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Die Erfindung betrifft allgemein ein Immunoassay-Verfahren betreffend
menschliche Granulocyte-Elastase und insbesondere ein Verfahren zur genauen
Bestimmung der Menge an menschlicher Granulocyte-Elastase bei der zu
untersuchenden Probe als Gesamtmenge an menschlicher Granulocyte-Elastase, wenn die
Probe eine Mischung aus freier Elastase mit einem Elastase-Inhibitor-Komplex
beinhaltet, wie auch die klinische Verwendung desselben.
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Menschliche Granulocyten sind in vorderster Reihe des Biophylaxe-Mechanismus
angeordnet, und sammeln sich in der allerersten Stufe der Invasion und
Freisetzung von Protease und aktiven Enzymen für die Zersetzung, Degradation und
Sterilisation fremder Materie und Bakterien am Infektionsort an. Von der
freigesetzten Protease besitzt Elastase die stärkste Wirkung und nimmt deshalb eine
zentrale Stelle im Biophylaxe-Mechanismus ein. Jedoch ist auf der anderen Seite
dieses Enzym in seiner Substratspezifität zu gering, um verschiedene
Bindegewebekomponenten (Elastin, Kollagen, Proteoglycan etc.) zu zersetzen, was zur
Zerstörung des lebenden körpergewebes infolge der Digestion und Degradation
konstruktiver Proteine führt.
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Normalerweise besitzt ein lebendiger körper in seinem Blut eine große Menge an
Inhibitor wie α&sub1;-Antitrypsin, um das der Invasion nicht ausgesetzte Gewebe gegen
die starken digestiven Wirkungen der Enzyme zu schützen; das heißt, daß selbst
wenn von den Granulocyten, die sich am Invasionsort ansammeln, freigesetzte
Elastase durch den lebendigen Körper infolge der Blutzirkulation wandert, werden
sofort Elastase-Inhibitor-Komplexe gebildet, wodurch die Aktivität der Elastase
deaktiviert wird, um die Zerstörung des Gewebes stärker als erforderlich zu
vermeiden.
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Die Bestimmung menschlicher Granulocyten-Elastase, die eine derartige Rolle
spielt, wird als sehr effektiv für die Diagnose einer Entzündung angesehen, oder
um den Entzündungsgrund aufzuklären, zu behandeln und die Wiederherstellung
zu beurteilen, wobei ein Verfahren zur Durchführung einer Immunoassay der
Menge an Granulocyten-Elastase im Blut in JP-A-57-551 vorgestellt ist. Gemäß
diesem Verfahren wird ein Elastase-Inhibitor-Komplex immunologisch untersucht,
wobei als erster Antikörper ein Antikörper für menschliche Granulocyten-Elastase
und als zweiter Antikörper ein enzymmarkierter Antikörper als Inhibitor verwendet
wird.
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Jedoch wird dieses Verfahren lediglich für die Messung von Elastase-Inhibitor-
Komplexen verwendet; mit anderen Worten ist es in einem solchen Fall nützlich,
in welchem zirkulierendes Blut, das freigesetzte menschliche Granulocyten-
Elastase nur in Form eines Elastase-Inhibitor-Komplexes beinhaltet, als zu
untersuchende Probe verwendet wird. Das heißt, daß ein ernsthaftes Problem bei
diesem Verfahren darin besteht, daß bei immunologisch zu untersuchenden Proben,
die Gewebeschleim enthalten, der von dem Entzündungsort stammt, welcher
geringe Mengen an Inhibitoren beinhaltet und in welchem freie Elastase mit
Elastase-Inhibitor-Komplexen vermischt ist, die Menge an menschlicher Granulocyten-
Elastase nicht präzise bestimmt werden kann.
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Dies bewahrheitet sich auch dann, wenn eine Immunoassay durchgeführt wird,
wobei als erster Antikörper ein Antikörper für menschliche Granulocyten-Elastase
und als zweiter Antikörper ein enzymmarkierter Antikörper für einen Inhibitor
verwendet wird. Mit anderen Worten kann die Menge an menschlicher Granulocyten-
Elastase nicht präzise bestimmt werden, da ein Unterschied in den Reaktivitäten
der genannten Antikörper mit freier Elastase und mit Elastase-Inhibitor-Komplexen
bestehen.
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Kramer, M.D. et al (1990) J. Immunological Methods 131: 41-48 offenbart die
Messung freier menschlicher Leukozyten-Elastase und menschlicher Leukozyten-
Elastase/α&sub1;-Proteinase-Inhibitor-Komplexe mittels eines enzymgekoppelten
Immunosorbentassay, jedoch wird die Bestimmung der Gesamtmenge an Elastase
nicht offenbart.
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Im Hinblick auf die oben genannten Probleme des Standes der Technik haben die
Erfinder intensiv geforscht, wie die genaue Menge an menschlicher Granulocyten-
Elastase zu untersuchen ist, selbst wenn freie Elastase mit Elastase-Inhibitor-
Komplexen vermischt ist. Gemäß dieser Erfindung können die oben genannten
Probleme des Standes der Technik mittels eines Verfahrens zur Bestimmung der
Gesamtmenge an menschlicher Granulocyte-Elastase in einer Probe gelöst
werden, unter Verwendung eines Antikörpers für die menschliche Granulocyte-
Elastase gebunden an unlösliche Träger, dadurch gekennzeichnet, daß das ge
nannte Enzym in Form einer Mischung von freier Elastase mit Elastase vorliegt,
die einen Komplex mit Inhibitoren bildet, die in der zu analysierenden Probe
vorhanden sind, und daß die genannte freie Elastase in einen Elastase-Inhibitor-
Komplex durch Zufügung eines Inhibitors umgewandelt wird, der in der Lage ist,
mit der freien Elastase eine Verbindung einzugehen, derart, daß der so konvertier
te Elastase-Inhibitor-Komplex und der vorher existierende Elastase-Inhibitor-
Komplex gleichzeitig analysiert werden.
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Vorzugsweise sind die Inhibitoren, die mit freier Elastase kombiniert werden
können und so bei dieser Erfindung verwendet werden können, menschliches α&sub1;-
Antitrypsin, menschliches Serum oder Plasma enthaltend menschliches α&sub1;-
Antitrypsin, tierisches Serum oder Plasma enthaltend eine Substanz, die sich mit
freier Elastase derart verbinden kann, daß menschliches α&sub1;-Antitrypsin sich damit
verbindet, um die Elastase-Aktivität zu hemmen, und ein synthetisches Material
enthaltend eine Substanz, die sich mit einer freien Elastase in einer Weise
verbinden kann, daß menschliches α&sub1;-Antitrypsin sich damit zur Hemmung der Elastase-
Aktivität verbindet.
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Erfindungsgemäß ist es selbst dann, wenn die zu analysierende Probe eine
Mischung aus freier Elastase mit Elastase-Inhibitor-Komplexen beinhaltet, möglich,
die genaue Menge an Elastase zu analysieren und so Klinikpersonen mit präzisen
Daten zur Diagnose zu versorgen.
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Wenn beispielsweise die zu untersuchende Probe Schleim aus dem
Gebärmutterhalskanal einer Frau mit Kind ist, welcher geringe Mengen an Inhibitoren ent
hält und in welchem freie Elastase mit Elastase-Inhibitor-Komplexen vermischt ist,
ist es möglich, eine gefährliche Frühgeburt, eine Frühgeburt oder ein durch
Frühgeburt bedingtes Reißen von Membranen (PROM) durch die Ermittlung der
Menge an Granulocyte-Elastase präzise vorherzusagen und zu verhindern. Eine
Ursache
einer bedrohlichen Frühgeburt, einer Frühgeburt oder von PROM ist villöse
Amnionitis, von der angenommen wird, daß sie sich durch zunehmende
Ausbreitung von Zervizitis entwickelt. Demzufolge kann durch Verwendung der Menge an
von Granulocyten freigesetzter Elastase als Parameter bestimmt werden, ob
Zervizitis vorliegt oder nicht, was es ermöglicht, daß die Infektion oder Entzündung in
einem frühen Stadium behandelt und die zunehmende Ausbreitung der
Entzündung verhindert werden kann.
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Sputum oder eine Spüllösung von Bronchovesikularlavage (bronchovesicular
lavage) liefert ebenfalls Proben, die kleine Mengen an Inhibitoren enthalten und in
welchen freie Elastase mit Elastase-Inhibitor-Komplexen vermischt ist. Wiederum
kann das Vorliegen chronischer und sich wiederholender Luftwegsinfektionen
oder Lungenemphysema basierend auf chronischen Atmungskrankheiten, die
Elastase zuzuschreiben sind, durch Analysieren der Menge an Elastase in diesen
Proben ermittelt werden, was es ermöglicht, daß die Patienten eine sachgemäße
Behandlung erhalten.
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Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die die Hemmungsverhältnisse
verschiedener Seren bezüglich der Elastase-Aktivität zeigt,
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Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktivitäten bezüglich eines
menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers von Elastase-Inhibitor-
Komplexen, erhalten durch Addition menschlicher Seren zu freier Elastase, zeigt,
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Figur 3 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktivitäten bezüglich eines
menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers von Elastase-Inhibitor-
Komplexen, erhalten durch Addition von Schafseren zu freier Elastase, zeigt,
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Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die. Reaktivitäten bezüglich eines
menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers von Elastase-Inhibitor-
Komplexen, erhalten durch Addition von Kaninchenseren zu freier Elastase, zeigt,
und
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Figur 5 ist eine graphische Darstellung, die die Reaktivitäten bezüglich eines
menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers von Elastase-Inhibitor-
Komplexen, erhalten durch Addition von α&sub1;-Antitrypsin (2,0 µm/ml), menschlichen
Serums (0,1%), Schafserum (1,0%) und Kaninchenserum (1,0%) zu freier
Elastase zeigt.
Beispiele
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Die vorliegende Erfindung wird nun spezifischerweise, jedoch nicht
ausschließlicherweise bezüglich der folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
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Untersucht wurden die Effekte, die durch Zugabe eines menschlichen Serums
enthaltend α&sub1;-Antitrypsin, als auch von Schaf- und Kaninchenseren enthaltend
eine Substanz mit einem Effekt ähnlich dem von menschlichen α&sub1;-Antitrypsin zu
freier Elastase erhalten wurden.
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Freie Elastase wurde verdünnt und auf 500 ng/ml (22,4 U/l als Enzymaktivität) mit
einer Phosphat-Puffer-Lösung (nachfolgend kurz PBS) (10 mM, pH 7,4)
eingestellt, welche menschliche Seren, und Seren vom Schaf und Kaninchen enthielt,
jede in einer Menge von 0,0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5 oder 1,0%, wodurch die zu
analysierenden Proben hergestellt wurden. Die Enzymaktivität jeder Probe wurde mit
einem synthetischen Substrat TESTTEAM S-2484 (Dai-ichi Kagaku)
(nachfolgend einfach S-2484) bestimmt, welches spezifisch mit Granulocyte-
Elastase reagiert (cf. "Scad. J. Clin. Lab. Invest" 43 427(1983)). Schließlich
wurde eine Lösung aus 80 µl der Proben in 640 µl eines Tris-Chlorwasserstoffsäure-
Puffers (nachfolgend einfach Tris-HCl-Puffer genannt) (0,05 M, pH 8,3) enthaltend
Natriumchlorid (0,4 M) und Rinderserumalbumin (0,125%) (Boehringer Mannheim
Gmbh) - nachfolgend kurz BSA - bei 37ºC für 5 Minuten bebrütet. Danach wurden
für eine 3-minütliche Inkubation bei 38ºC 80 µl-2484 (6 mM) zugefügt, und 160
µl Essigsäure (50%) wurden zugefügt, um die Reaktion zu beenden. Neben den
obigen Proben wurde eine Leerprobe vorgesehen, zu welcher 50%-ige
Schwefelsäure
vor der Zugabe von S-2484 zugefügt wurde und welche nicht der 3-
minütlichen Inkubation bei 37ºC unterworfen wurde. Die Absorptionsmaße dieser
Proben wurden bei 405 nm mit einem Mikroplattenleser Modell 450 (Bio-Rad
(eingetragenes Warenzeichen) Laboratories) bestimmt.
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In Tabelle 1 und Figur 1 sind die Mengen der zugefügten Seren und die
Hemmungsverhältnisse der Elastase-Aktivität dargestellt, woran zu erkennen ist, daß
die Schaf- und Kaninchenserum als Inhibitor für freie Elastase wirkt, wie dies der
Fall ist bei menschlichem Serum enthaltend α&sub1;-Antitrypsin, und einen Elastase-
Inhibitor-Komplex bildet, wodurch die Enzymaktivität der Elastase gehemmt wird.
Es ist ebenso offensichtlich, daß die Hemmungsverhältnisse der Enzymaktivität
ansteigen abhängig von der Menge der Seren, und daß die Enzymaktivität fast
vollständig gehemmt wird, wenn die Mengen des menschlichen Serums und jedes
der zugefügten Schaf- und Kaninchenseren 0,1 % und 1,0% betragen.
Tabelle 1 - Hemmungsverhältnisse der Elastase-Aktivität bei zugefügten
menschlichen, Schaf- und Kaninchen-Seren
Beispiel 2
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Untersucht wurden die Reaktivitäten von Elastase-Inhibitor-Komplexen, erhalten
durch Addition eines menschlichen Serums.
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Freie Elastase wurde verdünnt und mit PBSS enthaltend 0,0, 0,01, 0,05, 0,1 und
0,2% menschlicher Seren, jedes enthaltend α&sub1;-Antitrypsin als Inhibitor auf 0,0,
0,2, 08 und 3,2 ng/ml einreguliert. Fünfzig (50) µl jeder Probe wurden einer
Mikroplatte (Gostar Corporation), die mit einem Schafs-Antihuman-Granulocyte-
Elastase-Antikörper (Binding Site Ltd.) beschichtet war, zugefügt. Nach einer
einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Probe mit PBS enthaltend
Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) (Wako Junyaku) gut gewaschen, und
anschließend mit 50 µl einer Lösung aus Peroxidase (POD)-markiertem Schafs-
Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper (Binding Site Ltd.) versetzt, gefolgt
von einer einstündigen Inkubation bei 37ºC. Danach wurde die Probe gut mit PBS
enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen. Zu
diesem wurden 100 µl einer 0,1 M Zitronensäure/0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat-
Puffer-Lösung - nachfolgend als McIrvein-Puffer-Lösung genannt - (pH 5,5)
zugegeben, welche o-Phenylendiamin 2HCl (1 mg/ml, Wako Junyaku) - nachfolgend
kurz OPD genannt - und wäßriges Wasserstoffperoxid (0,05%), Mitsubishi Gas)
enthielt, zugegeben, gefolgt von einer 10-minütlichen Reaktion bei
Raumtemperatur. Anschließend wurden 100 µl einer 3N Schwefelsäure (Wako Junyaku)
zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Bis zu welchem Grad die Reaktionslösung
Farben entwickelte, wurde anhand des Absorptionsmaßes bei 490 nm mit einem
Mikroplattenleser (Modell 450, Bio-Rad (eingetragenes Warenzeichen)
Laboratories) bestimmt.
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In Tabelle 2 und Figur 2 sind die Reaktivitäten der Elastase-Inhibitor-Komplexe
angegeben und dargestellt, die durch Zugabe menschlichen Serums zu freier
Elastase bezüglich des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers bei
Absorptionsänderungen erhalten würden. Anhand dieser ist erkennbar, daß
bezüglich der Reaktivität des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers zu der
Granulocyte-Elastase die durch Zugabe des menschlichen Serums konvertierten
Elastase-Inhibitor-Komplexe besser sind als freie Elastase. Es hat sich ebenso
erwiesen, daß die Mengen der konvertierten Elastase-Inhibitor-Komplexe
zunahmen abhängig von der Menge des zugefügten menschlichen Serums, jedoch wird
die Konversion zu den Elastase-Inhibitor-Komplexen durch Zugabe von 0,1%
menschlichen Serums vervollständigt.
Tabelle 2 - Reaktivitäten von Elastase-Inhibitor-Komplexen, erhalten durch
Zugabe von menschlichen Serums
Beispiel 3
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Untersucht wurden die Reaktivitäten von Elastase-Inhibitor-Komplexen, erhalten
durch Zugabe von Schafserum.
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Freie Elastase wurde verdünnt und mit PBSS enthaltend 0,0, 0,1,1,0 und 5,0% an
Schafseren auf 0,0, 0,2, 0,8 und 3,2 ng/ml einreguliert. Fünfzig (50) µl jeder Probe
wurden einer Mikroplatte, die mit einem Schafs-Antihuman-Granulocyte-Elastase-
Antikörper beschichtet war, zugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei
37ºC wurde die Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20)
Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen, und anschließend mit 50 µl einer Lösung eines
Peroxidase (POD)-markierten Schafs-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper
versetzt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 37ºC. Danach wurde die
Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%)
gewaschen. Hierzu wurden 100 pl einer McIrvein-Puffer-Lösung enthaltend OPD
(1 mg/ml) und wäßriges Wasserstoffperoxid (0,05%) zugegeben, gefolgt von einer
zehnminütlichen Reaktion bei Raumtemperatur. Danach wurden 100 µl einer 3N
Schwefelsäure zugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das Maß, bis zu welchem
die Reaktionslösung Farben entwickelte, wurde anhand der Absorption bei 490
nm mit einem Mikroplattenleser (Modell 450, Bio-Rad (eingetragenes
Warenzeichen) Laboratories) bestimmt.
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In Tabelle 3 und Figur 3 sind angegeben und dargestellt die Reaktivitäten der
Elastase-Inhibitor-Komplexe, erhalten durch Zugabe von Schafserum zu freier
Elastase, bezüglich des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers anhand
von Absorptionsänderungen. Anhand dieser ist zu erkennen, daß anhand der
Reaktivität des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers zu der Granulocyte-
Elastase die durch Zugabe des Schafserums konvertierten Elastase-Inhibitor-
Komplexe besser sind als freie Elastase. Es ist ebenfalls offensichtlich, daß die
Mengen der konvertierten Elastase-Inhibitor-Komplexe abhängig von den Mengen
des zugefügten Schafserums sind, jedoch die Konversion zu den Elastase-
Inhibitor-Komplexen durch Zugabe von 1,0% Schafserum vervollständigt wird.
Tabelle 3 - Reaktivität von Elastase-Inhibitor-Komplexen, erhalten durch Zugabe
von Schafserum
Beispiel 4
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Untersucht wurden die Reaktivitäten von Elastase-Inhibitor-Komplexen, erhalten
durch Zugabe von Kaninchenserum.
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Freie Elastase wurde verdünnt und mit PBSS enthaltend 0,0, 0,1, 1,0 und 5,0% an
Kaninchen-Seren auf 0,0, 0,2, 0,8 und 3,2 ng/ml einreguliert. Fünfzig (50) µl jeder
Probe wurden einer Mikroplaffe, die mit einem Kaninchen-Antihuman
Granulocyte-Elastase-Antikörper beschichtet war, zugegeben. Nach einer
einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Probe gut mit PBS enthaltend
Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen, und anschließend mit 50 µl
einer Lösung eines POD-markierten Kaninchen-Antihuman-Granulocyte-Elastase-
Antikörpers versetzt für eine einstündige Inkubation bei 37ºC. Danach wurde die
Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%)
gewaschen. Hierzu wurden 100 µl einer McIrvein-Puffer-Lösung enthaltend OPD
(1 mg/ml) und wäßriges Wasserstoffperoxid (0,05%) zugegeben, gefolgt von einer
zehnminütlichen Reaktion bei Raumtemperatur. Anschließend wurden 100 µl
einer 3N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Bis zu welchem
Grad die Reaktionslösung Farben entwickelte, wurde anhand der Absorption bei
490 nm mit einem Mikroplattenleser (Modell 450, Bio-Rad (eingetragenes
Warenzeichen) Laboratories) bestimmt.
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In Tabelle 4 und Figur 4 sind angegeben und dargestellt die Reaktivitäten der
Elastase-Inhibitor-komplexe, erhalten durch Zugabe eines Kaninchenserums zu
freier Elastase bezüglich des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers
anhand der Absorptionsänderungen. Hieran ist zu erkennen, daß anhand der
Reaktivitäten des menschlichen Granulocyte-Elastase-Antikörpers zu der Granulocyte-
Elastase die durch die Zugabe von kaninchenserum konvertierten Elastase-
Inhibitor-Komplexe besser sind als freie Elastase. Es ist ebenso offensichtlich,
daß die Mengen der konvertierten Elastase-Inhibitor-Kompiexe zunehmen,
abhängig von den Mengen des zugefügten Kaninchenserums, jedoch die
Konvertierung zu den Elastase-Inhibitor-Komplexen durch Zugabe von 1,0%
Kaninchenserum vervollständigt wird.
Tabelle 4 - Reaktivitäten von Elastase-Inhibitoren-komplexen, erhalten durch
Zugabe von Kaninchenserum
Beispiel 5
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Vergleich zwischen α&sub1;-Antitrypsin, menschlichem Serum, Schafserum und
Kaninchenserum, sämtliche als Inhibitoren
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Freie Elastase wurde verdünnt und mit PBSs, jedes enthaltend α&sub1;-Antitrypsin (2,
µg/ml), menschliches Serum (0,1%), Schafserum (1,0%) und Kaninchenserum
(1,0%) und PBS, nichts davon enthaltend, auf 0,0, 02, 0,8 und 3,2 ng/ml
einreguliert. Fünfzig (50) µl jeder Probe wurden einer Mikroplatte, die mit einem Kanin
chen-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper beschichtet war, zugegeben.
Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde die Probe gut mit PBS
enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen, und
anschließend wurden 50 µl einer Lösung aus POD-markiertem Kaninchen-Antihuman-
Granulocyte-Elastase-Antikörper zugegeben, gefolgt von einer einstündigen
Inkubation bei 37ºC. Danach wurde die Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen
(20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen. Hierzu wurden 100 µl einer
McIrvein-Puffer-Lösung enthaltend OPD (1 mg/ml) und wäßriges Wasserstoffperoxid
(0,05%) für eine zehnminütliche Reaktion bei Raumtemperatur zugefügt. Danach
wurden 100 µl einer 3N Schwefelsäure zugegeben, um die Reaktion zu einem
Ende zu bringen. Zu welchem Grad die Reaktionslösung Farben entwickelte,
wurde anhand der Absorption bei 490 nm mit einem Mikroplattenleser (Modell 450,
Bio-Rad (eingetragenes Warenzeichen) Laboratories) bestimmt.
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In Tabelle 5 und Figur 5 sind angegeben und dargestellt die Reaktivitäten der
Elastase-Inhibitor-Komplexe bezüglich menschlichem Granulocyte-Elastase-
Antikörper anhand der Absorptionsänderungen, wobei die genannten Komplexe
durch Zugabe von α&sub1;-Antitrypsin (2,0 µg/ml), menschlichem Serum (0,1%),
Schafserum (1,0%) und Kaninchenserum (1,0%) zu menschlicher Elastase
erhalten wurden. Es ist ersichtlich, daß die Reaktivitäten der Elastase-Inhibitor-
Komplexe, erhalten durch Zugabe verschiedener Seren, im wesentlichen gleich
sind zu denen, die durch Zugage von 2,0 µg/ml von α&sub1;-Antitrypsin erhalten
wurden, unabhängig vom Serumtyp, vorausgesetzt, daß es in der oben genannten
Menge zugegeben wird.
Tabelle 5 - Vergleich zwischen α&sub1;-Antitrypsin, menschlichem Serum,
Schafserum und Kaninchenserum, alle als Inhibitoren
Beispiel 6
Immunoassay von Granulocyte-Elastase in Mukusproben, erhalten aus dem
Gebärmutterhalskanal einer Frau mit Kind
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Mukus wurde aus dem Gebärmutterhalskanal einer Frau mit Kind mit einem
Abstrich entnommen (Abbot Lab.), und dieser Abstrich wurde in PBS (1 ml)
eingetaucht. Anschließend wurde der Mukus gut in PBS eingerührt und bei 1000 U/min
für 5 Minuten zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit als zu analysierende
Probe zu sammeln.
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Zur Immunoassay wurde die Probe 500-fach mit PBS enthaltend Schafserum
(1,0%) verdünnt, und 50 ml wurden anschließend einer Mikroplatte, die mit einem
Schafs-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper beschichtet war, zugegeben.
Zur selben Zeit wurde eine freie Elastase-Standardiösung (0,2, 0,4, 0,8, 1,6 und
3,2 ng/ml) mit einem ähnlichen Verdünnungsmittel verdünnt, um Standardimien
herzustellen, und 50 µl jeder Lösung wurden derselben Mikroplatte, zu welcher die
Probe gegeben war, zugefügt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde
jede Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat
(0,05%) gewaschen, und anschließend mit 50 µl einer Lösung aus POD-
markiertem Kaninchen-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper versetzt,
gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 37ºC. Danach wurde die Probe gut mit
PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%) gewaschen.
Hierzu wurden 100 µl einer McIrvein-Pufferlösung enthaltend OPD (1 mg/ml) und
wäßriges Wasserstoffperoxid (0,05%) für eine zehnminütliche Reaktion bei
Raumtemperatur gegeben. Dann wurden 100 µl einer 3N Schwefelsäure
hinzugefügt, um die Reaktion zu einem Ende zu bringen. Zu welchem Grad die
Reaktionslösung Farben entwickelte, wurde anhand der Absorption bei 490 nm mit einem
Mikroplattenleser (Modell 450, Bio-Rad (eingetragenes Warenzeichen)
Laboratories) bestimmt. Die Konzentration an Elastase in der Probe konnte anhand der
Absorptionsmaße der Standardlösungen und der Probe bestimmt werden. Als
Konsequenz ist zu erkennen, daß die Konzentration (wie gemessen in dem
Extrakt)
der Granulocyte-Elastase in dem Mukus des Gebärmutterhalskanals einer
bis zur Geburt gesunden Frau mit Kind niedrig ist, jedoch bei einer schwangeren
Frau, die von einem Kind bedrohlicherweise und frühzeitig entbunden wurde, hoch
ist. Demzufolge ist es möglich, eine bedrohliche Frühgeburt durch Analysieren der
Konzentration an Granulocyte-Elastase im Mukus des Gebärmutterhalskanals
einer schwangeren Frau vorherzusagen. Nachfolgend sind die Ergebnisse dieses
Beispiels aufgeführt.
Tabelle 6
Mukus-Proben aus dem Gebärmutterhalskanal
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*: Bedrohliche Frühgeburt beobachtet
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**: Verblieb bis zur Geburt gesund.
Beispiel 7
Immunoassay von Granulocyte-Elastase im Urin
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Fünf (5) ml Urin wurden bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, und die
überstehende Flüssigkeit wurde als zu untersuchende Probe zusammengefaßt.
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In der Immunoassay wurde die Probe 500-fach mit PBS enthaltend Schafserum
(1,0%) verdünnt, und 50 ml wurden anschließend einer Mikroplatte, die mit einem
Schaf-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper beschichtet war, zugegeben.
Zur selben Zeit wurden freie Elastase-Standardlösungen (0,2, 0,4, 0,8, 1,6 und
3,2 ng/ml) mit einem ähnlichen Verdünnungsmittel verdünnt, um Standardlinien
herzustellen, und 50 µl jeder Lösung wurden derselben Mikroplatte, der die Probe
zugefügt war, hinzugegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wurde
jede Probe gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat
(0,05%) gewaschen, und anschließend mit 50 µl einer Lösung von POD-
markiertem Kaninchen-Antihuman-Granulocyte-Elastase-Antikörper versetzt,
gefolgt von einer einstündigen Inkubation bei 37ºC. Nach diesem wurde die Probe
gut mit PBS enthaltend Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (0,05%)
gewaschen. Hierzu wurden 100 µl einer McIrvein-Pufferlösung enthaltend OPD (1
mg/ml) und wäßriges Wasserstoffperoxid (0,05%) für eine zehnminütliche
Reaktion bei Raumtemperatur hinzugefügt. Anschließend wurden 100 µl einer 3N
Schwefelsäurelösung zugegeben, um die Reaktion zu einem Ende zu bringen.
Der Grad, zu welchem die Reaktionslösung Farben entwickelte, wurde anhand der
Absorption bei 490 nm mit einem Mikroplattenleser (Modell 450, Bio-Rad
(eingetragenes Warenzeichen) Laboratories) bestimmt. Die Konzentration an
Elastase in der Probe konnte anhand der Absorptionen der Standardlösungen und
der Probe bestimmt werden. Als Konsequenz ist zu sehen, daß die Konzentration
der Granulocyte-Elastase im Urin derjeniger, die gesund sind, niedrig ist, daß sie
aber bei denjenigen, die Harnwegsinfektionen haben, hoch ist. Es ist folglich
möglich, eine Diagnose von Harnwegsinfektionen durch Analysieren der Konzentration
an Granulocyte-Elastase im Urin durchzuführen. In Tabelle 7 sind die Ergebnisse
dieses Beispiels angegeben.
Tabelle 7
Urinproben
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*: Harnleiterinfektionen
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**: Gesund
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***: Nicht bestimmbar