CN102648430A - 用于扫描显微镜的移相滤光器 - Google Patents

Abstract

说明了一种用于扫描显微镜的光学装置，借助该装置能够很大程度上与波长不相关地实现光束的焦点形成及由此简化在较大的波长频谱中的高分辨率的显微技术、尤其是STED显微技术。在此，至少两个移相滤光器被设置在固定器上。该固定器有利地为可设置在光束的光程中的滤光盘或滤光滑板，其中优选地涉及在STED显微镜中的受激发光束的光程。所述固定器被构造为玻璃衬底，相应的移相滤光器被设置在该衬底上。符合目的地，一个位置为了调节目的还附加地位于所述固定器上，在通过该位置时光的波阵面不受影响，也就是说，在此涉及一个空位，没有移相滤光器位于该位置上。

Description

用于扫描显微镜的移相滤光器

技术领域

本发明涉及具有聚焦光学器件和用于形成光束焦点的移相滤光器的光学装置，该光学器件使至少一束光束聚焦到焦平面中，其中，移相滤光器引起光束的相移。

此外，本发明涉及具有聚焦的光学器件和用于形成光束焦点的移相滤光器的扫描显微镜，该光学器件将光束聚焦在焦平面中，其中，移相滤光器引起光束的相移。

背景技术

在扫描显微技术（Scanmikroskopie）中，样品被光束照亮，以便观察从样品出发的反射光或荧光。照明光束的焦点借助于一个可控的光束偏转装置（扫描装置），通常通过两个镜子的倾斜而在一个物平面中运动，其中该偏转轴线通常彼此垂直地竖立，使得一个镜子向着x方向及另一个向着y方向偏转。

共焦的扫描显微镜通常包括光源、聚焦光学器件，借助该光学器件光源的光聚焦在一个孔板上、分光器、用于射束控制的光束偏转装置、显微光学器件、检测光阑和用于证明检测光或荧光的检测器。照明光由一个分光器耦入。来自物体的荧光或反射光通过光束偏转装置返回到达分光器，经过该分光器，以便接着被聚焦到检测光阑上，检测器位于该检测光阑的后面。不直接来自焦平面的检测光选取另一条光路并且不经过检测光阑，使得得到了样品的点信息，所述信息通过对物体的顺序扫描得到一幅三维图像。三维图像大多通过层式的图像数据接收来获得。

此外，共焦扫描显微镜的分辨力除其他因素之外还取决于激发光束的焦点的亮度分布和空间延伸。STED（受激发射损耗）显微技术，如其由Prof.Stefan所开发的，提供了提高分辨率的可能性。在此，激发光束的焦点空间的侧向边缘区域被用另一波长的光束、所谓的受激发光束或退激发光束照亮，这些光束优选由第二激光器发射，以便在那里将由第一激光器激发的样品区域（即那里的荧光分子）受激发地返回基态。随后仅检测来自不被第二激光器照亮的区域的自发发射的光，使得总体上实现了分辨率的改进。

已证实，当理想地实现了将受激发光束的焦点在内部、更确切地说在所有三个空间方向上构造为零点时，可同时不仅侧向地而且轴向地提高分辨率。以图示说明，在受激发光束的亮度轮廓的内部构成一个空心球体，在该空心球体中受激发光束的亮度为零，也就是说不存在辐射。受激发焦点的形状由移相滤光器函数的傅里叶变换得出。在此，已知了多种不同的移相滤光器。例如具有所谓的Vortex移相滤光器或轴向移相滤光器，如其例如在《应用物理快报》（Appl.Phys.Lett.）2003年5月5日第82卷第18期，3125-3127中说明的那样。在轴向移相滤光器中，穿过板的中心部分的光相对板的边缘区域延迟半个波长。在此，穿过中心部分的光部分必须与穿过边缘区域的部分相同。由此，由于干涉效应在光束的中心区域中产生消光。在实践中，在侧向和轴向方向上经常不能相同地实现非常高的消光改进，因为所描述的理想空心球体很难产生。因此，人们经常需要决定选择某个装置以要么在侧向要么在轴向方向上实现高的分辨率，这取决于相应的应用情况。

其次，对于不同的荧光色素也必须使用不同波长的激发及退激发光。但是，已知的移相滤光器具有缺点，即，它仅对于一个特定的光波长度精确地进行相移，该相移导致所希望的焦点上的亮度分布。因此，它们通常仅可在一个在中心波长附近约60nm的窄的波长带宽中使用。但是，这是一个大的缺点，因为荧光色素在一个宽的波长范围中出现并且对于确定的生物学课题必须使用不同的荧光色素。但是，随后由于该移相滤光器不与该荧光色素配套而仅可实现较差的分辨率。

发明内容

本发明所基于的任务在于，提供一个光学装置，该光学装置能够很大程度上与波长不相关地实现光束的焦点形成并且由此允许在较大的波长频谱中使用高分辨率的显微技术、尤其是STED显微技术。

该任务通过一个光学装置解决，该光学装置其特征在于，在一个固定器上设置至少两个移相滤光器。有利的是，该固定器是一个滤光盘或滤光滑板，它被置入光束的光程中。优选地，它用于STED显微镜中的受激发光束的光程。优选地，在固定器上矩阵式地设置多个移相滤光器。有利地，固定器是一个玻璃衬底，各个移相滤光器被气相喷镀在该衬底上。符合目的地，为了调节目的附加地还有一个位置位于固定器上，在通过该位置时不影响光的波阵面，也就是说，在此涉及一个空位，没有移相滤光器位于该空位上。

为了调节光的光程，首先在光程中调节空位，也就是在滤光盘或滤光滑板中没有移相滤光器位于其上的位置，使得从激光器输出端或者说激发针孔或者耦入激光器的光导纤维的端部开始直到样品平面的焦点为止的光程可不受移相滤光器影响地被调节。当例如应用在DE102007011305A1中说明的、用于调节两个光束的调节方法时，如其在STED显微技术中所必需的那样，是特别有利的。

有利地，移相滤光器应位于显微镜的物镜光瞳中或一个与其共轭的平面中。但是，由于移相滤光器出于结构原因通常不能被直接装入到物镜光瞳中，因此它尽可能接近物镜光瞳地定位或者借助成像光学器件成像在物镜光瞳中。移相滤光器被相对显微镜的光轴调节，使得它或其图像被设置在物镜的光瞳中心。在应用用于移相滤光器的滤光盘时必要的是，在滤光盘转动时各个移相滤光器的中心点总是可以成像在物镜的光瞳的中心点上。因此必要的是，滤光盘的转动轴线被相应地调节，使得在该盘转动时各个移相滤光器的中心点也与光瞳的中心点相一致。特别有利的是在使用滤光盘时，对于调节使用极坐标系并且通过距离和角度来定义滤光盘的中心点。滤光盘可被电机驱动转动。各个移相滤光器在光程中的定位可通过计算机电子控制地实现。在此，各个移相滤光器相对物镜光瞳的中心点的精确定位是必需的。为了测量移相滤光器的位置应用一种高精度的测量***、例如磁阻测量***，借助该***可实现对***到光程中的相应移相滤光器的位置的精确测量。

移相滤光器的调节例如可如下进行：滤光盘的转动轴线的位置被沿着光束的光轴手动调节，然后通过转动滤光盘来调节相应的移相滤光器。下述实施变型尤其是有利的：在r方向上借助微调螺钉将各个移相滤光器的位置范围定向到光路上。在

方向上通过步进电机驱动装置转动盘来调节精确的

位置。通过应用扫描器，可精确地并且可再现地调节转动位置，有利的是磁阻传感器结合直接设置在移相滤光盘上的磁极盘使用。也可考虑，在r方向上的调节也通过扫描器来实现。由此，调节可借助计算机中执行的算法来自动控制。有利地，正确的盘位置的测量值被电子地存储在数据表中。在稍后对运行中的移相滤波器矩阵进行定位时，移相滤波器以迭代的方法定位，其中，转动滤光盘并且测量当前的位置。如果还未达到目标位置，则再次运动滤光盘、测量当前位置等，直到最后达到最终位置。用于正确定位的另一个操作方式是，使用位置调节器。通过相对于光轴调节移相滤光器矩阵可实现移相滤光器矩阵或者其在光瞳中的像的最佳定位。这也可被机械化地进行，以便例如对分别具有不同光瞳位置的不同物镜自动地获得正确的调节。为此，可再次使用数据表。物镜的选择被计算机控制地进行。由此可为每个所选择的物镜相应地定位移相滤光器。

为了在显微镜中不仅实现侧向的而且实现轴向的分辨率提高，移相滤光器矩阵可不仅装配提高侧向分辨率的移相滤光器而且装配提高轴向分辨率的移相滤光器。替换地，例如对于STED显微技术，受激发光束可借助分光器被分成两个分光束。为此，例如可使用偏振分光器并且两个分光束的光输出比例用一个λ/2板来调节。两个分光束中的每一个可穿过一个移相滤光器，其中，两个移相滤光器中的每一个是根据本发明的移相滤光器固定器的一部分。在两个分光束穿过相应的移相滤光器之后，两个分光束又彼此叠加，使得随后尽可能地在受激发光束的焦点中形成一种空心球及由此能够实现STED显微镜的在侧向而且在轴向方向上的高分辨率。在该实施例中，一个固定器仅装配仅提高侧向分辨率的移相滤光器，而另一个固定器仅装配提高轴向分辨率的移相滤光器。由此，除了两个极限位置——仅侧向分辨率提高及仅轴向分辨率提高——之外，可实现组合的侧向及轴向分辨率的提高。

也可考虑，同时使用不同的退激发激光器，其中，每个激光器分别配置一个特定的移相滤光器。它们可位于不同的移相滤光器固定器上。对于STED显微技术必需的是，激发光的焦点和受激发光或者退激发光的焦点彼此精确地重叠，也就是说，允许的偏离小于100nm。为了实现它，有利的是所使用的激光器借助光导纤维被耦入STED显微镜中。因此，所有的光束可以说从一个点光源出发，使得在显微镜***组件漂移时这些焦点位置彼此间保持不变。在实际应用中，由于激发及退激发光的特性不同，通常有利的是，使用两个不同的光纤用于激发及退激发光。可能地，也使用不同的光纤用于不同的退激发波长，以便例如可将光以单模式分别导入。在使用来自不同波长的光的点光源或光导纤维时，这要求使用被相应地良好校正的光学器件。尤其是，所涉及的波长的色差在焦点处必须校正到100nm。这尤其对于多色接收装置是必要的，在这些装置中使用多种荧光标记并且它们用不同的激发激光器和/或退激发激光器来激发或退激发。

为了具有最大的适应性，激光通过声光分光器（AOBS）耦入。为此可使用一个用于所有的波长的AOBS或者多个AOBS，例如一个第一AOBS用于耦入激发光及一个第二AOBS用于耦入退激发光。

所述一个或多个移相滤光器的选择通过软件的用户界面来实现。该界面控制用于定位移相滤光器的电子机构和机械机构。它提供了多种不同的形成用户输入的可能性。第一种可能性是，使用者在用户界面中直接选择所述相应的一个或多个移相滤光器。另一种可能性是，该一个或多个移相滤光器的选择与使用的退激发激光器或退激发波长相联系。这样则可例如在选择具有波长592nm的退激发激光器时运行用于592nm的移相滤光器或者相应波长带宽的移相滤光器。为此，可建立及使用参考表格。也可考虑，在同时使用提高侧向分辨率的移相滤光器和提高轴向分辨率的移相滤光器时，用户在用户界面中输入所希望的侧向及轴向分辨率的值。软件相应地控制电子机构或机械机构，使得需要用于该激光器的、用于侧向及轴向分辨率提高的移相滤光器进入光程中并且将在这两个路径之间的光输出，例如通过转动λ/2板被这样分配，使得所述相应的比率相应于侧向及轴向方向上的分辨率提高的比率。为此同样可使用参考表格。通过调节退激发激光器的激光功率来调节STED显微镜中的分辨率。这是可能的，因为STED显微镜与通常的共焦显微镜相比的分辨率的提高与由退激发激光器的激光功率得出的平方根成比例。为此也可使用参考表格和/或可计算待调节的值。

附图说明

在附图中示意性地示出了本发明的技术方案并且在下面根据附图来说明。在此示出了：

图1根据本发明的、具有多个移相滤光器的固定器，

图2根据本发明的扫描显微镜，

图3根据本发明的第二扫描显微镜，

图4根据图1的、具有多个移相滤光器的固定器的实施例。

具体实施方式

图1示出了根据本发明的、具有至少两个移相滤光器2、3的固定器1。固定器1在此被构造为滤光盘并且除了这两个移相滤光器2、3之外还有其它的移相滤光器4、5和6位于该滤光盘上，这些移相滤光器被环形地设置在该固定器上。该固定器有利地为玻璃衬底，移相滤光器被气相蒸镀在该衬底上。符合目的地，一个位置7为了调节的目的还附加地位于该固定器1上，在通过该位置时，光的波阵面不受影响，也就是说在此涉及一个不存在移相滤光器的空位。

光轴10总是垂直地延伸通过滤光盘上的一个移相滤光器的位置的中心。为了调节的目的，设有两个方向8和9，其在极坐标系中一个是指半径r的长度另一个是指角度

在图2中示出了根据本发明的扫描显微镜，在此尤其是用于STED显微技术。设有两个激光器11，18，其中，激光器18发射用于激发样品的光21，该光通过第一光学器件19、一个未详细示出的光导纤维和第二光学器件20被导入照明针孔22中。随后，激发光21射到第一分光器17和第二分光器29上并且到达扫描模块23。该扫描模块23具有一个或多个扫描镜。替换地，也可考虑一些声光元件。最后，激发光21通过两个另外的光学器件25、26到达物镜27并且随后射到样品28上。

激光器11发射用于退激发的光，所述光通过第一光学器件12、光导纤维13和第二光学器件14射到根据本发明的移相滤光器矩阵15上。该移相滤光器矩阵15由一个装配有至少两个移相滤光器的固定器1构成。在分光器17上反射后，所述光选取与激发光21相同的路径到达样品28。

在图3中是根据本发明的第二扫描显微镜，尤其是用于STED显微技术，其中具有与图2中相同功能的元件被设有相同的参考标号。除了在图2中示出的，在此设有一个λ/2板36以及一个偏振分光器37，该分光器将激光射束分成两个分光束。激光射束的透射部分射到第一移相滤光器矩阵34上并且在穿过分光器40之后再次与另一分光束会聚。光束的反射部分射到镜子38上及第二移相滤光器矩阵35上。在通过镜子39和分光器40转向后，它再次与激光射束的另一部分会聚。接着，两束再次会聚的光束穿过一个λ4板41。退激发激光射束由此通过这种设置被分开并且两个分光束分别穿过不同的移相滤光器34、35，使得可由此整体地影响轴向及侧向分辨率。

图4示出了根据本发明的、具有多个移相滤光器的固定器1的一个实施例。固定器1在此被构造为具有多个移相滤光器51、52、53、54和55的滤光盘50。该滤光盘50是一种光学上透明的材料如玻璃或塑料并且移相滤光器51-55被气相蒸镀在该滤光盘50上。符合目的地，还有一个位置56为了调节的目的位于固定器1上，在通过该位置时光不被影响，也就是说设有一空位。光轴70垂直于滤光盘1，50的面。

为了调节光的光程，首先将空位7、56调节到光程中，使得从激光器输出端11或激发针孔或耦入激光器11的光导纤维的端部开始直到样品平面28中的焦点的光程可不受移相滤光器2-6、51-55影响地被调节。当例如使用在DE102007011305A1中说明的、如其在STED显微技术中所需要的那样、用于调节两个光束的调节方法时，这尤其是有利的。

有利地，移相滤光器2-6、51-55应当位于显微镜物镜27或与其共轭的平面的光瞳中。但是，由于移相滤光器2-6、51-55通常出于结构原因并不能直接安装在物镜光瞳中，因此它们或者尽可能地定位在物镜光瞳附近或者借助成像光学器件成像到物镜光瞳中。移相滤光器被相对显微镜的光轴调节，使得它或其图像被中心地设置在物镜的光瞳中。在使用用于移相滤光器的滤光盘1、50时必要的是，在转动滤光盘1、50时，各个移相滤光器2-6、51-55的中心点可分别成像在物镜光瞳的中心点上。因此必要的是，滤光盘1、50的转动轴线被相应地调节，使得在转动盘1、50时，相应的移相滤光器2-6，51-55的中心点也与光瞳的中心点相一致。滤光盘1、50可由电机60驱动地转动。各个移相滤光器2-6、51-55在光程中的定位可电子控制地通过计算机来进行，其中，必须实现各个移相滤光器相对物镜光瞳的中心点的精确定位。为了测量移相滤光器的位置，使用一个高精度的测量***61、例如一个磁阻测量***，借助所述***可精确地测量相应向内摆动到光程中的移相滤光器的位置。但是，也可考虑光学的或电子的其它测量方法。移相滤光器的调节例如可如下进行：滤光盘1、50的转动轴线的位置首先用手来调节及随后相应的移相滤光器2-6，51-55通过滤光盘1，50的转动来调节。所述两个调节自由度在此是（a）沿着移动方向r的可定位性和（b）沿着转动方向

的运动。在图4中示出的实施变型是尤其有利的：在X方向（移动方向r）上，借助一个微调螺钉62将各个移相滤光器位置范围定向到光程上。在Y方向（转动方向

）上通过一个步进电机驱动装置60转动盘1，50来调节精确的Y位置。通过使用扫描器61，可精确及可再现地调节转动位置，有利地是将磁阻传感器与直接设置在移相滤光盘50上的磁极盘65相连接。此外可考虑，在X方向上的调节通过扫描器（在此未示出）来实现。由此，调节可借助计算机中执行的算法被自动控制。

有利地，正确的盘位置的测量值被电子地存储在数据表中。在之后对运行中的移相滤光器矩阵进行定位时，移相滤光器以迭代的方法定位，其中，转动滤光盘1、50并且测量当前位置。如果还未到达目标位置，则再次运动盘1、50，测量当前位置等，直到最终达到最终位置。

用于正确定位的另一操作方式是位置调节器的使用。通过相对光轴70调节移相滤光器矩阵1，50，可实现移相滤光器矩阵1，50或者其在光瞳中的成像的最佳定位。这也可机械地进行，以便例如对于分别具有不同光瞳位置的不同物镜自动地得到正确调节。为此，可再次使用数据表。物镜的选择同样被计算机控制地实现。由此，移相滤光器2-6、51-55可被相应地定位用于每个所选择的物镜。

Claims (20)

1.具有聚焦光学器件的光学装置，所述光学器件使光束聚焦到焦平面中并且具有用于形成光束焦点的移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55），其中，所述用于形成焦点的移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）引起光束的相移，其特征在于，设有固定器（1；50），该固定器被装配有至少两个移相滤光器（2，3；51，52），并且所述移相滤光器（2，3；51，52）能够分别单独地设置到光束的光程中。

2.根据权利要求1所述的光学装置，其特征在于，所述固定器（1；50）被构造为滤光盘，所述滤光盘能够通过电机转动。

3.根据权利要求1或2所述的光学装置，其特征在于，所述固定器（1；50）被构造为玻璃衬底，所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）被设置在该衬底上。

4.根据权利要求2或3所述的光学装置，其特征在于，所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）在光束的光程中的定位能够由计算机电子控制实现。

5.根据权利要求3或4所述的光学装置，其特征在于，一个位置（7，56）位于所述固定器（1；50）上，在通过该位置时光的波阵面不受影响。

6.根据权利要求5所述的光学装置，其特征在于，所述位置（7，56）是一个空位，没有移相滤光器位于该位置上。

7.根据权利要求2至6中一项或多项所述的光学装置，其特征在于，通过在r方向上移动及以角度

转动，所述滤光盘（1；50）能够相对于光轴（70）调节

8.根据权利要求7所述的光学装置，其特征在于，设置扫描器用于调节滤光盘（1；50）的转动位置。

9.根据权利要求8所述的光学装置，其特征在于，该扫描器被构造为磁阻传感器和直接设置在滤光盘（1；50）上的磁极盘的组合。

10.根据权利要求7至9中一项所述的光学装置，其特征在于，滤光盘（1；50）的调节借助于存储在计算机中的算法来实现。

11.根据权利要求1至10中一项或多项所述的光学装置，其特征在于，所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）被这样地构造，使得其导致轴向或侧向方向上的分辨率提高。

12.根据权利要求1至11中一项或多项所述的光学装置，其特征在于，所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）位于显微镜物镜的光瞳或与其共轭的平面中。

13.具有聚焦光学器件的扫描显微镜，所述光学器件使光束聚焦到焦平面中并且具有用于形成光束焦点的移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55），其中，所述用于形成焦点的移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）引起光束的相移，其特征在于，设有固定器（1，50），该固定器装配有至少两个移相滤光器（2，3；51，52），并且所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）能够分别单独地设置到光束的光程中。

14.根据权利要求13所述的扫描显微镜，其特征在于，所述固定器（1；50）被构造为滤光盘。

15.根据权利要求14所述的扫描显微镜，其特征在于，所述固定器（1，50）被构造为玻璃衬底，所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）被气相蒸镀在该衬底上。

16.根据权利要求14或15所述的扫描显微镜，其特征在于，一个位置（7，56）位于所述固定器（1，50）上，在通过该位置时光的波阵面不受影响。

17.根据权利要求16所述的扫描显微镜，其特征在于，所述位置（7，56）是一个空位，没有移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）位于该位置上。

18.根据权利要求14至17中一项或多项所述的扫描显微镜，其特征在于，通过在r方向上移动及以角度转动，所述滤光盘（1，50）能够相对于光轴（70）调节

19.根据权利要求18所述的扫描显微镜，其特征在于，光束是激光光束并且所述移相滤光器（2，3，4，5，6；51，52，53，54，55）的选择取决于所使用的激光器。

20.根据权利要求19所述的扫描显微镜，其特征在于，所述显微镜是具有激发-及退激发激光器的STED显微镜并且所述移相滤光器被设置用于退激发激光器。

Images