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Die Erfindung beschreibt die Darstellung
und Anwendung von dünnen,
kovalent gebundenen, dendritischen und hyperverzweigten Polymerfilmen
als proteinabweisendes Oberflächenmaterial.
Weiterhin reduziert die vorgelegte Erfindung die unspezifische Adhäsion von
biologischen Spezies wie Zellen, Bakterien oder Viren, und sie erlaubt
die spezifische Anbindung von Biomolekülen, Bakterien, Zellen und
Viren über
geeignete Liganden.
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Proteine, Bakterien, Zellen und Viren
können an
einer fest-flüssig
Grenzfläche
adsorbieren, wenn die Oberfläche
Lösungen
bzw. Suspensionen dieser Spezies ausgesetzt wird. Beispiele, bei
denen dieses Phänomen
ungewollt auftritt, sind die Adsorption von zellulären, biologischen
Spezies an künstliche
Oberflächen
von medizinischen Geräten,
an Materialien zum Transfer von Medikamenten, Impfstoffen und an Biosensoren
(J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3464-3473; Anal. Biochem. 1988, 168,
292-297). Komplikationen, die auf unspezifische Proteinadsorption
an künstliche,
in den menschlichen Körper eingebrachten
Oberflächen
[z.B. bei Kathetern (Langmuir 1995, 11, 4383-4385; J. Colloid Interface Sci.
1990, 139, 561-570), Implantaten (J. Biomed. Mater. Res. 1984, 18,
337-355) oder Prothesen (Dtsch. Zahnärztl. Z. 1988, 43, 719-727)]
zurückgeführt werden
können,
sind Thrombosen, Infektionen oder Irritationen (Langmuir 2001, 17,
1225-1233; Chem. Rev. 1992, 92, 1799-1818). In Biosensoren führt die
unspezifische Proteinadsorption zu einer Beeinträchtigung ihrer Funktionstüchtigkeit.
Oben genannte Materialien können
auch zur Vermeidung der Biofilmbildung, der Anreicherung von Bakterien, Schimmel
oder Meeresorganismen an Schiffen und anderen Geräten, die
Gewässern
ausgesetzt sind, eingesetzt werden. Trotz ihrer großen Bedeutung
für oben
genannte Anwendungen sind bis jetzt nur wenige Beispiele für proteinabweisende
Materialien bekannt.
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Ein weit verbreiteter Ansatz zur
Unterdrückung
der Biofilmbildung, die auf die unspezifische Adsorption biologischer
Spezies zurückzuführen sind,
ist die Beschichtung einer Oberfläche mit einem Film proteinabweisender
Materialien. Beispiele für solche
Materialien sind Dextrane (Biomaterials 2000, 21, 957-966) oder
Poly(ethyloxazoline) (Macromolecular Symposia 1999, 142, 1-12; Journal
of Biomaterials Science, Polymer Edition 1994, 6, 91-109). Weiterhin
wurde eine große
Auswahl an Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und verschiedenen Funktionalitäten auf
eine Gold-/Glasoberfläche
aufgebracht und auf ihre proteinabweisenden Eigenschaften untersucht
(Langmuir 2001, 17, 5605-5620; J.
Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8308-8304).
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Das gebräuchlichste Beispiel als Material
zur Reduzierung der Proteinadsorption ist Poly(ethylenglycol) (EG)n, ein linearer, flexibler, hydrophiler und wasserlöslicher
Polyether. SAMs, die Oligo(ethylenglycol)-Einheiten an der Oberfläche präsentieren
[wie bei HS(CH2)11-(EG)nOH und -(EG)nOCH3] stellen ebenfalls eine proteinabweisende
Oberfläche
dar, sogar dann, wenn die Anzahl an Ethylenglykol-Einheiten größer gleich
drei ist. PEG findet breite Anwendung als Material zur Beschichtung
von biomedizinischen Geräten,
hat jedoch den Nachteil der Oxidationsempfindlichkeit. Es wird entweder
in Anwesenheit von Übergangsmetallionen
durch O2 oder in vivo enzymatisch zu entsprechenden
Aldehyden und Säuren
oxidiert (Langmuir 2001,17, 5605-5620).
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Daraus resultiert ein Bedarf an proteinabweisenden
Oberflächen,
die nicht auf der Derivatisierung mit EG-Einheiten beruhen. Van
der Heiden beschreibt eine Poly (ether urethan)-Oberfläche die
mit Phosphorylcholin derivatisiert wurde und so gegenüber Protein-
und Blutplättchenadsorption
passiviert wurde (J. Biomed. Mater. Res. 1998, 40, 195-203). Deng
et al. beschreibt SAMs auf der Basis von Tri(propylensulfoxid)-Gruppen,
denen auch Alkan-terminierten Ketten beigemischt werden können, zur
Darstellung einer Oberfläche
mit proteinabweisenden Eigenschaften (J. Am. Chem. Soc. 1996, 118,
5136-5137).
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Bestimmte Polymere zeigen ebenfalls
proteinabweisende Eigenschaften. U. S. Patent No. 4,241,682 [(Konstandt)]
beschreibt die Verwendung einer Polymerlösung zur Beschichtung einer
lackierten Oberfläche
zur Erhöhung
der Lebensdauer des Lacks. Die Lösung
besteht aus Polyethylenimin und einem hydrophilen Acrylpolymer.
U. S. Patent No. 5,312,873 beschreibt die Umsetzung der an der Oberfläche befindlichen
Nitrit-Gruppen einer polymeren Membran zu Amid-Gruppen, was ihrem
Verfaulen durch Absorption entgegenwirkt. U. S. Patent No. 4,925,698
(Klausner et al.) beschreibt eine chemische Modifizierung von polymeren
Oberflächen,
die eine Verbesserung der Resistenz der Oberfläche gegen Proteinadsorption
bewirkt. Insbesondere ist an der chemischen Modifizierung eine Acylierung
beteiligt. Ein Film aus linearem oder verzweigten Poly(ethylenimin),
das über
ein Carboxyl-terminiertes Thiol an eine Goldoberfläche angebracht
wurde, wurde weiterhin mit Oligoethylenglykolcarbonsäuren derivatisiert
und lieferte ein PEG-Analogon, dass proteinabweisende Eigenschaften
zeigte (US patent no. 60/218,739; Langmuir 2001,17, 1225).
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Da es kein Material gibt, dass der
Adsorption von Proteinen, Bakterien, Zellen und Viren völlig entgegenwirkt,
besteht nach wie vor die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Materialien
mit proteinabweisenden Eigenschaften.
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Zusammenfassende
Beschreibung der Erfindung
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Dieses Patent beschreibt die Darstellung und
Anwendung von hyperverzweigten und dendritischen Polymerfilmen,
die proteinabweisende Eigenschaften zeigen und das Ausmaß der Adhäsion von Zellen
und/oder Bakterien an Oberflächen
reduziert. Diese Polymere beinhalten Polyether, Polyimine, Polyamide,
Polyester und/oder Polyethersulfone als Struktureinheiten. Vorzugsweise
beinhalten sie Polyether, besonders bevorzugt dendritische und hyperverzweigte
Polyglycerine. Polyglycerin-Derivate mit reaktiven, funktionellen
Gruppen wurden dargestellt und sowohl kovalent als auch über nicht-kovalente Wechselwirkungen
auf eine Oberfläche
aufgepfropft; beispielsweise an Goldoberflächen über Organoschwefel-Gruppen,
an Silicium-Oberflächen über geeignete
Silan-Linker oder an geladene Oberflächen wie SiO2,
TiO2 und anderen Metalloxiden über Polyelektrolyt-Ankergruppen,
die jeweils kovalent an das proteinabweisende Polymer gebunden sind.
Das Ausmaß der
Proteinadsorption an diese Polyglycerin-modifizierten Oberflächen wurde
durch Oberflächenplasmonen-Spektroskopie (SPR-Spektroskopie)
quantifiziert. Es war bedeutend niedriger als jenes an eine unbehandelte
Referenzoberfläche. Überraschenderweise
wurde nun gefunden, dass ein Film aus hyperverzweigtem Polyglycerin,
das eine große Zahl
an freien Wasserstoffbrückenbindungs-Donorgruppen
aufweist und an einer Gold/Glas-Oberfläche immobilisiert ist, im gleichen
Ausmaß proteinabweisend
ist wie Monolagen aus Oligoethylenglycoleinheiten. Letztgenannte
Oberflächen
weisen die besten, bisher bekannten proteinabweisenden Eigenschaften
auf. Zuvor durchgeführte
Studien an methylierten Zuckerderivaten schlossen darauf, dass proteinabweisende
Eigenschaften mit der Abwesenheit von Wasserstoffbrückenbindungs-Donorgruppen
in Zusammenhang stehen (J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8308). Auch
zeigten lineare, modifizierte Polyamin-Filme bessere proteinabweisende
Eigenschaften als ihre verzweigten Analoga (Langmuir 2001, 17, 1225). Überraschenderweise
zeigten unsere Ergebnisse, dass ein vollständig methyliertes Polyglycerin mit
einer Thioctinsäure-Gruppe
zur Immobilisierung keinerlei proteinabweisende , Eigenschaften
auf der Goldoberfläche
besitzt, und dass dendritische und hyperverzweigte Polymere mit
einem Verzweigungsgrad von über
10%, vorzugsweise von über
50%, besonders bevorzugt jene mit OH-Gruppen an der Oberfläche, zur
Oberflächenmodifizierung
von Materialien und Geräten
herangezogen werden können, und
dadurch die unspezifischen Adsorption biologischer Spezies (z.B.
Proteine, Bakterien, Zellen und Viren) reduzieren.
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Grundlage der vorliegenden Erfindung
ist die einzigartige Struktur der dendritischen und hyperverzweigten
Polymere als proteinabweisende Filme. Die kovalente Bindung der
Polymere an die Oberfläche eines
Substrats liefert eine im Vergleich zu physisorbierten Filmen robustere
und stabilere proteinabweisende Beschichtung. Die Synthesestrategie
basiert auf der kontrollierten Darstellung dendritischer und hyperverzweigter
Polymere, die oberflächenaktive Funktionalitäten tragen:
(i) der Synthese von hyperverzweigten und dendritischen Polymeren
in Lösung ausgehend
von einem Initiator, der eine oberflächenaktive Gruppe beinhaltet
oder (ii) durch die Modifizierung des betreffenden Bulk-Polymer mit einer
reaktiven Gruppe. Beispiele zur Darstellung von Polyglycerinen zur
Oberflächenmodifizierung
umfassen die Polymerisation von Glycidol ausgehend von einem Thiol-funktionalisierten
Initiator oder die Umwandlung seiner OH-Gruppen in oberflächenaktive
Organoschwefelgruppen. Diese Derivate wurden schließlich zur
Beschichtung einer Oberfläche,
die mit einer dünnen
Goldschicht versehen wurde, durch Selbstanordnung herangezogen (1). In ähnlicher Weise können Polyglycerin-Derivate
mit Ankergruppen zur Anbindung an Metalloxid-Oberflächen und
Copolymere des Typs Polyglycerin-g-polyelektrolyt, die an geladene
Oberflächen
adsorbieren, dargestellt werden. Die oben genannten Strategien erlauben
die Präparation
von Materialoberflächen
mit proteinabweisenden Eigenschaften, die ebenfalls das Ausmaß der Adhäsion von
weiteren biologischen Spezies wie Zellen, Bakterien und/oder Viren
reduzieren. Die dendritischen und hyperverzweigten Polymerfilme
können
ebenso als Träger
für weiterer
proteinabweisender Gruppen oder Liganden, die spezifisch Biomoleküle, Zellen,
Bakterien oder Viren binden, dienen. Um die Proteinresistenz der
oben genannten, mit kovalent gebundenem Polyglycerin modifizierten
Oberflächen
zu bestätigen
wurden selbstanordnende Monolagen aus hyperverzweigtem Polyglycerin
auf Gold dargestellt und das Ausmaß der Proteinadsorption an
diese Oberflächen über SPR-Spektroskopie
analysiert. Die Kontrolle der Oberflächenchemie eines semitransparenten,
50 nm dicken Goldfilms wurde über
SAM-Bildung mit Organoschwefel-Derivaten des Polyglycerins erreicht
(1). Die Menge an adsorbiertem
Protein wurde relativ zu einer Referenzoberfläche bestimmt, indem die beschichteten Oberflächen innerhalb
eines SPR-Spektrometers einer Proteinlösung ausgesetzt wurden (2).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Zur Darstellung von hyperverzweigten
Polyglycerin-Derivaten, die zur Oberflächenmodifikation eingesetzt
werden konnten, wurden zwei verschiedene Syntheserouten verfolgt:
(i) Die Polymerisation von Glycidol ausgehend von 4-Methoxybenzyl-geschütztem 3-Mercaptopropan-l,2-diol
[Schema 1, Initiator = (MBz)MethoxybenzylS-CH2-CHOR-CH2OH], wie es bereits für ein weiteres Substrat beschrieben wurde
(Macromolecules 2000, 33, 253), und anschließender Freisetzung der Thiol-Gruppe
oder (ii) die Kupplung einer Disulfid-Gruppe an mehrere, bevorzugt
eine OH-Gruppe pro Polyglycerin-Molekül.
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Mono-Thiol funktionalisiertes Polyglycerin. Die
Polymerisation von Glycidol (Macromolecules 2000, 33, 253) ausgehend
von MBz-geschütztem 3-Mercaptopropan-l,2-diol
analog zu Schema 1 lieferte Polyglycerine, die das erwünschte Initiatormolekül in das
Polymerrückgrat
inkorporiert hatten, was durch MALDI-TOF-Spektren klar nachgewiesen
werden konnte. Die Freisetzung der Thiol-Gruppe im Initiatorrest
gelang durch Rühren
des Polyglycerin-SMBz in Trifluoroessigsäure (Schema 1).
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Disulfid funktionalisiertes Polyglycerin.
Zusätzlich
zu den mono-thiolfunktionalisierten Polyglycerinen wurde ein zweiter
Ansatz ausgehend von unfunktionalisiertem Polyglycerin verfolgt.
Dabei wurden durch partielle Veresterung mit Thioctinsäure in einem
Schritt disulfid-funktionalisierte Polyglycerine erhalten (Schema
2). Es wurde von Polyglycerinen mit verschiedenen Initiatoreinheiten
ausgegangen und verschiedene Funktionalisierungsgrade eingestellt.
Die Funktionalisierung wurde durch Veresterung mittels DCC und DMAP
in wasserfreiem DMF bei 0 – 25 °C über Nacht
durchgeführt.
Filtration und Dialyse der Reaktionsmischungen in MeOH erlaubte eine
effektive Abtrennung der Nebenprodukte vom erwünschten, polymeren Produkt.
Die kovalente Anbindung der Thioctinsäure an Polyglycerin wurde durch 1H-NMR-Signale
im Produkt bewiesen. Ein experimenteller Wert für den Funktionalisierungsgrad wurde
aus dem Quotienten der Intensitäten
der 1H-NMR-Signale von Thioctinsäure und
Polymerrückgrat
erhalten. Durch die beiden beschriebenen Synthesestrategien war
es möglich
verschiedene Polyglycerin-Derivate
darzustellen, die weiterhin zur Modifikation von Goldoberflächen eingesetzt
werden konnten. Diese Verfahren wurden ebenfalls zur Immobilisierung
von überwiegend
methylierten Polyglycerin-Derivaten verwendet.
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Ein Beispiel für Polyglycerin-g-polyelektrolyt Pfropfcopolymere
ist jenes aus Poly-L-lysin (PLL) und Polyglycerin. Dieses Copolymer
wurde nach einer modifizierten Vorschrift von Kenausis et al. (J. Phys.
Chem. B 2000, 104, 3298) zur Darstellung von PLL-g-PEG Copolymeren
erhalten.
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Die dargestellten schwefelfunktionalisierten Polymere
bildeten selbstanordnende Monolagen auf einer Goldoberfläche (1). Die Quantifizierung der
Proteinadsorption an diese Oberflächen und an eine hydrophobe
Referenzoberfläche
(Monoschicht aus Hexadecanthiol auf Gold) basierte auf Oberflächenplasmonen-Spektroskopie.
Diese Methode erlaubt die Menge an adsorbiertem Protein zeitaufgelöst, relativ
zur Referenz zu ermitteln. Nach der Exposition der jeweiligen Oberfläche mit
einer Proteinlösung
(z.B. Fibrinogen) und anschließender
Spülung betrug
die verbleibende Menge an Protein auf Polyglycerin-beschichteten
Oberflächen
weniger als 3% im Vergleich zur Referenzoberfläche (2). Überraschenderweise
und im Gegensatz zu früheren
Studien an Zuckerderivaten (J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8308) zeigte
ein überwiegend
methyliertes Polyglycerin mit einer Thioctinsäure-Gruppe zur Immobilisierung
keinerlei proteinabweisende Eigenschaften auf der Goldoberfläche. Diese
Ergebnisse lassen darauf schließen,
dass die proteinabweisenden Eigenschaften von Polyglycerin seiner
einzigartigen Architektur und der Anwesenheit freier Wasserstoffbrückenbindungs-Donor-Gruppen zuzuschreiben
sind.
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Beispiele
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Beispiel 1. Modifizierung
von hyperverzweigtem Polyglycerin mit Thioctinsäure
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In einem Schlenkkolben wurden unter
Argon Polyglycerin (3.9 g, Mn = 2500), Thioctinsäure (0.32 g)
und eine katalytische Menge DMAP vorgelegt. Nach vollständigem Lösen der
Edukte in DMF (absolut., 10 ml) wurde der Ansatz auf 0°C gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC: 0.35 g in 1.5 ml DMF) wurde zugegeben. Nach 1 h wurde das
Kühlbad
entfernt. Der Ansatz wurde weitere 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung
wurde filtriert, der Rückstand wurde
mehrmals mit DMF und MeOH gewaschen. Das Filtrat wurde am Vakuum
eingeengt. Dialyse des Rückstandes
in MeOH, Einengen des Schlauchinhalts und Trocknen am Hochvakuum
lieferte die Titelverbindung als schwachgelbe, viskose Masse. Die Reinheit
und der Funktionalisierungsgrad wurde über 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
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Beispiel 2. Oberflächenmodifikation
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Zur kovalenten Anbindung der Polyglycerin-Derivate
wurde ein Glassubstrat, auf dass ein dünner Gold-Film (50 nm) aufgedampft
wurde, einer 1 M Lösung
der schwefelfunktionalisierten Polymere in Methanol über einen
Zeitraum von 18 h ausgesetzt. Nach gründlichem Spülen mit MeOH und Wasser wurde
die Proteinadsorption an die modifizierte Glasoberfläche mittels
SPR-Spektroskopie nach der Vorschrift von Whitesides et al. (Langmuir
2001, 17, 1225) verfolgt.