Polypeptide), und plaziert die Ergebnisse dann in einer Distanzmatrix. Sequenzähnlichkeit ist in der Hälfte unter der Trennlinie gezeigt, und Sequenzidentität ist in der Hälfte oberhalb der diagonalen Trennlinie gezeigt.
Die im Vergleich verwendeten Parameter waren folgende:
Wertungsmatrix: Blosum62
Erstlücke: 12
Lückenerweiterung: 2
Ergebnisse der Software-Analyse sind in Tabelle B für die globale Ähnlichkeit und Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen hinweg gezeigt (unter Ausschluß der partiellen Polypeptidsequenzen).
Die prozentuale Identität zwischen den Voll-Längen-Polypeptidsequenzen, die bei der Durchführung der Verfahren der Erfindung brauchbar sind, kann so niedrig wie 15 Aminosäureidentität im Vergleich zur SEQ ID NR: 2. sein.
Die prozentuale Identität kann beträchtlich erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwichen der QLQ-Domäne SEQ ID NR: 2 (wie repräsentiert durch die SEQ ID NR: 115, beinhaltet in der SEQ ID NR: 2; die QLQ-Domäne von den GRF-Polypeptiden der Tabelle A, repräsentiert in der 2) und den QLQ-Domänen der Polypeptide, die in der Durchführung der Erfindung brauchbar sind, durchgeführt wird. In entsprechender Weise kann die prozentuale Identität beträchtlich erhöht werden, wenn die Identitätsberechnung zwischen der WRC-Domäne SEQ ID NR: 2 (wie repräsentiert durch die SEQ ID NR: 116, beinhaltet in der SEQ ID NR: 2; WRC-Domäne der GRF-Polypeptide von Tabelle A, repräsentiert in der 3) und den WRC-Domänen von den Polypeptiden, die in der Durchführung der Erfindung brauchbar sind, durchgeführt wird. Die prozentuale Identität über die QLQ-Domäne hinweg bezüglich der Polypeptidsequenzen, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung brauchbar sind, reicht von 25% bis 99% Aminosäureidentität, und die prozentuale Identität über die WRC-Domäne hinweg bezüglich der Polypeptidsequenzen, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung brauchbar sind, reicht von 60% bis 99% Aminosäureidentität. Wie ebenfalls in der 3 ersichtlich ist, ist die WRC-Domäne besser konserviert als die QLQ-Domäne bezüglich der unterschiedlichen GRF-Polypeptide, wie in der 2 gezeigt.
Die Prozentwerte bzgl. der Aminosäureidentität zwischen den QLQ-Domänen und die prozentuale Identität zwischen den WRC-Domänen sind signifikant höher als die prozentuale Aminosäureidentität, welche zwischen den Voll-Längen-GRF-Polypeptidsequenzen errechnet wurde.
Ergebnisse der Softwareanalyse, die auf das RAA1-ähnliche Polypeptid bezogen ist, sind in der Tabelle B2 für die globale Ähnlichkeit und die Identität über die volle Länge der Polypeptidsequenzen gezeigt. Die prozentuale Ähnlichkeit ist oberhalb der Diagonalen gezeigt, und die prozentuale Identität ist unterhalb der Diagonalen gezeigt (Fettansicht).
Die prozentuale Identität zwischen den RAA1-ähnlichen Polypeptidsequenzen, die in der Durchführung der Verfahren der Erfindung geeignet sind, kann sich auf so niedrig wie 31% Aminosäureidentität im Vergleich zur SEQ ID NR: 121 belaufen, wobei Q9LXB6 (SEQ ID NR: 155) keine Berücksichtigung findet.

Tabelle B5-2 zeigt die SEQ ID NR: entsprechend den Sequenzen, die in der Tabelle B5-1 verwendet wurden. Tabelle B5-2: DUF221-Domänen

Beschreibung	SEQ ID NR
YTP13_DUF221	530
YTP16_DUF221	533
YTP5_DUF221	522
YTP12_DUF221	529
YTP6_DUF221	523
YTP18_DUF221	525
YTP11_DUF221	528
YTP19_DUF221	536
YTP21_DUF221	538
YTP3_DUF221	520
YTP15_DUF221	532
YTP9_DUF221	526
YTP26_DUF221	543
YTP4_DUF221	521
YTP1_DUF221	518

Beispiel 4: Identifizierung von Domänen, enthalten in Polypeptidsequenzen, die zur Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Die ”Integrated Resource of Protein Families, Domains and Sites”(InterPro)-Datenbank ist eine integrierte Schnittstelle für häufig verwendeten Signaturdatenbanken für text- und sequenzbasierte Suchläufe. Die InterPro-Datenbank kombiniert diese Datenbanken, welche verschiedene Methodologien und unterschiedliche Klassen von biologischer Information über gut charakterisierte Proteine zum Ableiten von Proteinsignaturen verwendet. Zu kollaborierenden Datenbanken zählen SWISS-PROT, PROSITS, TrEMBL, PRINTS, ProDom und Pfam, Smart und TIGRFAMs. Interpro wird am 'European Bioinformatics Institute' in Großbritannien bereitgestellt.

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert, sind in der Tabelle C wiedergegeben. Tabelle C1: Ergebnisse des InterPro-Scans der von SEQ ID NR: 2 repräsentierten Polypeptidsequenz

InterPro-Zugangsnummer und -name	Name der integrierten Datenbank	Zugangsnummer in integrierter Datenbank	Zugangsname in integrierter Datenbank
IPR014977 WRC-Domäne	PFAM	PF08879	WRC
IPR014978 QLQ-Domäne	PFAM	PF08880	QLQ

Die Ergebnisse des InterPro-Scans der durch SEQ ID NR: 213 repräsentierten Polypeptidsequenz sind in der Tabelle C1 wiedergegeben. Tabelle C2-1: Ergebnisse des InterPro-Scans (Haupt-Zugangsnummern) der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 213 repräsentiert.

Suchgegenstand	InterPRO Zugangsnr.	Beschreibung Zugang Interpro	Such-Methode	durchsuchte Datenbank	Zugangsnr. in Datenbank	Aminosäure koordinaten auf der Suchsequenz	e-Wert
Orysa_ARKL1	IPR0013083	Zink-Finger, RING/FYVE/PHD-Typ	Gene3D	Gene3D	G3DSA: 3.30.40.10	315–365	1,5e–10
Orysa_ARKL1	IPR001841	Zink-Finger, Ring-Typ	HMM Smart	Smart	SM00184	319–359	7,4e–07
Orysa_ARKL1	keine IPR-Zugangsnr.	RING FINGER PROTEIN 24-RELATED	HMM Panther	Panther	PTHR22766	316–365	9,6e–12
Orysa_ARKL1	IPR001841	Zink-Finger, Ring-Typ	HMM Pfam	Pfam	PF00097	319–359	4,9e–09
Orysa_ARKL1	keine IPR-Zugangsnr.	NA*	HMM Pfam	Pfam	PF2828	266–296

Die Ta belle C2 gibt die SEQ ID NR: an, welche die konservierte RING-Domäne (ZfC3HC4) und DAR1 (PfamB2828) in den ARKL-Polypeptiden von Tabelle A umfasst. Tabelle C2-2. RING- und DAR1-Domänen in ARKL-Polypeptiden

Domäne	Referenzprotein	SEQ ID NR:
ZfC3HC4_Orysa_ARKL1	Orysa_ARKL1	306
ZfC3HC4_Orysa_ARKL3	Orysa_ARKL3	307
ZfC3HC4_Orysa_ARKL4	Orysa_ARKL4	308
ZfC3HC4_Orysa_ARKL5	Orysa_ARKL5	309
ZfC3HC4_Orysa_ARKL6	Orysa_ARKL6	310
ZfC3HC4_Orysa_ARKL7	Orysa_ARKL7	311
ZfC3HC4_Orysa_ARKL8	Orysa_ARKL8	312
ZfC3HC4_Orysa_ARKL9	Orysa_ARKL9	313
ZfC3HC4_Zeama_ARKL1	Zeama_ARKL1	314
ZfC3HC4_Zeama_ARKL2	Zeama_ARKL2	315
ZfC3HC4_Horvu_ARKL1	Horvu_ARKL1	316
ZfC3HC4Horvu_ARKL2	Horvu_ARKL2	317
ZfC3HC4_Horvu_ARKL3	Horvu_ARKL3	318
ZfC3HC4_Lyces_ARKL1	Lyces_ARKL1	319
ZfC3HC4_Lyces_ARKL2	Lyces_ARKL2	320
ZfC3HC4_Lyces_ARKL3	Lyces_ARKL3	321
ZfC3HC4_Glyma_ARKL1	Glyma_ARKL1	322
ZfC3HC4_Glyma_ARKL2	Glyma_ARKL2	323
ZfC3HC4_Zinel_ARKL1	Zinel_ARKL1	324
ZfC3HC4_Lotja_ARKL1	Lotja_ARKL1	325
ZfC3HC4_Arath_ARKL1	Arath_ARKL1	326
ZfC3HC4_Arath_ARKL2	Arath_ARKL2	327
ZfC3HC4_Arath_ARKL3	Arath_ARKL3	328
ZfC3HC4_Arath_ARKL4	Arath_ARKL4	329
ZfC3HC4_Arath_ARKL5	Arath_ARKL5	330
ZfC3HC4_Arath_ARKL6	Arath_ARKL6	331
ZfC3HC4_Arath_ARKL7	Arath_ARKL7	332
ZfC3HC4_Arath_ARKL8	Arath_ARKL8	333
ZfC3HC4_Arath_ARKL9	Arath_ARKL9	334
ZfC3HC4_Arath_ARKL10	Arath_ARKL10	335
ZfC3HC4_Arath_ARKL11	Arath_ARKL11	336
ZfC3HC4_Arath_ARKL12	Arath_ARKL12	337
ZfC3HC4_Poptr_ARKL1	Poptr_ARKL1	338
ZfC3HC4_Poptr_ARKL2	Poptr_ARKL2	339
ZfC3HC4_Poptr_ARKL3	Poptr_ARKL3	340
ZfC3HC4_Poptr_ARKL4	Poptr_ARKL4	341
ZfC3HC4_Poptr_ARKL5	Poptr_ARKL5	342
ZfC3HC4_Poptr_ARKL6	Poptr_ARKL6	343
ZfC3HC4_Poptr_ARKL7	Poptr_ARKL7	344
ZfC3HC4_Poptr_ARKL8	Poptr_ARKL8	345
ZfC3HC4_Poptr_ARKL9	Poptr_ARKL9	346
ZfC3HC4_Poptr_ARKL10	Poptr_ARKL10	347
ZfC3HC4_Medtr_ARKL1	Medtr_ARKL1	348
ZfC3HC4_Medtr_ARKL2	Medtr_ARKL2	349
ZfC3HC4_Medtr_ARKL3	Medtr_ARKL3	350
ZfC3HC4_Medtr_ARKL4	Medtr_ARKL4	351
PfamB2828_Orysa_ARKL1	Orysa_ARKL1	352
PfamB2828_Orysa_ARKL2	Orysa_ARKL2	353
PfamB2828_Orysa_ARKL3	Orysa_ARKL3	354
PfamB2828_Orysa_ARKL4	Orysa_ARKL4	355
PfamB2828_Orysa_ARKL5	Orysa_ARKL5	356
PfamB2828_Orysa_ARKL6	Orysa ARKL6	357
PfamB2828_Orysa_ARKL7	Orysa_ARKL7	358
PfamB2828_Orysa_ARKL8	Orysa_ARKL8	359
PfamB2828_Orysa_ARKL9	Orysa_ARKL9	360
Pfam62828_Zeama_ARKL1	Zeama_ARKL1	361
PfamB2828_Zeama_ARKL2	Zeama_ARKL2	362
Pfam62828_Horvu_ARKL1	Horvu_ARKL1	363
Pfam62828_Horvu_ARKL2	Horvu_ARKL2	364
PfamB2828_Horvu_ARKL3	Horvu_ARKL3	365
PfamB2828_Lyces_ARKL1	Lyces_ARKL1	366
PfamB2828_Lyces_ARKL2	Lyces_ARKL2	367
PfamB2828_Lyces_ARKL3	Lyces_ARKL3	368
PfamB2828_Glyma_ARKL1	Glyma_ARKL1	369
PfamB2828_Glyma_ARKL2	Glyma_ARKL2	370
PfamB2828_Zinel_ARKL1	Zinel_ARKL1	371
PfamB2828_Lotja_ARKL1	Lotja_ARKL1	372
PfamB2828_Arath_ARKL1	Arath_ARKL1	373
PfamB2828_Arath_ARKL2	Arath_ARKL2	374
PfamB2828_Arath_ARKL3	Arath_ARKL3	375
PfamB2828_Arath_ARKL4	Arath_ARKL4	376
Pfam62828_Arath_ARKL5	Arath_ARKL5	377
PfamB2828_Arath_ARKL6	Arath_ARKL6	378
PfamB2828_Arath_ARKL7	Arath_ARKL7	379
PfamB2828_Arath_ARKL8	Arath_ARKL8	380
PfamB2828_Arath_ARKL9	Arath_ARKL9	381
PfamB2828_Arath_ARKL10	Arath_ARKL10	382
PfamB2828_Arath_ARKL11	Arath_ARKL11	383
PfamB2828_Arath_ARKL12	Arath_ARKL12	384
PfamB2828_Poptr_ARKL1	Poptr_ARKL1	385
Pfam62828_Poptr_ARKL2	Poptr_ARKL2	386
PfamB2828_Poptr_ARKL3	Poptr_ARKL3	387
PfamB2828_Poptr_ARKL4	Poptr_ARKL4	388
PfamB2828_Poptr_ARKL5	Poptr_ARKL5	389
PfamB2828_Poptr_ARKL6	Poptr_ARKL6	390
PfamB2828_Poptr_ARKL7	Poptr_ARKL7	391
PfamB2828_Poptr_ARKL8	Poptr_ARKL8	392
PfamB2828_Poptr_ARKL9	Poptr_ARKL9	393
PfamB2828_Poptr_ARKL10	Poptr_ARKL10	394
PfamB2828_Medtr_ARKL1	Medtr_ARKL1	395
PfamB2828_Medtr_ARKL2	Medtr_ARKL2	396
PfamB2828_Medtr_ARKL3	Medtr_ARKL3	397
PfamB2828_Medtr_ARKL4	Medtr_ARKL4	398

Die Ergebnisse des Pfam-Suchlaufs der Polypeptidsequenz, wie durch die SEQ ID NR: 409 repräsentiert, sind in der Tabelle C3-1 (Zuverlässige Übereinstimmungen) und der Tabelle C2 (Übereinstimmungen zu Pfam-B) wiedergegeben. Tabelle C3-1: Zuverlässige Übereinstimmungen aus einer Pfam-Suche unter Verwendung von SEQ ID NR: 409 as Suchsequenz. Zuverlässige Übereinstimmungen sind höher als die 'gathering threshold' für die spezifische Domäne in Pfam. DUF221 ist eine Pfam-A-Domäne mit der Zugangsnummer PF02714.

Domäne Start Ende Bits E-Wert Alignment Modus

DUF221 305 411 44.10 2.3e–12 Align fs

Tabelle C3-2: Übereinstimmungen mit Pfam-B

Domäne Start Ende Alignment

Pfam-B_1332 1 110 Align

Pfam-B_4698 144 233 Align

Pfam-B_131006 234 304 Align
Beispiel 5: Vorhersage der subzellulären Lokalisierung der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind.
Experimentelle Verfahren zur Proteinlokalisierung reichen von der Immunlokalisierung bis zum Tagging von Proteinen unter Verwendung von Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) oder Beta-Glucoronidase (GUS). Zum Beispiel wurde ein GRF-Polypeptid, das an einem GUS-Reportergen fusioniert war, verwendet, um Zwiebel-Epidermiszellen transient zu transformieren (van der Knapp et al. (2000) Plant Phys. 122: 695–704). Der Zellkern wurde als das subzelluläre Kompartiment des GRF-Polypeptids identifiziert. Derartige Verfahren zum Identifizieren der subzellulären Kompartimentierung des GRF-Polypeptids sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Ein vorausgesagtes Kernlokalisationssignal (NLS) wurde durch multiples Sequenzalignment, gefolgt von visueller Inspektion, in der WRC-Domaine (CRRTDGKKWRC) des GRF-Polypeptids von Tabelle A gefunden. Bei einem NLS handelt es sich um eine oder mehrere kurze Sequenzen von positiv geladenen Lysinen oder Argininen.
Eine Computervorhersage der Proteinlokalisierung aus Sequenzdaten wurde durchgeführt. Unter den, einem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannten, Algorithmen sind bei den ExPASy-Proteomics-Werkzeugen, welche vom Schweizer Institut für Bioinformatik (Swiss Institute for Bioinformatics) bereitgestellt werden, beispielsweise PSort, TargetP, ChloroP, LocTree, Predotar, LipoP, MITOPROT, PATS, PTS1, Signale und andere verfügbar.

LOCtree ist ein Algorithmus, welcher die subzelluläre Lokalisierung und DNA-Bindungs-Neigung von Nicht-Membran-Proteinen in nicht-pflanzlichen und pflanzlichen Eukaryoten sowie Prokaryoten vorhersagen kann. LOCtree klassifiziert eukaryotische tierische Proteine in eine von fünf subzellulären Klassen, während pflanzliche Proteine in eine von sechs Klassen klassifiziert werden, und prokaryotische Proteine in eine von drei Klassen klassifiziert Die Tabelle D zeigt die Ausgabe von LOCtree unter Verwendung der Polypeptid-Sequenzinformation von SEQ ID NR: 2. Hohe Konfidenz-Vorhersagen weisen Zuverlässigkeits-Index-Werte (reliability index values) von mehr als 5 auf. Tabelle D Ausgabe von LOCtree unter Verwendung der Polypeptidsequenz-Information von SEQ ID NR: 2.

Vorhergesagte Lokalisierung	Zuverlässigkeits-Index	Zwischen-Lokalisierungsvorhersage (Ausgabe verschiedener SVMs im hierarchischen Baum)	Zuverlässigkeits-Index
DNA-Bindung	6	Nicht sezerniert, nukleär, DNA-bindend	8, 6, 9

Das vorhergesagte subzelluläre Kompartiment des GRF-Polypeptids, wie es durch die SEQ ID NR: 2 repräsentiert wird, unter Anwendung des LOCTree-Algorithmus ist der Zellkern.
Beispiel 6: Assay bezüglich der Polypeptidsequenzen, welche in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche GRF-Polypeptide (zumindest in ihrer nativen Form) besitzen in der Regel, aber nicht notwendigerweise, transkriptionsregulierende Aktivität und das Vermögen zum Wechselwirken mit anderen Proteinen. DNA-bindende Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen können leicht in vitro oder in vivo unter Anwendung von allgemein im Fachgebiet bekannten Techniken bestimmt werden (beispielsweise in: Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (1994), Current Protocols). GRF-Polypeptide sind zur transkriptionellen Aktivierung von Reportergenen in Hefezellen in der Lage (Kim & Kende (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101(36): 13374–13379).
GRF-Polypeptide sind ebenfalls in der Lage zum Wechselwirken mit GRF-interagierenden Faktor-Polypeptiden (GIF1 bis GIF3; ebenfalls bezeichnet als SYT1 bis SYT3) in vivo in Hefezellen bei Anwendung eines Hefe-Zwei-Hybrid-Protein-Protein-Interaktions-Assays (Kim & Kende, siehe oben). Auch In-vitro-Bindungsassays werden angewandt, um zu zeigen, dass GRF-Polypeptide und GIF-Polypeptide (ebenfalls bezeichnet als SYT-Polypeptide) interagierende Partner sind (Kim & Kende, siehe oben). Die in dieser Veröffentlichung beschriebenen Experimente sind nützlich beim Charakterisieren von GRF-Polypeptiden und sind im Fachgebiet allgemein bekannt.
Beispiel 7: Topologie-Vorhersage der Polypeptidsequenzen, die in der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
TargetP 1.1 sagt die subzelluläre Lokalisierung von eukaryotischen Proteinen voraus. Die Lagebestimmung bzw. Ortszuordnung basiert auf der vorhergesagten Gegenwart von einer beliebigen der N-terminalen Prä-Sequenzen: Chloroplasten-Transit-Peptid (cTP), mitochondriales Targeting-Peptid (mTP) oder Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid (SP). Wertungen, auf welchen die endgültige Vorhersage beruht, sind nicht wirklich Wahrscheinlichkeiten und sie addieren sich nicht notwendigerweise zu 1. Allerdings ist die Lage bzw. Lokalisierung mit der höchsten Bewertung gemäß TargetP am wahrscheinlichsten, und die Beziehung zwischen den Wertungen (die Zuverlässigkeitsklasse) kann eine Angabe sein, wie sicher die Vorhersage ist. Die Zuverlässigkeitsklasse bzw. ”Reliability Class” (RC) liegt im Bereich von 1 bis 5, wobei 1 die stärkste Vorhersage anzeigt. TargetP wird am Senner der Technischen Universität von Dänemark (Technical University of Denmark) bereitgestellt.
Für die Sequenzen, welche vorhergesagtermaßen eine N-terminale Präsequenz enthalten, kann ebenfalls eine potentielle Spaltungsstelle vorhergesagt werden.
Mehrere Parameter wurden ausgewählt, wie etwa Organismengruppe (Nicht-Pflanze oder Pflanze), Ausschluss-Einstellungen (keine, vordefinierte Einstellung der Ausschlussbedingungen, oder benutzerspezifizierte Einstellung von Ausschlussbedingungen), sowie die Berechnung der Vorhersage von Spaltungsstellen (ja oder nein).

Die Ergebnisse der TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie sie von SEQ ID NR: 121 repräsentiert ist, sind in der Tabelle E1 wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde angewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen (cutoffs) definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Bei der subzellulären Lokalisierung der durch die SEQ ID NR: 121 repräsentierten Polypeptidsequenz handelt es sich wahrscheinlich um das Cytoplasma, wobei kein Transitpeptid (SignalP) oder Kernlokalisationssignal (PredictNLS) vorhergesagt wird. Tabelle E1: TargetP1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 121

Länge (AS)	109
Chloroplasten-Transitpeptid	0,098
Mitochondriales Transitpeptid	0,404
Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid	0,025
Sonstiges subzelluläres Targeting	0,450
Vorhergesagte Lokalisierung	/
Zuverlässigkeitsklasse	5
Vorhergesagte Transitpeptid-Länge	/

Es können viele andere Algorithmen zur Durchführung derartiger Analysen verwendet werden, einschließlich:

• ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
• Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
• PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada;
• TMHMM, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark

Die Ergebnisse der TargetP1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 169 repräsentiert, sind in der Tabelle E2 wiedergegeben. Die Organismengruppe ”Pflanze” wurde gewählt, es wurden keine Ausschlussbedingungen (cutoffs) definiert, und die vorhergesagte Länge des Transitpeptids wurde angefordert. Die subzelluläre Lokalisierung der Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 169 repräsentiert, kann das Mitochondrion sein; es sollte jedoch angemerkt werden, dass es sich bei der Zuverlässigkeitsklasse um 5 handelt (d. h. die niedrigste Zuverlässigkeitsklasse). Tabelle E2: TargetP 1.1-Analyse der Polypeptidsequenz, wie repräsentiert von SEQ ID NR: 169

Länge (AS)	105
Chloroplasten-Transitpeptid	0,025
Mitochondriales Transitpeptid	0,552
Sekretorischer-Pfad-Signalpeptid	0,009
Sonstiges subzelluläres Targeting	0,416
Vorhergesagte Lokalisierung	Mitochondrion
Zuverlässigkeitsklasse	5

Zwei Transmembrandomänen werden durch das TMHMM-Programm, bereitgehalten auf dem Server des ”Center for Biological Sequence Analysis”, Technical University of Denmark, identifiziert. Die Wahrscheinlichkeit, dass der N-Terminus im Inneren lokalisiert ist, beläuft sich 0,997. Weitere Details über die Orientierung sind in der Tabelle F angegeben: Tabelle F: Ergebnisse von TMHMM 2.0

Orientierung Beginn-Ende-Rest

Innen 1 42

TM-Helix 43 65

Außen 66 74

TM-Helix 75 92

Innen 93 105
Viele weitere Algorithmen können angewandt werden, um derartige Analysen durchzuführen, einschließlich:
ChloroP 1.1, bereitgehalten auf dem Server der Technical University of Denmark;
Protein Prowler Subcellular Localisation Predictor Version 1.2, bereitgehalten auf dem Server des Institute for Molecular Bioscience, Universität von Queensland, Brisbane, Australien;
PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5, bereitgehalten auf dem Server der Universität von Alberts, Edmonton, Alberts, Canada;
Beispiel 8: Funktioneller Assay für die ARKL-Polypeptide
Der Ubiquitinylierungs-Assay wird im Wesentlichen durchgeführt, wie von Stone et al. 2005 beschrieben. GST-markiertes ARKL-Protein wird bei 30°C und bei einem pH-Wert von 7,5 mit Hefe-E1, gereinigtem E2 At UBCC8 und Ubiquitin (Sigma) inkubiert. Die Reaktion wird gestoppt und durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert, worauf ein Western-Blot unter Verwendung von Ubiquitin-Antikörpern folgt.
Zink-Chelatierungs-Experimente wurden durch Inkubieren von, an TPEN-behandelte Kügelchen gebundenem GST-ARKL-Protein mit ZnCl₂ ausgeführt.
Beispiel 9: Transmembran-Topologievorhersage der Polypeptidsequenzen, die bei der Ausführung der Verfahren der Erfindung nützlich sind
Der TMHMM V 2.0-Algorithmus (Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol., 305, 567–580) wurde angewandt, um Transmembran-Helizes in SEQ ID NR: 409 vorherzusagen.

Wie nachstehend gezeigt, gibt es 4 vorhergesagte Transmembran-Helizes. Die Position der Aminosäurereste für die Helizes ist ebenfalls angegeben. Der Vorhersage nach liegen die Schleifen zwischen den Transmembran-Helizes für die Schleifen zwischen den Resten 28–85 und 172–373 auf der Innenseite der Membran, und für die Schleife zwischen den Resten 109–151 auf der Außenseite.
# Sequenz Anzahl vorhergesagter TM-H's: 4
# Sequenz Exp Anzahl an Aminosäuren in TM-H's: 89,26923
# Sequenz Exp Anzahl, erste 60 Aminosäuren: 22,14249
# Sequenz Ges.-Wahrscheinl. für N-innen: 0,04519
# Sequenz MÖGLICHE N-term. Signalsequenz Start End (Aminosäure-Koordinate)

Sequenz TMHMM2.0	Außen	1	4
Sequenz TMHMM2.0	TM-Helix	5	27
Sequenz TMHMM2.0	Innen	28	85
Sequenz TMHMM2.0	TM-Helix	86	108
Sequenz TMHMM2.0	Außen	109	151
Sequenz TMHMM2.0	TM-Helix	152	171
Sequenz TMHMM2.0	Innen	172	373
Sequenz TMHMM2.0	TM-Helix	374	396
Sequenz TMHMM2.0	Außen	397	428

Beispiel 10:
a) Klonierung der Nukleinsäuresequenz, wie von SEQ ID NR: 1 repräsentiert
Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laborstory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Die Arabidopsis thaliana-cDNA, welche die GRF-Polypeptidsequenz, wie durch SEQ ID NR: 2 repräsentiert, codiert, wurde mittels PCR unter Verwendung einer Arabidopsis-cDNA-Bank synthetisiert aus mRNA, welche aus gemischten Pflanzengeweben extrahiert worden war, als Matrize amplifiziert. Es wurden die folgenden Primer, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, für die PCR-Amplifikation verwendet:

1) Prm 10010 (SEO ID NR: 118, Sense):
2) Prm 10011 (SEQ ID NR: 119, rückwärts, komplementär):

Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der erwarteten Länge (beinhaltend die attB-Stellen) wurde amplifiziert und ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde danach ausgeführt, wobei darin das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombinierte, wodurch gemäß der Gateway-Terminologie ein ein ”Eintritts-Klon” hergestellt wurde. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
b) Klonierung der Nukleinsäuresequenz, codierend RAA1-ähnliche Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Oryza sativa-Setzlingen (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung der Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm09129 (SEQ ID NR: 122; Sense, Startcodon in Fettdruck):
und prm09988 (SEQ ID NR: 123; rückwärts, komplementär):
welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, wobei während dieser das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon”, pRAA1-like, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
c) Genklonierung der Nukleinsauresequenz, die SYR-Polypeptide codiert
DNA-Manipulierung: Außer es ist anderweitig angegeben, werden rekombinante DNA-Techniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, die in (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) oder in den Bänden 1 und 2 von Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, beschrieben sind. Standardmaterialien und -verfahren für molekulares Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd (Großbritannien) sowie Blackwell Scientific Publications (Großbritannien), beschrieben.
Das Oryza sativa-SYR-Gen wurde durch PCR amplifiziert, wobei eine Oryza sativa-Setzling-cDNA-Bibliothek (Invitrogen, Paisley, UK) als Matrize verwendet wurde. Nach der reversen Transkription von aus Setzlingen extrahierter RNA wurden die cDNAs in pCMV Sport 6.0 kloniert. Die durchschnittliche Insertgröße der Bank belief sich auf 1,5 kb, und die Ursprungszahl an Klonen lag in der Größenordnung von 1,59 × 10⁷ cfu. Es wurde bestimmt, dass der Ursprungstiter 9,6 × 10⁵ cfu/ml nach der ersten Amplifikation von 6 × 10¹¹ cfu/ml, beträgt. Nach der Plasmidextraktion wurden 200 ng Matrize in einem 50 μl-PCR-Mix verwendet. Es wurden die Primer prm08170 (SEQ ID NR: 170; Sense, Startcodon in Fettdruck, AttB1-Stelle in Kursivdruck:
sowie prm08171 (SEQ ID NR: 171; rückwärts, komplementär, AttB2-Stelle in Kursivdruck:
verwendet, welche die AttB-Stellen für Gateway-Rekombination einschließen, für die PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polypermase bei Standardbedingungen durchgeführt. Ein PCR-Fragment der korrekten Größe wurde ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren amplifiziert und gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, wobei während dieser das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon”, pSYR, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
d) Klonierung der Nukleinsäuresequenz, codierend ARKL-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Setzlingen und Rispen von Oryza sativa (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde unter Verwendung von Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen mit der Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren prm04873 (SEQ ID NR: 404; Sense, Startcodon in Fettdruck):
und prm04874 (SEQ ID NR: 405; rückwärts, komplementär):
welche die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, wobei während dieser das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon”, pARKL, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
e) Klonierung der Nukleinsäuresequenz, codierend YTP-Polypeptide, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden
Die in den Verfahren der Erfindung verwendete Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei als Matrize eine maßgeschneiderte cDNA-Bibliothek aus Setzlingen von Oryza sativa (in pCMV Sport 6.0; Invitrogen, Paisley, Großbritannien) verwendet wurde. Die PCR wurde mit Hilfe der Hifi Taq-DNA-Polymerase bei Standardbedingungen unter Verwendung von 200 ng Matrize in einem 50 μl PCR-Mix durchgeführt. Die verwendeten Primer waren (SEQ ID NR: 546; Sense, Startcodon in Fettdruck):
und (SEQ ID NR. 547; rückwärts, komplementär):
welche die AttB-Stellen für die Gateway-Rekombination einschließen. Das amplifizierte PCR-Fragment wurde ebenfalls unter Anwendung von Standardverfahren gereinigt. Der erste Schritt des Gateway-Vorgehens, die BP-Reaktion, wurde dann durchgeführt, wobei während dieser das PCR-Fragment in vivo mit dem pDONR201-Plasmid rekombiniert, wodurch, gemäß der Gateway-Terminologie, ein ”Eintritts-Klon”, pENTR-YTP1, hergestellt wird. Das Plasmid pDONR201 wurde von Invitrogen, als Teil der Gateway^®-Technologie, käuflich erworben.
Beispiel 11:
a) Expressionsvektor-Konstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie von SEQ ID NR: 1 repräsentiert
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 1, wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 117) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::GRF (4) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stramm LBA4044 transformiert.
b) Expressionsvektor-Konstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie von SEQ ID NR: 120 repräsentiert
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 120, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 124) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. In einer alternativen Ausführungsform, war ein Reis-HMGP-Promotor (SEQ ID NR: 125) für konstitutive Expression stromaufwärts der Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::RAA1-like (9) oder pHMGP::RAA1-Iike gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stramm LBA4044 transformiert.
c) Expressionsvektor-Konstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, die SYR-Polypeptide codiert
Der Eintritts-Klon pSYR wurde anschließend in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Sequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 211) für konstitutive Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert. Ein ähnliches Vektorkonstrukt wurde hergestellt, jedoch mit dem ”High mobility group”-Protein-Promotor (HMGP, SEQ ID NR: 200 oder SEQ ID NR: 210) anstatt des GOS-Promotors.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurden die resultierenden Expressionsvektoren, pGOS2::SYR (mit dem GOS2-Promotor) und pHMGP::SYR (mit dem HMGP-Promotor), beide für konstitutive SYR-Expression (13), in den Agrobacterium-Stramm LBA4044 und anschließend in Oryza sativa-Pflanzen transformiert.
d) Expressionsvektor-Konstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 212
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 212, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 406) für wurzelspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::ARKL (18) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stramm LBA4044 transformiert.
e) Expressionsvektor-Konstruktion unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 408
Der Eintritts-Klon, umfassend SEQ ID NR: 408, wurde dann in einer LR-Reaktion mit einem zur Oryza sativa-Transformation verwendeten Destinationsvektor eingesetzt. Dieser Vektor enthielt als funktionelle Elemente innerhalb der T-DNA-Borders: einen selektierbaren pflanzlichen Marker; eine screenbare Marker-Expressionskassette; und eine Gateway-Kassette, gedacht zur LR-In-vivo-Rekombination mit der bereits im Eintritts-Klon klonierten Nukleinsäuresequenz von Interesse. Ein Reis-GOS2-Promotor (SEQ ID NR: 548) für wurzelspezifische Expression war stromaufwärts dieser Gateway-Kassette lokalisiert.
Nach dem LR-Rekombinationsschritt wurde der resultierende Expressionsvektor pGOS2::YTP1 (23) gemäß im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren in den Agrobacterium-Stramm LBA4044 transformiert.
Beispiel 12: Pflanzentransformation
Transformation von Reis
Das Agrobacterium, welches den Expressionsvektor enthielt, wurde zum Transformieren von Oryza sativa-Pflanzen verwendet. Reife trockene Samen des Reis-japonica-Kultivars Nipponbare wurden einer Enthülsung unterzogen. Die Sterilisierung wurde durchgeführt mittels Inkubieren während einer Minute in 70% Ethanol, gefolgt von 30 Minuten in 0,2% HgCl₂, gefolgt von sechsmaligem, 15-minütigem Waschen mit sterilen destilliertem Wasser. Die sterilen Samen wurden dann auf einem Medium auskeimen gelassen, welches 2,4-D enthielt (Callus-Induktions-Medium). Nach vierwöchiger Inkubation im Dunklen wurden embryogene, vom Scutellum abgeleitete Calli herausgeschnitten und auf dem gleichen Medium vermehrt. Nach zwei Wochen wurden die Calli vervielfältigt oder vermehrt durch Subkultivierung auf dem gleichen Medium während weiterer 2 Wochen. Embryogene Callus-Stücke wurden drei Tage vor der Cokultivierung auf frischem Medium subkultiviert (zur Steigerung der Zellteilungsaktivität).
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, welcher jeden individuellen Expressionsvektor enthielt, wurde unabhängig für die Co-Kultivierung verwendet. Agrobacterium wurde auf AB-Medium mit den geeigneten Antibiotika inokuliert und drei Tage lang bei 28°C kultiviert. Die Bakterien wurden dann abgesammelt und in flüssigem Cokultivierungs-Medium bis zu einer Dichte (OD₆₀₀) von etwa 1 suspendiert. Die Suspension wurde dann in eine Petrischale überführt, und die Calli wurden 15 Minuten lang in der Suspension eingetaucht. Die Callusgewebe wurden dann auf einem Filterpapier trocken getupft und auf verfestigtes, Cokultivierungs-Medium überführt und 3 Tage lang im Dunklen bei 25°C inkubiert. Cokultivierte Calli wurden auf 2,4-D-enthaltendem Medium 4 Wochen lang im Dunklen bei 28°C in Gegenwart eines Selektionsmediums wachsen gelassen. Während dieser Periode entwickelten sich rasch wachsende, resistente Callus-Inseln. Nach dem Übertragen dieses Materials zu einem Regenerationsmedium und Inkubation bei Licht, wurde das embryogene Potential freigesetzt, und Sprosse entwickelten sich in den nächsten vier bis fünf Wochen. Die Sprosse wurden aus den Calli herausgeschnitten und 2 bis 3 Wochen lang auf Auxin-enthaltendem Medium inkubiert, von welchem sie in den Erdboden überführt wurden. Gehärtete Sprosse wurden unter hoher Feuchtigkeit und bei kurzen Tagen in einem Gewächshaus wachsen gelassen.
Ungefähr 35 unabhängige TO-Reis-Transformanten wurden für jedes Konstrukt erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus überführt. Nach einer quantitativen PCR-Analyse zur Bestätigung der Kopienzahl des T-DNA-Inserts wurden lediglich transgene Einzelkopie-Pflanzen, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel zeigen, für die Ernte von T1-Samen beibehalten. Die Samen wurden anschließend drei bis fünf Monate nach dem Umpflanzen geerntet. Das Verfahren ergab Einzel-Locus-Transformanten bei einer Rate von über 50% (Aldemita und Hodges 1996, Chan et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Beispiel 13: Vorgehen zur phänotypischen Auswertung
13.1-1 Allgemeiner Auswertungsansatz
Ungefähr 35 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Kultivieren und Ernten von T1-Samen überführt. Sechs Ereignisse, bei denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die transgenen Pflanzen und die entsprechenden Nullizygoten wurden an zufälligen Positionen Seite an Seite wachsen gelassen. Die Gewächshausbedingungen bestanden in kurzen Tagen (12 Stunden Licht), 28°C im Licht und 22°C im Dunklen, sowie einer relativen Feuchtigkeit von 70%.
13.1-2 Auswertungsansatz für Pflanzen, welche mit SYR unter der Steuerung des Reis-GOS2-Promotors oder des HMGP-Promotors transformiert wurden.
Ungefähr 15 bis 20 unabhängige T0-Reis-Transformanten wurden erzeugt. Die primären Transformanten wurden aus einer Gewebekulturkammer in ein Gewächshaus zum Heranzüchten und Ernten von T1-Samen überführt. Acht Ereignisse, von denen die T1-Nachkommenschaft hinsichtlich Gegenwart/Abwesenheit des Transgens bei 3:1 segregierte, wurden beibehalten. Für jedes dieser Ereignisse wurden ungefähr 10 T1-Setzlinge, enthaltend das Transgen (Hetero- und Homozygote) und ungefähr 10 T1-Setzlinge, denen das Transgen fehlte (Nullizygote), durch Überwachen der Expression des sichtbaren Markers selektiert. Die ausgewählten T1-Pflanzen wurden in ein Gewächshaus überführt. Jede Pflanze erhielt ein einmaliges Strichcode-Etikett, um die Phänotypierungs-Daten unzweideutig mit der entsprechenden Pflanze zu verknüpfen. Die ausgewählten T1-Pflanzen wurden auf Erdboden in Blumentöpfen mit einem Durchmesser von 10 cm bei den folgenden Umweltbedingungen wachsen gelassen: Photoperiode = 11,5 h, Tageslicht-Intensität = 30000 Lux oder mehr, Tages-Temperatur = 28°C oder höher, Nacht-Temperatur = 22°C, relative Feuchtigkeit = 60–70%.
Allgemeiner Ansatz
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Vier T1-Ereignisse wurden in der T2-Generation weiter ausgewertet, wobei man demselben Auswertungsvorgehen wie für die T1-Generation, jedoch mit mehr Individuen pro Ereignis, folgte. Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
13.2 Statistische Analyse: F-Test
Eine Zwei-Faktor-ANOVA (Analyse von Varianten) wurde als ein statistisches Modell für die Gesamtauswertung von phänotypischen Pflanzenmerkmalen verwendet. Ein F-Test wurde bei allen gemessenen Parametern von allen Pflanzen von allen Ereignissen, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung transformiert waren, durchgeführt. Der F-Test wurde durchgeführt, um eine Prüfung hinsichtlich eines Effekts des Gens über alle Transformationsereignisse hinweg vorzunehmen und einen Gesamteffekt des Gens, ebenfalls bekannt als globaler Geneffekt, zu bestätigen. Der Schwellenwert der Signifikanz für einen echten globalen Geneffekt wurde bei einer 5%-Wahrscheinlichkeitsstufe für den F-Test festgelegt. Ein signifikanter F-Testwert deutet auf einen Geneffekt, was heißt, dass es nicht nur die bloße Gegenwart oder Position des Genes ist, welche die Unterschiede hinsichtlich des Phänotyps verursacht.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das verwendete Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) in Betracht zieht. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
Weil zwei Experimente mit überlappenden Ereignissen durchgeführt wurden, wurde eine kombinierte Analyse ausgeführt. Dies ist nützlich, um die Konsistenz der Effekte über die zwei Experimente hinweg zu überprüfen, und, sofern dies der Fall ist, Beweise aus beiden Experimenten zu sammeln, damit die Konfidenz bei der Schlussfolgerung erhöht wird. Das verwendete Verfahren war ein Misch-Modell-Vorgehen, welches die Mehrfachebenen-Struktur der Daten (d. h. Experiment-Ereignis-Segreganten) in Betracht zieht. P-Werte wurden durch Vergleichen des Wahrscheinlichkeitsverhältnis-Tests mit Chi-Quadrat-Verteilungen erhalten.
13.3 Gemessene Parameter
Biomassen-bezogene Parameter-Messung (allgemeines Verfahren)
Vom Stadium des Aussäens bis zum Stadium der Reife wurden die Pflanzen mehrmals durch eine digitale Bilderzeugungs-Kammer hindurchgeleitet. An jedem Zeitpunkt wurden Digitalbilder (2048×1536 Pixel, 16 Millionen Farben) von jeder Pflanze aus mindestens 6 verschiedenen Winkeln aufgenommen.
Die oberirdische Pflanzenfläche (oder blattartige Biomasse) wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln auf den Digitalbildern von oberirdischen Pflanzenteilen, die vom Hintergrund unterschieden wurden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche zum gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen worden waren, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimeter ausgedrückt wird. Experimente zeigen, dass die auf diese Weise gemessene oberirdische Pflanzenfläche mit der Biomasse der Pflanzenteile über der Erdoberfläche korreliert. Die oberirdische Fläche ist die Fläche, welche zu einem Zeitpunkt gemessen wird, an dem die Pflanze ihre maximale blattartige Biomasse erreicht hatte. Die Früh-Wuchskraft ist die oberirdische Pflanzen(Setzling)-Fläche drei Wochen nach der Keimung. Eine Erhöhung der Wurzelbiomasse wird als Erhöhung in der Gesamtwurzelbiomasse (gemessen als Maximumbiomasse der Wurzeln, die während der Lebensdauer einer Pflanze beobachtet wird) oder als Erhöhung im Wurzel/Spross-Index (gemessen als das Verhältnis zwischen Wurzelmasse und Sprossmasse in der Periode des aktiven Wachstums von Wurzel und Spross) ausgedrückt.
Die Früh-Wuchskraft wurde durch Zählen der Gesamtzahl an Pixeln von oberirdischen Pflanzenteilen, welche sich vom Hintergrund unterschieden, bestimmt. Dieser Wert wurde für die Bilder gemittelt, welche am gleichen Zeitpunkt aus den unterschiedlichen Winkeln heraus aufgenommen wurden, und wurde durch Kalibrierung in einen physikalischen Oberflächenwert umgewandelt, der in Quadratmillimeter ausgedrückt wird. Die nachstehend beschriebenen Ergebnisse gelten für Pflanzen drei Wochen nach der Keimung.
Messungen von Samen-bezogenen Parametern (allgemeines Verfahren)
Die reifen Hauptrispen wurden geerntet, gezählt, eingetütet, mit Strichcode etikettiert und dann drei Tage lang in einem Ofen bei 37°C getrocknet. Die Rispen wurden dann gedroschen, und alle Samen wurden gesammelt und gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden von den leeren Hülsen unter Verwendung einer Luftgebläsevorrichtung getrennt. Die leeren Hülsen wurden verworfen, und die verbleibende Fraktion wurde erneut gezählt. Die gefüllten Hülsen wurden auf einer Analysewaage abgewogen. Die Anzahl an gefüllten Samen wurde durch Zählen der Anzahl an gefüllten Hülsen bestimmt, welche nach dem Trennungsschritt verblieben. Das Gesamtsamengewicht pro Pflanze wurde durch Wiegen aller, von einer Pflanze abgeernteten, gefüllten Hülsen gemessen. Die Gesamtsamenzahl pro Pflanze wurde gemessen durch Zählen der Anzahl der von einer Pflanze geernteten Hülsen. Das Tausendkorngewicht (TKW) wird aus der Anzahl von gezählten, gefüllten Samen und ihrem Gesamtgewicht extrapoliert. Der Ernteindex (HI) ist in der vorliegenden Erfindung definiert als das Verhältnis zwischen dem Gesamtsamengewicht pro Pflanze und der oberirdischen Fläche (mm²), multipliziert mit einem Faktor 10⁶. Die Gesamtzahl an Blüten pro Rispe ist in der vorliegenden Erfindung als das Verhältnis zwischen der Gesamtzahl an Samen und der Anzahl an reifen Hauptrispen definiert. Die Samen-Füllrate, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, ist der Anteil (ausgedrückt als ein %-Wert) der Anzahl gefüllter Samen gegenüber der Gesamtzahl an Samen (oder Blütchen).
Screen der Stickstoffverwendungseffizienz (für Pflanzen, die mit SYR transformiert sind)
Reispflanzen aus T2-Samen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, mit Ausnahme der Nährstofflösung. Die Blumentöpfe wurden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt enthielt, üblicherweise zwischen 7- bis 8-mal weniger. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie für Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress wachsen gelassen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt ist.
Dürrestress-Screen (für Pflanzen, die mit SYR transformiert sind)
Reispflanzen aus T1, T2 oder weiteren Generationen wurden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Rispenschiebens näherten. Sie wurden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, worin die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden wurden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Als der SWC unter bestimmte Schwellenwerte sank, wurden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wurde. Die Pflanzen wurden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) war der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter wurden aufgezeichnet, wie für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt. Die angewandten Dürrebedingungen waren ”schwere Dürrebedingungen”, wie oben definiert.
Beispiel 14: Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz exprimieren, die ein GRF-Polypeptid, wie durch SEQ ID Nr: 2 repräsentiert, codiert
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID Nr: 2, codiert, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren, und welche unter normalen Wachstumsbedingungen wachsen gelassen wurden, sind nachstehend dargestellt.

Es bestand eine signifikante Erhöhung der Früh-Wuchskraft, der oberirdischen Biomasse, des Gesamtsamenertrags pro Pflanze, der Samen-Füllrate, des Ernteindex und des Tausendkerngewichtes (TKW) der transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), wie in Tabelle G gezeigt wird. Tabelle G: Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID Nr: 2, codiert, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimieren.

Eigenschaft	Gesamtdurchschnitt-% Erhöhung in 6 Ereignissen in der T1-Generation
Oberirdische Biomasse	2%
Früh-Wuchskraft	13%
Gesamtsamenertrag pro Pflanze	12%
Samen-Füllrate	5%
Ernteindex	11%
TKW	11%

Beispiel 15:
a) Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Reispflanzen, welche Nukleinsäuresequenzen exprimieren, die andere GRF-Polypeptide codieren
Transgene Reispflanzen wurden erzeugt, welche unabhängig voneinander die Nukleinsäuresequenzen, die andere GRF-Polypeptide codieren, wie in der nachstehenden Tabelle H gezeigt, unter der Kontrolle des GOS2-Promotors für konstitutive Expression exprimierten.
Es bestand eine Erhöhung des Tausendkerngewichts (TKW) der Samen von transgenen Pflanzen im Vergleich zu entsprechenden Nullizygoten (Kontrollen), für die drei Konstrukte. Diese Erhöhung war weniger ausgeprägt als bei den Samen transgener Pflanzen, welche die Nukleinsäuresequenz exprimieren, die das GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID Nr: 2, codiert. Tabelle H: Andere GRF-Nukleinsäure- und Polypeptidsequenzen, welche in transgenen Reispflanzen getestet wurden, unter der Steuerung des GOS2-Promotors für konstitutive Expression.

getestetes GRF-Polypeptid Nukleinsäure SEQ ID NR Polypeptid SEQ ID NR

AT4G37740 SEQ ID NR: 15 SEQ ID NR: 16

AT2G36400 SEQ ID NR: 7 SEQ ID NR: 8

AT2G22840 SEQ ID NR: 5 SEQ ID NR: 6
b) Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen, welche eine RAA1-ähnliche Nukleinsäure exprimieren
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine RAA1-ähnliche Nukleinsäure unter der Steuerung eines konstitutiven Promotors (ob GOS2 oder HMGP) unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, waren die Folgenden: eine Erhöhung von mindestens 2% wurde für das Tausendkerngewicht beobachtet, und eine Erhöhung von mehr als 5% wurde für mindestens einen der nachfolgenden Parameter beobachtet: Wurzel/-Sprossindex, Gesamtwurzelbiomasse, Blüten pro Rispe. Auch unter Bedingungen mit verringerter Stickstoffverfügbarkeit beobachtete man eine Erhöhung in einem oder mehreren von: Wurzelbiomasse, Höhe und Grünheits-Index.
c1) Messung ertragsbezogener Parameter für pGOS2::SYR-Transformanten, welche unter Bedingungen mit Nährstoffmangel kultiviert wurden:
Bei der Analyse der Samen, wie oben beschrieben, stellten die Erfinder fest, dass Pflanzen, welche mit dem pGOS2::SYR-Genkonstrukt transformiert und unter Nährstoffmangel-Stress wachsen gelassen worden waren, einen höheren Samenertrag, ausgedrückt als Anzahl an gefüllten Samen (Erhöhung von mehr als 5%), Gesamtgewicht der Samen (Erhöhung von mehr als 5%) und TKW (Erhöhung von mehr als 2,5%), im Vergleich zu Pflanzen aufwiesen, denen das SYR-Transgen fehlt. Es wurde außerdem eine Erhöhung in der Sprossbiomasse (mehr als 5%) und Wurzelbiomasse (bei mehreren Linien, mehr als 5%) beobachtet.
c2) Messung ertragsbezogener Parameter für pGOS2::SYR-Transformanten, welche unter Bedingungen von schwerem Dürre-Stress kultiviert worden waren:
Bei der Analyse der Samen, wie oben beschrieben, stellten die Erfinder fest, dass Pflanzen, welche mit dem pGOS2::SYR-Genkonstrukt transformiert und unter schwerem Dürre-Stress wachsen gelassen worden waren, einen höheren Samenertrag, ausgedrückt als Gesamtgewicht an Samen (Erhöhung von mehr als 5%), Füllrate (Erhöhung von mehr als 5%) und Ernteindex (Erhöhung von mehr als 5%), im Vergleich zu Pflanzen aufwiesen, denen das SYR-Transgen fehlte.
d) Ergebnisse der phänotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen, welche die Orysa_ARKL1-Nukleinsäure exprimieren
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche die Orysa_ARKL1-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend dargestellt. Für die Emergenz-Wuchskraft (Früh-Wuchskraft), den Gesamtsamenertrag, die Anzahl an gefüllten Samen, das Tausendkerngewicht und den Ernteindex wurde eine Erhöhung von mindestens 5%, und für das Tausendkerngewicht von 3%, beobachtet. Tabelle I. Ergebnisse der phänotypischen Auswertung.

Eigenschaft % Erhöhung in transgenen Pflanzen/Kontroll-Pflanzen unter Nicht-Stress-Bedingungen

Gesamt-Samenertrag 11

Zahl an gefüllten Samen 8

TKW 3

Früh-Wuchskraft 11

Ernteindex 6
Die transgenen Reispflanzen, welche die Orysa_ARKL1-Nukleinsäure exprimieren, wurden ebenfalls unter Dürrestress-Bedingungen, wie oben beschrieben, ausgewertet. Dieselben Parameter (Erhöhung hinsichtlich Samenertrag, Anzahl an gefüllten Samen, Früh-Wuchskraft und Ernteindex) waren ebenfalls in transgenen Pflanzen im Vergleich zu der entsprechenden Kontrollpflanze erhöht, wenngleich zu einem geringeren Ausmaß.
e) Ergebnisse der phanotypischen Auswertung der transgenen Pflanzen, weiche eine YTP1-Nukleinsäure exprimieren
Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine YTP1-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind nachstehend angegeben. Für Gesamtsamenertrag, Samen-Füllrate, Anzahl an Blüten pro Rispe, Ernteindex wurde eine Erhöhung von mindestens 5%, und für das Tausendkerngewicht von 2%, beobachtet.

Die Ergebnisse der Auswertung von transgenen Reispflanzen, welche eine YTP1-Nukleinsäure unter Nicht-Stress-Bedingungen exprimieren, sind hierin nachstehend dargestellt. Es wurde eine Erhöhung hinsichtlich Gesamtsamengewicht, Anzahl an gefüllten Samen, Füllrate, Ernteindex und Tausendkerngewicht beobachtet (Tabelle J). Tabelle J. Ergebnisse der phänotypischen Auswertung.

Ertragsbezogene Eigenschaft	% Erhöhung in den transgenen Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen
Gesamtsamengewicht	10
Samen-Füllrate	6
Blüten pro Rispe	7
Ernteindex	12
Tausendkerngewicht	2

Beispiel 16: Beispiele der Transformation von anderen Nutzpflanzen
Transformation von Mais
Die Transformation von Mais (Zea mays) wird mit einer Abwandlung des Verfahrens durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50, beschrieben ist.
Die Transformation in Mais ist Genotyp-abhängig, und nur spezifische Genotypen sind einer Transformation und Regeneration zuführbar. Die Inzucht-Linie A188 (University of Minnesota) oder Hybride mit A188 als einem Elternteil sind gute Quellen von Spendermaterial für eine Transformation, aber auch andere Genotypen können erfolgreich verwendet werden. Ähren werden aus der Maispflanze ungefähr 11 Tage nach der Bestäubung (DAP) abgeerntet, wenn die Länge des unreifen Embryos ungefähr 1 bis 1,2 mm beträgt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Herausgeschnittene Embryos werden auf Callus-Induktionsmedium und anschließend Mais-Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden 2–3 Wochen lang, oder bis sich der Spross entwickelt, im Licht bei 25°C inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Mais-Bewurzelungsmedium überführt und bei 25°C während 2–3 Wochen, bis sich die Wurzel entwickelt, inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Weizen-Transformation
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren durchgeführt, welches von Ishida et al. (1996) Nature Biotech 14(6): 745–50, beschrieben wurde. Üblicherweise wird das Kultivar Bobwhite (erhältlich von CIMMYT, Mexico) bei der Transformation verwendet. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches den Expressionsvektor enthält, cokultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Nach der Inkubation mit Agrobacterium werden die Embryonen in vitro auf Callus-Induktionsmedium, und dann Regenerationsmedium, welches das Selektionsmittel enthält (zum Beispiel Imidazolinon, wobei jedoch verschiedene Selektionsmarker verwendet werden können), wachsen gelassen. Die Petri-Schalen werden im Licht bei 25°C während 2–3 Wochen, oder bis sich Sprosse entwickeln, inkubiert. Die grünen Sprosse werden von jedem Embryo auf Bewurzelungsmedium überführt und während 2–3 Wochen, bis sich die Wurzeln entwickeln, bei 25°C inkubiert. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdboden im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Sojabohne
Sojabohne wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens transformiert, welches in U.S.-Patent 5 164 310 von Texas A&M beschrieben ist. Mehrere kommerzielle Sojabohnenvarietäten sind einer Transformation durch dieses Verfahren zugänglich. Üblicherweise wird das Kultivar Jack (erhältlich von der Illinois Seed Foundation) zur Transformation verwendet. Sojabohnensamen werden für das In-vitro-Ausäen sterilisiert. Das Hypokotyl, die Keimwurzel und ein Kotyledon werden aus sieben Tage alten jungen Setzlingen herausgeschnitten. Das Epikotyl und das verbleibende Kotyledon werden weiter wachsen gelassen, um axilläre Nodi zu entwickeln. Diese axillären Nodi werden herausgeschnitten und mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, welches den Expressionsvektor enthält. Nach der Cokultivierungsbehandlung werden die Explantate gewaschen und in Selektionsmedien überführt. Regenerierte Triebe bzw. Sprosse werden herausgeschnitten und auf ein Sprossverlängerungsmedium gebracht. Sprosse, welche nicht länger als 1 cm sind, werden auf Bewurzelungsmedium gebracht, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Raps/Canola
Kotyledonäre Petiolen bzw. Keimblattstiele sowie Hypokotyle von 5–6 Tage alten, Jungsämlingen werden als Explantate für die Gewebekultur verwendet und gemäß Babic et al. (1998, Plant Cell Rep 17: 183–188) transformiert. Das kommerzielle Kultivar Westar (Agriculture Canada) ist die zur Transformation verwendete Standardvarietät, aber auch andere Varietäten können verwendet werden. Canola-Samen werden für das In-vitro-Ausäen oberflächensterilisiert. Die Keimblattstiel-Explantate mit dem anhängigen Kotyledon werden von den In-vitro-Setzlingen abgeschnitten und mit Agrobacterium (enthaltend den Expressionsvektor) durch Eintauchen des Schnittendes des Blattstiel-Explantats in die Bakteriensuspension inokuliert. Die Explantate werden dann 2 Tage lang auf MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, 3% Saccharose, 0,7% Phytagar, bei 23°C, 16 Stunden Licht, kultiviert. Nach zwei Tagen Cokultivierung mit Agrobacterium werden die Blattstiel-Explantate in MSBAP-3-Medium, enthaltend 3 mg/l BAP, Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin (300 mg/l) während 7 Tagen überführt und danach auf MSBAP-3-Medium ohne Cefotaxim, Carbenicillin oder Timentin und Selektionsmittel bis zur Sprossregeneration kultiviert. Wenn die Sprosse 5–10 mm Länge aufweisen, werden sie abgeschnitten und auf Sprossverlängerungsmedium (MSBAP-0.5, enthaltend 0,5 mg/l BAP) überführt. Sprosse von etwa 2 cm Länge werden auf Bewurzelungsmedium (MSO) zur Wurzelinduktion überführt. Die bewurzelten Sprosse werden in Erdreich im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Alfalfa
Ein sich regenerierender Klon von Alfalfa (Medicago sativa) wird unter Anwendung des Verfahrens von (McKersie et al., 1999, Plant Physiol. 119: 839–847) transformiert. Die Regeneration und Tansformation von Alfalfa ist genotypabhängig, und daher wird eine sich regenerierende Pflanze benötigt. Verfahren zum Erhalten von regenerierenden Pflanzen sind beschrieben worden. Zum Beispiel können diese aus dem Kultivar Rangelander (Agriculture Canada) oder einer beliebigen anderen kommerziellen Alfalfa-Varietät ausgewählt werden, wie es durch Brown, DCW, und A. Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4: 111-112) beschrieben wurde. Alternativ dazu ist die RA3-Varietät (University of Wisconsin) zur Verwendung in der Gewebekultur ausgewählt worden (Walker et al., 1978, Am. J. Bot. 65: 654–659). Petiolen-Explantate werden mit einer Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (McKersie et al., 1999 Plant Physiol. 119: 839–847) oder LBA4404, enthaltend den Expressionsvektor, cokultiviert. Die Explantate werden drei Tage lang im Dunklen auf SH-Induktionsmedium cokultiviert, welches 288 mg/l Pro, 53 mg/l Thioprolin, 4,35 g/l K₂SO₄ und 100 μm Acetosyringinon enthält. Die Explantate werden in Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke (Murashige und Skoog, 1962) gewaschen und auf dem gleichen SH-Induktionsmedium ohne Acetosyringinon aber mit einem geeigneten Selektionsmittel und einem geeigneten Antibiotikum zum Inhibieren des Agrobacterium-Wachstums ausplattiert. Nach einigen Wochen werden somatische Embryonen auf BOi2Y-Entwicklungsmedium, das keine Wachstumsregulatoren, keine Antibiotika sowie 50 g/l Saccharose enthält, überführt. Somatische Embryonen werden anschließend auf Murashige-Skoog-Medium von halber Stärke keimen gelassen. Bewurzelte Setzlinge wurden in Blumentöpfe umgepflanzt und in einem Gewächshaus wachsen gelassen. T1-Samen werden aus Pflanzen produziert, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Transformation von Baumwolle
Die Transformation von Baumwolle (Gossypium hirsutum L.) wird unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens auf Hypokotylen-Explantaten durchgeführt. Die kommerziellen Kultivare, wie Coker 130 oder Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX) sind standardmäßige Varietäten, die für die Transformation verwendet werden, aber andere Varietäten können ebenfalls verwendet werden. Die Samen werden oberflächensterilisiert und im Dunkeln keimen gelassen. Hypokotyl-Explantate werden aus den gekeimten Setzlingen zu Längen von etwa 1–1,5 Zentimeter ausgeschnitten. Das Hypokotyl-Explantat wird im Agrobacterium tumefaciens-Inokulum, das den Expressionsvektor enthält, 5 Minuten lang untergetaucht und dann etwa 48 Stunden lang auf MS +1,8 mg/l KNO₃ + 2% Glucose bei 24°C im Dunklen cokultiviert. Die Explantate werden auf das gleiche Medium überführt, das geeignete bakterielle und pflanzliche selektierbare Marker enthält (mehrmalig erneuert), bis embryogene Calli zu beobachten sind. Die Calli werden getrennt und subkultiviert, bis somatische Embryos erscheinen. Aus den somatischen Embryos abgeleitete Pflänzchen werden auf Bewurzelungsmedium heranreifen gelassen, bis sich Wurzeln entwickeln. Die bewurzelten Sprosse werden in Blumentopferde im Gewächshaus umgepflanzt. T1-Samen werden aus Pflanzen hergestellt, welche Toleranz gegenüber dem Selektionsmittel aufzeigen und welche eine Einzelkopie des T-DNA-Inserts enthalten.
Example 17: Beispiel von Screens hinsichtlich abiotischem Stress
Dürre-Screen
Pflanzen aus einer gewählten Anzahl von Ereignissen werden in Blumentopferde unter normalen Bedingungen wachsen gelassen, bis sie sich dem Stadium des Ähren/Rispenschiebens näherten. Sie werden dann in einen ”Trocken”-Bereich überführt, worin die Bewässerung weggelassen wird. Feuchtigkeitssonden werden in zufällig ausgewählten Blumentöpfen eingesteckt, um den Bodenwassergehalt (SWC) zu überwachen. Wenn der SWC unter bestimmte Schwellenwerte sinkt, werden die Pflanzen automatisch wieder fortwährend bewässert, bis erneut ein normaler Spiegel erreicht wird. Die Pflanzen werden dann zurück zu normalen Bedingungen überführt. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischen Stress-Bedingungen herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
Salzstress-Screen
Pflanzen werden auf einem Substrat wachsen gelassen, das aus Kokosfaser und Argex (Verhältnis 3 zu 1) hergestellt ist. Eine normale Nährstofflösung wird während der ersten zwei Wochen nach Umpflanzen der Pflänzchen in das Gewächshaus verwendet. Nach den ersten zwei Wochen werden der Nährstofflösung 25 mM Salz (NaCl) zugesetzt, bis die Pflanzen geerntet wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
Screen hinsichtlich verringerter Nährstoff(Stickstoff)-Verfügbarkeit
Pflanzen aus sechs Ereignissen (T2-Samen) werden in Blumentopferde unter Normalbedingungen, mit Ausnahme der Nährstofflösung, wachsen gelassen. Die Töpfe werden vom Umpflanzen bis zur Reifung mit einer spezifischen Nährstofflösung bewässert, welche einen verringerten N Stickstoff (N)-Gehalt, in der Regel zwischen 7- bis 8-mal weniger, enthält. Der Rest der Kultivierung (Pflanzenreifung, Samenernte) ist der gleiche wie bei Pflanzen, die nicht unter abiotischem Stress herangezogen wurden. Wachstums- und Ertragsparameter werden aufgezeichnet, wie es für das Wachstum unter Normalbedingungen ausführlich dargestellt wurde.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen das Gebiet der Molekularbiologie und zielt auf ein Verfahren zur Erhöung von verschiedenen ertragsbezogenen Eigenschaften bei Pflanzen ab, und zwar indem die Expression in einer Pflanze von einer Nukleinsäure erhöht wird, welche ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe gewählt wird, welche aus folgendem besteht: GRF-Polypeptid, RAA1-artiges Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen mit einer erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, welche ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe gewählt wird, welche aus folgendem besteht: GRF-Polypeptid, RAA1-artiges Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, wobei die Pflanzen erhöhte ertragsbezogene Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen besitzen. Die Erfindung sieht ebenfalls Konstrukte vor, die bei den Verfahren der Erfindung brauchbar sind.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Verfahren zur Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften in Pflanzen im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend das Modulieren der Expression in einer Pflanze einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – Wachstumsregulierender Faktor(GRF)-Polypeptid, – RAA1-ähnliches Polypeptid, – SYR-Polypeptid – ARKL-Polypeptid – und – YTP-Polypeptid und gegebenenfalls Selektieren nach Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei: – das GRF-Polypeptid Folgendes umfasst: (i) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer QLQ-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 115; und (ii) eine Domäne mit mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zu einer WRC-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 116, – wobei das RAA1-ähnliche Polypeptid zwei oder mehr der folgenden Motive umfasst: (iii) Motiv 1: GVW(V/L)F (SEQ ID NR: 162), (iv) Motiv 2: LGW(E/S)RY(Y/F) (SEQ ID NR: 163), (v) Motiv 3: (D/H)L(L/I)S(I/V/L)P(R/K/A)(S/D)F (SEQ ID NR: 164), (vi) Motiv 4: (H/Y)(F/M)YD(V/I)VVK(N/T)(R/P) (SEQ ID NR: 165), – wobei das SYR-Polypeptid eine Leucin-reiche Domäne umfasst, der das konservierte Tripeptidmotiv 1 (eines von SEQ ID NR: 173, 174, 175 oder 176) vorangeht und das konservierte Motiv 2 (SEQ ID NR: 177) nachfolgt, – wobei das ARKL-Polypeptid eine oder mehrere der folgenden Domänen umfasst: (vii) eine ZfC3H2C3-Domäne, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 400, oder eine Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der ZfC3H2C3-Domänen, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 306 bis SEQ ID NR. 351; und (viii) eine DAR1-Domäne mit, in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz, mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder mehr Sequenzidentität zu einer oder mehreren der PfamB2828-Domänen, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 35 bis SEQ ID NR. 398 – und – wobei das YTP-Polypeptid (ix) mindestens eine Transmembran-Domäne und (x) mindestens einen Teil einer DUF221-Domäne umfasst und gegebenenfalls Selektieren nach Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das GRF-Polypeptid umfasst: (i) eine QLQ-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014978 (PFAM-Zugangsnummer PF08880); (ii) eine WRC-Domäne mit einer InterPro-Zugangsnummer IPR014977 (PFAM-Zugangsnummer PF08879); und (iii) eine Effector-of-Transcription(ET)-Domäne, welche drei Cys-Reste und einen His-Rest in einer konservierten Anordnung (CX₉CX₁₀CX₂H) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das GRF-Polypeptid in aufsteigender Reihenfolge der Präferenz mindestens 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% oder mehr Aminosäuresequenzidentität zum GRF-Polypeptid, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 2, oder zu einer beliebigen der in Tabelle A hierin aufgeführten Polypeptidsequenzen aufweist.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, durch eine beliebige der in Tabelle A aufgeführten Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn oder einen Abschnitt davon, oder eine Sequenz, die zum Hybridisieren mit einer beliebigen der in Tabelle A aufgeführten Nukleinsäuresequenz-SEQ ID NRn befähigt ist, repräsentiert wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Ortholog oder Paralog einer beliebigen der in Tabelle A aufgeführten Polypeptidsequenz-SEQ ID NRn codiert.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die erhöhte Expression durch beliebige ein oder mehrere aus Folgendem bewirkt wird: T-DNA-Aktivierungstagging, TILLING oder homologe Rekombination.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die erhöhte Expression durch Einführen und Exprimieren einer Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, in einer Pflanze bewirkt wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei es sich bei der erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaft um eine oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; oder (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW).
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, vorzugsweise einem konstitutiven Pflanzenpromotor, weiter bevorzugt einem GOS2-Promotor, am stärksten bevorzugt einem GOS2-Promotor aus Reis, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 117.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäuresequenz, die ein GRF-Polypeptid codiert, von pflanzlichem Ursprung ist, vorzugsweise aus einer dikotyledonen Pflanze, weiter bevorzugt aus der Familie Brassicaceae, am stärksten bevorzugt aus Arabidopsis thaliana.
Pflanzen, Teile davon (einschließlich Samen) oder Pflanzenzellen, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem beliebigen vorangehenden Anspruch, wobei die Pflanze, ein Teil davon oder eine Zelle davon ein isoliertes Nukleinsäure-Transgen umfasst, das ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – Wachstumsreguliender Faktor(GRF)-Polypeptid, – RAA1-ähnliches Polypeptid, – SYR-Polypeptid, – ARKL-Polypeptid – und – YTP-Polypeptid codiert und mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor funktionsfähig verbunden ist.
Konstrukt, das: (a) eine Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnlichem Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert; (b) eine oder mehrere Steuerungssequenzen, die zum Antreibender Expression der Nukleinsäuresequenz von (a) in der Lage sind; und gegebenenfalls (c) eine Transkriptionsterminationssequenz umfasst.
Konstrukt gemäß Anspruch 13, wobei es sich bei der Steuerungssequenz um einen konstitutiven Pflanzenpromotor, vorzugsweise einen GOS2-Promotor, weiter bevorzugt einen GOS2-Promotor, wie repräsentiert durch SEQ ID NR: 117, handelt.
Verwendung eines Konstrukts gemäß den Ansprüchen 13 oder 14 in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, wobei es sich bei den erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften um eine oder mehrere der folgenden handelt: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte Biomasse, vorzugsweise erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW), (vii) erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress, vorzugsweise erhöhte Toleranz gegen Dürrestress, oder (viii) erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz.
Pflanze, Pflanzenteil oder Pflanzenzelle, die/der mit einem Konstrukt gemäß Anspruch 13 oder 14 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, umfassend: (i) Einbringen und Exprimieren in einer Pflanze, einem Pflanzenteil oder einer Pflanzenzelle, einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, unter der Steuerung eines konstitutiven Pflanzenpromotors; und (ii) Kultivieren der Pflanzenzelle, des Pflanzenteils oder der Pflanze unter Bedingungen, welche Pflanzenwachstum und -entwicklung fördern.
Transgene Pflanze mit erhöhten ertragsbezogenen Eigenschaften im Vergleich zu Kontrollpflanzen, resultierend aus der erhöhten Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, codiert und mit einem konstitutiven Pflanzenpromotor funktionsfähig verbunden ist, oder eine transgene Pflanzenzelle oder ein transgener Pflanzenteil, die/der aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Transgene Pflanze gemäß Anspruch 12, 16 oder 18, wobei die Pflanze eine Nutzpflanze oder eine Monokotyle oder ein Getreide ist, wie Reis, Mais, Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Sorghum und Hafer, oder eine transgene Pflanzenzelle, die aus der transgenen Pflanze abgeleitet ist.
Erntefähige Teile, umfassend eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, einer Pflanze gemäß Anspruch 18, wobei die erntefähigen Teile vorzugsweise Samen sind.
Produkte, abgeleitet aus einer Pflanze gemäß Anspruch 18 und/oder aus erntefähigen Teilen einer Pflanze gemäß Anspruch 20.
Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, codierend ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GRF-Polypeptid, RAA1-ähnliches Polypeptid, SYR-Polypeptid, ARKL-Polypeptid und YTP-Polypeptid, wie in einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6 definiert, bei der Erhöhung von ertragsbezogenen Eigenschaften, welche eines oder mehrere der folgenden umfassen: (i) erhöhte Früh-Wuchskraft; (ii) erhöhte oberirdische Biomasse; (iii) erhöhter Gesamt-Samenertrag pro Pflanze; (iv) erhöhte Samen-Füllrate; (v) erhöhter Ernteindex; oder (vi) erhöhtes Tausendkorngewicht (TKW), (vii) erhöhte Beständigkeit gegenüber abiotischem Stress, vorzugsweise erhöhte Toleranz gegen Dürrestress, oder (viii) erhöhte Nährstoffaufnahme-Effizienz.