DE10297227T5

DE10297227T5 - Verbesserung bei oder bezüglich des Nachweises von beeinträchtigter Fruchtbarkeit

Info

Publication number: DE10297227T5
Application number: DE10297227T
Authority: DE
Inventors: John Coley; Fernando Miro; Laurence John Aspinall; Peter George Murray; Anthony William Dadd; Zhi Gang Zhang; Paul Mundill
Original assignee: Inverness Medical Switzerland GmbH
Current assignee: Alere Switzerland GmbH
Priority date: 2001-09-18
Filing date: 2002-09-18
Publication date: 2004-09-02
Also published as: GB2394547A; GB2394547B; WO2003025582A1; US20050130311A1; GB0403126D0

Abstract

Verfahren zum Nachweis eines verlangsamten Zyklus in einer menschlichen weiblichen Testperson, die einen solchen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Entnehmen einer Probe von Körperflüssigkeit aus der Testperson an jedem einer Vielzahl von, aber nicht weniger als drei, Tagen; Testen jeder der Vielzahl von Proben, um die Konzentration wenigstens eines signifikanten Analyten im Ovulationszyklus darin zu bestimmen; Vergleichen eines Ergebnisses, das aus den Testen bestimmt wird, mit einem vorbestimmten Grenzwert; und, falls das bestimmte Ergebnis von dem Grenzwert abweicht, Erklären des Zyklus, während dem die Proben entnommen wurden, zu einem verlangsamten Zyklus.

Description

Umfeld der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis beeinträchtigter Fruchtbarkeit in einer menschlichen weiblichen Testperson und/oder Zuschreiben oder Ausschließen eines besonderen Grundes für die beeinträchtigte Fruchtbarkeit. Die Erfindung liefert außerdem einen Testkit zum Durchführen des Verfahrens.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt viele Gründe für Unfruchtbarkeit bei Frauen, einige "natürliche" oder psychologische und einige pathologische. Selbstverständlich erreichen alle Frauen schließlich das Ende ihrer reproduktiven Leben und werden unfruchtbar. Dies ist die Menopause, die definiert ist als die dauerhafte Beendigung der Menstruation aufgrund des Verlustes der follikulären Eierstockaktivität (WHO Technical Report Series 670, Genf, 1981: 8–10).
Nach der Menopause ist eine Frau dauerhaft unfruchtbar. Davor jedoch findet ein "Menopausenübergang" statt, während dem eine Frau von voller normaler Fortpflanzungsfähigkeit zu vollständiger Unfruchtbarkeit (d.h. die Menopause) gelangt. Der Menopausenübergang wird auch als die Perimenopause bezeichnet. Das Alter, in dem der Menopausenübergang beginnt, ist hochvariabel, ebenso wie die Geschwindigkeit des Ablaufs. Zusätzlich ist die Abnahme der Fruchtbarkeit nicht vorhersagbar, in dem Sinne, dass eine Frau selbst sehr spät in dem Menopausenübergang gelegentlich nahezu normale Ovulationszyklen erfahren und daher sporadisch Phasen durchlaufen kann, in denen sie schwanger werden kann. Daher besteht eine starke Unregelmäßigkeit in der Zykluslänge während des Menopausenübergangs. Dieses Phänomen wurde gut dokumentiert, und es ist allgemein akzeptiert, dass der Beginn des Menopausenübergangs durch den Beginn von Zyklusunregelmäßigkeiten definiert ist.
Es finden viele Veränderungen in der Konzentration und dem Profil der Fortpflanzungshormone während des Menopausenübergangs statt. In der wissenschaftlichen Literatur wurde von einer großen Zahl von Studien berichtet. Das Bild ist kompliziert, aber es ist wahr zu sagen, dass akzeptiert wurde, dass der Menopausenübergang im Allgemeinen assoziiert ist mit einem Anstieg des follikelstimulierenden Hormons (FSH). Um die Veränderungen zu verstehen, die während des Menopausenübergangs stattfinden, ist es wünschenswert die normale Funktion der Eierstöcke zu verstehen.
In gesunden, fruchtbaren Frauen am Beginn des Menstruationszyklus (die Follikelphase) sekretiert die Hypophyse follikelstimulierendes Hormon (FSH), das die Ei enthaltenden Follikel in den Eierstöcken rekrutiert und stimuliert, zu wachsen und Hormone zu bilden. Die erste Sekretion aus den Eierstöcken während des Zyklus ist Inhibin B, das teilweise die FSH Bildung unterdrückt. Stimuliert durch FSH wachsen Follikel und beginnen signifikante Mengen an Östrogen (hauptsächlich Östradiol) zu bilden, und die FSH Mengen fallen weiter. Schließlich, und als ein Ergebnis der fallenden FSH Konzentration, wird eines der Follikel ausgewählt (möglicherweise durch seine höhere Ansprechbarkeit gegenüber FSH, ebenso wie der neu erworbenen Ansprechbarkeit gegenüber luteinisierendem Hormon: LH), sein Wachstum wird beschleunigt, und bildet einen starken Anstieg an Östrogenen, was den Eisprung durch die Induktion eines LH Schubes auslöst. Nach dem Eisprung (in der Gelbkörperphase) reorganisieren sich die Reste des follikulären Gewebes zu einer hochvaskularisierte Struktur, die als Gelbkörper bekannt ist, die große Mengen an Progesteron sekretiert, ebenso wie Inhibin A und Östradiol in geringeren Mengen. Die Hormonmengen während dieser Phase erreichen ihre Spitze um Tag 7 nach dem LH Schub und fallen danach bis der Gelbkörper sich zurückbildet und ein neuer Zyklus beginnt.
Wenn eine Frau jedoch älter wird, wird die Eierstockfunktion beeinträchtigt. Zunächst wird eine große Anzahl von Follikeln rekrutiert, und so werden die Mengen an FSH früh in der Follikelphase aufgrund der hohen Mengen an Inhibin B relativ niedrig gehalten. Mit der Zeit jedoch nimmt die Zahl der rekrutierten Follikel ab und folglich steigen die FSH Mengen. Es wird angenommen, dass der Abfall in der Zahl der rekrutierten Follikel das erste Anzeichen des Alterns der Eierstöcke ist.
Die direkte Konsequenz der steigenden FSH Mengen (auch bekannt als der monotrope Anstieg an FSH) ist die Reduktion in der Länge der Follikelphase des Zyklus, aufgrund der schnelleren Reifung der Follikel, aber die menstruelle Regelmäßigkeit ist nicht beeinträchtigt. Die verringerte Fruchtbarkeit wurde mit diesem Anstieg an FSH assoziiert. Wenn die FSH Mengen ansteigen, wird die Follikelphase des Zyklus weiter reduziert.
Eine andere fundamentale Veränderung, die in den Vorgang des Alterns der Eierstöcke involviert ist, ist die Zerstörung der menstruellen Regelmäßigkeit. Während dieses Zeitraums treten einige Zyklen mit relativ langer Dauer auf, die häufiger und auch länger werden.
Es wird angenommen, dass die Fruchtbarkeit (oder, exakter, Fortpflanzungsfähigkeit) in Übereinstimmung mit dem monotropen Anstieg von FSH abnimmt, aber sie ist noch ausgeprägter nach dem Beginn von Zyklusunregelmäßigkeit. Trotzdem ist es nicht möglich, das Auftreten von fruchtbaren Zyklen auszuschließen, nachdem die menstruelle Unregelmäßigkeit begonnen hat. Daher ist die beeinträchtigte Eierstockfunktion, so wie sie oben verstanden wird, abhängig von dem Altern der Eierstöcke, das seinerseits die Basis für einige der hormonellen Änderungen ist, die mit dem Menopausenübergang assoziiert sind. Für Übersichtsartikel zu diesem Thema wird der Leser auf die Folgenden verwiesen: Fortune (1994) Biology of Reproduction 50: 225–32; Klein et al (1996) Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81: 1038–45; und Prior (1998) Endocrine Reviews 19: 397–428.
Der Menopausenübergang ist nicht nur mit abnehmender Fruchtbarkeit assoziiert, sondern auch mit vielen anderen Symptomen und potentiellen Gesundheitsproblemen. Daher gibt es viele Gründe, warum eine Frau sich möglicherweise wünscht, zu wissen, ob der Menopausenübergang begonnen hat oder nicht. Diese schließen ein: Bestätigung (eine Frau kann Anstrengungen unternehmen um zu wissen, dass es eine physiologische Basis gibt für körperliche Symptome oder Emotionen, die auftreten); um eine informierte Entscheidung zu ermöglichen, ob es angemessen ist, eine Hormonersatztherapie zu beginnen oder nicht; und ob Änderungen in "Lebensstil" notwendig sind oder nicht, wie ein Fitnessprogramm oder eine spezielle Diät (z.B. eine Diät, die reich ist an Phytoöstrogenen) zu beginnen, um damit Osteoporose oder verwandte Zustände zu verhindern oder deren Wahrscheinlichkeit zu reduzieren.
Zur Zeit sind eine Vielzahl von Testkits kommerziell verfügbar (z.B. aus Genua, NY 14305, USA), deren Verwendung für sich in Anspruch nimmt, Testpersonen zu identifizieren, die post-menopausal sind (d.h. die "durch die Menopause" gegangen sind und den Menopausenübergang abgeschlossen haben). Die Verwendung des Kits verlangt die Durchführung von zwei Tests, mit 7 Tagen Abstand, mit Urinproben der Testperson. Wenn die Konzentration von FSH 20 mlU/ml Urin in beiden Urinproben übersteigt, dann wird die Testperson als post-menopausal erklärt.
Jedoch können Testpersonen, wie oben erwähnt, während des Menopausenübergangs sporadische Perioden durchmachen, während denen ihre Fähigkeit schwanger zu werden nahezu normal ist, und während solcher Perioden können die absoluten und/oder relativen Hormonkonzentrationen leicht jenen einer Frau gleichen, bei der der Menopausenübergang noch nicht begonnen hat. Wenn der Kit des Standes der Technik während solcher Perioden verwendet wird, wird er Daten liefern, die, obwohl sie zu der Zeit korrekt sind, dennoch extrem irreführend im Zusammenhang mit dem gesamten reproduktiven Status der Frau sind.
Als ein Ergebnis der vorgenannten technischen Schwierigkeiten hat es sich bisher als nicht möglich erwiesen, ein Testverfahren zur Verfügung zu stellen, das verlässlich und unzweideutig bestimmen kann, ob eine bestimmte Testperson den Menopausenübergang begonnen hat. Genauso hat es sich bisher nicht als möglich erwiesen, ein Testverfahren zur Verfügung zu stellen, das verlässlich und unzweideutig einen Zustand der beeinträchtigten Eierstockfunktion dem Menopausenübergang im Gegensatz zu anderen Gründen zuschreibt.
Alle Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung genannt sind, werden hiermit spezifisch durch Bezugnahme eingeschlossen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass Unregelmäßigkeit in der Zykluslänge, die spät während des Menopausenübergangs auftritt, hauptsächlich in dem Auftreten dessen was als "verlangsamte Zyklen" bezeichnet wird, begründet ist. Die genauen Eigenschaften eines verlangsamten Zyklus neigen dazu, in Abhängigkeit von der Stufe des Menopausenübergangs, an welcher der verlangsamte Zyklus auftritt, zu variieren. Ein verlangsamter Zyklus ist ein Zyklus mit einer atypisch langen Follikelphase (relativ zu normalen Zyklen), mit einer verlängerten Lagphase in der follikulären Entwicklung, die häufig (aber nicht zwangsweise) die Qualität des Follikels beeinträchtigt und möglicherweise den Eisprung inhibiert und die, so glauben die Erfinder der vorliegenden Erfindung, im Wesentlichen nur mit dem Menopausenübergang assoziiert ist. Im Allgemeinen haben die Erfinder herausgefunden, dass bei Fortschreiten des Menopausenübergangs der Prozentsatz der Zyklen, die verlangsamt sind, ebenso ansteigt wie das Ausmaß der Verzögerung (mit einer Follikelphase von bis zu 30 Tagen oder mehr in späteren Zyklen).
Demzufolge liefert die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Nachweis eines verlangsamten Zyklus in einer menschlichen weiblichen Testperson, die einen solchen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Entnehmen einer Probe von Körperflüssigkeit aus der Testperson an jedem einer Vielzahl von, aber nicht weniger als drei Tagen; Testen jeder der Vielzahl von Proben, um die Konzentration wenigstens eines signifikanten Analyten im Ovulationszyklus darin zu bestimmen; Vergleichen eines Ergebnisses, das aus dem Testen bestimmt wird, mit einem vorbestimmten Grenzwert; und, falls das bestimmte Ergebnis von dem Grenzwert abweicht, Erklären des Zyklus, während dem die Proben entnommen wurden, zu einem verlangsamten Zyklus.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung glauben, dass solche verlangsamte Zyklen symptomatisch und im Wesentlichen einzigartig sind für den Menopausenübergang, so dass es für eine Frau mit einem verlangsamten Zyklus möglich ist mit Gewissheit zu sagen, dass die Frau den Menopausenübergang begonnen hat: das Auftreten des ersten verlangsamten Zyklus ist ein Anzeichen, dass eine irreversible Änderung stattgefunden hat, und dass die Testperson jetzt irreversibel mit dem Menopausenübergang begonnen hat.
Demzufolge liefert die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Verfahren zum Identifizieren, dass eine Testperson, die einen verlangsamten Zyklus aufweist oder aufgewiesen hat, in den Menopausenübergang eintritt oder eingetreten ist, je nachdem, wobei das Verfahren dieselben Schritte umfasst, wie sie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind.
Zusätzlich liefert die Erfindung, in einem dritten Aspekt, ein Verfahren zum Identifizieren einer beeinträchtigten Eierstockfunktion in einer menschlichen weiblichen Testperson, die durch einen verlangsamten Zyklus verursacht ist (d.h. aufgrund des Menopausenübergangs), wobei das Verfahren dieselben Schritte umfasst, wie sie in dem ersten Aspekt der Erfindung definiert sind.
Der Fachmann wird es begrüßen, dass es, um die Erfindung auszuführen, nicht notwendig ist, die absolute Analytenkonzentration in den Proben zu bestimmen, und dass die Bestimmung von relativen Konzentrationen (z.B. relativ zu dem gewählten Grenzwert) angemessen sein kann. Demzufolge sollte an den Stellen, an denen die Beschreibung sich auf die Bestimmung der "Konzentration" eines Analyten bezieht, der Ausdruck breit interpretiert werden.
Darüber hinaus haben die Erfinder herausgefunden, dass ein verlängerter Zyklus häufig ohne Eisprung (nicht-ovulatorisch) verläuft. Demzufolge soll der Begriff "ovulatorisch", so wie er hier verwendet wird, nicht ausgelegt werden, dass er sich nur auf solche Fortpflanzungszyklen bezieht, die ein Ovulationsereignis einschließen, sondern er soll auch solche Zyklen umfassen, in denen es kein Ovulationsereignis gibt, außer der Zusammenhang bestimmt etwas anderes.
Darüber hinaus kann das Ergebnis, das durch das Testen bestimmt wird, jeden Wert oder Bereich von Werten betreffen, die aus den Analytenkonzentrationen abgeleitet werden können. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform die Analytenkonzentration an jedem Testtag mit dem Grenzwert verglichen, und es wird festgehalten, ob das Testergebnis für jeden einzelnen Tag gegenüber dem Grenzwert signifikant verschieden (ein "positives" Ergebnis) ist oder nicht (ein "negatives" Ergebnis). Wenn eine ausreichende, vorbestimmte Zahl der einzelnen Testergebnisse positiv ist, dann kann der Zyklus als ein verlangsamter Zyklus erklärt werden.
In anderen Ausführungsformen wird eine durchschnittliche Analytenkonzentration über einen Zeitraum von einigen Tagen (aufeinanderfolgend oder anders) bestimmt und mit einem durchschnittlichen Bezugsgrenzwert verglichen. In noch einer anderen Ausführungsform kann eine Gesamtsumme der Analytenkonzentration gefunden und mit einem Grenzsummenwert verglichen werden.
Ein Testergebnis kann positiv sein, falls das bestimmte Ergebnis höher ist als der Grenzwert für einige Analyten, wohingegen für andere Analyten das Testergebnis positiv sein kann, falls das bestimmte Ergebnis niedriger ist als der Grenzwert.
Daher kann ein bestimmtes Ergebnis "verschieden" gegenüber einem vorbestimmten Grenzwert sein, falls (a) der Grenzwert gleich oder niedriger ist als ein besonderer Wert und das bestimmte Ergebnis den besonderen Wert übersteigt, oder (b) der Grenzwert gleich oder höher ist als ein besonderer Wert und das bestimmte Ergebnis unterhalb des besonderen Wertes liegt.
Was einen "signifikanten" Unterschied zwischen einem bestimmten Testwert und einem zuvor festgelegten Grenzwert ausmacht, wird von dem gewählten Grenzwert abhängen. Falls beispielsweise der Grenzwert in Form eines Bereichs vorliegt, dann kann es sein, dass jeder bestimmte Testwert außerhalb des Bereichs als signifikant erachtet wird. Alternativ dazu, falls der Grenzwert ein einzelner Wert ist, kann es sein, dass ein bestimmter Testwert nur dann als signifikant verschieden erachtet werden wird, wenn er in wenigstens einer besonderen Menge, die in numerischer Bezeichnung ausgedrückt werden kann (z.B. wenigstens 5 % über oder unter dem Grenzwert, je nachdem) abweicht, oder er kann in statischer Bezeichnung ausgedrückt werden (z.B. wenigstens eine Standardabweichung über oder unter dem Grenzwert).
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass die Tage, an denen die Proben abgenommen werden, entweder vollständig innerhalb der Follikelphase des Ovulationszyklus oder vollständig innerhalb der Gelbkörperphase liegen: es ist bevorzugt, die Probenentnahme in einem Intervall zu vermeiden, das einen Teil oder vollständig beide Phasen des Ovulationszyklus umfasst. Von den beiden ist es bevorzugt, dass Proben besser in der Follikelphase als in der Gelbkörperphase abgenommen werden, weil der Beginn der Follikelphase (der erste Tag der Blutung) leicht zu bestimmen und so für die Testperson offensichtlich ist, ohne die Notwendigkeit irgendeines Tests, und dies stellt einen günstigen Bezugspunkt dar. Die Entnahme von Proben während der Gelbkörperphase, obwohl sie machbar ist, ist problematischer, weil der Beginn der Gelbkörperphase (Eisprung) nur ungefähr bestimmt werden kann, und dann auch nur einfach durch Messung der LH Konzentration (der Einsprung findet innerhalb von 24 Stunden des nachweisbaren "LH Schubes" statt), was keinen günstigen Bezugspunkt darstellt.
Jedoch können einige Analyten einfacher in der Follikelphase gemessen werden, während andere einfacher in der Gelbkörperphase gemessen werden können.
Der Grenzwert kann abgeleitet sein von Konzentrationsanalysen des bzw. der fraglichen Analyten in einer großen Anzahl von Testpersonen, welche die Allgemeinheit in ihrer Gesamtheit repräsentiert/repräsentieren (z.B. ein arithmetisches Mittel basierend auf Daten, die aus der Bevölkerung gewonnen wurden). Ein solcher Grenzwert kann als ein "bevölkerungsabgeleiteter" Grenzwert bezeichnet werden. Alternativ dazu kann der Grenzwert durch Konzentrationsanalyse des/der fraglichen Analyten in vorherigen Zyklen oder vorherigen Abschnitten des gegenwärtigen Zyklus in einer besonderen Testperson, die sich in der Untersuchung befindet, erhalten werden (z.B. ein arithmetisches Mittel basierend auf Daten, die von einem einzelnen Individuum erhalten wurden). Ein solcher Grenzwert kann als ein "individueller" Grenzwert bezeichnet werden, weil er nur für ein Individuum gültig ist und nicht notwendigerweise für eine weitere Testperson geeignet ist. (Es sollte angemerkt werden, dass Tests, die durchgeführt werden um einen Grenzwert zu etablieren, nicht Teil des "Testens" der Erfindung sind. Wenn die vorliegende Beschreibung beispielsweise lehrt, dass das Testen während der Periode an den Tagen 6 – 9 begonnen werden soll, lässt dies alle früheren Tests außer Acht, die zuvor während desselben Zyklus mit dem Zweck, einen Grenzwert zu etablieren, durchgeführt worden sein können). Im Allgemeinen sind bevölkerungsabgeleitete Grenzwerte bevorzugt, weil Daten von einem Individuum aus vorhergehenden Zyklen nicht immer zur Verfügung stehen werden. Insbesondere ist ein bevölkerungsabgeleiteter Grenzwert vorteilhaft, wenn der signifikante Analyt das follikelstimulierende Hormon ist.
Der signifikante Analyt in dem Ovulationszyklus ist typischerweise ein Hormon, für dessen Konzentration bekannt ist, dass sie während des Ovulationszyklus schwankt. Bevorzugte Beispiele schließen eines oder mehrere der Folgenden ein: follikelstimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH), Inhibin (insbesondere Inhibin B), Progesteron oder ein Metabolit davon und Östrogen oder ein Metabolit davon. Insbesondere schließen Metaboliten von Östrogen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden Östron-3-Glucuronid ("E3G"), Östradiol-3-Glucuronid, Östradiol-17-Glucuronid, Östriol-3-Glucuronid und Östriol-16-Glucuronid, ein. Zum Zweck der Kürze, wo es der Zusammenhang erlaubt, ist es beabsichtigt, dass der Begriff "Östrogen" auch einen oder mehrere der zuvor genannten Metaboliten von Östrogen einschließt. E3G ist der am meisten bevorzugte Östrogenmetabolit für die Zwecke der vorliegenden Erfindung. Genauso ist ein bevorzugter Metabolit von Progesteron Pregnandiol-3-Glucuronid ("P3G"). FSH wird in geeigneter Weise in Proben gemessen, die während der Follikelphase entnommen werden, während LH und/oder P3G in geeigneter Weise in Proben gemessen werden, die während der Gelbkörperphase entnommen werden.
Die getestete Körperflüssigkeit umfasst vorzugsweise Urin, aber andere Körperflüssigkeiten, die im Rahmen der Erfindung untersucht werden können, schließen Schweiß, Speichel, Tränenflüssigkeit, Vaginalflüssigkeit oder ähnliches ein, die alle vergleichsweise einfach erhalten werden können. Grundsätzlich könnten auch innere Flüssigkeiten wie Blut und Plasma/Serum getestet werden, aber sie sind im Allgemeinen nicht bevorzugt, weil sie nur durch invasive Techniken erreicht werden können.
Es ist offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung auch die Bestimmung der Konzentration von mehr als einem Analyt einschließt. Es kann beispielsweise sein, dass die Bestimmung eines Konzentrationsverhältnisses von zwei Analyten einen aussagekräftigeren Assay liefert.
Geeigneterweise werden dieselben Körperflüssigkeitsproben für die Bestimmung von beiden oder allen Analytenkonzentrationen verwendet. Es ist gewünscht, dass der eine weitere oder die weiteren Analyten in Urinproben der Testperson gemessen werden. Der weitere oder die weiteren Analyten können jeden Analyten umfassen, dessen Konzentrationsbestimmung wertvoll ist, der aber normalerweise ein signifikanter Analyt im Ovulationszyklus/in der Kontrolle der Vermehrung in Frauen ist. Beispielsweise kann der eine weitere oder die weiteren Analyten ein Sexualhormon wie Progesteron oder Metaboliten davon oder Östrogen und Metaboliten davon umfassen.
In einem verlangsamten Zyklus besteht eine Verzögerung an dem Punkt des Zyklus, an dem die Erhöhung von E3G, trotz einer normal funktionierenden Hypophyse (wie durch FSH Mengen bewiesen wird), beginnt. Das bedeutet, dass der Eierstock langsam auf das FSH Signal anspricht, und deshalb bilden die Follikel nur langsam Östrogen, und deshalb sind die FSH Mengen für längere Zeit als normal erhöht. In einem normalen Ovulationszyklus beginnt die signifikante Erhöhung von E3G ungefähr am Tag 7 des Zyklus (wobei Tag 1 der erste Tag der Blutung ist), aber in einem verlangsamten Zyklus kann der E3G Anstieg um so wenig wie 2–3 Tage danach (zu Beginn des Menopausenübergangs) bis so viel wie 30 Tagen und mehr (spät im Menopausenübergang) verzögert sein.
1 zeigt typische Konzentrationsprofile von FSH, E3G und LH in der Follikelphase eines Zyklus. In einem verlangsamten Zyklus ist der "Buckel" in dem FSH Profil gegenüber einem normalen Zyklus vergrößert, und der Anstieg der E3G Konzentration ist verzögert.
Diese Verzögerung oder Verlangsamung kann in irgendeiner einer Vielzahl von Wegen bestimmt werden. Beispielsweise kann während der Follikelphase des Zyklus die Verzögerung bestimmt werden durch das Festhalten einer anhaltenden Erhöhung von FSH über den normalen Bereichen, oder durch eine korrespondierende anhaltende Unterdrückung von E3G unter den normalen Bereichen, oder durch das Festhalten einer anhaltenden Unterdrückung des E3G/FSH Verhältnisses, oder durch irgendeine Kombination des vorhergehenden.
Weil die Verzögerung eine "Anstoß"-Wirkung besitzt, kann die Verlangsamung des Zyklus alternativ auch in der Gelbkörperphase bestimmt werden, z.B. durch Vergleichen von Progesteron oder Derivaten davon, wie Pregnandiol-3-Glucuronid (P3G) mit der Konzentration eines anderen Analyten, insbesondere E3G.
In einer besonderen Ausführungsform schließt die Erfindung das Messen der Urin FSH Konzentration und Bestimmen der durchschnittlichen FSH Konzentrationswerte (fDurchschnitt) ein, die während der Periode von (und diesen einschließend) Tag 1 (d.h. erster Tag der Blutung) bis zu, aber diesen ausschließend, dem Tag des signifikanten E3G Anstiegs (d.h. der Tag des Zyklus, an dem die Steigung in der Graphik der Urin E3G Konzentration gegenüber der Zeit maximal ist) erhalten werden. Die Erfinder haben eine Vielzahl von Algorithmen, basierend auf retrospektiven Analysen einer großen Datenvielzahl, die von Freiwilligen gesammelt wurde, um den Nachweis von verlangsamten Zyklen zu unterstützen, erfunden. In der oben beschriebenen Ausführungsform wird ein verlangsamter Zyklus erklärt, falls der FSH Durchschnitt größer ist als der Grenzwert von 15 mlU/ml und der Tag des Zyklus (wobei Tag 1 der erste Tag der Blutung ist), an dem die maximale Urin FSH Konzentration auftritt (wobei Variationen im Urinvolumen zugelassen werden), vor dem Tag des signifikanten E3G Anstiegs später war als Tag 7. Dies kann mathematisch wie folgt ausgedrückt werden: Falls (fDurchschnitt > 15 fmaxTag > 7) dann Ergebnis = 1(1 zeigt einen verlangsamten Zyklus, 0 zeigt einen normalen Zyklus), wobei fmaxTag der Tag mit der maximal aufgezeichneten FSH Konzentration vor dem Tag des signifikanten E3G Anstiegs ist.
In einer anderen Ausführungsform schließt das erfindungsgemäße Verfahren das Bestimmen des fe Verhältnis ein. Das fe Verhältnis wird berechnet durch die Summe aller Urin FSH Werte dividiert durch die Summe aller Urin E3G Werte während der Periode von (und einschließlich) Tag 1 bis zu, aber ausschließlich, dem Tag des signifikanten E3G Anstiegs. Falls das berechnete fe Verhältnis über einem vorbestimmten Referenzwert liegt, dann wird der fragliche Zyklus zu einem verlangsamten Zyklus erklärt. In den besonderen Assaybedingungen, die von den Erfindern verwendet wurden, wurde 39 als ein geeigneter Referenzwert herausgefunden. Die Erfinder erfanden einen geeigneten Algorithmus, der wie folgt ausgedrückt werden kann: Falls (fe Verhältnis > 39) dann Ergebnis = 1.
Insbesondere haben die Erfinder herausgefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren verbessert werden kann, indem die beiden oben beschriebenen Ausführungsformen in einen einzelnen Algorithmus zusammengefasst werden: Falls (fDurchschnitt > 15 und fmaxTag > 7) oder (fe Verhältnis > 39) dann Ergebnis = 1.
Das gewählte Grenzwertniveau, mit dem eine Analytenkonzentration verglichen wird, wird von der Probe der Körperflüssigkeit und dem zu testenden Analyten, dem Testformat und den verwendeten Testreagenzien abhängen. Falls beispielsweise immunologische Techniken verwendet werden, wird das Grenzwertniveau von den Eigenschaften (z.B. Bindungsaffinität) des verwendeten Antikörpermoleküls abhängen. Der gewählte Grenzwert wird auch von dem abhängen, was als akzeptable falsch positive (FPR) und falsch negative (FNR) Raten erachtet wird. Im Allgemeinen sollten sowohl FPR und FNR weniger als 10 %, vorzugsweise weniger als 7 % und idealerweise nicht mehr als 5 % betragen, obwohl (wie in Beispiel 3 erklärt wird) eine akzeptable falsch negativ Rate normalerweise höher sein wird als die akzeptierte falsch positive Rate. Typischerweise wird bei Urinproben das Grenzwertniveau für FSH 10–30 mlU FSH pro ml Urin, vorzugsweise 10–20 mlU FSH/ml betragen, und falls die durchschnittliche FSH Menge während der Follikelphase (oder des Teils davon, in dem das Testen durchgeführt wird) diesen Grenzwert übersteigt, weist die Testperson einen verlangsamten Zyklus auf.
Wie oben ausgeführt, ist es eine minimale Voraussetzung der Erfindung, dass Tests an Proben durchgeführt werden, die an wenigstens drei verschiedenen Tagen abgenommen wurden. Vorzugsweise werden Tests an Proben durchgeführt, die an wenigstens vier verschiedenen Tagen abgenommen wurden, und weiter bevorzugt werden Tests an Proben durchgeführt, die an wenigstens fünf verschiedenen Tagen abgenommen wurden. Am meisten bevorzugt werden Tests an Proben durchgeführt, die an wenigstens sieben Tagen abgenommen wurden. Es gibt keine maximale Anzahl von Tagen, an denen Proben abgenommen werden können, aber es liegt kein besonderer Vorteil darin, Proben zu testen, die an mehr als 14 Tagen abgenommen wurden, und geeigneterweise wird das Testen an Proben durchgeführt, die an nicht mehr als 10 verschiedenen Tagen abgenommen wurden.
Es ist bevorzugt, aber keineswegs essentiell, dass das Testen an Proben durchgeführt wird, die an aufeinanderfolgenden Tagen abgenommen wurden. Jedoch können Proben beispielsweise an abwechselnden Tagen erhalten werden, aber dies ist die minimal gewünschte Probenfrequenz. Falls ein Probenzeitraum dahingehend erachtet wird, dass er sich von dem ersten Tag, an dem eine Probe erhalten wird, zu dem letzten Tag, an dem eine Probe erhalten wird, erstreckt, ist es somit wünschenswert, dass wenigstens 50 % der Tage in dem Testzeitraum Testtage sind, vorzugsweise wenigstens 60 %, weiter bevorzugt wenigstens 70 % und am meisten bevorzugt wenigstens 80 %.
In einer Ausführungsform, in der individuelle Tagestests als "positiv" oder "negativ" bezeichnet werden, hängt die Zahl der positiven Ergebnisse (Y), die für die Erklärung, dass ein verlangsamter Zyklus stattfindet/stattgefunden hat, benötigt werden, von der Zahl der Tage (X) ab, an dem das Testen durchgeführt wird. Bevorzugte Beziehungen sind in Tabelle 1 unten angegeben (ein Grad der Flexibilität existiert in Anbetracht der Variationen was als akzeptable falsch positive oder falsch negative Raten erachtet wird oder nicht): Tabelle 1
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, wird das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere Anwendung bei Frauen finden, deren Ovulationszyklen unregelmäßig sind. Angenommen, dass solche Frauen immer noch menstruieren, wird es jedoch möglich sein, einen "ersten Tag der Blutung" zuzuweisen, der signifikant ist, weil die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden haben, dass für eine optimale Wirksamkeit und/oder Genauigkeit, es in wenigstens einigen Ausführungsformen notwendig ist, den Testablauf innerhalb eines einigermaßen definierten zeitlichen Rahmens relativ zu dem ersten Tag der Blutung durchzuführen. Daher ist es in einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere wenn der zu messende Analyt Urin FSH und/oder Urin E3G umfasst, angenommen Tag 1 ist der erste Tag der Blutung, vorzuziehen, dass der erste Testtag während der Periode an den Tagen 5–10, am meisten bevorzugt während der Periode an den Tagen 6–9 durchgeführt wird. Weiter bevorzugt wird das Testen begonnen und durchgeführt an wenigstens zwei Tagen während der Periode an den Tagen 6–9.
Zum Testen der Urin FSH Konzentrationen, wenn der Testzeitraum auf fünf Tage beschränkt ist, ist es bevorzugt, wenn das Testen während der Periode an den Tagen 8–13 durchgeführt wird. Wenn der Testzeitraum sieben Tage umfasst, ist es bevorzugt, wenn das Testen während der Periode an den Tagen 7–15 (weiter bevorzugt an den Tagen 8–14) durchgeführt wird, und wenn der Teszreitraum 10 Tage beträgt, ist es bevorzugt, wenn das Testen während der Periode an den Tagen 6–16 durchgeführt wird. Im Allgemeinen ähnliche Testzeiträume sind geeignet für das Testen von Urin E3G Konzentrationen, obwohl das "Fenster" etwas größer ist.
Verfahren zum Testen von Konzentrationen an FSH, E3G, P3G und ähnlichem in verschiedenen Proben von menschlicher Körperflüssigkeit sind dem Fachmann gut bekannt (z.B. Santoro et al. 1996 Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81, 1495–1501) und stellen keinen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
Die zuvor genannten Kommentare bezüglich FSH beziehen sich auf die Bestimmung der FSH Konzentration in Proben, die während der Follikelphase erhalten werden. Andere Analyten sind jedoch der Messung in der Gelbkörperphase eher zugänglich. Beispielsweise erreicht die Pregnandiol-3-Glucuronid ("P3G") Konzentration ihre Spitze in der Gelbkörperphase, und die Erfinder haben herausgefunden, dass die Messung eines Urin E3G/Urin P3G Verhältnisses in der Gelbkörperphase Informationen liefern kann, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind. Ebenso wie die Schwierigkeit, die durch den Mangel eines geeigneten Bezugspunktes, der den Start der Gelbkörperphase angibt, neigen die P3G Mengen dazu, zwischen verschiedenen Individuen hochvariabel zu sein. Während es somit für FSH relativ einfach ist, einen populationsabgeleiteten Referenzgrenzwert zu bestimmen, ist dies für P3G sehr viel problematischer, und es ist deshalb wahrscheinlich anstelle dessen notwendig, einen Grenzwert zu verwenden, der aus vorherigen Messungen in einem bestimmten fraglichen Individuum berechnet wurde. Darüber hinaus erscheint es wahrscheinlich, dass die Urin P3G Konzentration variabler ist als beispielsweise die Urin FSH Konzentration, wenn der Menopausenübergang fortschreitet.
Egal welcher Analyt getestet wird, wird das Testen vorzugsweise durch eine immunologische Technik durchgeführt (d.h. es werden einer oder mehrere Antikörper oder Antigen-bindende Abschnitte davon als ein spezifisches Bindungsreagens verwendet). In geeigneter Weise wird das Testen unter Verwendung einer immunchromatographischen Technik durchgeführt (z.B. basierend auf jenen, die in der WO 94/04925, WO 95/01128 und EP 0656118 offenbart sind), typischerweise unter Verwendung einer Lateralflusstestvorrichtung, wahlweise zusammen mit einer in geeigneter Weise programmierten elektronischen Datenverarbeitungsvorrichtung.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung einen Testkit zum Durchführen von erfindungsgemäßen Verfahren, wobei der Kit eine Vielzahl von Testvorrichtungen umfasst, typischerweise Testvorrichtungen des "Dipstick"-Typs, zum Bestimmen der Konzentration eines Analyten (wie FSH und/oder E3G) in einer Probe aus Körperflüssigkeit aus einer menschlichen weiblichen Testperson, und Auslesemittel zum Auslesen der Testergebnisse. Die Auslesemittel können einfach eine sichtbare Markierung sein, die in einem Testfenster, das auf der Testvorrichtung vorgesehen ist, erscheint. Wenn eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das Testen von zwei oder mehr Analyten notwendig macht, ist es günstig, wenn die Testvorrichtungen die Konzentration von zwei oder mehr Analyten messen können, vorzugsweise gleichzeitig aber unabhängig. Solche Testvorrichtungen sind beispielsweise in der EP 0291194 und der EP 0560411 offenbart.
Alternativ dazu können die Auslesemittel in eine programmierbare elektronische Datenverarbeitungsvorrichtung integriert werden oder auf andere Weise funktionell mit ihr verbunden sein, in der Form eines elektronischen Monitors, der die Ergebnisse der Tests, die von den Testvorrichtungen geliefert werden, interpretiert, und vorzugsweise eine Anzeige liefern, die der Analyse einer geeigneten Zahl von Testergebnissen folgt, ob die Testperson einen verlangsamten Zyklus aufweist oder aufgewiesen hat, je nachdem. Daher liefert ein weiterer Aspekt der Erfindung eine programmierbare elektronische Datenverarbeitungsvorrichtung zur Verwendung in Verfahrensaspekten der oben definierten Erfindung, wobei die Vorrichtung so programmiert ist, dass sie aus den Ergebnissen der Analytenkonzentrationstests das Auftreten eines verlangsamten Zyklus nachweist; wobei die Vorrichtung wahlweise weiterhin Anzeigemittel umfasst, um anzuzeigen, ob ein verlangsamter Zyklus nachgewiesen wurde oder nicht. Ein geeigneter elektronischer Monitor, der einfach für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch geeignete Programmierung modifiziert werden kann, ist in der WO 99/51989 offenbart. Geeigneterweise wird der Monitor so programmiert, dass er einen oder mehrere der hier offenbarten Logarithmen ausführt.
Vorzugsweise sind die Testvorrichtungen billig und nach einer einzigen Verwendung zum Wegwerfen gedacht. Es ist wünschenswert, dass die Testvorrichtungen die Form von immunochromatographischen Dipsticks haben, die in eine Urinprobe eingetaucht werden können. Solche geeigneten Testvorrichtungen sind dem Fachmann gut bekannt. Umgekehrt ist die elektronische Datenverarbeitungsvorrichtung, wenn sie vorliegt, relativ teuer, und sie kann wiederverwendet werden.
Der Fachmann wird erkennen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren nicht verwendet werden können, wenn die fragliche Testperson Arzneimittel oder andere Substanzen (z.B. orale Verhütungsmittel, HRT) einnimmt, welche die normalen Profile der Hormonanalyten beeinflussen, deren Messung in dem Verfahren benötigt wird. Darüber hinaus ist manchmal die E3G Konzentration zu Beginn eines Zyklus ungewöhnlich hoch, und dies sollte als ein Anzeichen verwendet werden, das aussagekräftige Testdaten während der Follikelphase nicht zur Verfügung stehen werden. Solche ungewöhnlich hohen E3G Mengen am Beginn eines Zyklus sind primär in vielfacher Follikelstimulation in dem vorhergehenden Zyklus begründet, was einen "Übertrag" an Östrogenen in den anschließenden Zyklus und eine gleichzeitige Unterdrückung der FSH Mengen bewirkt. Es sollte angemerkt werden, dass Ereignisse dieser Art zu einem Anstieg der Zykluslänge führen können, aber diese werden nicht als echte verlangsamte Zyklen innerhalb der Bedeutung des Begriffs für die Zwecke der vorliegenden Erfindung betrachtet, weil solche Zyklen nicht alleine mit dem Menopausenübergang assoziiert sind.
In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein computerbasiertes Verfahren zum Nachweis eines verlangsamten Zyklus in einer Frau und/oder ein Verfahren zum Nachweisen, ob die menschliche weibliche Testperson den Menopausenübergang begonnen hat und/oder Identifizieren, ob eine beeinträchtigte Eierstockfunktion in der menschlichen weiblichen Testperson in dem Menopausenübergang begründet ist, wobei das Verfahren die Verwendung von einem oder einer Kombination von Algorithmen umfasst, die hier offenbart sind (insbesondere die Algorithmen, die in den Beispielen 3–6 offenbart sind). Die Erfindung liefert darüber hinaus ein Computerprogramm für die Verwendung in dem computerbasierten Verfahren, und einen computerbasierten Monitor, der mit dem Programm programmiert ist.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden im Folgenden durch erläuternde Beispiele näher beschrieben, und unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, in denen:
1 die typischen Profile von verschiedenen Hormonen in der Follikelphase eines Zyklus zeigt;
2A – D Graphen von aktuellen Hormonprofilen über drei Zyklen in vier verschiedenen Testpersonen zeigen; und
3A und 3B Beispiele von Graphen einer E3G Konzentration gegenüber dem Tag sind, welche die Berechnung des Tages des signifikanten E3G Anstiegs zeigen.
Beispiele
Beispiel 1
Die Erfinder haben Daten aus einer vertraulichen Studie zusammengetragen, die eine große Anzahl von Frauen im Alter von 30–58 Jahren umfasst, in der täglich morgens Urinproben über einen Zeitraum von 6–12 Monaten gesammelt wurden und bei 4 bis 8°C (enthaltend Natriumacid bei 0,1 % als Konservierungsmittel) vor dem Testen gelagert wurden.
Die Proben wurden analysiert, um die Konzentration einer Vielzahl von Urinanalyten zu bestimmen, einschließlich FSH, E3G, P3G und LH. Die Urinanalytenkonzentration wurde unter Verwendung einer Immunassaytechnik bestimmt, die auf einem AutoDELFIA-System durchgeführt wurde, was ein High Throughput automatisiertes System darstellt, das ausgelegt ist, 24 Stunden am Tag zu laufen, mit einem Minimum des Eingriffs der Bedienungsperson. Während dies die Handhabung einer sehr großen Zahl von Proben vereinfacht, kann dasselbe zugrundeliegende Assayverfahren in einer nicht automatisierten Weise durchgeführt werden.
Der besondere Test, der verwendet wurde um die FSH Konzentration zu messen, umfasste Streptavidin-beschichtete Platten, einen Biotin-markierten anti-FSH monoklonalen Fängerantikörper (MAb 4882) und einen Europium (Eu³⁺)-markierten anti-FSH monoklonalen Antikörper (MAb 5948), um ein Testsignal zu bilden. Diese Antikörper sind für die Durchführung der Erfindung nicht essentiell: andere anti-FSH monoklonale Antikörper mit ähnlichen Spezifitäten sind kommerziell erhältlich, wie die FSH-spezifischen Klone 6602 und 6601, die erhältlich sind von Medix Biochemia AB, Finnland.
Das Testprotokoll war wie folgt (Wallac Testpuffer, Waschpufferkonzentrat und Verstärkungslösung sind Reagenzien, die speziell für DELFIA-Tests entwickelt wurden, und sie sind erhältlich von Perkin Elmuer Life Sciences [vormals E.G. & G. Wallac] unter den jeweiligen Produktnummern 1244-111; 1244-114 und 1244-105):

1. Anfänglich wurde eine Lösung enthaltend Biotin-markierten MAb 4882 (in einer 1/160 Verdünnung) und Eu³⁺-markierter MAb 5948 (in einer 1/200 Verdünnung) in Wallac Testpuffer) hergestellt und in eine AutoDELFIA Reagenskassette gegeben.
2. Streptavidin-beschichtete Platten (E.G. & G. Wallac), die trocken geliefert werden, wurden in eine AutoDELFIA Maschine eingesetzt und mit 2 × 200 μl Waschpuffer (Waschpufferkonzentrat erhalten von E.G. & G. Wallac) gewaschen.
3. Zu testende Urinproben (25 μl) oder Standards oder Kontrollen wurden in die Löcher der Platten verteilt.
4. Die MAb 4882/MAb 5948 Mischung wurde weiter 1/100 in Testpuffer (von E.G. & G. Wallac) automatisch durch die AutoDELFIA verdünnt, was eine Endverdünnung von 1/16.000 für MAb 4882 und 1/20.000 für MAb 5948 ergab. 200 μl der verdünnten Mischung wurde anschließend zu den Löchern auf den Platten hinzugefügt.
5. Die Platte wurde unter Schütteln für 120 Minuten inkubiert und anschließend mit 6 × 200 μl Waschpuffer gewaschen.
6. 200 μl der Verstärkungslösung (E.G. & G. Wallac) wurde zu jedem Loch hinzugefügt, die Platte wurde für 5 Minuten geschüttelt, und die Treffer wurden ausgelesen. Die Konzentrationswerte wurden aus einer Standardkurve unter

Verwendung des AutoDELFIA Multicalcprogramms berechnet.
Sehr ähnliche Protokolle (aber unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern mit geeigneten Bindungsspezifitäten) wurden verwendet, um Urin LH zu testen. Geeignete LH-spezifische Antikörper sind kommerziell erhältlich von Medix Biochemica, Finnland (z.B. monoklonale Antikörper Nummern 5501 und 5503), obwohl die Erfinder in der Tat ihre eigenen monoklonalen Antikörper verwendeten. Für den E3G Test wurde ein einzelnes Antikörperkompetitionsformat verwendet (detaillierter an anderer Stelle beschrieben).
Zusätzlich zu den Urinanalytendaten wurden auch die Ovulationszyklen der Freiwilligen genau aufgezeichnet (z.B. Zykluslänge etc.). Die retrospektive Analyse all dieser Daten erlaubte es den Erfindern, Frauen in der freiwilligen Gruppe zu identifizieren, die unregelmäßige Zyklen aufwiesen. Detailliertere Analysen zeigten, dass die Unregelmäßigkeit von dem Auftreten von Zyklen mit einer ungewöhnlich verlängerten Follikelphase abhing, das bedeutet "verlangsamten" Zyklen, in denen der gewöhnliche E3G Anstieg verzögert ist, trotz normal funktionierender Hypophyse (wie durch die FSH Mengen bewiesen wurde).
Durch Vergleich mit den anderen Urinanalytendaten, wurde den Erfindern klar, dass die verlangsamten Zyklen nur in Frauen auftraten, bei denen der Menopausenübergang begonnen hatte, und niemals in Frauen auftrat, die den Übergang noch nicht begonnen hatten.
Darüber hinaus bemerkten die Erfinder, dass es möglich ist durch Bestimmen der Konzentration von einem oder mehreren Urinanalyten an einer Vielzahl von Tagen, beginnend während der Follikelphase des Zyklus, das Auftreten eines verlangsamten Zyklus zu identifizieren. Die Analyten, welche die beste Unterscheidung zwischen "verlangsamten" und "normalen" Zyklen erlaubten, waren FSH und E3G.
Beispiel 2
Es war den Erfindern klar, dass das Testen der Urin FSH Konzentration an irgendeinem einzelnen Tag nicht zwischen "verlangsamten" und "normalen" Zyklen unterscheiden konnte, aufgrund der beträchtlichen Variabilität der Analytenmengen von Tag zu Tag. Auf der anderen Seite ist es wünschenswert, dass die Zahl der Tage, an denen die Tests durchgeführt werden müssen, so gering wie möglich ist, während sie akkurate Informationen liefern. Je geringer die Zahl der Testtage, desto billiger das Verfahren und desto leichter ist es für ungeübte Testpersonen, den Testablauf zuhause unter Verwendung von einfachen Testkits durchzuführen.
Deshalb gibt es eine Zahl von Variablen, welche die Erfinder untersuchten, einschließlich:
Tag des Zyklus, an dem das Testen begonnen werden sollte (Tage 4, 5, 6, 7, 8 oder 9); Zahl der Testtage pro Zyklus (5, 7, 10 oder 14 Tests/Zyklus); Grenzwert FSH Konzentration, über welcher ein Test als "positiv" (10, 15 oder 20 mlU/ml) erachtet wird; und Zahl der "positiven" Tests, die für einen Zyklus benötigt werden, damit er als verlangsamt erklärt wird.
Die retrospektive Analyse der Daten, die in der Studie gesammelt wurden, zeigte, dass die beste Unterscheidung (bezüglich der niedrigsten Raten der falsch negativen und falsch positiven) durch einen Testablauf geliefert wurde, in dem:

i) der FSH Grenzwert auf 15 mlU/ml gesetzt wurde
ii) der erste Testtag Tag 8 sein sollte (wobei Tag 1 der erste Tag der Blutung ist);
iii) es 7 Tests pro Zyklus geben sollte; und
iv) wenigstens vier positive Tests (d.h. Wiederkehren einer FSH Konzentration über 15 mlU/ml) aus den sieben Tests sollten benötigt werden, damit ein Zyklus als verlangsamt erklärt wird.

Tabelle 2 unten zeigt repräsentative Ergebnisse aus drei aufeinanderfolgenden Zyklen (1–3) für vier Testpersonen A–D (von denen jede den Menopausenübergang begonnen hatte), unter Verwendung des oben beschriebenen Testablaufs. Das Testen an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend an Tag 8 des Zyklus, Verwenden eines FSH Grenzwerts von 15 mlU/ml und die Notwendigkeit, dass mindestens 4/7 Testergebnisse über dem Grenzwert für ein "positives" Ergebnis liegen, zeigten, dass für jede Testperson, einer der drei Zyklen verlangsamt war. Typischerweise weisen Frauen an dieser Stufe des Menopausenübergangs diese Frequenz von verlangsamten Zyklen auf, wobei die Frequenz ansteigt, wenn sich die Frauen der Menopause nähern.
Zur Klarheit sind die Profile der Hormone E3G, P3G, LH und FSH in jedem der drei Zyklen ebenfalls graphisch in den 2A–D dargestellt.
2A(i) stellt die Konzentration von E3G (gestrichelte Linie) in ng/ml (linke Skala) und P3G (durchgezogene Linie) in g/ml (rechte Skala) graphisch dar; 2A(ii) stellt die Konzentration von LH (gestrichelte Linie) in mlU/ml (linke Skala) und FSH (durchgezogen_e Linie) in mlU/ml (rechte Skala) graphisch dar; über Zyklen 1–3 für Testperson A.
2B(i) und (ii) zeigen dieselben Daten für Testperson B, 2C(i) und (ü) zeigen dieselben Daten für Testperson C, und 2D(i) und (ii) zeigen dieselben Daten für Testperson D.
Beispiel 3
Die gesammelten Daten zeigten, dass in einem verlangsamten Zyklus,

(a) die durchschnittliche FSH Konzentration über die meiste Zeit der Follikelphase hoch ist, und dass der FSH Spitzentag ungewöhnlich spät liegt; und
(b) die Bildung von E3G während des Zeitraums des erhöhten FSH in der Follikelphase unterdrückt wird.

Eine detaillierte statistische Analyse der gesammelten Daten erlaubte des den Erfindern zwei Algorithmen aufzuzeichnen, die einen verlangsamten Zyklus definieren, die jeweils die Beobachtungen (a) und (b) oben umfassen.
Der erste Algorithmus ist: Falls (fDurchschnitt > 15 und fmaxTag > 7) dann Ergebnis = 1(1 ist ein verlangsamter Zyklus, 0 ist ein normaler Zyklus).
fDurchschnitt ist der Durchschnitt (in mlU/ml) an FSH Werten von Tag 1 des Zyklus bis zu, aber ausschließend, den Tag, an dem ein signifikanter Anstieg an E3G beobachtet wird (oder "ERiseTag", welcher der Tag ist [vor dem Auftreten des LH Maximums], an dem die Steigung der graphischen Darstellung von E3G maximal ist). (Die Erfinder haben einen anderen Algorithmus erfunden, der verwendet werden kann, um retrospektiv den ersten aufgetretenen signifikanten Anstieg in der E3G Konzentration – dies ist beschrieben in Beispiel 5 unten, zu bestimmen). fmaxTag ist einfach der Tag des Zyklus, an dem, Urinvolumenschwankungen zulassend, ein Maximum an FSH auftritt. (Urinvolumenschwankung kann durch einige Verfahren zugelassen werden; ein geeignetes Verfahren ist das Berechnen eines Verhältnisses von FSH gegenüber einem anderen Analyten, dessen Konzentration ebenfalls durch Schwankungen im Urinvolumen beeinflusst wird. Ein geeigneter Analyt für diesen Zweck ist P3G, das im Allgemeinen in einer mäßig konstanten, niedrigen Menge während der Follikelphase vorliegt.)
Der zweite Algorithmus ist: Falls (fe Verhältnis > 39) dann Ergebnis = 1
Das fe Verhältnis ist die Summe von FSH Werten geteilt durch die Summe von E3G Werten, während der Periode von Tag 1 bis zu, aber ausschließend, den Tag, an dem ein signifikanter Anstieg in E3G vorliegt.
Die Erfinder haben gefunden, dass durch Kombination der zwei Algorithmen als eigene Absätze innerhalb eines einzigen Algorithmus der Test stabiler gemacht werden konnte (z.B. das fe Verhältnis Grenzwert kann irgendwo zwischen 37 und 51 gesetzt werden und es liefert immer noch akzeptable Raten an falsch negativen und falsch positiven). Es ist offensichtlich, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein falsch negatives Ergebnis nicht übermäßig beunruhigend ist – der Test würde normalerweise über den Verlauf von drei oder vier Zyklen fortgesetzt, so dass ein falsch negatives einfach durch ein echtes positives Ergebnis in einem späteren Zyklus abgelöst werden kann. Umgekehrt sollte ein falsch positives Ergebnis im Idealfall vermieden werden, weil dies zu unnötiger Betroffenheit in dem Individuum führen könnte. Demzufolge können die verschiedenen Kriterien so gesetzt werden, dass die akzeptable falsch negative Rate höher (z.B. 10 %) liegt als die akzeptable falsch positive Rate (z.B. 5 %).
Beispiel 4
Dieses Beispiel stellt dar wie Messungen von Urin E3G Konzentration alleine verwendet werden können, um das Auftreten eines verlangsamten Zyklus nachzuweisen.
Urinproben wurden aus einer großen Gruppe von Freiwilligen gesammelt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Proben wurden retrospektiv analysiert, und eine Vielzahl von Analyten wurde untersucht, einschließlich E3G.
E3G Testverfahren
Das Testprotokoll war wie folgt (Testpuffer, Waschpufferkonzentrat und Verstärkungslösung sind Reagenzien, die speziell für DELFIA-Tests entwickelt wurden, und sie sind erhältlich von Perkin Elmer Life Sciences [vormals E.G. & G. Wallac] unter den jeweiligen Produktnummern 1244-111; 1244-114 und 1244-105). Kaninchen-Antimaus-Platten (Produktbezeichnung AAAND-0003) und Europium-markiertes Östron-3-Glucuronid wurden von Perkin Elmer Life Sciences erhalten.

1. Zwei Lösungen wurden in Testpuffer hergestellt und in eine AutoDELFIA Reagenskassette gegeben; anti-E3G-Antikörper (MAb 4155) wurde vorverdünnt 1/40, und Eu³⁺-markiertes Östron-3-Glucuronid (E3G) wurde vorverdünnt gemäß dem Batch des Reagens, das verwendet wurde.
2. Kaninchen-Antimaus-Platten wurden in den AutoDELFIA eingesetzt und mit 2 × 200 μl Waschpuffer gewaschen.
3. Zu testende Urinproben (25 μl) oder Standards oder Kontrollen wurden in die Löcher der Platten verteilt.
4. Die Antikörperlösung wurde 1/100 automatisch weiter in Testpuffer durch die AutoDELFIA verdünnt, was eine Endantikörperverdünnung von 1/4000 ergab. 100 μl des verdünnten Antikörpers wurde anschließend in die Löcher der Platte hinzugefügt.
5. Die Platte wurde unter Schütteln für 30 Minuten inkubiert.
6. Das E3G-Eu³⁺ Konjugat wurde weiter 1/100 in Testpuffer durch die AutoDELFIA verdünnt. 100 μl des Konjugats wurden anschließend zu den Löchern der Platte hinzugefügt.
7. Die Platte wurde unter Schütteln für 30 Minuten inkubiert und anschließend mit 6 × 200 μl Waschpuffer gewaschen.
8. 200 μl der Verstärkungslösung (Perkin Elmer Life Sciences) wurde zu jedem Loch hinzugefügt, die Platte wurde für 5 Minuten geschüttelt, und die Treffer wurden ausgelesen. Die Konzentrationswerte wurden aus einer Standardkurve unter Verwendung des AutoDELFIA Multicalcprogramms berechnet. Durch statistische Analyse der Daten war es den Erfindern möglich, einen Algorithmus zu bilden, der die verlangsamten Zyklen bestimmt.

Eine Anzahl von verschiedenen E3G Testabläufen wurden von den Erfindern erfunden, aus den Ergebnissen der Tests war es möglich zwischen verzögerten Zyklen und normalen Zyklen in den Daten, die von den Freiwilligen gesammelt wurden, zu unterscheiden.
Ein einfacher Testablauf umfasst Messen der Konzentration von Urin E3G an jedem der Tage 6–15 des Zyklus (d.h. für 10 aufeinanderfolgende Tage). Ein Referenzgrenzwert von 10 ng/ml E3G wurde angenommen. Falls mehr als 3 Testergebnisse in den 10 Tagen Testintervall über diesem Grenzwert lagen, dann wird der Zyklus als normal (oder ovulatorisch) klassifiziert. Umgekehrt, falls die Urin E3G Konzentration weniger oder gleich 10 ng/ml an 8 oder mehr Tagen des 10 Tage Testintervalls beträgt, dann wird der Zyklus als verlangsamt klassifiziert.
Diese Testkriterien wurden auf dieselben Zyklen 1–3 derselben Testpersonen A–D, wie in Tabelle 2 gezeigt, angewendet, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Es wird angemerkt, dass das FSH Testverfahren, das in Beispiel 2 verwendet wurde, und das E3G Testverfahren, das oben beschrieben ist, Ergebnisse in vollständiger Übereinstimmung liefern in Bezug auf die Klassifikation von Zyklen als verlangsamt oder normal.
Es wird auch Bezug genommen auf die 2A-D, die zuvor erwähnt wurden, welche die E3G Profile für Zyklen 1–3 jeweils in den vier Testpersonen A–D zeigen.
Die Erfinder haben das Ergebnis ebenfalls untersucht wenn verwendet wurde: verschiedene E3G Grenzwertkonzentrationen (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18 und 20 ng/ml); verschiedene Testintervalle (Tage 6–14, 6–15, 7–14, 7–15, 7–16, 8–14, 8–15, 7–16 und 9–15); und verschiedene Zahl von Tagen (über dem Grenzwert), die für ein positives Ergebnis benötigt werden (3, 4 oder 5).
Die Erfinder haben herausgefunden, dass die beste Leistung erhalten wurde unter Verwendung einer Grenzwertkonzentration im Bereich 8–12 ng/ml. Ein Absenken des Grenzwertes auf 6 ng/ml führte zu einer nicht akzeptablen hohen falsch negativen Rate (d.h. zu viele verlangsamte Zyklen wurden fälschlich als "normal" klassifiziert), wohingegen ein Erhöhen des Grenzwertes auf 15 ng/ml oder mehr zu einer nicht akzeptabel hohen falsch positiven Rate führte.
Das oben genannte Protokoll benötigt nur eine Messung von relativen E3G Konzentrationen (d.h. relativ zu der gewählten Grenzwertkonzentration), und es ist deshalb möglich, das notwendige Testen unter Verwendung von einfachen "Dipstick"-Testvorrichtungen oder ähnlichem durchzuführen, in dem das Testergebnis für einen bestimmten Tag durch ein einfaches visuelles Signal (z.B. Auftreten einer Linie oder sichtbaren Markierung auf einer Testvorrichtung, wie sie im Stand der Technik gut bekannt ist), geliefert wird. Jedoch sind auch andere Testabläufe umfasst, in denen ein eher quantitatives Testergebnis benötigt wird. Solche eher quantitativen Verfahren können einfacher durchgeführt werden unter Zuhilfenahme einer elektronisch programmierbaren Datenverarbeitungsvorrichtung, wie einem elektronischen Monitor, umfassend Datenverarbeitungsmittel, die programmiert sind, um die notwendigen Berechnungen durchzuführen.
Wenigstens zwei verschiedene Arten solcher Methoden sind umfasst; solche, die einen "festen" Grenzwert und solche, die einen "schwimmenden" Grenzwert verwenden.
a) Fester Grenzwert
In einem Beispiel eines "festen" Grenzwertverfahrens wird der Zyklus als normal oder verzögert definiert in Abhängigkeit davon, ob die durchschnittene E3G Konzentration in dem Testintervall über oder unter einem festen Grenzwert (z.B. 10 ng/ml) liegt. Ein normaler Zyklus besitzt eine durchschnittliche E3G Konzentration größer als 10 ng/ml, ein verlangsamter Zyklus besitzt eine durchschnittliche E3G Konzentration gleich oder geringer als 10 ng/ml.
Die folgenden Testintervalle wurden analysiert: Tage 6–14, 6–15, 7–14, 7–15, 8–14, 8–15, 9–14 und 9–15. Obwohl es sehr wenig Variation in der Durchführung zwischen den Testfenstern gibt, wurde die beste Durchführung mit einem Testintervall der Tage 8–15 erhalten.
b) "Schwimmender Grenzwert"
Diese Ausführungsform misst einen basalen E3G Wert über die Tage 3–6 eines jeden Zyklus, und bestimmt anschließend, ob es einen signifikanten Anstieg in der E3G Konzentration über das Testintervall (Tage 7–17), relativ zu dem basalen E3G Wert gibt oder nicht.
Zwei Kriterien wurden verwendet, um einen signifikanten Anstieg (A oder B) unten zu bestimmen:
Signifikanter Anstieg (A)
Der Basalwert wurde über die Tage 3-6 bestimmt. Wenn die Basalkonzentration weniger als 8 ng/ml betrug, dann wurde ein Wert von 8 ng/ml verwendet. Wenn der bestimmte Basalwert höher ist als 8 ng/ml, dann wurde die höhere Konzentration verwendet. Dies kompensiert die normalerweise geringen Konzentrationen an E3G, welche die basale Bestimmung verzerren kann. Die Erfinder betrachteten die Konzentrationen von 8, 10 und 12 ng/ml als die minimale Konzentration für den Basalwert.
Der Grenzwert wurde als 25 % höher als die basale Konzentration definiert. Falls beispielsweise die basale E3G Konzentration 8 ng/ml beträgt, dann ist die Grenzwertkonzentration 10 ng/ml. Wenn jedoch der so bestimmte Grenzwert größer ist als 20 ng/ml, dann wird der Maximalwert von 20 ng/ml als der Grenzwert verwendet. Dies kompensiert eine ungewöhnlich hohe basale E3G Konzentration. Der Zyklus ist "normal", wenn es 4 Proben in dem Testintervall gibt, die den Grenzwert überschreiten.
Signifikanter Anstieg (B)
Das alternative Verfahren vergleicht den Unterschied zwischen der durchschnittlichen E3G Konzentration in dem Basalfenster, d.h. Tage 3–6 und die durchschnittliche E3G Konzentration für das Testintervall, z.B. Tage 7–17. Wenn die durchschnittliche Konzentration an E3G in dem Testintervall weniger als 12 ng/ml beträgt, und die Differenz zwischen der durchschnittlichen Konzentration des Testintervalls und dem Basalfenster weniger als 5 ng/ml beträgt, dann wird der Zyklus als "verlangsamt" erachtet; d.h. falls [DurchschnittE3G Konz]_7–17 – [Durchschnitt E3G Konz]_3–6 < 5 ng/ml und [Durchschnitt E3G Konz]_7–17 < 12 ng/ml, dann ist der Zyklus verlangsamt.
Beispiel 5: E3G Anstiegsalgorithmus
Der Algorithmus bestimmt nachträglich die erste stattgefundene relativ hohe Änderung in der E3G Konzentration. Der E3G Anstieg ist ein Parameter, der den Beginn der Eierstockantwort gegenüber FSH bestimmt. Dieser Parameter ist fundamental in der Bestimmung der Wirkung von erhöhten Konzentrationen von FSH auf die Follikelentwicklung und die Anwesenheit oder Abwesenheit eines "verlangsamten Zyklus". Die Einheit dieses Parameters ist der Tag.
Dieser Parameter verwendet geglättete Werte an E3G über die menstruellen Zyklen, und misst "Schubgröße" (S) für jeden Tag (i) in dem Zyklus mit einer positiven Steigung, aber schließt die letzten zehn Tage des Zyklus aus.
S_i basiert auf der Änderung in der E3G Steigung, relativ zu der gegenwärtigen E3G Menge (d.h. am Tag i): Si =(Rechte_Steigung – Maximum (Linke_Steigung))/Maximum (E3G)wobei
Rechte_Steigung = die Steigung der Linie, welche den aktuellen Tag (i) mit dem Tag R Tage später verbindet
Linke_Steigung = die Steigung der Linie, welche den aktuellen Tag (i) mit dem Tag L Tage früher verbindet.
Maximum E3G = Maximumwert an E3G (≥ 4 ng/ml) (falls die E3G Konzentration 4 ng/ml nicht übersteigt, dann wird der Wert von 4 ng/ml verwendet).
Erläuternde Beispiele sind in den 3A & 3B gezeigt, in denen die ausgefüllten Kreise den aktuellen E3G Mengen entsprechen, und die Pfeile mit den beiden Spitzen erläutern den Wert des (Rechte_Steigung-Maximum(Linke_Steigung). Die 3A und 3B sind Graphen von (E3G) gegenüber der Zeit (Tagen). Die 3A erläutert die Umstände einer Änderung in den E3G Gradienten von einem negativen Wert zu einem positiven Wert (d.h. ein Biegungspunkt). 3B erläutert die Situation, wenn ein signifikanter plötzlicher Anstieg in dem E3G Gradienten auftritt.
In 3A ist die Linke_Steigung negativ und wird deshalb durch Null ersetzt, entsprechend der horizontalen Linie. In diesen Beispielen: L = 2 und R = 3; so dass S von der aktuellen Menge an E3G abhängt und seinen Werten 2 Tage früher und 3 Tage später.
Obwohl L bei 2 festliegt, bestimmt R die Zykluslänge. Für Zyklen mit einer Länge von ≤ 30 Tagen R = 3. R steigt um 1 für jeden 5 Tage Anstieg in der Zykluslänge bis zu 10 für eine Zykluslänge > 60. Das zuletzt genannte Merkmal trägt zu längeren Zyklen bei, welche dazu neigen, längere E3G Anstiege aufzuweisen.
Der Nenner, Maximum (E3G) verleiht Steigungsänderungen bei geringen E3G Konzentrationen größeres Gewicht, vorausgesetzt diese übersteigen 4 ng/ml, um eine unnötige Sensitivität zu vermeiden.
Der E3G Anstiegstag wird anschließend definiert als der erste Tag in dem Zyklus an dem: S_i > Minimum (0,65·Maximum (S), 0,25), d.h., wenn S_i entweder > 0,25 oder > 0,65 × sein maximaler Wert über den Zyklus ist. Die zuletzt genannte Bedingung liefert eine Adaption an den Zyklus, und stellt sicher, dass ein Schub jeweils definiert wird.
Beispiel 6
Dieses Beispiel betrifft den Nachweis eines verlangsamten Zyklus durch Messung von einem oder mehreren Analyten in der Gelbkörperphase des Zyklus.
Die am meisten geeigneten Marker in der Gelbkörperphase zum Identifizieren verlangsamter Zyklen sind (vorzugsweise) LH und/oder (weniger bevorzugt) E3G/P3G. Die zeitlich Koordinierung des bevorzugten Testintervalls ist weitestgehend ähnlich, egal ob die LH Konzentration oder das Verhältnis von E3G und P3G Konzentrationen gemessen wird, und die Erfinder haben zwei Verfahren für jeden Marker beschrieben: 1) Zählen der Zahl der individuellen Testergebnisse über dem Grenzwert; und 2) Messen der Durchschnittskonzentration oder des Verhältnisses während des Testintervalls und sein Vergleichen mit einem Grenzwert.
Das Testintervall ist von dem Tag von LHmax + A zu dem Tag von LHmax + B z.B., falls A = 5, und B = 16 und der Tag von LHmax = Tag 14 des Zyklus, dann beträgt das Testintervall die Tage 19–30, d.h. ein 12 Tage Testintervall.
Die Erfinder haben die folgenden Kombinationen von A und B getestet:
Beispiel 6A - E3G/P3G Verhältnis
Das E3G Testverfahren wurde zuvor beschrieben. Die Erfinder testeten P3G in Urinproben wie unten beschrieben.
P3G Testverfahren
Das Testprotokoll war wie folgt (Testpuffer, Waschpufferkonzentrat und Verstärkungslösung sind Reagenzien, die speziell für DELFIA-Assays entwickelt wurden, und sie sind erhältlich von Perkin Elmer Life Sciences [vormals EG & Wallac] unter den jeweiligen Produktnummern 1244-111; 1244-114 und 1244-105). Kaninchen-Antimaus-Platten (Produktbezeichnung AAAND-0003) und Europium-markiertes Pregnandiol-3-Glucuronid (Kundensynthese) wurden ebenfalls von Perkin Elmer Life Sciences erhalten.

1. Zwei Lösungen wurden in Testpuffer hergestellt und in die AutoDELFIA-Reagenskassette gegeben; anti-P3G Antikörper (MAb 5806) wurde 1/40 vorverdünnt, und Eu³⁺-markiertes Pregnandiol-3-Glucuronid (P3G) wurde gemäß den verwendeten Batchreagenzien vorverdünnt.
2. Die Kaninchen-Antimaus-Platten wurden in die AutoDELFIA eingesetzt und mit 2 × 200 μl Waschpuffer gewaschen.
3. Zu testende Urinproben (25 μl) oder Standards oder Kontrollen wurden in die Löcher der Platten verteilt.
4. Die Antikörperlösung wurde 1/100 im Testpuffer automatisch weiter durch die AutoDELFIA verdünnt, was eine Endantikörperverdünnung von 1/4000 ergab. 100 μl des verdünnten Antikörpers wurden anschließend in die Löcher der Platte hinzugefügt.
5. Die Platte wurde unter Schütteln für 30 Minuten inkubiert.
6. Das P3G Eu³⁺ Konjugat wurde weiter 1/100 in Testpuffer durch die AutoDELFIA verdünnt. 100 μl des Konjugats wurden anschließend zu den Löchern der Platte hinzugefügt.
7. Die Platte wurde unter Schütteln für 30 Minuten inkubiert und anschließend mit 6 × 200 μlWaschpuffer gewaschen.
8. 200 μl der Verstärkungslösung (Perkin Elmer Life Sciences) wurde zu jedem Loch hinzugefügt, die Platte wurde für 5 Minuten geschüttelt, und die Treffer wurden ausgelesen. Die Konzentrationswerte wurden aus einer Standardkurve unter Verwendung des AutoDELFIA Multicalcprogramms berechnet.

Der Fachmann wird es begrüßen, dass es keine Notwendigkeit gibt P3G (oder irgendeinen anderen Analyten) in dieser besonderen Weise zu messen, und Verfahren zur Analytenmessung per se stellen keinen Teil der Erfindung dar. Beispielsweise schließen bekannte Verfahren für die Bestimmung von E3G und P3G Publikationen von Stancyzk et al., (1980. Amer. J. Obstetrics and Gynecology, 137, 443–450) und Weerasekera et al., (1983. J. Steroid Biochem. 18, 465–470) ein.
Das E3G/P3G Verhältnis ist einfach das arithmetische Verhältnis von den zwei Hormonkonzentrationen mit den Einheiten ng/ml für E3G und μg/ml für P3G.
Verfahren 1 – Zahl der Tests über einem Grenzwert
Ein Zyklus wird als verlangsamt bestätigt, wenn n oder mehrere Tage in dem Testintervall mit einem E3G/P3G Verhältnis größer als T vorliegen; d.h., E3G (ng/ml)/P3G (μg/ml) > T an ≥ n Tagen in dem Testfenster = verlangsamter Zyklus.
Die Erfinder haben Verhältnisse von Grenzwerten (T) von 2, 3 und 4 getestet, und es ist notwendig, dass die Zahl der Tests (n) größer ist als der Grenzwert von 2, 3, 4 und 5 Tests in dem Testintervall.
Die erfolgreichsten Kombinationen waren:

i) A = 3, B = 16, d.h. 14 Tage Testintervall, Zahl der Tage größer als der Grenzwert (n) = 2, und das Grenzwertverhältnis (T) = 4; und
ii) A = 5, B = 16, d.h. 12 Tage Testintervall, Zahl der Tage größer als der Grenzwert (n) = 3, und das Grenzwertverhältnis (T) = 3.

Verfahren 2 – Durchschnittswert des Verhältnisses während des Testintervalls
Ein Zyklus wird als verlangsamt bestätigt, wenn der durchschnittliche Wert des E3G/P3G Verhältnisses während des Testintervalls größer ist als das Grenzwertverhältnis (T).
D.h. Durchschnitt(E3G ng/ml)/ P3G (μg/ml) für die Tage in dem Testfenster > T = verlangsamter Zyklus.
Die erfolgreichsten Kombinationen waren:

i) A = 3, B = 16, d.h. 14 Tage Testintervall, durchschnittliches Verhältnis größer als ein Grenzwert (T) = 3; und
ii) A = 5, B = 14, d.h. 10 Tage Testintervall, durchschnittliches Verhältnis größer als ein Grenzwert (T) = 3.

Dieses "durchschnittliche" Verfahren wurde angewendet auf die Daten, die während der Zyklen 1–3 für die vier Testpersonen A–D, die in den vorherigen Beispielen verwendet wurden, erhalten wurden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4

(Man beachte, dass die Regel versagt hat, den Zyklus 3 als einen verlangsamten Zyklus für Testperson C zu identifizieren).

Beispiel 6B - LH
Verfahren 1 - Zahl der Tests über einem Grenzwert Es wurde derselbe Bereich an Testintervallen wie für das E3G/P3G Verhältnis untersucht. Ein Zyklus wurde als verlangsamt bestätigt, falls n oder mehrere Tage mit einer LH Konzentration größer als eine Grenzwertkonzentration von L mlU/ml beobachtet wurde. D.h., LH Konzentration > L an ≥ n Tagen in dem Testfenster = verlangsamter Zyklus Die Erfinder untersuchten Grenzwertkonzentrationens (L)-werte von 3, 4, 5 und 6 mlU/ml, und die Zahl der Tests (n) musste größer als der Grenzwert von 2, 3, 4 und 5 Tests in dem Testfenster sein.
Die erfolgreichsten Kombinationen waren:

i) A = 3, B = 10, d.h., 8 Tage Testintervall, Zahl der Tage (n) größer als der Grenzwert = 4, und Grenzwertkonzentration (L) = 4 mlU/ml; und
ii) A = 4, B = 10, d.h., 7 Tage Testintervall, Zahl der Tage (n) größer als der Grenzwert = 3, und Grenzwertkonzentration (L) = 4 mlU/ml.

Verfahren 2 – durchschnittlicher Wert der LH Konzentration während des Testintervalls Ein Zyklus wird als verlangsamt bestätigt, wenn die durchschnittliche Konzentration an LH während des Testintervalls größer ist als eine Grenzwertkonzentration (L).
D.h., durchschnittliche LH Konzentration (mlU/ml) für die Tage in dem Testfenster > L = verlangsamter Zyklus Die erfolgreichsten Kombinationen waren:

i) A = 3, B = 10, d.h. 8 Tage Testintervall, durchschnittliche LH Konzentration über dem Testintervall ist größer als eine Grenzwertkonzentration (L) = 4 mlU/ml; und
ii) A = 4, B = 10; d.h. 7 Tage Testintervall, durchschnittliche LH Konzentration über dem Testintervall ist größer als eine Grenzwertkonzentration (L) = 4 mlU/ml.

Dieses Verfahren wurde auf die Daten angewendet, die während den Zyklen 1–3 der vier Testpersonen A–D, die in den vorherigen Beispielen verwendet wurden, erhalten werden. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Zusammenfassung
Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis eines verlangsamten Zyklus in einer menschlichen weiblichen Testperson, die einen solchen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Entnehmen einer Probe von Körperflüssigkeit aus der Textperson an jedem einer Vielzahl von, aber nicht weniger als drei, Tagen; Testen jeder der Vielzahl von Proben, um die Konzentration wenigstens eines signifikanten Analyten im Ovulationszyklus darin zu bestimmen; Vergleichen eines Ergebnisses, das aus den Testen bestimmt wird, mit einem vorbestimmten Grenzwert, und, falls das bestimmte Ergebnis von dem Grenzwert abweicht, Erklären des Zyklus, während dem die Proben entnommen wurden, zu einem verlangsamten Zyklus.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines verlangsamten Zyklus in einer menschlichen weiblichen Testperson, die einen solchen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Entnehmen einer Probe von Körperflüssigkeit aus der Testperson an jedem einer Vielzahl von, aber nicht weniger als drei, Tagen; Testen jeder der Vielzahl von Proben, um die Konzentration wenigstens eines signifikanten Analyten im Ovulationszyklus darin zu bestimmen; Vergleichen eines Ergebnisses, das aus den Testen bestimmt wird, mit einem vorbestimmten Grenzwert; und, falls das bestimmte Ergebnis von dem Grenzwert abweicht, Erklären des Zyklus, während dem die Proben entnommen wurden, zu einem verlangsamten Zyklus.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe von Körperflüssigkeit eine Urinprobe umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der signifikante Analyt eines oder mehrere der folgenden umfasst: FSH; LH; Progesteron oder einen Metaboliten davon; und Östrogen oder einen Metaboliten davon.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei Proben von Körperflüssigkeit an aufeinander folgenden Tagen abgenommen werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede der Vielzahl von Proben an aufeinander folgenden Tagen abgenommen werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Vielzahl von Proben in der Follikelphase abgenommen werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt FSH oder E3G umfasst, und die erste der Vielzahl von Proben am Tag 5 bis Tag 10 der Periode abgenommen wird, wobei Tag 1 der erste Tag der Blutung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die erste der Vielzahl von Proben am Tag 6 bis Tag 9 der Periode abgenommen wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede der Vielzahl der Proben an den Tagen 6–16 der Periode abgenommen wird, wobei Tag 1 der erste Tag der Blutung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei jede der Vielzahl der Proben an den Tagen 7–15 der Periode abgenommen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei jede der Vielzahl der Proben an den Tagen 8–14 der Periode abgenommen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei ein Vielzahl von Proben während der Gelbkörperphase abgenommen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der signifikante Analyt LH umfasst, oder ein Verhältnis von E3G/P3G ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an wenigstens 4 Tagen Proben abgenommen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei Proben an wenigstens 5 Tagen abgenommen werden.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei Proben an wenigstens 7 Tagen abgenommen werden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Grenzwert ein populationsabgeleiteter Grenzwert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16, wobei der Grenzwert ein individueller Grenzwert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der signifikante Analyt FSH und E3G umfasst, und der Zyklus zu einem verlangsamten Zyklus erklärt wird, falls, unter anderem, das Testen zeigt fDurchschnitt > X und fmaxTag > 7, wobei (i) fDurchschnitt definiert ist als der Durchschnitt der FSH Konzentrationswerte in mlU/ml, bestimmt von Tag 1 des Zyklus bis zu, aber nicht umfassend, den Tag, an dem ein signifikanter Anstieg an E3G vorliegt; (ii) der signifikante Anstieg an E3G definiert ist als der Tag des Zyklus (vor Auftreten des LH Maximums) an dem die Steigung in der graphischen Darstellung von E3G (gegenüber der Zeit) maximal ist; (iii) X ein Grenzwert im Bereich von 10–30 mlU/ml Urin ist; (iv) und fmaxTag definiert ist als der Tgg des Zyklus an dem, eine Urinvolumenschwankung zulassenden, die FSH Konzentration maximal ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei X im Bereich von 10–20 mlU/ml liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei X im Bereich von 12–18 mlU/ml liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der signifikante Analyt FSH und E3G umfasst, und der Zyklus als ein verlangsamter Zyklus erklärt wird, falls, unter anderem, das Testen zeigt fe Verhältnis > Y wobei fe Verhältnis die Summe der FSH Konzentrationswerte in mlU/ml geteilt durch die Summe der E3G Konzentrationswerte in ng/ml ist, während der Periode von Tag 1 bis zu, aber nicht umfassend, dem Tag, an dem ein signifikanter Anstieg an E3G vorliegt, wie in Anspruch 19 (ii) definiert, und wobei Y eine Zahl im Bereich von 37–51 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei Y im Bereich von 37–41 liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23 und weiter in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 19–21.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei der signifikante Analyt Urin E3G umfasst, und das Verfahren die Bestimmung eines Basis E3G Wertes umfasst, der die durchschnittliche Urin E3G Konzentration in Tests angibt, die während der Periode an den Tagen 3–6 des Zyklus durchgeführt werden.
Verfahren zum Identifizieren einer Testperson, die einen verlangsamten Zyklus aufweist oder aufgewiesen hat, in den Menopausenübergang eintritt oder eingetreten ist, je nach dem, wobei das Verfahren Durchführen eines Verfahrens in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1–25; und Erachten, dass der Menopausenübergang begonnen hat, falls ein verlangsamter Zyklus nachgewiesen wird, umfasst.
Verfahren zum Nachweis einer beeinträchtigten Eierstockfunktion aufgrund des Menopausenübergangs, wobei das Verfahren Durchführen eines Verfahrens in Übereinstimmung mit einem der Ansprüche 1–25, und Erachten, dass die beeinträchtigte Eierstockfunktion aufgrund des Menopausenübergangs aufgetreten ist, falls ein verlangsamter Zyklus nachgewiesen wird und keine weiteren offensichtlichen Gründe einer beeinträchtigten Funktion in der Testperson vorliegen, umfasst.
Programmierbare Vorrichtung zur elektronischen Datenverarbeitung zur Verwendung in dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung so programmiert ist, dass sie aus den Ergebnissen der Analytenkonzentrationstests das Auftreten eines verlangsamten Zyklus nachweist; wobei die Vorrichtung wahlweise weiterhin Anzeigemittel umfasst, um anzuzeigen, ob ein verlangsamter Zyklus nachgewiesen wurde oder nicht.
Vorrichtung gemäß Anspruch 28, weiter umfassend: Aufnahmemittel zum Aufnehmen einer Testvorrichtung, die verwendet werden, um einen Analytenkonzentrationstest durchzuführen; und Auslesemittel zum Auslesen des Ergebnisses eines Analytenkonzentrationstests, der unter Verwendung der Testvorrichtung durchgeführt wurde, von einer Testvorrichtung, die in die Aufnahmemittel aufgenommen wurde.
Kit für die Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1–27, umfassend eine programmierbare Vorrichtung zur elektronischen Datenverarbeitung gemäß Anspruch 29, und eine Vielzahl von Testvorrichtungen.