DE102004004894A1 - Verfahren zur Wirkstoffidentifizierung bei Harninkontinenz unter Verwendung von PIM-Kinasen - Google Patents
Verfahren zur Wirkstoffidentifizierung bei Harninkontinenz unter Verwendung von PIM-Kinasen Download PDFInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierender Substanzen unter Verwendung von PIM-Kinasen, insbesondere der PIM-1- oder PIM-3-Kinase, und die Verwendung dadurch identifizierter Verbindungen sowie Antikörper und Antisensenukleotide gegen PIM-1- oder PIM-3-Kinase in Arzneimitteln und Diagnostika sowie in der Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auffindung Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierender Substanzen unter Verwendung der PIM-Kinasen, insbesondere PIM-1- oder PIM-3-Kinase, und die Verwendung dadurch identifizierter Verbindungen sowie Antikörper und Antisensenukleotide gegen PIM-1- oder PIM-3-Kinase in Arzneimitteln und Diagnostika sowie in der Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang.
- Harninkontinenz ist der unwillkürliche Harnabgang. Dieser tritt unkontrolliert auf, wenn der Druck innerhalb der Harnblase den Druck übersteigt, der zum Schließen des Harnleiters notwendig ist. Ursachen können zum einen ein erhöhter interner Blasendruck (z. B. durch Detrusorinstabilität) mit der Folge der Dranginkontinenz und zum anderen ein erniedrigter Sphinkterdruck (z. B. nach Geburt oder chirurgischen Eingriffen) mit der Folge der Streßinkontinenz sein. Der Detrusor ist die grob gebündelte mehrschichtige Blasenwandmuskulatur, deren Kontraktion zur Harnentleerung führt, der Sphinkter der Schließmuskel der Harnröhre. Es treten Mischformen dieser Inkontinenzarten sowie die sogenannte Überflußinkontinenz (z. B. bei benigner Prostatahyperplasie) oder Reflexinkontinenz (z. B. nach Rückenmarksschädigungen) auf. Näheres dazu findet sich bei Chutka, D. S. und Takahashi, P. Y., 1998, Drugs 560: 587-595.
- Harndrang ist der auf Harnentleerung (Miktion) abzielende Zustand vermehrter Blasenmuskelspannung bei Annäherung an die Blasenkapazität (bzw. bei deren Überschreitung). Dabei wirkt diese Anspannung als Miktionsreiz. Unter einem vermehrten Harndrang versteht man dabei insbesondere das Auftreten vorzeitigen oder gehäuften manchmal sogar schmerzhaften Harndrangs bis hin zum sog. Harnzwang. Das führt in der Folge zu einer deutlich häufigeren Miktion. Ursachen können u.a. Harnblasenentzündungen und neurogene Blasenstörungen sowie auch Blasentuberkulose sein. Es sind aber noch nicht alle Ursachen geklärt.
- Vermehrter Harndrang wie auch Harninkontinenz werden als extrem unangenehm empfunden, und es besteht ein deutlicher Bedarf bei von diesen Indikationen betroffenen Personen, eine möglichst langfristige Verbesserung zu erreichen.
- Üblicherweise werden vermehrter Harndrang und insbesondere Harninkontinenz, vor allem Dranginkontinenz, medikamentös mit Substanzen behandelt, die an den Reflexen des unteren Harntraktes beteiligt sind (Wein, A. J., 1998, Urology 51 (Suppl. 21): 43 – 47). Meistens sind dies Medikamente, die eine hemmende Wirkung auf den Detrusormuskel, der für den inneren Blasendruck verantwortlich ist, haben. (Diese Medikamente sind z. B. Parasympatholytika wie Oxybutynin, Propiverin oder Tolterodin und haben bspw. antimuskarine Wirkung, trizyklische Antidepressiva wie Imipramin oder Muskelrelaxantien wie Flavoxat. Andere Medikamente, die insbesondere den Widerstand der Harnröhre oder des Blasenhalses erhöhen, zeigen Affinitäten zu α-Adrenorezeptoren wie Ephedrin, zu β-Adrenorezeptoren wie Clenbutarol oder sind Hormone wie Östradiol. Auch bestimmte Opioide, Diarylmethylpiperazine und -piperidine, sind für diese Indikation in der WO 93/15062 beschrieben. Wenige Medikamente, wie z. B. Duloxetin (ein gemischter 5HT- und Noradrenalin-Aufnahme-Inhibitor) sind zur Behandlung von Streßinkontinenz geeignet.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe Stoffe bzw. Substanzen aufgefunden werden können, die zur Be handlung von vermehrtem Harndrang bzw. Harninkontinenz hilfreich sind ebenso wie Stoffe bzw. Substanzen als solche zur Behandlung der vorgenannten Indikationen, die bei wirksamer Dosierung bevorzugt gleichzeitig geringere Nebenwirkungen aufweisen als solche aus dem Stand der Technik. Eine weitere Aufgabe ist es, Zielstrukturen bzw. Zielsubstanzen („targets") zu identifizieren, die als Angriffspunkte für potentielle Arzneimittelwirkstoffe in erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können.
- Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß nunmehr festgestellt, dass die Serin/Threonin-Kinasen der PIM-Subfamilie, insbesondere die Kinasen PIM-1 und PIM-3, an der Blasenkontrolle beteiligt sind.
- Daraus folgend war primäre Aufgabe der Erfindung, ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die zur Kontrolle der Blasenfunktion befähigt sind, insbesondere Harndrang- bzw. Harninkontinenz-regulierender Substanzen, zu entwickeln. Die Erfindung betrifft daher insbesondere ein Verfahren zur Auffindung Harndrang- bzw. Harninkontinenz-regulierender Substanzen bzw. die Verwendung von PIM-Kinasen, insbesondere PIM-1- und/oder PIM-3-Kinase, in einem Verfahren zur Auffindung Harndrang- bzw. Harninkontinenz-regulierender Substanzen bzw. ein Verfahren zur Auffindung Harndrang- bzw. Harninkontinenzregulierender Substanzen unter Verwendung von PIM-1- und/oder PIM-3-Kinase, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Inkubation
einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer
Zelle und/oder einer Präparation
aus einer solchen Zelle, die das Protein PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase
und/oder ein Protein gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Protein und/oder ein Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden, oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine synthetisiert hat, - (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Protein oder Teilprotein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder Teilprotein veränderten funktionellen Parameter.
- Erfindungsgemäß kann in in vitro Verfahren untersucht werden, inwieweit mit PIM-Kinasen, insbesondere PIM-1/3-Kinasen, wechselwirkende Substanzen die Blasenkontrolle beeinflussen. Dies gilt insbesondere bei peripherer Wirkung der Testsubstanzen. Hierzu werden vorzugsweise Blasenstreifen, bspw. eines Versuchstieres (bspw. der Maus oder Ratte), präpariert und in einer Organbadapparatur unter Verwendung einer geeigneten Nährlösung unter isometrischen Bedingungen befestigt. Testsubstanzen werden, vorzugsweise als Lösungen, der Nährlösung hinzugegeben. Nach Zugabe der Testsubstanzen wird ein Messparameter bestimmt, der eine Aussage über die biologische Wirkung der Testsubstanz auf die Blasenstreifen zulässt. Bspw. wird die Kontraktionskraft der Blasenstreifen, ggf. in Abhängigkeit von der Konzentration der zugegeben Testsubstanz, oder Ableitungen der Messwerte, bspw. die Kraftanstiegssteilheit, bestimmt.
- Dieses neuartige Screeningverfahren basiert darauf, daß hier eine potentielle Wirksamkeit einer Substanz über ihre Wechselwirkung mit einer Harninkontinenzregulierenden Proteinstruktur, insbesondere PIM-1- oder PIM-3-Kinase oder verwandte Strukturen, aufgefunden werden kann.
- Dabei bezieht sich der Begriff Harninkontinenz-regulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Geschehen im Zusammenhang mit einer Harninkontinenz bzw. dem Harndrang (vgl. die obigen Ausführungen zur Phänomenologie der Harninkontinenz und des Harndrangs), insbesondere eine Harninkontinenz- bzw. Harndrang-hemmende Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper.
- Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0 – 7,5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten.
- Eine Zelle, die ein bestimmtes Teilprotein oder Protein synthetisiert hat, ist eine Zelle, die dieses Teilprotein oder Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurde, so daß sie dieses Teilprotein oder Protein exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Teilprotein oder Protein enthält. Die Zellen können Zellen aus evtl. immortalisierten Zellinien sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.
- Die hier aufgezählten Proteine und Teilproteine wurden im Rahmen dieser Erfindung als bei der Kontrolle der Blasenfunktion beteiligt identifiziert, in dem ein PIM-Kinase-defizientes, insbesondere ein PIM-1- bzw. PIM-3-defizientes Tier hinsichtlich des Miktionsverhaltens untersucht wurde.
- Aus welcher Spezies diese Proteine stammen, ist für die Funktion des Verfahrens unerheblich, es ist aber bevorzugt, die humane, Maus- oder Ratten-Variante zu verwenden. Die PIM-1-Kinase und die PIM-3-Kinase sind in Hinblick auf die kodierende DNA- und die Aminosäure-Sequenz bekannt und auch in Ihrer generellen Funktion beschrieben. Keine dieser Kinasen wurde aber bisher im Stand der Technik in einen Zusammenhang mit Harninkontinenz oder Harndrang, insbesondere der Regulation der Blasenfunktion, gebracht. Da hier die Identifizierung der Proteine über eine Veränderung des Miktionsverhaltens in einem In-vivo-Modell erfolgte, hat das daraus abgeleitete erfindungsgemäße Screening-Verfahren für zukünftige Arzneimittel unter Verwendung dieser Proteine den erheblichen Vorteil, nicht nur auf theoretischen Überlegungen aufzubauen, sondern vermutlich eine starke In-vivo-Relevanz zu besitzen. Da mit diesem Verfahren die Wechselwirkung von Substanzen mit im Bereich der Harninkontinenz bzw. dem Harndrang bisher nicht verwendeten Proteinen und Peptiden als Maßstab für das Auffinden harnblasenregulierender Substanzen ermöglicht wird, sind mit dem erfindungsgemäßen erfahren potentiell zur Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang geeignete Substanzen aufzufinden, die bei den im Stand der Technik bisher bekannten Verfahren mit anderen Peptiden oder Proteinen nicht aufgefallen wären. Auch dies ist ein erheblicher Vorteil des neuen erfindungsgemäßen Verfahrens.
- Der Maßstab, über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein oder Teilprotein, die z.B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Teilprotein oder Protein.
- Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das Ionenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger sein.
- Zur Erläuterung der Erfindung werden im folgenden neben den im allgemeinen Text zu Begriffen gegebenen Erklärungen weitere Definitionen angegeben, um klarzustellen, wie bestimmte, insbesondere in den Ansprüchen verwendete Begriffe im Sinne dieser Erfindung zu verstehen und auszulegen sind.
- – Substanz: Damit ist eine chemische Verbindung gemeint. Hier handelt es sich im engeren Sinne um Verbindungen, die potentiell eine Wirkung im Körper entfalten können, niedermolekulare Wirkstoffe, Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine, insbesondere hier niedermolekulare Wirkstoffe.
- – Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierend: Im Sinne der Erfindung heißt Harninkontinenz-regulierend, daß die Substanz die Funktion der Harnblase direkt oder indirekt beeinflußt, insbesondere natürlich einer Harninkontinenz bzw. einem Harndrang entgegenwirkt.
- – Inkubation: Unter Inkubation ist das Einbringen und Belassen eines biologischen Untersuchungsobjektes, beispielsweise einer Zelle oder eines Proteins, in einem temperierten Medium wie in einem Brutschrank oder auf einem Wasserbad zu verstehen. Dabei bedeutet hier unter geeigneten Bedingungen eine Inkubation unter physiologischen Bedingungen (z.B. 37°C, pH 7,2) oder bei den Bedingungen, bei denen eine optimale Messung im Verfahren möglich wird.
- – Zelle: Die Zelle ist ein sich selbst regulierendes, offenes, mit seiner Umgebung durch permanenten Stoffaustausch in einem Fließgleichgewicht stehendes System mit eigenem Stoffwechsel, und Vermehrungsfähigkeit. Die Zelle kann separat kultiviert oder Teil eines Gewebes, insbesondere aus einem Organ, sein, und dort vereinzelt oder noch im Zellverband vorliegen.
- – Präparation aus einer Zelle: Darunter versteht man Präparate, die mittels chemischer, biologischer, mechanischer oder physikalischer Methoden unter Änderung der Zellstruktur hergestellt werden, beispielsweise Membranfragmente, isolierte Zellkompartimente, isoliertes Cytosol, oder aus Gewebe gewonnenes Homogenat.
- – Peptid: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften Aminosäuren. Ein Oligopeptid besteht aus zwischen 2 und 9 Aminosäuren, ein Polypeptid aus zwischen 10 und 100 Aminosäuren.
- – Protein: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 100 Aminosäuren u.U. mit einer definierten Raumstruktur.
- – Teilprotein: Verbindung aus über peptidische Bindungen zu Ketten verknüpften mehr als 10 Aminosäuren u.U. mit einer definierten Raumstruktur aber ausgeschnitten bzw. ausgewählt aus einem definierten Priotein. Ein Teilprotein kann ein Peptid sein.
- – PIM-Kinase: ein Mitglied der PIM-Kinase-Subfamilie. Bei den PIM-Kinasen handelt es sich um Serin-Threonin-Proteinkinasen. Sie weisen eine ATP-Bindungsstelle auf. Zu dieser Subfamilie gehören bspw. die PIM-1-, PIM-2- oder PIM-3-Kinase.
- – Polynukleotid: Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nukleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nukleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynucleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter diesem Begriff fallen erfindungsgemäß aber auch modifi zierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.
- – zu mindestens 90 (95, 97)% ähnlich: Darunter ist zu verstehen, daß die hiermit erfaßten Polynucleotide in ihrem kodierenden Bereich bezüglich der Basenabfolge zu mindestens 90% (95%, 97%) identisch mit der Referenz (Abbildung etc.) sind und die mit diesem Ausdruck erfaßten Peptide und Proteine in ihrer Primärstruktur, der Abfolge der Aminosäuren zu mindestens 90% (95%, 97%) mit der Referenz identisch sind.
- – Gen: Mit dem Begriff Gen wird ein Genomabschnitt mit einer definierten Nukleotidsequenz bezeichnet, der die Information zur Synthese einer m- oder prä-mRNA oder einer sonstigen RNA (z.B. tRNA, rRNA, snRNA etc.) enthält. Es besteht aus kodierenden und nicht kodierenden Abschnitten.
- – Genfragment: Nukleinsäureabschnitt, der in seiner Basenabfolge einen Teilbereich eines Gens beinhaltet.
- – Bindung an das Peptid, Teilprotein oder Protein: Wechselwirkung zwischen Substanz und Peptid, Teilprotein oder Protein, die zu Fixierung führt.
- – funktionelle Parameter: Meßgrößen eines Experimentes, die mit der Funktion eines Proteins (Ionenkanal, Rezeptor, Enzym) korrelieren.
- – gentechnisch manipuliert: Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht bzw. verändert wird
- – endogen exprimiert: Expression eines Proteins, die eine Zelllinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne daß dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde.
- – G-Protein: International übliche Abkürzung für ein Gunaosintriphosphat (GTP)-bindendes Protein, das als Signalprotein durch G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktiviert wird.
- – Reportergen: Generelle Bezeichnung für Gene, deren Genprodukte sich mit Hilfe einfacher biochemischer Methoden oder histochemischer Methoden einfach nachweisen lassen, wie z.B. Luziferase, alkalische Phosphatase oder Green Fluorescent Protein (GFP).
- – (rekombinantes) DNA-Konstrukt: Generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-Molekülen entstanden sind.
- – Klonierungsvektor: Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.
- – Expressionsvektor: Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.
- – LTR-Sequenz: Abkürzung für Long Terminal Repeat. Generelle Bezeichnung für längere Sequenzbereiche, die an beiden Enden eines linearen Genoms zu finden sind. Derartige Sequenzbereiche kommen z.B. in den Genomen von Retroviren und an den Enden eukaryontischer Transposons vor.
- – Poly-A-Schwanz: Am 3'-Ende von messenger-RNAs durch Polyadenylierung angehefteten Adenyl-Reste (ca. 20-250).
- – Promotor-Sequenz: Bezeichnung für einen DNA-Sequenzbereich, von dem aus die Transkription eines Gens, d.h. die Synthese der mRNA, gesteuert wird.
- – ORI-Sequenz: Abkürzung für Origin of Replication. Die ORI-Sequenz erlaubt einem DNA-Molekül, sich als autonome Einheit in der Zelle zu vermehren.
- – Enhancer-Sequenz: Bezeichung für relativ kurze, zum Teil als Repetitionen auftretende, genetische Elemente, die in der Regel die Expression mancher Gene in unterschiedlichem Maße verstärken.
- – Transkriptionsfaktor: Bezeichnung für ein Protein, das über eine Bindung an spezifische DNA-Sequenzen die Transkription eines Gens beeinflußt.
- – kultivieren: Zellen oder Gewebe unter geeigneten Kulturbedingungen halten
- – Bedingungen, die eine Expression erlauben: Darunter versteht man die Auswahl und Anwendung von Kulturbedingungen, die eine Expression des interessierenden Proteins erlauben. Dazu gehören Temperaturänderung, Mediumwechsel, Zusatz von induzierenden Substanzen, Weglassen hemmender Substanzen.
- – Inkubationszeit: Zeitdauer, für die Zellen oder Gewebe inkubiert, d.h. einer definierten Temperatur ausgesetzt werden.
- – Selektionsdruck: Anwendungen von Kulturbedingungen, die Zellen mit einem bestimmtem Genprodukt, dem sog. Selektionsmarker, einen Wachstumsvorteil verschaffen.
- – Amphibienzelle: Zelle aus einem Tier der Klasse der Amphibia.
- – Bakterienzelle: Zelle, die dem Überreich der Eubacteria oder Archaebacteria zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- – Hefezelle: Zelle, die der Ordnung der Endomycetalse zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- – Insektenzelle: Zelle, die der Ordnung der Hexapoda zuzuordnen ist, oder von ihr abstammt.
- – native Säugetierzelle: Aus einem Säugetier stammende Zelle, die in ihren relevanten Merkmalen der im Organismus befindlichen Zelle entspricht.
- – immortalisierte Säugetierzelle: Zelle, die durch die angewendeten Kulturbedingungen oder gentechnische Manipulation die Eigenschaft erlangt hat, sich über die normalerweise übliche Teilungshäufigkeit hinaus (ca.100) in der Kultur zu teilen.
- – markiert: Durch entsprechende Modifizierung oder Derivatisierung für eine Nachweisreaktion zugänglich gemacht. Beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend oder lumineszierend.
- – Ligand: Substanz, die an ein im Körper oder einer Zelle befindliches Molekül, im speziellen einen Rezeptor, bindet.
- – Verdrängung: Vollständiges oder partielles Entfernen eines Liganden von seiner Bindungsstelle.
- – gebundene Aktivität: Biochemisch oder physikalisch erfaßter Meßwert, der mit der an einen Rezptor gebundenen Ligandenmenge korreliert.
- – Regulation: Die als Teil eines Regelprozesses erfolgte Hemmung oder Aktivierung eines Vorgangs.
- – Hemmung: Als Sonderfall der Regulation die Verhinderung/Minderung eines Vorgangs.
- – Aktivierung: Als Sonderfall der Regulation die Verstärkung eines Vorgangs.
- – Rezeptoren: Im weitesten Sinne alle im pro- oder eukaryoten Organismus vorhandenen Moleküle, an die ein Wirkstoff binden kann. Im engeren Sinne membrangebundene Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, die durch Bindung eines Wirkstoffes eine Änderung in der Zelle hervorrufen.
- – Ionenkanäle: Membrangebundene Proteine oder Komplexe mehrerer Proteine, durch die Kationen oder Anionen durch die Membran hindurchgelangen können.
- – Enzyme: Bezeichnung für Proteine oder Komplexe aus einer aktivierenden Nichteiweißkomponente mit einem Protein, die katalytische Eigenschaften besitzen.
- – Genexpression (exprimieren/exprimierbar): Das Übersetzen der genetischen Information eines Genes in RNA (RNA-Expression) oder in Protein (Proteinexpression).
- – Ionenmilieu: Ionenkonzentration eines oder mehrerer Ionen in einem bestimmten Kompartiment.
- – Membranpotential: Spannungsdifferenz über einer Membran aufgrund eines Überschusses an Kationen auf der einen Seite und Anionen auf der anderen Seite der Membran.
- – Veränderung der Enzymaktivität: Hemmung oder Induktion der katalytischen Aktivität eines Enzyms.
- – 2nd messenger: Kleines Molekül, das als Antwort auf ein extrazelluläres Signal entweder im Cytosol gebildet wird oder in das Cytosol hineinwandert und dabei hilft, die Information an das Zelliniere weiterzugeben, wie zum Beispiel CAMP, IP3.
- – (Gen-)Sonde: Bezeichnung für jede Art von Nukleinsäuren, mit deren Hilfe man ein gesuchtes Gen oder eine bestimmte DNA-Sequenz nachweisen kann. Durch Derivatisierung der Gensonde (z.B. Biotin, magnetische Beads, Digoxinin) können zudem DNA-Moleküle aus einem Gemisch herausgezogen werden. Als Sonden werden klonierte Gene, Genfragmente, chemisch synthetisierte Oligonukleotide und auch RNA verwendet, die meist radioaktiv markiert ist.
- – DNA: Internationale Bezeichnung für Desoxyribonukleinsäure.
- – genomische DNA: Generelle Bezeichnung für die bei eukaryontischen Organismen aus dem Zellkern einer Zelle stammenden DNA.
- – cDNA: Abkürzung für complementary DNA. Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls.
- – cDNA-Bank/Bibliothek: Bezeichung für eine Sammlung von willkürlich klonierten cDNA-Fragmenten, die zusammengenommen die Gesamtheit aller von einer Zelle oder einem Gewebe synthetisierten RNA repäsentieren.
- – cDNA-Klon: Bezeichnung für eine Population genetisch einheitlicher Zellen, die sich von einer einzigen Zelle ableiten, derart, daß diese Zelle eine künstlich eingebrachtes cDNA-Fragment enthält.
- – Hybridisierung: Durch Basenpaarung bewirkte Ausbildung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls aus zwei getrennten Einzelsträngen.
- – stringente Bedingungen: Bedingungen, unter denen nur perfekt basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden und stabil bleiben.
- – isolieren: Ein gesuchtes Molekül aus einem Gemisch herausfinden und abtrennen.
- – DNA-Seauenzierung: Bestimmung der Abfolge der Basen in einem DNA-Molekül.
- – Nukleinsäuresequenz: Bezeichnung für die Primärstruktur eines DNA-Moleküls, d.h. die Abfolge der einzelnen Basen, aus denen sich eine DNA zusammensetzt.
- – Genspezifische Oligonukleotid-Primer: Oligonukleinsäuren, also 10-40 Basen lange Nukleinsäurefragmente, die in ihrer Basenzusammensetzung eine stringente Hybridisierung an das gesuchte Gen oder die gesuchte cDNA erlauben.
- – Ermitteln von Oligonukleotid-Primern: Die manuelle oder Computerunterstützte Suche von Oligonukleotiden zu einer vorgegebenen DNA-Sequenz, die für eine Hybridisierung und/oder eine Polymerase-Kettenreaktion optimal geeignet sind.
- – PCR: Abkürzung für Polymerase-Kettenreaktion. In vitro-Verfahren zur selektiven Anreicherung von Nukleinsäure-Bereichen definierter Länge und definierter Sequenz aus einem Gemisch von Nukleinsäure-Molekülen.
- – DNA-Template: Nukleinsäuremolekül oder ein Gemisch von Nukleinsäuremolekülen, aus denen ein DNA-Abschnitt mit Hilfe der PCR (s.o.) vervielfältigt wird.
- – RNA: International gebräuchliche Abkürzung für Ribonukleinsäuren.
- – mRNA: International gebräuchliche Abkürzung für messenger-Ribonukleinsäuren, die am Transfer der genetischen Information aus dem Kern in die Zelle beteiligt sind und die Information für die Synthese eines Polypetids oder eines Proteins beinhalten.
- – Antisense-Polynukleotid: Eine aus mehreren natürlichen oder modifizierten Nukleinsäuren bestehendes Molekül, deren Basenabfolge komplementär zur Basenabfolge eines Teilbereiches einer in der Natur vorkommenden RNA ist.
- – PNA: International gebräuchliche Abkürzung für Peptide Nucleic Acids. Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine zur Hybridisierung mit DNA oder RNA befähigten Base trägt.
- – Sequenz: Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.
- – Ribozym: Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease).
- – DNA-Enzym: Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z.B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease).
- – katalytische RNA/DNA: generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA-Enzyme (s.o.).
- – Adenovirus: Bei Vertebraten vorkommender cytopathogener Virus.
- – Adenoassoziiertes Virus (AAV): Gehört zur Familie der Parvoviren. Für eine effektive Vermehrung des AAV ist eine Coinfektion der Wirtszellen mit Helferviren (z.B. Herpes-, Vaccinia- oder Adenoviren) erforderlich. Die Eigenschaft von AAV, stabil in das Wirtsgenom zu integrieren, macht es als Transduktionsvektor für Säugetierzellen besonders interessant.
- – Herpesvirus: Viraler Erreger der Herpes-Infektion.
- – posttranslationale Modifikation: Veränderung an Proteinen oder Polypetiden, die nach der Translation durchgeführt wird. Hierzu zählen z.B. Phosphorylierung, Glykosylierung, Amidierung, Acetylierung oder Proteolyse.
- – glykosilieren: Bezeichnung für das Anhängen von einzelnen Zuckermolekülen oder ganzen Zuckerketten an Proteine.
- – phosphorylieren: Bezeichnung für das Anhängen von einem oder mehreren Phosphatresten an ein Protein, bevorzugt an die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin.
- – amidieren: Die Bezeichnung für das Umwandeln einer Carboxylfunktion in eine Amidfunktion, z.B. an den carboxyterminalen Aminosäurerest eines Peptides oder Proteins.
- – mit Membrananker versehen: Posttranslationelle Modifikation eines Proteins oder eines anderen organischen Moleküls, derart daß es durch Anhängen eines hydrophoben Moleküls, geeigneterweise eine Fettsäure oder ein Derivat derselben, an die Lipiddoppelschicht-Membran von Zellen verankert wird.
- – spalten: In diesem spezifischen Fall die Spaltung eines Peptids oder Proteins in mehrere Untersequenzen.
- – verkürzen: Ein aus mehreren Einzelteilen bestehendes Molekül um eine oder mehrere Teile zu verkürzen.
- – Antikörper: Lösliche, oder an Zellmembranen gebundene, als Immunglobuline bezeichnete Proteine mit einer spezifischen Bindungsstelle für Antigene.
- – monoklonaler Antikörper: Gegen eine einzige antigene Determinante eines Antigens gerichtete Antikörper mit extrem hoher Selektivität.
- – polyklonaler Antikörper: Gemisch aus Antikörpern, die gegen mehrere Determinanten eines Antigens gerichtet sind.
- – transgen: Genetisch verändert.
- – nichthumanes Säugetier: Die Gesamtheit der Säugetiere (Klasse der Mammalia) mit Ausnahme der Spezies Mensch.
- – Keim-Zelle: Zelle mit haploidem Genom, die durch Verschmelzung mit einer zweiten Keimzelle die Bildung eines neuen Organismus ermöglicht.
- – somatische Zelle: Diploide Zelle als Bestandteil eines Organismus
- – chromosomale Einbringung: Eingriff in die Nukleotidsequenz auf chromosomaler Ebene.
- – Genom: Allgemeine Beschreibung für die Gesamtheit aller Gene in einem Organismus
- – Vorfahr des Tieres: Ein Tier (der Vorfahr), das auf natürliche oder künstliche Weise durch Weitergabe an seinem genetischen Material in direkter Linie mit einem anderen Tier (dem Nachfahren) verwandt ist.
- – exprimierbar: Ein Nukleinsäuremolekül ist dann exprimierbar, wenn es die Information zur Synthese eines Proteins oder Polypetids beinhaltet und mit ensprechenden regulatorischen Sequenzen versehen ist, die eine Synthese dieses Proteins oder Polypeptids in vitro oder in vivo erlauben. Wenn diese Voraussetzungen nicht mehr gegeben sind, beispielsweise durch Eingriff in der kodierenden Sequenz, ist das Nukleinsäuremolekül nicht mehr exprimierbar.
- – Nagetier: Tier aus der Ordnung der Rodentia, z.B. Ratte oder Maus.
- – als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifizierbar: Substanz, die bei Einbringung in einen lebenden Organismus eine Verhaltensänderung bewirkt, die der Fachmann als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-hemmend bezeichnet. Im Falle des Screeningverfahrens bezieht sich das darauf, daß die Substanz beim Screening durch stärkere Bindung oder Auslösung einer Änderung eines funktionellen Parameters deutlich, beispielsweise 100 %, die Bindung oder Wechselwirkung des Durchschnitts der getesteten Substanzen übertrifft.
- – Verbindung: Ein anderer Name für Molekül, als aus mehreren Atomen bestehend, hier ein durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziertes Molekül.
- – Wirkstoff: Eine Verbindung, die bei Anwendung an einem Organismus eine Veränderung in diesem Organismus hervorruft. Im Besonderen werden darunter organisch-chemisch synthetisierte Moleküle verstanden, die auf den Organismus eine heilende Wirkung ausüben. Hier insbesondere Moleküle, die an die erfindungsgemäßen Proteine und Peptide binden.
- – niedermolekular: Molekül mit einem Molekulargewicht < 2kDa.
- – Arzneimittel: Ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 § 2 des Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln.
- – Diagnostikum: Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren.
- – Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang: Verfahren, mit dem Ziel Harninkontinenz bzw. Harndrang zu lindern oder aufzuheben, oder das zu erwartende Auftreten von Harninkontinenz bzw. Harndrang zu hemmen.
- – chronische Harninkontinenz bzw. chronischer Harndrang: Länger anhaltende Harninkontinenz bzw. länger anhaltender Harndrang.
- – Gentherapie: Unter Gentherapie versteht man alle Verfahren, die das Ziel haben, genetische Erkrankungen durch geeignete Veränderungen des Genoms kausal zu behandeln.
- – In-vivo-Gentherapie: Einbringen von genetischem Material in den lebenden Organismus mit dem Ziel der Gentherapie. Man kann zwischen somatischem und Keimbahn-Eingriff unterscheiden, der einmal an diploiden Zellen und einmal an haploiden Zellen stattfindet.
- – In-vitro-Gentherapie: Einbringen von genetischem Material in Zellen außerhalb des menschlichen Körpers mit dem Ziel, diese nachher wieder durch Einbringen in den menschlichen Körper zur Gentherapie zur verwenden.
- – Diagnostik: Verfahren, um eine Krankheit zu identifizieren.
- – Wirksamkeitsuntersuchung: Untersuchung mit dem Ziel, die Wirksamkeit einer Verbindung nach Einwirkung auf einen lebenden Organismus zu untersuchen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert. Dabei wird genetisches Material in die Zelle eingebracht, insbesondere eine oder mehrere Polynukleotidsequenzen. In einer weiter bevorzugten Variante dieser Ausführungsform erlaubt die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter. In dieser Ausführungsform werden durch gentechnische Manipulation Voraussetzungen geschaffen, unter denen die Verände rung eines funktionellen Parameters überhaupt oder verbessert gemessen werden kann. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, daß durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird. Darunter ist insbesondere die gentechnische Einführung eines endogen nicht vorhandenen oder physiologisch nicht exprimierten G-Proteins (GTP-bindenden Proteins) in die Zelle zu verstehen, beispielsweise die Einführung eines chimären G-Proteins, das eine Veränderung des Signalweges erlaubt oder eines promiskuitiven G-Proteins, das sehr bindungsfreudig ist. Die Einführung eines Reportergens wiederum erlaubt die Messung einer (extrazellulär ausgelösten) induzierten Expression des Genproduktes.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle gentechnisch so manipuliert, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2a) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid enthält. Damit kann beispielsweise erreicht werden, daß ein Teilprotein oder Protein, das in der im Verfahren verwendeten Zelle oder Präparation nicht endogen exprimiert wird, von der Zelle synthetisiert wird. Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist. Unter einem (rekombinanten) DNA-Konstrukt versteht man ein in vitro hergestelltes DNA-Molekül. - Wenn beim Verfahren vor dem Schritt a) die Zelle gentechnisch manipuliert wird, ist es bevorzugt, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation und vor dem Schritt (a) unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck. Unter kultivieren versteht man, Zellen oder Gewebe bei Bedingungen, die ein Überleben der Zellen, bzw. deren Nachfolgegeneration sichern, zu halten. Dabei sollten die Bedingungen hier so gewählt werden, daß eine Expression des durch die gentechnische Manipulation eingefügten Materials ermöglicht wird. Dazu sollten pH, Sauerstoffgehalt, und Temperatur physiologisch gehalten sein und ausreichend Nährstoffe und notwendige Cofaktoren beigefügt sein. Der Selektionsdruck erlaubt, nur die Zellen weiter zu kultivieren, bei denen die gentechnische Manipulation zumindest teilweise erfolgreich war. Dazu gehört beispielsweise die Einführung einer Antibiotikaresistenz über das DNA-Konstrukt.
- Es ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt, wenn die verwendete Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenopus Oocyten, für Bakterienzellen E-coli-Zellen, für Hefezellen solche von Saccharomyces cerevisiae, für Insektenzellen Sf9-Zellen, für immortalisierte Säugetierzelle HeLa-Zellen und für native Säugetierzellen die CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle.
- Bei einer bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der Bindung der Substanz an ein Teilprotein oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden vom Teilprotein oder Protein und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz. Dabei ist ein Ligand ein mit hoher Spezifität an das Protein oder Teilprotein bindendes Molekül, das durch eine ebenfalls bindende, zu testende Substanz aus der Bindungsstelle verdrängt wird. Unter Markierung ist eine den Nachweis erleichternde künstliche Modifikation am Molekül zu verstehen. Beispiele sind radioaktive, fluoreszierende oder lumineszierende Markierung.
- Bei einer anderen bevorzugten Meßmethode zur Feststellung der durch die Bindung der Substanz an das Teilprotein oder Protein im erfindungsgemäßen Verfahren ausgelösten Veränderung der funktionellen Parameter, erfolgt die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger. Damit ist auf der einen Seite direkt die Messung der Wirkung der Substanz über die Beeinflußung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfaßt, auf der anderen Seite als bevorzugt zu messende Beispiele sich än dernder Parameter wie Genexpression, Ionenmilieu, pH, Membranpotential, Enzymaktivität oder Konzentration der 2nd messenger. Dabei versteht man unter Ionenmilieu insbesondere die Konzentration eines oder mehrer Ionen in einem Zellkompartiment, insbesondere dem Cytosol, unter Membranpotential die Ladungsdiffferenz zwischen zwei Seiten einer Biomembran und unter 2nd messenger Botenstoffe des intrazellulären Signalwegs wie z.B. zyklisches AMP (cAMP), Inosotoltriphosphat (IP3) oder Diacylglycerol (DAG).
- In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird das Teilprotein oder Protein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt aus:
- – der PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, - – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der
1b) ,1d) oder1f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder - – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder deren Antiisense Polynukleotide bindet, - – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine.
- Darunter erfaßt ist die Verwendung von Teilproteinen und insbesondere Proteinen mit bekannter Sequenz und Funktion, ohne daß für diese im Stand der Technik eine Funktion im Zusammenhang mit Harninkontinenz oder Harndrang bekannt war.
- Es ist weiter bevorzugt, daß es sich im erfindungsgemäßen Verfahren bei dem Polynukleotid um RNA bzw. ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA handelt.
- Ebenso ist es bevorzugt, daß es sich im erfindungsgemäßen Verfahren bei dem Polynukleotid um ein Antisense-Polynukleotid oder PNA handelt, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an ein erfindungsgemäßes Polynukleotid zu binden. Dabei versteht man unter PNA „peptidic nucleic acid" (peptidische Nukleinsäure), die zwar die Basenpaare trägt, aber dessen Rückrat peptidisch gebunden ist. Ein Antisense-Polynukleotid zeigt die komplementäre Basenabfolge zu mindestens einem Teil einer Basis-Nukleinsäure. Ebenfalls bevorzugt ist es, daß das Polynukleotid Teil eines Ribozym oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA bzw. DNA ist. Unter Ribozym ist eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure zu verstehen, unter DNA-Enzym ein entsprechende Desoxyribonukleinsäure, also katalytische RNA beziehungsweise DNA.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Vektor bevorzugt, enthaltend eines dieser vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotide. Unter einem Vektor versteht man ein Nukleinsäuremolekül, das bei gentechnischer Manipulation dazu dient, Fremdgene zu enthalten bzw. zu übertragen. Besonders bevorzugt ist dabei, daß es sich um einen Expressionsvektor handelt. Er dient damit der Expression des enthaltenen Fremdgens, des Polynukleotids.
- Weiter bevorzugt ist ein derartiger Vektor, der abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält. Ein LTR ist ein „Long-TerminalRepeat", ein am Ende befindlicher Abschnitt beispielsweise bei Viren. Poly-A-Sequenz ist ein mehr als 20 Adenosinreste langer Schwanz. Eine Promotorsequenz ist der Steuerungsbereich für die Transkription.
- Es ist auch Gegenstand des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn das Protein bzw. ein daraus abgeleitetes Teilprotein posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde. Posttranslationale Modifikationen sind beispielsweise dem Voet/Voet, Biochemistry, 1st Edition, 1990, S. 935-938 zu entnehmen.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung identifizierbar als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz durch ein erfindungsgemäßes Verfahren. Hierbei bezieht sich Verbindung insbesondere auf niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch auf Peptide, Proteine und Nukleinsäuren. Dabei bedeutet identifizierbar, daß die Verbindung das Merkmal aufweist, daß es beim erfindungsgemäßen Screeningverfahren bezüglich der Bindung deutlich stärker, vorzugsweise doppelt so stark bindet wie der Durchschnitt der zu testenden Substanzen oder bezüglich der Änderung der funktionellen Parameter deutlich vom Durchschnitt der zu testenden Substanzen abweicht.
- Eine besonders ausgewählte Form der erfindungsgemäßen Verbindung ist durch ein Verfahren unter Verwendung eines Proteins oder Teilproteins in den Schritten (a) und (b) als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifizierbar, wobei das Protein oder Teilprotein ausgewählt ist aus:
- – der PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, - – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder - – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, - – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel zur Behandlung von Harninkontinenz- oder Harndrang, enthaltend
- a.
ein Polynukleotid kodierend für
eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder
ein Polynukleotid, welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. ein Polynukleotid, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. einen Vektor, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
ein Protein gemäß einer der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Protein und/oder ein Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine, - e. einen Antikörper gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. eine Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e),
- g. eine Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als Harninkontinenz bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert wurde, und/oder
- h. einen Wirkstoff, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase,
und/oder ein Protein gemäß einer der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnlichen Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine, - e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,
- Bevorzugt ist auch eine Form des Diagnostikums, das ein Polynukleotid enthält, bei dem es sich um ein Antisense-Polynukleotid oder eine PNA handelt.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, - e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,
- Besonders bevorzugt ist die Verwendung zur Behandlung der chronischen Harninkontinenz bzw. des chronischen Harndrangs.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) oder einen Vektor gemäß Punkt c)
- Bevorzugt beim Einsatz in der Gentherapie ist auch die Verwendung eines Polynukleotids, beim dem es sich um ein Antisense-Polynukleotid oder eine PNA handelt, oder das Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA ist.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase,
insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids,
welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 (vorzugsweise 20) Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, - e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e)
- g. einer Verbindung, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifiziert wurde, und/oder
- h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet,
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere
die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches
einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, - b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden,
- c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b)
- d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder
eines Proteins gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 (vorzugsweise 20) Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, - e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d),
- f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e),
- Dabei ist es für ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, ein erfindungsgemäßes Diagnostikum und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid gemäß Punkt a) ein Polynukleotid, kodierend für PIM-1-Kinase, oder ein Polynukleotid, welches einer der in einer der
1a) ,1c) oder1e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, ist
und/oder
das Protein gemäß Punkt d) eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase, und/oder ein Protein gemäß einer der1b) ,1d) oder1f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Protein und/oder ein Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine ist. - Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt a) und/oder Punkt b)) eine RNA oder eine ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA ist.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt b)) Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA ist.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) ein Expressionsvektor ist.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly-A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn das Protein oder Teilprotein (gegebenfalls gemäß Punkt d)) posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn der Antikörper (gegebenenfalls gemäß Punkt e)) ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
- Dabei ist es für die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen (nicht Gentherapie) sowie Arzneimittel und/oder Diagnostika besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Zelle (gegebenenfalls gemäß Punkt f)) um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt.
- Dabei ist es für eine erfindungsgemäße Verbindung (auch Anti-Sense etc.), ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, ein erfindungsgemäßes Diagnostikum und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn es sich bei der Verbindung (gegebenenfalls gemäß Punkt g)) um eine niedermolekulare Verbindung handelt.
- Dabei ist es für ein erfindungsgemäßes Arzneimittel, ein erfindungsgemäßes Diagnostikum und/oder eine erfindungsgemäße Verwendung besonders bevorzugt, wenn der genannte Wirkstoff gemäß Punkt h) ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in einem Teilverfahren das Protein oder Teilprotein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt aus:
- – der PIM-1-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, - – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der
1b) ,1d) ,1f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder - – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der
1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, - – oder einem mindestens 10 Aminosäuren fangen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine
- – der PIM-2-Kinase, oder
- – der PIM-3-Kinase,
- – einem
Protein, für
das ein Polynukleotid gemäß einer
der
2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, - – einem
Protein mit einer Aminosäuresequenz
gemäß einer
der
2b) ,2d) ,2f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder - – einem
Protein, das durch eine Nukleinsäure
kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid
gemäß einer
der
2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, - – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine,
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Harninkontinenz oder Harndrang, insbesondere chronischer Harninkontinenz bzw. chronischem Harndrang, bei einem nichthumanen Säugetier oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Harninkontinenz (Streßinkontinenz oder Dranginkontinenz) oder Harndrang, insbesondere chronischer Harninkontinenz bzw. chronischem Harndrang, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche, enthaltend eine erfindungsgemäße Substanz und/oder einen erfindungsgemäßen Wirkstoff.
- Die Verabreichung kann beispielsweise in Form eines Arzneimittels, wie oben beschrieben, erfolgen.
- Insgesamt ist eine wichtige Grundlage der Erfindung die Identifizierung Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierter Gene und Genfragmente. Darauf basiert das Screeningverfahren. Aber auch die Verwendung zur Diagnose oder Therapie bietet sich, wie bereits ausgeführt, an. Im folgenden werden entsprechende Anwendungsmöglichkeiten und weitere Ausführungsbeispiele erläutert.
- 1. Therapie chronischer Harninkontinenz bzw. chronischem Harndrang
- 1.1 Antisense-Strategien
- Hierbei werden, abgeleitet von der Nukleinsäuresequenz der vollständigen cDNA oder von Teilbereichen Konstrukte erstellt, die die mRNA oder Proteinkonzentration herabsetzen können. Dies können z.B. Antisense-Oligonukleotide (DNA oder RNA) sein, die eventuell unter Verwendung modifizierter Nukleotidbausteine (z.B. O-Allyl-Ribose) eine erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen aufweisen. Zudem ist die Verwendung von Ribozymen denkbar, die als enzymatisch aktive RNA-Moleküle eine spezifische Spaltung der RNA katalysieren. Daneben könnten auch Vektoren eingesetzt werden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen oder Teilbereiche dieser Nukleotidsequenzen unter Kontrolle eines geeigneten Promotors exprimieren und somit für eine In-vivo- oder Ex-vivo-Therapie geeignet sind. Zusätzlich sind auch Antisense-Konstrukte möglich, die unter Austausch des Phosphatrückgrats von Nukleotidsequenzen (z.B. PNAs, d.h. Peptide Nucleic Acids) oder Verwendung nichttraditioneller Basen wie Inosine, Queosine oder Wybutosine sowohl wie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanosin u, Thymidin und Uridin nicht oder in geringerem Masse durch endogene Nukleasen abgebaut werden können.
- 1.2. Antagonisten/Agonisten bzw. Inhibitoren/Aktivatoren der im Screeningverfahren verwendeten erfindungsgemäßen Genprodukte.
- Dies umfaßt Substanzen, die durch eine Bindung an das Genprodukt dessen Funktion verändern. Dies können sein:
- 1.2.1. Organisch-chemische Moleküle, die im Rahmen eines Wirkstoffscreenings unter Verwendung der Genprodukte der erfindungsgemäßen cDNA als Bindungspartner gefunden werden.
- 1.2.2. Antikörper, seien es polyklonale, chimäre, single-chain, Fab-Fragmente oder Fragmente aus Phagen-Banken, die bevorzugt als neutralisierende Antikörper über eine Bindung an die Genprodukte spezifisch die Funktion beeinflußen.
- 1.2.3. Aptamere, d.h. Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate mit Proteinbindenden Eigenschaften. Dazu gehören auch sog. Spiegelmere, die durch Spiegelevolution gewonnene spiegelbildliche und damit stabile Oligonukleotide darstellen, die hochaffin und hochspezifisch ein Zielmolekül binden können (Klußmann et al., 1996: Nature Biotechnology 14: 1112-1115).
- 1.3. Gentherapie
- Die beschriebenen Sequenzen können zur Therapie von Harninkontinenz oder Harndrang, insbesondere chronischer Formen, eingesetzt werden, indem sie nach Klonierung in geeignete Vektoren (z. B. Adenovirus-Vektoren oder adenoassozierter-Virus-Vektoren) zur In-vivo oder Ex-vivo-Therapie verwendet werden, um dort z.B. einer Überexpression oder Unterexpression des endogenen Genproduktes entgegenzusteuern, die Sequenz des defekten Genproduktes zu korrigieren (z. B. durch Transsplicing mit dem exogenen Konstrukt) oder ein funktionelles Genprodukt zur Verfügung zu stellen.
- 2. Diagnose
- Polynukleotidsequenzen (Oligonukleotide, Antisense-DNA & RNA-Moleküle, PNAs), die von den im Screeningverfahren etc. verwendeten Nukleotidsequenzen abgeleitet sind, könnten zur Diagnose bzw. Untersuchung der Grundlage für Harninkontinenzen oder Harndrangzuständen werden. Beispiele derartiger Grunderkrankungen beinhalten neurologische Erkrankungen oder neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Chorea Huntington, Jacob-Creutzfeld, amyotrophe Lateralsklerose und Demenzen. Die Nukleotidsequenzen können auf vielfältige Weise (Northernblot, Southernblot, FISH-Analyse, PRINS-Analyse, PCR) entweder zur Identifizierung der Genproduktes oder abweichender diagnostisch relevanter Genprodukte oder zur Quantifizierung des Genproduktes dienen. Neben der Nukleinsäurediagnostik können auch Antikörper oder Aptame re gegen das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierte Protein zur Diagnostik eingesetzt werden (z. B. mittels ELISA, RIA, immuncytochemische oder immunhistochemische Verfahren), um das Protein oder abweichende Formen zu identifizieren und das Protein zu quantifizieren.
- Im Hinblick auf eine Gendiagnostik könnten Nukleinsäure-Sonden abgeleitet von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zur Bestimmung des Gen-Lokus eingesetzt werden (z.B. durch FISH, FACS, artifizielle Chromosomen. wie YACs, BACs oder P1-Konstrukte).
- Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne sie darauf zu beschränken.
- Abbildungen und Beispiele
- Abbildungen:
-
1a) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, human; AN: NM_002648 -
1b) Aminosäure-Sequenz von PIM-1-Kinase, human; AN: NP_002639 -
1c) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, Ratte; AN: NM_017034 -
1d) Aminosäure-Sequenz von PIM-1-Kinase, Ratte; AN: NP_058730 -
1e) cDNA-Sequenz von PIM-1-Kinase, Maus; AN: NM_008842 -
1f) Aminosäure-Sequenz von PIM-1-Kinase, Maus; AN: NP_032868 -
2a) enthält zwei Sequenzen, nämlich (i) mRNA-Sequenz ähnlich zu PIM-3-Kinase, human; AN: BC017083 und (ii) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, human; AN (EMBL): BC052239 -
2b) Aminosäure-Sequenz von PIM-3-Kinase, human; AN: Q86V86 (Datenbank: Swiss Prot) -
2c) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, Ratte; AN: NM_022602 -
2d) Aminosäure-Sequenz von PIM-3-Kinase, Ratte; AN: NM_072124 -
2e) cDNA-Sequenz von PIM-3-Kinase, Maus; AN: BC017621 -
2f) Aminosäure-Sequenz von PIM-3-Kinase, Maus; AN: BC017621 -
3 zeigt in einer graphischen Darstellung die Ergebnisse von Untersuchungen des Miktionsverhaltens von PIM-1-defizienten (knock-out) Mäusen (PIM –/–) im Vergleich zum Wildtyp (FVB +/+). Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der Messungen bei 20 (FVB +/+) bzw. 22 (PIM –/–) Tieren. - Die vorliegende Anmeldung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher beschrieben.
- Ausführungsbeispiele
- 1. Ausführungsbeispiel
- Miktionstest
- Männliche Wildtyp- (FVB +/+) Mäuse bzw. PIM-1-defiziente (PIM –/–) Mäuse (bezogen von Memorec Stoffel GmbH, Köln, Deutschland) wurden jeweils für 1 h auf Filterpapier (15,5 × 21,5 cm) gehalten und danach die Anzahl von großen (> 1,6 cm2) und kleinen (bis 1,6 cm2) Spots unter UV-Licht visualisiert und gemessen. Im Ergebnis handelt es sich um das Miktionsmuster der Tiere.
- Ergebnisse
-
- Die vorliegende Untersuchung zeigt eine deutliche Veränderung des Miktionsverhaltens der PIM-1 knock-out Mäuse im Vergleich zum Wildtyp. Insbesondere zeigen die PIM-1-defizienten Mäuse eine deutlich geringere stündliche Harnentleerung, was sich in einer etwa halbierten Anzahl an kleinen Spots (Fläche bis 1,6 cm2) im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen zeigt. Diese Ergebnisse belegen eine Beteiligung von PIM-1 an der Blasenkontrolle.
- 2. Ausführungsbeispiel
- Es wurde eine in vitro Untersuchung verschiedener Testsubstanzen in Hinblick auf deren Wirkung als Wirkstoffe für die Behandlung der Harninkontinenz durchgeführt. Isometrische Messungen von Kontraktionsparametern an isolierten Blasenstreifen von Meerschweinchen wurden in einer Organbadapparatur durchgeführt.
- Die nachfolgenden Versuchsbedingungen wurden eingesetzt.
- a. Tiermaterial
- Männliche und weibliche Meerschweinchen, ca. 200 – 400 g Körpergewicht. Haltung in Gruppen zu 5 Tieren in Makrolon®-Käfigen (Typ III); Kunstlicht 12/12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus; 22-24° C Raumtemperatur; 50 % relative Luftfeuchte. Herlin®-Standardfutter und Trinkwasser (Lixit®-Selbstränke) ad libitum.
- b. Organbadapparatur
- Es wurde eine 4-fach Organbadapparatur eigener Herstellung (Abteilung Biotechnik, Grünenthal GmbH) verwendet, die aus folgenden Komponenten besteht:
- – Nährlösungsvorratsbehälter
- – Dosiereinrichtung zur Abgabe von jeweils 50 ml Nährlösung an ein Organbad
- – Umwälzthermostat (Haake), angeschlossen an Organbäder und Wärmeaustauscher zur Temperierung der zugeführten Nährlösung
- – 4 Organhalterungen, absenkbar: untere Organbefestigung als schraubbare Klemmhaltung mit integrierter Stimulationselektrode; obere Halterung = isometrischer Aufnehmer Statham UC2. Zweite Elektrode als Platin-Stabelektrode parallel zum Organ. Feintrieb zum Einstellung der Vorspannung.
- Organbäder und Organhalterungen wurden auf einem gemeinsamen Sockel montiert, der zu- und abführendes Schlauchsystem und die Pneumatik zur Regulierung von Zu- und Ablauf der Nährlösung enthält. Zu- und Ablauf der Nährlösung wurde über Druckluft mit pneumatischen, manuell zu betätigenden Ventilen geregelt.
- c. Meß- und Registriergeräte
- Zur isometrischen Kraftmessung wurden Statham-Aufnehmer, Typ UC2 verwendet. Die Verstärkung und Differenzierung der Meßsignale erfolgte mit 4 Verstärker-Differenzier-Einheiten eigener Herstellung (Abteilung Biotechnik, Grünenthal GmbH). Die Registrierung der Meßsignale erfolgte mit einem 4-Kanal-Thermo-Schnellschreibewr, Fa. Honeywell, mit Schreibgeschwindigkeiten zwischen 5 mm .sec–I und 100 mm .sec–I.
- Zur elektrischen Stimulation der Organe wurde ein Stimulator eigener Herstellung (Abteilung Biotechnik, Grünenthal GmbH) verwendet.
- d. Meßparameter
- d.1 Atrien
-
- Isometrische Kontraktionskraft (p)
- Schlagfrequenz (n × min–I)
- d.2 Blasenstreifen
-
- Isometrische Kontraktionskraft (p)
- Kraftanstiegssteilheit (p × sec–I)
- e. Nährlösung
-
- CaCl2 wurde erst nach vollständiger Lösung aller anderen Substanzen zugegeben. Vor Versuchsbeginn Zusatz von Insulin (Alt-Insulin®, Hoechst), 2 mE/1000 ml. Die Nährlösung wurde ab 30 min vor Füllung der Organgefäße mit Carbogen (95 % O2/5 % CO2) über eine Fritte im Nährlösungsvorratsbehälter durchströmt. Während der Versuche wurde die Nährlösung über die Fritten in den Organgefäßen mit Carbogen durchströmt. In den Organbädern betrug die Temperatur der Nährlösung 35° C, der pH-Wert liegt bei 7,3-7,5.
- f. Substanzzugaben
-
- Die Tiere wurden mit Urethan (1,0 g/kg i.p.; 50 %ige Lösung) narkotisiert. Der Urogenitalbereich wurde eröffnet, und die Blase mit einer Präparierschere rasch herausgeschnitten. Nach kurzem Waschen in einem Glas mit begaster Nährlö sung wurde die Blase in Striefen geschnitten und diese in eine Präparierschale mit Nährlösung (Begasung über Fritte) gelegt (Raumtemperatur).
- Die Blasenstreifen wurden an der Organhalterung der Organbadapparatur befestigt und in die Nährlösung des Organbades abgesenkt. Es wurde darauf geachtet, daß die Periode, während der das Organ nicht in begaster Nährlösung ist, nur einige Sekunden beträgt.
- h. Versuchsdurchführung
- Nach etwa 5 min wurde am Feintrieb der Organhalterung eine Vorspannung von ca 1,0 p bis ca. 0,5 p bei den befestigten Blasenstreifen eingestellt und in den folgenden 30 min solange nachgespannt, bis die Vorspannung von den Organen beibehalten wurde. Vom Einstellen der Vorspannung an wurden die Blasenstreifen kontinuierlich mit Rechteckimpulsen von 1 msec Dauer bei einer Spannung von 5 V und – abgesehen von speziellen Fragestellungen – einer Reizfrequenz von 2 Hz stimuliert. Die Äquilibirierungsdauer der Blasenstreifen) betrug > 1 Stunde, während der die Nährlösung 2 mal gewechselt wurde.
- i. Ergebnisse
- Es ist bekannt, daß bei in vitro- Versuchsanordnungen die tatsächlich gemessenen Werte in hohem Maß von speziellen Bedingungen wie etwa Gewicht und Zustand der Versuchstiere, Temperatur der Nährlösung, Vorspannung, Reizstärke und Äquilibrierungszeit, Durchmesser der Blasenstreifen etc. abhängen. Unter den hier beschriebenen Bedingungen, die als "Standardbedingungen" etwa bei Versuchen zur Arzneimittelsicherheit verwendet werden, zeigen Meerschweinchenatrien eine isometrische Kontraktionskraft zwischen 0,6 und 1 p und eine Schlagfrequenz von ca. 2001 min, Blasenstreifen eine Kontraktionskraft um 0,5 p. Diese Werte werden ab Ende der Äquilibrierungszeit mit nur geringen Abweichungen für mindestens 3 Stunden beibehalten.
- Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
Claims (30)
- Verfahren zur Auffindung Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten: (a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die ein Protein der PIM-Kinase-Familie, insbesondere das Protein PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder ein Protein gemäß einer der
1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Protein und/oder ein Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden, oder ein mindestens 10 Aminosäuren langes Teilprotein eines der vorgenannten Proteine synthetisiert hat, (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von der Zelle synthetisierten Protein oder Teilprotein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder Teilprotein veränderten funktionellen Parameter. - Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird.
- Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.
- Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, daß die Zelle mindestens ein Polynukleotid gemäß einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid enthält. - Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid in einem rekombinanten DNA-Konstrukt enthalten ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle nach der gentechnischen Manipulation gemäß Anspruch 2 und vor dem Schritt (a) gemäß Anspruch 1 unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, gegebenenfalls unter Selektionsdruck.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden des Teilproteins oder Proteins und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz erfolgt.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfolgt, insbesondere über Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH oder des Membranpotentials, über Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Teilprotein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt ist aus: – der PIM-1-Kinase, – einem Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der
1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, – einem Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der1b) ,1d) ,1f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine. - Verbindung identifizierbar als Harninkontinenz- und/oder Harndrangregulierende Substanz durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und 30.
- Verbindung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 30 als Harninkontinenz- bzw. Harndrang-regulierende Substanz identifizierbar ist.
- Verwendung a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden, c. eines Vektors enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder eines Proteins gemäß einer der1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d), f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e) g. einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz bzw. Harndrang. - Verwendung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung chronische Harninkontinenz bzw. chronischen Harndrang betrifft.
- Verwendung a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden, c. eines Vektors, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) d. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) oder einen Vektor gemäß Punkt c) für die Gentherapie zur Behandlung von Harninkontinenz und/oder Harndrang. - Verwendung gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um In-vivo- oder In-vitro-Gentherapie handelt.
- Verwendung a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden, c. eines Vektors, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder eines Proteins gemäß einer der1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d), f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e) g. einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 und/oder h. eines Wirkstoffs, der an ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt a) bindet, für die Diagnostik von Harninkontinenz bzw. Harndrang und/oder für Wirksamkeitsuntersuchungen bei Harninkontinenz bzw. Harndrang. - Verwendung a. eines Polynukleotids, kodierend für eine PIM-Kinase, insbesondere die PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, oder eines Polynukleotids, welches einer der in einer der
1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, b. eines Polynukleotids, insbesondere Antisense-Polynukleotid oder PNA, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eines der unter Punkt a) aufgeführten Polynukleotide zu binden, c. eines Vektors, enthaltend ein Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b) d. einer PIM-Kinase, insbesondere der PIM-1-Kinase oder PIM-3-Kinase, und/oder eines Proteins gemäß einer der1b) ,1d) ,1f) ,2b) ,2d) oder2f) und/oder eines zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Proteins und/oder eines Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) ,1e) ,2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder eines mindestens 10 Aminosäuren langen Teilproteins eines der vorgenannten Proteine, e. eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder Teilproteine gemäß Punkt d), f. einer Zelle, enthaltend eine Polynukleotid gemäß einem der Punkte a) oder b), einen Vektor gemäß Punkt c), ein Protein oder Teilprotein gemäß Punkt d) oder einen Antikörper gemäß Punkt e) in einem Verfahren zur Auffindung Harninkontinenz- bzw. Harndrangregulierender Substanzen. - Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid gemäß Punkt a) ein Polynukleotid, kodierend für PIM-1-Kinase oder ein Polynukleotid, welches einer der in einer der
1a) ,1c) oder1e) dargestellten Nukleotidsequenzen zu wenigstens 90%, vorzugsweise 95%, insbesondere zu wenigstens 97% entspricht, ist und/oder das Protein gemäß Punkt d) eine PIM-1-Kinase und/oder ein Protein gemäß einer der1b) ,1d) oder1f) und/oder ein zu einem dieser vorgenannten Proteine zu mindestens 90 % ähnliches Protein und/oder ein Proteins, für das ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 % ähnliches Polynukleotid kodiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide binden oder ein mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine ist. - Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt a) und/oder Punkt b)) eine RNA oder eine ein- oder doppelstängige DNA, insbesondere mRNA oder cDNA ist.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Polynukleotid (gegebenfalls gemäß Punkt b)) Teil eines Ribozyms oder sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA ist.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) ein Expressionsvektor ist.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor (gegebenfalls gemäß Punkt c)) abgeleitet ist von einem Virus, beispielsweise dem Adenovirus, Adenoassoziiertem Virus oder Herpesvirus und/oder er mindestens eine LTR-, Poly-A-, Promotor- und/oder ORI-Sequenz enthält.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 15, 18 und/oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Teilprotein (gegebenfalls gemäß Punkt d)) posttranslational modifiziert wurde, es insbesondere glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP-ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt wurde.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 15, 18 und/oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper (gegebenenfalls gemäß Punkt e)) ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
- Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 15, 18 und/oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zelle (gegebenenfalls gemäß Punkt f)) um eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säugetierzelle handelt.
- Verbindung gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, Verwendung gemäß einem der Ansprüche 14, 15, 18 und/oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Verbindung (gegebenenfalls gemäß Punkt g)) um eine niedermolekulare Verbindung handelt.
- Verwendung gemäß Anspruch 14 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Wirkstoff gemäß Punkt h) ein niedermolekularer Wirkstoff ist.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in einem Teilverfahren das Protein oder Teilprotein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt ist aus: – der PIM-1-Kinase, – einem Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der
1a) ,1c) oder1e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, – einem Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der1b) ,1d) ,1f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der1a) ,1c) oder1e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und in einem anderen Teilverfahren das Protein oder Teilprotein in den Schritten (a) und (b) ausgewählt ist aus: – der PIM-2-Kinase, oder – der PIM-3-Kinase, – einem Protein, für das ein Polynukleotid gemäß einer der2a) ,2c) oder2e) oder ein dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnliches Polynukleotid kodiert, – einem Protein mit einer Aminosäuresequenz gemäß einer der2b) ,2d) ,2f) , oder einem dazu zu mindestens 90 %, vorzugsweise 95%, insbesondere 97%, ähnlichem Protein und/oder – einem Protein, das durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die unter stringenten Bedingungen an ein Polynukleotid gemäß einer der2a) ,2c) oder2e) oder deren Antisense-Polynukleotide bindet, – oder einem mindestens 10 Aminosäuren langen Teilprotein eines der vorgenannten Proteine und die Ergebnisse aus Schritt b) der Teilverfahren differentiell verglichen werden.
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