DE10350256A1

DE10350256A1 - PIM-1-spezifische siRNA-Verbindungen

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Publication number: DE10350256A1
Application number: DE10350256A
Authority: DE
Inventors: Volker Prof. Dr. Erdmann; Arnold Dr. Grünweller; Jens Dr. Kurreck; Thomas Dr. Christoph; Clemens Gillen
Original assignee: Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2003-10-28
Publication date: 2005-06-02

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt dsRNAs bereit, die für die PIM-1-Kinase spezifisch sind. Ferner werden diese enthaltenden Wirtszellen bereitgestellt. Gemäß einem weiteren Aspekt werden diese enthaltenden Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Schmerz und anderen mit PIM-1 zusammenhängenden Krankheiten, angegeben.

Description

Die Erfindung betrifft kleine, insbesondere Interferenz doppelsträngige RNA-Moleküle (dsRNA), die gegen PIM-1 gerichtet sind, und die erfindungsgemäße ds RNA enthaltenden Wirtszellen. Die erfindungsgemäße dsRNA und entsprechende Wirtszellen eignen sich als Arzneimittel bzw. zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere zur Behandlung von Schmerzen und anderen mit PIM-1 zusammenhängenden krankhaften Zuständen.

Schmerz ist nach der Definition der Internationalen Gesellschaft zum Studium des Schmerzes (IASP) ein „unangenehmes Sinnes- und Gefühlserlebnis, das mit einer akuten oder potentiellen Gewebsschädigung verknüpft ist oder mit Begriffen solcher Schädigungen beschrieben wird" (Wall and Melzack, 1999).

Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung ist, keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen leiden allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen. Unglücklicherweise ist die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmer zes noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.

Zahlreiche Proteine sind als Ansatzpunkte in der Schmerzforschung bekannt. Hierzu gehört auch die Familie der PIM-Kinasen, wobei beispielsweise unter diesen Proteinen die PIM-1 als Ansatzpunkt für die Schmerzbehandlung beschrieben ist. Somit stellt die PIM-1-Kinase einen vielversprechenden Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Schmerzmedikamente dar. Die cDNA-Sequenz von humaner PIM-1-Kinase, findet sich in den Datenbanken unter AN: NM 002648. Die Aminosäure-Sequenz von humaner PIM-1-Kinase, findet sich in den Datenbanken unter AN: NP_002639. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, Ratte, findet sich in den Datenbanken unter AN:NM_017034. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1-Kinase, Ratte, findet sich in den Datenbanken unter AN: NP_058730. Die cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, Maus, findet sich in den Datenbanken unter AN: NM_008842. Die Aminosäure-Sequenz von PIM-1-Kinase, Maus, findet sich in den Datenbanken unter AN: NP_032868.

Die PIM-1-Kinase gehört zu der Familie der Serin/Threonin-Kinasen, die in der Evolution in mehrzelligen Organismen hochkonserviert ist. Die Kinase ist ein Enzym, das Phosphatgruppen von ATP oder einem anderen Nucleosidtriphosphat auf ein anderes Molekül überträgt. In der Kontrolle des Zellwachstums, Zelldifferenzierung und der Apoptose spielt die PIM-1 eine Rolle. Zur PIM-Kinase-Familie gehören folgende PIM-Kinasen: PIM-1, PIM-2, PIM-3, PIM-4 (Fox, CJ., et. Al. 2003, Deneen, B., et. al. 2003, Fisher, K., et. al. 2001). Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren kann die Expression der PIM-1 stimulieren und die Transkription, Posttranskription, Translation und Posttranslation regulieren. Auch wird der PIM-1-Kinase eine wichtige Rolle außerhalb des hämatopoetischen Systems zugeordnet. PIM-1 phosphoryliert HP1 und andere Targets, wie z.B. cdc25 und c-myb (Koike, et. al. 2000, Mochizuki, et. al. 1999, Winn, et. al., 2003).

Da Schmerz vielschichtig ist, besteht Bedarf für neue Targets, wie z. B. PIM-1, wie auch für Moleküle, die gegen diese Targets binden. Bekannt sind beispielsweise niedermolekularer Wirkstoffe oder anderer Verbindungen wie Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), für die Behandlung insbesondere chronischer Schmerzen.

In der nicht-veröffentlichten deutschen Patentanmeldung DE 10226702.2 sind derartige Antisense-Oligonukleotide gegen PIM-1 offenbart, und zwar als Schmerztherapeutika. Allerdings weisen derartige Antisense-Oligonukleotide den Nachteil auf, dass sie eine schlechte Zellpermeabilität und eine geringe Effizienz besitzen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere Substanzen zur Verfügung zu stellen, die die Wirkung von PIM-1 effizient modulieren können, gleichwohl aber ohne weitere Komponenten Zellpermeabilität besitzen und effizient die Expression von PIM-1 modulieren können und auch galenisch gut einsetzbar sind.

Die vorstehend genannte Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst. Erfindungsgemäß werden zur Lösung der Aufgabe PIM-1-spezifische dsRNAs zur Verfügung gestellt, die das Phänomen der RNA-Interferenz auszulösen vermögen.

Auf das Phänomen der RNA-Interferenz wurde man im Zuge der immunologischen Forschung aufmerksam.

Das Immunsystem höherer Eukaryonten hat nämlich eine Reihe von Abwehrmechanismen gegen Pathogene entwickelt. Man sollte also annehmen, dass sich auch das Genom vor der vollständigen Übernahme solcher molekularen Eindringlinge schützt.

In den letzten Jahren wurde ein RNA-basierter Abwehrmechanismus entdeckt, der sowohl im Reich der Pilze, als auch im Pflanzen- und Tierreich vorkommt und wie ein „Immunsystem des Genoms" wirkt. Das System wurde ursprünglich unabhängig voneinander in verschiedenen Spezies, zuerst in C. elegans (Fire et. al., 1998), beschrieben, ehe man die zugrundeliegenden Mechanismen auf bestimmten Ebenen der Prozesse als identisch identifizieren konnte: RNA-vermittelte Virus-Resistenz in Pflanzen (Lindbo and Dougherty, 1992), PTGS (posttranscriptional gene silencing) bei Pflanzen (Napoli et al., 1990) und RNA-Interferenz bei Eukaryonten basieren demnach auf einer gemeinsamen Funktionsweise (Plasterk, 2002).

Die in vitro Technik der RNA-Interferenz (RNAi) beruht auf doppelsträngigen RNA-Molekülen (dsRNA), welche die sequenzspezifische Suppression der Genexpression auslösen (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746–750; Sharp (2001) Genes Dev. 5: 485–490: Hannon (2002) Nature 41: 244–251). Die Aktivierung von Proteinkinase R und RNaseL bewirkte bei der Transfektion von Säugerzellen mit langer dsRNA unspezifische Effekte, wie z.B. eine Interferon-Antwort (Stark et. Al. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227–264; He und Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95–119). Diese unspezifischen Effekte werden bei Verwendung von kürzerer, bspw. 21- bis 23-merer, sog dsRNA (engl. „small interfering RNA") umgangen, da unspezifische Effekte durch dsRNA, die kürzer als 30 by ist, nicht ausgelöst werden (Elbashir et. al. (2001) Nature 411: 494–498). Kürzlich wurden dsRNA-Moleküle auch in vivo zur Anwendung gebracht (McCaffrey et. al. (2002), Nature 418: 38–39; Xia et. al. (2002), Nature Biotech. 20: 1006–1010; Brummelkamp et. al. (2002), Cancer Cell 2: 243–247.

Die erfindungsmäßige doppelsträngige RNA (dsRNA) enthält eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N_17-25)-3', wobei N irgendeine Base ist und für Nukleotide steht. Die allgemeine Struktur besteht aus einer doppelsträngigen RNA mit einem aus Ribonucleotiden aufgebauten Makromolekül, wobei das Ribonukleotid aus einer Pentose (Ribose), einer organischen Base und einem Phosphat besteht. Hierbei bestehen die organischen Basen in der RNA aus den Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G) sowie den Pyrimidinbasen Cytosin (C) und Uracil (U). Die dsRNA enthält Nukleotide mit einer gerichteten Struktur mit Überhängen.

Vorzugsweise weisen erfindungsgemäße dsRNAs die allgemeine Struktur 5'-(N_19-25)-3', stärker 5'-(N_19-24)-3', noch stärker bevorzugt 5'-(N_21-23)-3' auf, wobei N irgendeine Base ist. Hierbei können zumindest 90%, vorzugsweise 99% und insbesondere 100% der Nukleotide einer erfindungsgemäßen dsRNA komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz von PIM-1 sein. 90% komplementär bedeutet hierbei, dass bei einer bspw. gegebenen Länge von 20 Nukleotiden einer erfindungsgemäßen dsRNA diese nur für höchstens 2 Nukleotide nicht mit dem entsprechenden Abschnitt auf der (m)RNA komplementär ist. Die Sequenz der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA ist mit ihrer allgemeinen Struktur vorzugsweise vollständig komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA von PIM-1.

Grundsätzlich kann eine erfindungsgemäße dsRNA zu jedem beliebigen Abschnitt auf der mRNA oder dem Primärtranskript von PIM-1, oder auch gegen mRNAs oder Primärtranskripte von anderen Mitgliedern der PIM-Kinase-Familie komplementär sein.

In einer eukaryontischen Zelle wird für die Herstellung einer mRNA das Gen in seiner gesamten Länge, sowohl Introns als auch Exons, in ein langes RNA-Molekül transkribiert, das Primärtranskript. Die Stabilität der mRNA erfolgt durch Prozessierung des Primärtranskripts am 5'-Ende mit einer Addition eines untypischen Nukleotids mit einem methylierten Guanin und einer Polyadenylierung am 3'-Ende. Bevor die RNA den Zellkern verlässt, werden durch RNA-Spleißen die Intronsequenzen entfernt und die Exons miteinander verbunden.

Zielsequenzen für erfindungsgemäße dsRNA können sowohl das Primärtranskript als auch die prozessierte mRNA sein. Das Primärtranskript und die mRNA werden im folgenden zusammenfassend als (m)RNA bezeichnet.

Grundsätzlich können alle im codierenden Bereich der (m)RNA auftretenden 17 bis 29, vorzugsweise 25 Basenpaare langen Abschnitte als Zielsequenz für eine erfindungsgemäße dsRNA dienen. Besonders bevorzugt sind hierbei auch solche Zielsequenzen für erfindungsgemäße dsRNAs, die zwischen Position 75 und 900 (jeweils gerechnet ab dem AUG Starttriplett des codierenden Bereichs der (m)RNA von humanem PIM-1) liegen. Bevorzugt sind daher solche 17 bis 25, insbesondere 19 bis 25 und ganz besonders 21 bis 23 Basenpaare langen Abschnitte auf der (m)RNA, deren Anfangsnukleotid einem Nukleotid einer Position 50 bis 890 des codierenden Bereichs der PIM-1-(m)RNA, entspricht und deren Endnukleotid 17 bis 25, vorzugsweise 19 bis 25 und ganz besonders bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide weiter stromabwärts vom Startnukleotid liegt.

Besonders bevorzugt sind solche dsRNAs, die gegen Regionen im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA gerichtet sind. Insbesondere sollten derartige erfindungsgemäße dsRNAs gegen PIM-1-(m)RNA-Abschnitte gerichtet sein, die im zentralen Bereich der codierenden Region liegen, vorzugsweise mindestens 50, 70, 100 Nukleotide vom AUG Starttriplett der (m)RNA entfernt, bzw. mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 70 noch stärker bevorzugt 100 Nukleotide vom 3'-terminalen codierenden Bereich der (m)RNA entfernt.

Ganz besonders bevorzugt sind solche siRNAs, die gegen Abschnitte im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA gerichtet sind, welche mit der Startsequenz AA beginnen. Hierbei werden siRNAs ganz besonders bevorzugt, die komplementär sind und damit gegen (m)RNA-Abschnitte gerichtet sind, die bspw. die Sequenzfolge AACGACCUGCA am 5'-Terminus, die Sequenz AAGCUGGCG, die Sequenz AAGGAGAA, die Sequenz AAGGAGCCC, die Sequenz AACUUGCCGGUGG, die Sequenz AAACACGU, die Sequenz AAGGACCGGA, die Sequenz AAUGGCACUCG, die Sequenz AAGUGGUCC, die Sequenz AAGAAGGUGA, die Sequenz AAGAUCUCUUCGA, die Sequenz AAAGGGGAGC, die Sequenz AAGAGGAGCUGG, die Sequenz AACUGCGGGGU, die Sequenz AAGGACGAAAACA, die Sequenz AAAACAUCCUU, die Sequenz AACAUCCUUA, die Sequenz AAUCGCGGCGA, die Sequenz AAGCUCAUC, die Sequenz AAGGACACCGUC, die Sequenz AAGAGAUCAUCA, die Sequenz AAUGUCAGCAUCU, die Sequenz AACCUUCGAAGA, die Sequenz AAGAAAUCCAG oder die Sequenz AACCAUCCAU, vorzugsweise im 5'-terminalen Bereich der Zielsequenz, oder aber grundsätzlich in der Zielsequenz enthalten.

Gleichwohl könnten erfindungsgemäße dsRNAs auch gegen Nukleotidsequenzen auf der PIM-1-(m)RNA, die nicht im codierenden Bereich liegen, gerichtet sein, insbesondere im nicht-codierenden 5'-Bereich der (m)RNA, der Regulationsfunktionen aufweist.

Die Grenzen am 5'-Ende der Zielsequenz mit bspw. AA der Nukleotidbindungen spiegeln sich in der dazugehörigen erfindungsgemäßen dsRNA ebenfalls in einer Sequenzfolge 5'-AAN_15-23 und den dazu komplementären Strang 3'-TTN_15-23 wider. Diese Sequenz kann im translatierten und nicht translatierten Bereich und gegen alle Steuerungselemente gerichtet sein. Ein Strang der doppelsträngigen RNA ist also zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des PIM-1-Gens komplementär.

Vorzugsweise jedoch wird für eine effektive Blockierung und Spaltung der (m)RNA von PIM-1 besonders dadurch erreicht, dass für die Wahl der Zielsequenz von erfindungsgemäßen dsRNA gewisse Auswahlregeln berücksichtigt werden.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine dsRNA, die einen GC-Gehalt von mindestens 38%, in einer stärker bevorzugten Ausführungsform von bis 38 bis 60% und in einer stärker bevorzugten Ausführungsart von 38 bis 50% aufweist (1). In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen erfindungsgemäße dsRNA-Moleküle höchstens 2 aufeinander folgenden Guanidinreste in ihrer Sequenz auf (2). Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Zielsequenz, die im zu untersuchenden Genom nur im Targetgen vorhanden, nicht aber an anderen Stellen im Genom (3). Weiterhin besonders bevorzugt sind Kombinationen der vorgenannten Eigenschaften bei erfindungs gemäßen dsRNAs. So etwa wird die Zielsequenz einer erfindungsgemäßigen dsRNA besonders bevorzugt nur einmal in den Targetgenen auftreten.

Verschiedene Kombinationen der vorgenannten Eigenschaften sind möglich, bspw. der Eigenschaften von (1), (2) und/oder (3).

Die Zielsequenz der PIM-1-(m)RNA ist vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus den folgenden 5 Sequenzen: (a) AAC GUG GAG AAG GAC CGG AUU; (b) AAC UCG AGU GCC CAU GGA AGU; (c) AAC CGC GAC AUC AAG GAC GAA, (d) AAU AUU CCU UUC GAG CAU GAC; (e) AAG GGU CUC UUC AGA AUG UCA.

Bei einer erfindungsgemäßen dsRNA kann vorzugsweise ein modifiziertes Nukleotid auftreten. Der Begriff „modifiziertes Nukleotid" bedeutet erfindungsgemäß, dass das jeweilige Nukleotid chemisch modifiziert ist. Der Fachmann versteht unter dem Begriff „chemische Modifikation", dass das modifizierte Nukleotid durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nukleotiden verändert ist. Mindestens ein modifiziertes Nukleotid in erfindungsgemäßer dsRNA dient einerseits der Stabilität und andererseits der Verhinderung der Dissoziation.

Vorzugsweise sind zwischen 2 und 10, ganz besonders zwischen 2 und 5 Nukleotiden modifiziert.

Vorzugsweise können die Enden der doppelsträngigen RNA (dsRNA) modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegenzuwirken, insbesondere um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen.

Eine regelmäßig nicht gewünschte Dissoziation der Einzelstränge von dsRNA tritt insbesondere bei Verwendung niedriger Konzentrationen oder kurzer Kettenlängen auf. Zur besonders wirksamen Hemmung der Dissoziation kann der durch die Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur von erfindungsgemäßer dsRNA durch mindestens eine, vorzugsweise mehr chemische Verknüpfung/en erhöht werden. Eine erfindungsgemäße dsRNA, deren Dissoziation vermindert ist, weist eine höhere Stabilität gegen enzymatischen und chemischen Abbau in der Zelle bzw. im Organismus oder ex vivo auf.

Die chemische Verknüpfung der Einzelstränge einer erfindungsgemäßen dsRNA wird zweckmäßigerweise durch eine kovalente oder ionische Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, hydrophobe Wechselwirkung, vorzugsweise van-der-Waals oder Stapelungswechselwirkungen, oder durch Metall-ionenkoordination gebildet. Sie kann nach einem besonders vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal an mindestens einem, vorzugsweise an beiden, Ende/n hergestellt werden. Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, dass die chemische Verknüpfung mittels einer oder mehrerer Verbindungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungsgruppen vorzugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-1,3-propan-diol)- und/oder Polyethylenglycol-Ketten sind. Die chemische Verknüpfung kann auch durch in der doppelsträngigen Struktur anstelle von Purinen benutzte Purinanaloga gebildet werden. Von Vorteil ist es ferner, dass die chemische Verknüpfung durch in der doppelsträngigen Struktur eingeführte Azabenzoleinheiten gebildet wird. Sie kann außerdem durch in der doppelsträngigen Struktur anstelle von Nukleotiden benutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet werden.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, dass zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylblau; bifunktionelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; N-acetyl-N'-(p-glyoxybenzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil; Psoralen. Ferner kann die chemische Verknüpfung durch an den Enden des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-Gruppen gebildet werden. Vorzugsweise wird die chemische Verknüpfung an den Enden des doppelsträngigen Bereichs durch Tripelhelix- Bindungen hergestellt. Die chemische Verknüpfung kann zweckmäßigerweise durch ultraviolettes Licht induziert werden.

Die Modifizierung der Nukleotide der dsRNA führt zu einer Deaktivierung einer an doppelsträngigen RNA abhängigen Proteinkinase (PKR), in der Zelle. Die PKR induziert Apoptose. Vorteilhafterweise ist mindestens eine 2'-Hydroxygruppe der Nukleotide der dsRNA in der doppelsträngigen Struktur durch eine chemische Gruppe, vorzugsweise eine 2'-Amino- oder eine 2'-Methylgruppe, ersetzt. Mindestens ein Nukleotid in mindestens einem Strang der doppelsträngigen Struktur kann auch ein sogenanntes „locked nucleotide" mit einem, vorzugsweise durch eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke, chemisch modifizierten Zuckerring sein. Vorteilshafterweise sind mehrere Nukleotide „locked nucleotides".

Modifizierungen der Nukleotide von erfindungsgemäßen dsRNA betrifft vor allem die Dissoziation der Nukleotide durch Verstärkung der Wasserstoffbrückenbindung. Die Stabilität der Nukleotide wird erhöht und gegen einen Angriff von RNA-sen geschützt.

Eine weitere Möglichkeit zur Verhinderung frühzeitiger Dissoziation erfindungsgemäßer dsRNA in der Zelle besteht durch die Ausbildung der Haarnadelschleife. In einer besonderen Ausführungsform weist eine erfindungsgemäße dsRNA eine Haarnadelstruktur auf, um die Dissoziations- kinetik zu verlangsamen. Bei einer derartigen Struktur ist vorzugsweise am 5'- und/oder 3'-Ende eine Loopstruktur ausgebildet. Eine derartige Loopstruktur weist keine Wasserstoffbrücken auf.

Darüber hinaus kann durch Modifizierung des Rückgrates von der erfindungsgemäßen dsRNA ein vorzeitiger Abbau verhindert werden. Insbesondere bevorzugt ist dsRNA, die (Phosphorthioat, 2'-O-Methyl-RNA, LNA, LNA/DNA-Gapmeren) modifiziert ist und daher eine längere Halbwertszeit in-vivo aufweist.

Eine erfindungsgemäße dsRNA ist vorzugsweise gegen die (m)RNA der PIM-Kinasen, insbesondere der PIM-1-Kinase, von Säugern, wie Mensch, Affe, Ratte, Hund, Katze, Maus, Kaninchen, Meerschweinchen, Hamster, Rind, Schwein, Schaf und Ziege, abgeleitet.

Vorzugsweise unterdrückt die dsRNA die Expression von PIM-1 in der Zelle mindestens zu 50%, 60%, 70%, zu mindestens 90%; es handelt sich also bei erfindungsgemäßen dsRNA dann um sogenannte siRNA, die das Phänomen der RNA-Interferenz auslöst. Die Messung der Unterdrückung kann über Northern-Blot, quantitative Real-Time PCR oder auf Proteinebene mit PIM-1 spezifischen Antikörpern erfolgen.

Weiterhin können erfindungsgemäße dsRNAs, insbesondere humane erfindungsgemäße dsRNAs, sowohl sogenannte "blunt ends" (glatte Enden) aufweisen oder aber überhängende Enden.

Grundsätzlich können überhängende Ende mindestens zwei überhängende Nukleotide aufweisen, vorzugsweise 2 bis 10, insbesondere 2 bis 5 überhängende Nukleotide am 3'-Terminus, gegebenenfalls allerdings auch alternativ am 5'-Terminus.

Bei den überhängenden Enden sind dTdT, jeweils am 3'-Terminus der doppelsträngigen erfindungsgemäßen siRNA bevorzugt.

Die überhängenden Nukleotide können, wie oben erwähnt, dT (desoxy Thymidin) sein oder aber auch Uracil, grundsätzlich können beliebige überhängende Enden an die zur mRNA von PIM-1 komplementären erfindungsgemäßen dsRNA Doppelstränge angehängt werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen dsRNA ist gegen eine Zielsequenz der PIM1-mRNA gerichtet, welche die allgemeine Struktur 5'-AAG UGU ACU UUA GGC AAA GGG-3' (Ratte) aufweist. Eine besonders bevorzugte dsRNA der vorliegenden Erfindung ist daher ein Duplexmolekül, dessen Sense-Strang die Sequenz 5'-GUG UAC UUU AGG CAA AGG GdTdT-3' und dessen Antisense-Strang die Sequenz 5'-CCC UUU GCC UAA AGU ACA CdTdT-3' aufweist. Dieses ist gegen den vorgenannten Abschnitt der PIM-1-mRNA gerichtet.

Die dsRNA wird nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt, dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield-Synthese, an einem unlöslichen Träger (H.G. Gassen, Chemical and Enzymatic Synthesis of Genfragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Beyer/Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.). Die Gewinnung der mRNA der PIM-1 kann durch Hybridisierung mittels Genom- und cDNA-Datenbanken erreicht werden. siRNA-Moleküle können bspw. synthetisch hergestellt werden über verschiedenen Anbietern, bspw. IBA GmbH (Göttingen, Deutschland), bezogen werden.

Erfindungsgemäße doppelsträngige RNA (dsRNA) kann in micellare Strukturen eingeschlossen sein, die die Separation von Substanzgruppen in-vitro und in-vivo beeinflussen. Hierbei liegt die dsRNA vorzugsweise in Liposomen vor. Die Liposomen sind künstliche, kugelig in sich geschlossene Membranen, aus Phospholipiden, in die sowohl hydrophile Substanzen in den wässrigen Innenraum verkapselt, als auch lipophile Substanzen in den Innenbereich der Lipidmembran inkorporiert werden können. Die Voraussetzung für die Verwendung von Liposomen für experimentelle oder therapeutische Zwecke ist deren Verträglichkeit mit Zellen und Geweben. Die dsRNA, die vorzugsweise in den Liposomen vorliegt, kann mit einer Peptidsequenz, vorzugsweise mit einer Lysin- und Arginin-reichen Sequenz, bspw. einer Sequenz aus dem viralen TAT-Protein (bspw. enthaltend AS 49–57) modifiziert sein, um dann als Transporterpeptid die Zellmembran leichter zu überwinden.

Die dsRNA kann gleichfalls in virale natürliche Kapside oder in auf chemischen oder enzymatischen Weg hergestellte künstliche Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen sein. Die genannten Merkmale ermöglichen ein Einschleusen der dsRNA in vorgegebene Zielzellen.

Nach einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung ist vorgesehen, dass die dsRNA an mindestens ein von einem Virus stammendes, davon abgeleitetes oder ein synthetisch hergestelltes virales Hüllprotein gebunden, damit assoziiert oder davon umgeben wird. Das Hüllprotein kann vom Polyomavirus abgeleitet sein. Es kann das Hüllprotein das Virus-Protein 1 (VP1) und/oder das Virus-Protein 2 (VP2) des Polyomavirus enthalten. Die Verwendung derartiger Hüllproteine ist z.B. aus der DE 19618797 A1 bekannt. Die vorgenannten Merkmale erleichtert wesentlich das Einführen der dsRNA in die Zelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression der erfindungsgemäßen dsRNA dadurch, daß das 1. Template (sense dsRNA) und das 2. Template (antisense dsRNA) unter der Kontrolle von zwei identischen oder verschiedenen Promotoren stehen. Hierbei erfolgt die Expression in vivo und wird gentherapeutisch über Vektoren in die Zellen gebracht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße dsRNA und/oder eine diese enthaltende Zelle, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

Arzneimittel: ein Stoff entsprechen der Definition im Artikel 1 § 2 des deutschen Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG). Das heißt, Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendungen am oder im menschlichen oder tierischen Körper

1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, lindern, zu verhüten oder zu erkennen,
2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen.
3. vom menschlichen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen,
4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder
5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, parenteral, intravenös, intraperitonal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation, Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblicherweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren etc.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft Wirtszellen, ausgenommen humane Keimzellen und humane embryonale Stammzellen, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA transformiert sind. Erfindungsgemäße dsRNA-Moleküle können in die jeweilige Wirtszelle über übliche Methoden, bspw. Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun eingebracht werden. Bei der Transformation werden mindestens zwei voneinan der verschiedene dsRNAs in die Zelle eingeführt, wobei ein Strang jeder dsRNA zumindest abschnittsweise komplementär ist zur (m)RNA der PIM-1. Der komplementäre Bereich der dsRNA zur (m)RNA von PIM-1 enthält weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotidpaare.

Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder eukaryontischer Natur in Betracht, bspw. von Bakterien, Pilzen, Hefen, pflanzlichen oder tierischen Zellen. Bevorzugte Wirtszellen sind Bakterienzellen, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryontische Mikroorganismen, wie Aspergillus oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et. al. (1997) Nature 282: 39).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden jedoch zur Transformation mittels erfindungsgemäßer dsRNA-Konstrukte Zellen aus multizellulären Organismen gewählt. Im Prinzip ist jede höhere eukaryontische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von Säugern, bspw. Affen, Ratten, Hamstern, Mäusen oder Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1997), BHK (Babyhamsternierenzellen), CHO (Zellen aus den Hamsterovarien, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Accad. Sci. USA 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Karzinomzellen) und weitere – insbesondere für den Laboreinsatz etablierte – Zellinien, bspw. HEK293-, SF9- oder COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere neuronale Stammzellen und Zellen des "Schmerz-Weges", vorzugsweise primäre sensorische Neuronen. Humane Zellen, insbesondere autologe Zellen eines Patienten, eignen sich nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen dsRNA-Molekülen, ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke, also nach Durchführung einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und abschließender Retransplantation in den Patienten.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA bzw. pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arznei- bzw. Schmerzmittels, zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.

Die erfindungsgemäßen Gegenstände eignen sich als Arzneimittel, bspw. zur Inhibition der Nozizeption, bspw. aufgrund der Verminderung der Expression der PIM1-Kinase mittels erfindungsgemäßer dsRNA.

Darüber hinaus wird die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA, enthaltend erfindungsgemäße dsRNA, und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz; auch von neurogenen Blasensymptomen; Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von PIM-1-Kinase-assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit PIM-1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäße dsRNA. Ein weiterer Gegenstand sind auch entsprechende Verfahren zu Behandlung von Pruritus und/oder Harninkontinenz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist ebenso die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen siRNA und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo- oder In-vitro-Gentherapie.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist ebenso die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen dsRNA und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo- oder In-vitro-Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen bspw. ein Effektorgen, meist ein Protein, exprimiert wird, den vorliegenden Fall also insbesondere erfindungsgemäße dsRNA. Man unterscheidet prinzipiell In-vivo und In-vitro-Verfahren. In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systematisch (z.B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsforme wird ein Vektor verabreicht, der sowohl das Transkriptionselement für die Sense-dsRNA, als auch das Transkriptionselement für die Antisense-dsRNA unter der Kontrolle geeigneter Promotoren enthält. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die beiden Transkriptionselemente auf verschiedenen Vektoren liegen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Diagnostikum enthaltend mindestens eine dsRNA und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe. Diagnostikum bedeutet hierin eine Verbindung oder ein Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten:

(a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen dsRNA-Konstrukt,
(a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder • unterbleibend, • unter Durchführung der Manipulation parallel ohne dsRNA oder dsRNA-Konstrukt oder • mit einer veränderten nicht mehr erfindungsgemäßen dsRNA.
(b) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Kontrollzelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens ein Protein, ausgewählt aus der PIM-1-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, synthetisiert hat.
(c) Messung der Bindung der Testzubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz and das Protein veränderten funktionellen Parameter.
(d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Messwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.

Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluss auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfasst jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper. Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, dass die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Bevorzugt sind aber Zellen zwischen 1 min und 60 min. Das wässrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so dass bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0–7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, ein facher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Messwert zu erhalten. Eine Zelle, die ein Protein synthetisiert hat, ist eine Zelle, die dieses Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie dieses Protein exprimiert und entsprechend von Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Protein enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfasst insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.

Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein, die z.B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eine funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger sein. Dabei heißt:

– genetisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, dass hier genetisches Material eingebracht wird.
– endogen exgrimiert: Expression eines Proteins, die eine Zellinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, dass die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, dass die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform diese Verfahrens sieht vor, dass durch die gentechnischen Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise die PIM-1-Kinase, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, dass die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, erfolgt.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform diese Verfahrens sieht vor, dass zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) ≥ 8 h, vorzugsweise ≥ 12 h, insbesondere ≥ 24 h, vergehen.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Gegenstände in die Zelle kann dabei auf die vorstehend dargelegte Art und Weise erfolgen.

Die Figuren zeigen:

1A und B zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen (A) und korrespondierende Western-Blot-Analysen (B) von Zellen, die zum Vergleich der Aktivitäten von PsiR4 bezüglich der Hemmung der Expression von PIM-1 mit einem PIM-1-GFP kodierenden Plasmid und verschiedenen Konzentrationen von PsiR4 kotransfiziert wurden. PsiR4 wurde in Konzentrationen zwischen 1, 5 und 50 nM verwendet. PsiR4inv diente als Kontrolle, die die invertierte Sequenz von PsiR4 darstellt. Wie die fluoreszenzmikroskopische Analyse in (A) zeigt, unterdrückt die erfindungsgemäße siRNA die PIM-GFP-Expression (reduziert die Zahl der sichtbaren Zellen) bereits bei einer Konzentration von 5 nM. Die Western-Blot-Analyse (B) bestätigt die fluoreszenzmikroskopischen Experimente.

1C zeigt eine Northem-Blot-Analyse der spezifischen Degradation von PIM-1 (m)RNA in Kotransfektions-Experimenten. Als Kontrolle für die Menge von RNA diente eine Aktin spezifische Sonde. C steht für die PIM-1-GFP Kontrolle, + steht für den Effekt von 50 nM PsiR4 auf PIM-1 mRNA und – steht für den Effekt von 50 nM PsiR4inv auf PIM-1 (m)RNA. PsiR4inv ist eine invertierte Kontroll-Sequenz.

2A zeigt die Wirkung von 5' Sense Cy3-Markierung von PsiR4 auf die PIM-1-GFP Expression. A zeigt in der oberen Reihe die GFP Fluoreszenz von COS-7 Zellen. In der zweiten Reihe ist die Cy3-Fluoreszenz von COS-7 Zellen dargestellt. Dargestellt sind Kotransfektions-Experimente mit 10 nM oder 50 nM PsiR4-Cy3 wie angegeben. Die Kontrollen wurden allein mit PIM-1-GFP durchgeführt.

2B zeigt eine Western-Blot-Analyse der Heruntgerregulierung von PIM-1-GFP mit PsiR4 (–) und PsiR4-Cy3 (+) mit den Konzentrationen von 0 nM, 5 nM und 50 nM.

3 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Abbildung der Kolokalisation von PIM-1-GFP und PsiR4-Cy3 24 Stunden nach der Kotransfektion von COS-7 Zellen. Der markierte Pfeil Nr. 1 kennzeichnet Zellen, die PIM-1-GFP exprimieren in Abwesenheit einer feststellbaren Mengen von siRNA. Der markierte Pfeil Nr: 2 kennzeichnet Zellen, die nicht PIM-1-GFP exprimieren, aber einen sichtbaren Anteil von siRNA. Der markierte Pfeil Nr. 3 kennzeichnet Zellen, die PIM-1-GFP exprimieren und eine erkennbare Menge von siRNA enthalten. Die Übereineinderlagerungen wurden mit Adobe Photoshop 7.0 durchgeführt.

4 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Abbildung der Lokalisation von PsiR4-Cy3 24 Stunden nach der Lipofektion in lebenden F-11 Zellen. Das linke Bild zeigt F-11 Zellen im Phasenkontrast, während die rechte Figur die gleichen Zellen zeigt, die PsiR4-Cy3 enthalten.

5 zeigt fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von F-11 Zellen Mit neutritenartigen Strukturen, die mit PsiR4-Cy3 transfiziert wurden. Die Lokalisation von siRNA in den neuritenartigen Strukturen ist durch Pfeile markiert.

6A zeigt eine graphische Darstellung einer quantitativen Auswertung einer intrathekal verabreichten PIM-1 siR4 im Bennetmodell (Ratte). Gezeigt sind jeweils die Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte an 4 aufeinderfolgenden Tagen. Als Kontrolle diente die Verabreichung einer NaCl-Lösung. In der Darstellung sind auf der X-Achse die Tage aufgetragen und auf der Y-Achse die Pfotenhebungen pro 2 Minute. Die Punkte zeigen jeweils den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente mit der angegebenen Standardabweichung.

6B zeigt eine graphische Darstellung einer quantitativen Auswertung einer intrathekal verabreichten PIM-1siR4KTR im Bennetmodell (Ratte). Gezeigt sind jeweils die Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte an 4 aufeinderfolgenden Tagen. Als Kontrolle diente die Verabreichung einer NaCl-Lösung. In der Darstellung sind auf der X-Achse die Tage aufgetragen und auf der Y-Achse die Pfotenhebungen pro 2 Minute. Die Punkte zeigen jeweils den Mittelwert zweier unabhängiger Experimente mit der angegebenen Standardabweichung.

Tabelle 1 Charakteristische siRNAs gegen PIM-1

siRNA gegen PIM-1

Bei beiden Sequenzen ist als Erstes der Sequenzabschnitt der PIM-1 (m)RNA aufgeführt, von der die PIM-1 siRNA abgeleitet wurde.

Die Duplex-Sequenzen sind die tatsächlich in vivo und in vitro getesteten Doppelstrang-RNA Moleküle.

Beispiel 1
Erzeugung von PIM-1 spezifischer siRNA
Es wurde ein Satz von 5 siRNAs gemäß den Kriterien der Dharmacon's homepage konstruiert (www.dharmacon.com).
Diese siRNAs wurden in verschiedenen Konzentrationen in COS-7 Zellen transfiziert und die Wirkung auf die PIM-1-GFP Expression wurde mit Fluoreszenzmikroskopie und Western-Blot-Analyse untersucht. Die siRNAs PsiR1, PsiR2 und PsiR3 zeigten keine wesentliche Herunterregulierung des PIM-1-GFP Reportergens in Konzentrationen bis zu 100 nM. Nur PsiR4 führte bei geringen Konzentrationen zu einer starken PIM-1 Herunterregulierung und daher wurde PsiR4 im Detail untersucht. Es wurde der Herunterregulierungseffizienz von PsiR4 im Vergleich zu einer Kontroll-siRNA bestehend aus der invertierten PsiR4-Sequenz in einem Konzentrationsbereich von 1–50 nM untersucht. Auf Fluoreszenzebene wurde eine Verringerung der Zellen mit einem grünen Fluoreszenzphänotyp bei einer Konzentration von 5 nM beobachtet, während die invertierte Kontrolle keinen nachweisbaren Herunterregulierungseffekt bis zu einer Konzentration von 50 nM (1A) zeigte. Die Western-Blot-Experimente bestätigten die durch Fluoreszenzdarstellung erhaltenen Effekte (1B) in einer unabhängigen Methode. PIM-1 unterzieht sich einer Autophosphorylierung und ist daher in 1B durch Doppelbanden dargestellt, die unterschiedliche Phosphorylierungsstadien des Proteins darstellen. Bei einer Konzentration von 1 nM zeigte PsiR4 keine Wirkung, jedoch wurde die PIM-1-GFP Expression bei einer Konzentration von 5 nM klar reduziert. Höhere siRNA Konzentrationen führten zu mehr als 90% Auslöschung von PIM-1-GFP, während die Kontroll-siRNA keinen deutlichen Effekt zeigte.
Um zu beweisen, dass die beobachteten siRNA Auslöschungs-Phänotypen auf dem Abbau der PIM-1 (m)RNA beruhen, wurde eine Northern-Blot-Analyse mit einer PIM-1 spezifischen Sonde durchgeführt. PIM-1 (m)RNA wurde in Gegenwart von PsiR4 abgebaut, war jedoch unverändert in Gegenwart der invertierten Kontroll-siRNA bei einer Konzentration von 50 nM (1C).
Beispiel 2
Wirksamkeit einer Cy3-markierten PIM-1-siRNA
Die Markierung von siRNAs beispielsweise mit einem Fluoreszenzfarbstoff ist an 4 unterschiedlichen Positionen möglich: an den 5'- und 3'-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges. Hierin wurde die Markierung am 5'-Ende des Sense-Stranges mit Cy3 zur Markierung von PsiR4 durchgeführt. Um die zelluläre Aufnahme, Verteilung und Lokalisierung zu untersuchen, wurde zunächst die Wirkung der PsiR4-Cy3 Markierung auf die siRNA-Funktion untersucht. Hierzu wurde das Reporter-Gen PIM-1-GFP mit unterschiedlichen Konzentrationen von PsiR4-Cy3 kotransfiziert und die Effizienz der markierten und nicht-markierten siRNA auf die PIM-1 Expression verglichen. Eine zelluläre Aufnahme bei niedrigen nanomolaren Konzentrationen von PsiR4-Cy3 war zu beobachten und diese Aufnahme stieg konstant bis zu einer Konzentration von 50 nM an (2A). Die Western-Blot-Analyse bestätigte die Auslöschung von PIM-1 mit PsiR4-Cy3 auf Proteinebenen (2B). Im Vergleich zu nicht-markiertem PsiR4 beobachteten wir nur eine geringe, jedoch reproduzierbare negative Auswirkung der Farbstoff-Markierung auf die siRNA-Effizienz. Bei geringen nanomolaren Konzentrationen war die nicht-markierte siRNA wirksamer, jedoch begann der Herunterregulierungseffekt für beide bei einer Konzentration von 5 nM.
Beispiel 3
Zelluläre Aufnahme von PsiR4
Die zelluläre Aufnahme von PsiR4-Cy3 in COS-7 Zellen wurde durch Lipofektion untersucht. Zellen mit Cy3-Fluoreszenz wurden bereits 15 Minuten nach der Transfektion beobachtet. Die Anzahl an transfizierten Zellen stieg bis zu 4 Stunden nach der Lipofektion an und erreichte danach ein Plateau (Daten nicht gezeigt). Während dieses Zeitraumes nahmen mehr als 95% der Zellen PsiR4-Cy3 auf. Weiterhin wurden PIM-1-GFP und eine niedrige Konzentration von PsiR4-Cy3 (10nM) kotransfiziert, um sicher zu stellen, dass eine deutliche Anzahl an Zellen weiterhin PIM-1-GFP in Gegenwert von siRNA exprimiert. Unter diesen Bedingungen wurde beobachtet, dass die meisten Zellen, die PsiR4-Cy3 enthalten, keinen GFP-Phänotyp zeigten (3, markierter Pfeil Nr. 2 kennzeichnet einige Beispiele) und umgekehrt die meisten Zellen, die einen deutlichen GFP-Phänotyp aufwiesen, keine PsiR4-Cy3 Fluoreszenz zeigten (3, markierter Pfeil Nr. 1). Einige der Zellen enthalten Cy3-markierte siRNA und einen GFP-Phänotyp (3 markierter Pfeil Nr. 3).
Beispiel 4
Lokalisierung von PsiR4 in F-11 Zellen
Zur Untersuchung der intrazellulären Lokalisierung von PsiR4-Cy3 im Detail wurden F-11 Zellen transfiziert. Diese Zellen sind größer als COS-7 Zellen und erlauben die siRNA durch Fluoreszenzmikroskopie in lebenden Zellen zu lokalisieren. Es wurde eine punktförmige perinukleäre Lokalisierung von PsiR4-Cy3 nach der Lipofektion beobachtet (4). Dieses Färbungsmuster beruht wahrscheinlich auf der endosomalen Aufnahme von siRNA durch F-11 Zellen. Die Akkumulierung um den Kern könnte ein Hinweis darauf sein, dass siRNAs in den Kern importiert werden, um Funktionen bei der Heterochromatin-Bildung auszuüben. Es wurde PsiR4-Cy3 nicht nur allein am Kern lokalisiert, sondern auch in den neuritenartigen Strukturen (5) gefunden.
Beispiel 5
Wirksamkeit der PIM-1-siRNA und der PIM-1-Kontrolle-siRNA bei der Schmerzbehandlung in vivo
Schmerzmodell der Ratte nach Bennett
Neuropathischer Schmerz tritt u.a. nach Schädigung peripherer oder zentraler Nerven auf und lässt sich dementsprechend tierexperimentell durch gezielte Läsionen einzelner Nerven induzieren und beobachten. Ein Tiermodell ist die Nervenläsion nach Bennett (Bennett und Xie (1988) Pain 33: 87–107). Im Bennett-Modell wird der Ischiasnerv unilateral mit losen Ligaturen versehen. Es wird die Entwicklung von Anzeichen des Neuropathieschmerzes zu beobachtet und kann mittels thermischer oder mechanischer Allodynie quantifiziert werden.
Hierzu wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (Janvier, Frankreich) mit einem Gewicht von 140 bis 160 Gramm zunächst mit Pentobarbital (50 mg pro kg Körpergewicht der Ratte Nembutal^®, i.p., Sanofi, Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Hannover, Deutschland) betäubt. Anschließend wurden einseitige mehrfache Ligaturen am rechten Hauptischiasnerv der Ratten vorgenommen. Hierzu wurde der Ischiasnerv auf der Höhe der Oberschenkelmitte freigelegt und vier lockere Ligaturen (softcat^®chrom USP 4/0, metric2, Braun Melsungen, Deutschland) wurden so um den Ischiasnerv gebunden, daß die epineurale Durchblutung nicht unterbrochen wurde. Der Operationstag war Tag 1.
Die Allodynie wurde ab Tag 2 auf einer Metallplatte getestet, die mit Hilfe eines Wasserbads auf eine Temperatur von 4°C temperiert wurde. Die Ratten wurden vor der intravenösen Applikation der jeweiligen Lösung in Gruppen von 9 oder 10 Tieren aufgeteilt. Zur Überprüfung der Allodynie wurden die Ratten auf die kalte Metallplatte gesetzt, die sich in einem Plastikkäfig befand. Dann wurde über einen Zeitraum von zwei Minuten vor der Applikation einer Lösung gezählt, wie häufig die Tiere mit ihrer geschädigten Pfote von der gekühlten Metallplatte heftig zurückzucken (Vorwert). Dann wurden die Lösungen, enthaltend 3,16 μg (5 μl) erfindungsgemäße siRNA in 15 μl NaCl oder 1 ng (5 μl) Kontroll-RNA (Sense-Strang der siRNA) in 15 μl NaCl i.t. appliziert, und die Anzahl der Wegziehreaktionen wurde jeweils nach 60 min wiederum für 2 Minuten gezählt (Testwert). Die Mes sungen wurden an 4 aufeinanderfolgenden Tagen (Tage 2 bis 5) durchgeführt. Tiere, denen reine NaCl-Lösung appliziert wurde, dienten sowohl bei den Experimenten mit siRNA als auch mit Kontroll-RNA als Vergleichsgruppe.
Die erfindungsgemäße PIM-1-siRNA (1 ng) zeigte in diesem Schmerzmodell eine starke analgetische Wirkung, wie die Verminderung der Wegziehreaktionen von bis zu etwa 1/3 gegenüber der NaCl-Kontrolle an den Tagen 2 bis 4 zeigt (6A). Im Vergleich dazu war die PIM-1-Kontroll-siRNA unwirksam (6B).
Effekt der intrathekal gegebenen PIM-1siRNAs im Bennettmodell (Ratte) Messung der Kälte-Allodynie (Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte pro 2 Minuten).
Effekt der intrathekal gegebenen PIM-1-Kontroll-siRNA im Bennettmodell (Ratte). Messung der Kälte-Allodynie (Anzahl der Pfotenhebungen auf einer 4°C kalten Platte pro 2 Minuten).

Claims

Doppelsträngige RNA, enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N_17-25)-3', die zumindest 90%, vorzugsweise 99% und 100% komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz von PIM-1 ist, wobei N irgendeine Base ist.
Doppelsträngige RNA nach Anspruch 1, enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N_19-25)-3'.
Doppelsträngige RNA nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend eine Sequenz mit der allgemeinen Struktur 5'-(N_21-23)-3'.
Doppelsträngige RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sequenz mit der allgemeinen Struktur vollständig komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA von PIM-1 ist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die doppelsträngige RNA (dsRNA) gegen Nukleotidabschnitte zwischen Position 50 und Position 890 im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA, komplementär ist.
Doppelsträngige RNA gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei dsRNA gegen Nukleotidabschnitte der codierenden Region von PIM-1-(m)RNA, die mindestens 50, 70, 100 Nukleotide vom AUG-Starttriplett des codierenden Bereichs der (m)RNA entfernt liegen.
Doppelsträngige RNA gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei die dsRNA gegen Nukleotidabschnitte der codierenden Region von PIM-1-(m)RNA, die mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 70 noch stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide vom 3'-terminalen codierenden Bereich der (m)RNA entfernt liegt, komplementär ist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die dsRNA gegen Abschnitte im codierenden Bereich der PIM-1-(m)RNA, komplementär ist, enthaltend die Sequenz AA.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die dsRNA am 5'-Terminus komplementär zur Sequenz AA ist.
Doppelsträngie RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die dsRNA gegen Nukleotidabschnitte im nicht-codierenden 5'-Bereich der PIM-1-(m)RNA, komplementär ist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die dsRNA mindestens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: (a) der GC-Gehalt mindestens 38% beträgt, (b) die dsRNA ist nicht gerichtet gegen Regionen, die höchstens 50 Nukleotide vom Start- bzw. Stopcodon entfernt liegen, (c) höchstens 2 aufeinanderfolgende Guanidinreste, (d) die Zielsequenz ist im zu untersuchenden Genom nur im Targetgen vorhanden.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zielsequenz der PIM-1-(m)RNA ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: AAC GUG GAG AAG GAC CGG AUU; AAC UCG AGU GCC CAU GGA AGU; AAC CGC GAC AUC AAG GAC GAA; AAU AUU CCU UUC GAG CAU GAC; AAG GGU CUC UUC AGA AUG UCA.
Doppelsträngige RNA nach einem der vorhergenden Ansprüche 1 bis 12, wobei die dsRNA chemisch modifiziert ist.
Doppelsträngige RNA nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die doppelsträngige RNA die Expression von PIM-1 in der Zelle zu mindestens 50% unterdrückt (dsRNA) ist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 14, wobei die dsRNA komplementär zu Nukleotidabschnitten der (m)RNA von PIM-1 von Säugetieren, insbesondere des Menschen, ist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 15, wobei die dsRNA „blunt ends" oder überhängende Enden aufweist.
Doppelsträngige RNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der 3'-Terminus oder am 5'-Terminus, jeweils die überhängenden Enden, insbesondere dTdT, der zum Doppelstrang verknüpften Einzelsträngen aufweist.
Doppelsträngige RNA gemäß Anspruch 17, wobei die überhängenden Enden mindestens 2 überhängende Nukleotide, vorzugsweise 2 bis 10, insbesondere 2 bis 5 überhängende Nukleotide am 3'-Terminus oder am 5'- Terminus aufweisen.
Doppelsträngige RNA gemäß Anspruch 18, wobei die überhängenden Nukleotide, vorzugsweise deoxidierte Thymidine oder Uracile, an den zur (m)RNA Sequenz von PIM-1 komplementären Doppelstrang angehängt werden.
Doppelsträngige RNA nach Anspruch 1 bis 4, wobei die zur dsRNA-Sequenz komplementäre Zielsequenz 5'-AAGUGUACUUUAGGCAAAGGG-3' ist.
Doppelsträngige RNA nach Anspruch 20, deren Sense-Strang die Sequenz 5'-GUGUACUUUAGGCAAAGGGdTdT-3' aufweist und deren Antisense-Strang die Sequenz 5'-CCCUUUGCCUAAAGUACACdTdT-3' aufweist.
Zelle, enthaltend mindestens eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.
Arzneimittel, enthaltend mindestens eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 22, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.
Diagnostikum, enthaltend mindestens eine dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder eine Zelle gemäß Anspruch 22, sowie gegebenfalls geeignete Zusatzstoffe.
Verwendung einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels, bzw. von Schmerzmittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz und/oder Entzündungsschmerz.
Verwendung einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz, auch von neurogenen Blasensymptom, Pruritus, Tumoren, Entzündungen; insbesondere von PIM-1-Kinase- assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma; sowie von allen mit der physiologischen Funktion von PIM-1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.
Verwendung einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 und/oder einer Zelle gemäß Anspruch 22 für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo – oder In-vitro – Gentherapie.
Verfahren zur Hemmung der Expression von PIM-1 in einer Zelle, wobei eine dsRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 21 in die Zelle eingeführt wird, wobei ein Strang der dsRNA einen zur mRNA von PIM-1 komplementären Be reich aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Bereich weniger als 25 aufeinanderfolgende Nukleotidpaare aufweist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die dsRNA in micellare Strukturen, vorzugsweise Liposomen, eingeschlossen wird.
Verfahren nach Ansprüche 28 oder 29, wobei die dsRNA in virale natürliche Kapside oder in auf chemischen oder enzymatischem Wege hergestellte Kapside oder davon abgeleitete Strukturen eingeschlossen wird.
Verfahren zur Identifizierung von dsRNA mit schmerzmodulierender Funktion, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungskonstante der Bindung einer vorzugsweise markierten dsRNA, gemäß der Ansprüche 1 bis 21, als Testsubstanz in einem Bindungsassay an eine (m)RNA von PIM-1 gemessen wird.
Verfahren zur Identifizierung einer schmerzmodulierenden Substanz mit folgenden Verfahrensschritten: (a) Überexpression einer PIM-Kinase, vorzugsweise PIM-1 in einer Testzelle, (b) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einer dsRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21, (b') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder • unterbleibend, • unter Durchführung der Manipulation parallel ohne dsRNA oder • mit einer veränderten, nicht mehr den Ansprüchen 1 bis 21 entsprechenden dsRNA, (c) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Kontrollzelle und/oder in einer Testzelle gemäß (a) erhalten wird. (d) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein veränderten funktionellen Parameter. (e) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.
Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle im Verfahrensschritt (a) eingesetzte Zelle gentechnisch manipuliert wird.
Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.
Verfahren gemäß Anspruch 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der PIM-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den parallelen Verfahrensschritten (b) und (b') und dem Verfahrensschritt (c) ≥ 8 h, vorzugsweise ≥ 12 h, insbesondere ≥ 24 h, vergehen.