Gegenstand
der Erfindung
Die gegenwärtige Erfindung betrifft neue
Inhibitoren der Tubulinpolymerisation mit Anthracenonstruktur sowie
deren Analoga. Es wurde nun gefunden, dass bestimmte 10- Benzyliden-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenone
potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation sind und daher zur
Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die mit einer erhöhten zellulären Proliferation
einhergehen. Die erfindungsgemäßen Tubulin-bindenden
Substanzen können
somit beispielsweise als wirkungsvolle anti-Krebs wirksame Verbindungen
fungieren.
Kurze Beschreibung
der Abbildungen
Die folgenden Abbildungen sind Bestandteil
der vorliegenden Patentschrift und dienen dem. besseren Verständnis sowie
der Spezifizierung der gegenwärtigen
Erfindung.
1 zeigt
ein representatives Reaktionsschema für die Synthese der erfindungsgemäßen 10-Benzyliden-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenone.
2 zeigt
den Effekt von Verbindung xy auf das Wachstum humaner chronisch
myelogener K562 Zellen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen
Konzentrationen der zu prüfenden
Verbindung über
einen Zeitraum von 48 h behandelt und die Zellzahl durch Zählung mittels
eines Hämozytometers
(Neubauer-Kammer) bestimmt. Die Ausgangszellzahl wird subtrahiert.
Der 100% Wert entspicht einer Zellzahl von 1.20 × 106 K562-Zellen
pro ml. Die Werte repräsentieren
das Mittel ± SD
(Standardabweichung) aus sechs Proben; Balken, SD.
3 zeigt
die Assemblierung des Tubulins in PIPES-Puffer bei pH = 6.8 und
37°C. Die
Tubulinkonzentration beträgt
1.1 × 10–5 M.
Detailierte
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung sind 10-Benzyliden-Verbindungen
der allgemeinen Formel I,
worin die erfindungsgemäßen Verbindungen
einen oder mehrere Substituenten (R1–R5) enthalten: Bevorzugte
Verbindungen gemäß der Erfindung
sind die in Tabelle I dargestellten sowie die in den Beispielen
exemplarisch aufgeführten
Verbindungen. Eine besonders bevorzugte Verbindung der allgemeinen
Formel I ist diejenige mit R2 = OH and R3 = OCH
3.
Representativ für die erfindungsgemäßen Verbindungen
stehen die im Folgenden aufgeführten:
10-[(3,4-Dimethoxy-benzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
(2); 10-((3,4,5-Trimethoxy-benzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
(3); 10-[(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
(4); 10-[(3-Hydroxy-4-methoxy-benzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon (5);
10-[(2-Hydroxy-3-methoxy-benzylidene)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
(6) 10-[(3-Methoxy-4-hydroxy-benzylidene)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon (7) 10-[(3,5-Dimethoxy-4-hydroxy-benzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
(8); 10-((2,4-Dimethoxy-3-Hydroxy-benzyliden)]-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenon
Im Einklang mit der vorliegenden
Erfindung kann die beschriebene Phenylalkyliden C-10 Einheit (Benzylidenstruktur)
durch eine Struktur mit terminaler heterocyclischer Gruppe wie Thiophen,
Pyrrol oder Imidazol ersetzt (modifiziert) werden.
Antineoplastischer
Effekt
Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine
anti-Tubulin-Wirkung durch Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation).
Die erfindungsgemäßen tubulinbindenden
Verbindungen sind daher brauchbar als neue anti-Krebs wirksame Verbindungen.
Salze
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls
die pharmazeutisch verträglichen
Säuren-
und Basenadditionssalze der Verbindungen zur pharmazeutischen Anwendung.
Die pharmazeutisch verträglichen
Salze können
Basenadditionssalze sein. Dazu zählen
Salze der Verbindungen mit Metallen und Aminen, wie Alkali- oder
Erdalkalimetallen oder organischen Aminen. Beispiele für brauchbare
Metallkationen wären
Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und dergleichen. Eingeschlossen
sind auch Schwermetallsalze mit den Kationen Silber, Zink, Kobalt,
und Cer. Beispiele für
brauchbare Amine sind N,N'-Dibenzylethylendiamin,
Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin, und
Procain. Pharmazeutisch verträgliche
Säureadditionssalze der
Verbindungen werden diejenigen, die mit organischen und anorganischen
Säuren
gebildet werden. Beispiele geeigneter Säuren zur Salzbildung sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Salicylsäure, Äpfelsäure, Gluconsäure, Fumarsäure, Bernsteinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Methansulfonsäure, und
dergleichen. Die Salze können
durch Behandlung der freien basischen Form mit einer ausreichenden
Menge der gewünschten
Säure unter
Bildung eines Monosalzes, Disalzes, etc. auf herkömmliche
Art und Weise erhalten werden. Die freie basische Form kann durch
Behandeln eines Salzes mit einer Base regeneriert werden. Es können z.B.
verdünnte
Lösungen
der wässrigen
Base verwendet werden. Verdünntes
wässriges
Natriumhydroxid, Kaliumcarbonat, Ammoniak und Natriumhydrogencarbonat
sind für
diesen Zweck brauchbar. Die freien basischen Formen unterscheiden
sich von den Salzen in einigen physikalischen Eigenschaften wie
z.B. der Löslichkeit
in polaren Solventien, die Salze verhalten sich jedoch entsprechend
den basischen Formen im Sinne der Erfindung.
Depolymerisation
von Tubulin
Die erfindungsgemäßen Verbindungen binden an
Tubulin. Durch Bindung der erfindungsgemäßen tubulinbindenden Substanzen
kommt es zu einer Hemmung der Tubulinassemblierung (Polymerisation).
Ein geeigneter Assay zur Feststellung der Tubulinwirksamkeit der
erfindungsgemäßen Verbindungen
findet sich in den angegegeben Beispielen.
Behandlung
proliferativer Erkrankungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich
als potente Inhibitoren der Tubulinpolymerisation erwiesen. Sie
sind daher auch geeignet zur Hemmung der Zellteilung und Proliferation
von nicht-Krebszellen. Solche Krankheiten umfassen EBV-induzierte
lymphoproliferative Erkrankungen und Lymphome, proliferative Sekundäreffekte
im Zusammenhang mit Diabetes, einschließlich vaskulärer Proliferation
und Retinopathie und Psoriasis; desweiteren benigne Tumore, einschließlich Angiome,
Fibrome, Myome, Osteoporose, Mastozytose und myeloproliferative
Erkrankungen.
Anti-Tumor
Wirkung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind brauchbar
zum Zwecke der Tumorbehandlung, um beispielsweise eine Hemmung der
Tubulinassemblierung des Tumorzelltubulins zu erreichen, eine Hemmung
des Tumorzellwachstums zu erzielen, Tumorzellen abzutöten, Apoptose
zu induzieren und/oder die Lebensdauer eines Patienten zu verlängern.
Die krebswirksamen, tubulinbindenden
erfindungsgemäßen Verbindungen
sind brauchbar zur Anwendung in Säuretieren. Säugetier
bezeichnet im Sinne dieser Erfindung jede Klasse höherer Vertebraten,
die ihre Jungen mit Milch, produziert in Milchdrüsen ernähren, einschließlich dem
Menschen, Kaninchen und Affen.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren der Tubulinpolymerisation
sind geeignet zur Behandlung jeder Krankheit, bei der die Polymerisation
von Tubulin von Bedeutung ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind außerdem geeignet
zur Behandlung von Krankheiten, welche durch parasitische Protozoen,
wie Sporozoen (z.B. Plasmodium, Toxoplasma), Amöben (z.B. Acanthamoeba, Entamoeba),
Flagellaten (z.B. Trypanosoma, Leishmania), Ciliaten (z.B. Balantidium)
hervorgerufen werden und für
die die Tubulinpolymerisation von Bedeutung für deren Bewegung ist. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren
der Tubulinpolymerisation sind insbesondere nützlich zur Behandlung der Chagas-Krankheit
oder von Krankheiten, die: durch Würmer hervorgerufen werden.
Methoden zur
Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können entweder
als einzelne therapeutische Wirkstoffe oder als Mischung mit anderen
therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Im allgemeinen werden
sie in Form pharmazeutischer Mittel verabreicht, das heißt als Mischungen
der Wirkstoffe mit geeigneten Trägern
oder Verdünnungsmitteln.
Die Verbindungen oder Mittel können
oral, parenteral (z.B. intravenös,
intraperitoneal), durch Inhalation oder topisch (einschließlich dermal,
transderinal, buccal, und sublingual) verabreicht werden.
Die Art des pharmazeutischen Mittels
und des pharmazeutischen Trägers
bzw. Verdünnungsmittels hängt von
der gewünschten
Verabreichungsart ab. Orale Mittel können beispielsweise als Tabletten
oder Kapseln, auch in retardierter Form, vorliegen und können übliche Exzipienzien
enthalten wie Bindemittel (z.B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit,
Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z.B. Lactose, Saccharose,
Maisstärke,
Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z.B. Magnesiumstearat,
Talcum, Polyethylenglykol oder Siliciumdioxid), desintegrierende
Mittel (z.B. Stärke)
oder Netzmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat). Orale flüssige Präparate können in
Form wässriger
oder öliger
Suspensionen, Lösungen,
Emulsionen, Sirupen, Elixieren oder Sprays usw. vorliegen oder können als
Trockenpulver zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten
Träger
vorliegen. Derartige flüssige
Präparate
können übliche Additive,
beispielsweise Suspendiermittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel
oder Emulgatoren enthalten. Für
die parenterale Verabreichung kann man Lösungen oder Suspensionen mit üblichen
pharmazeutischen Trägern
einsetzen. Für
die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen in wässriger
oder teilweise wässriger
Lösung
vorliegen, die in Form eines Aerosols angewendet werden kann. Mittel
für die
topische Anwendung können
z.B. als pharmazeutisch verträgliche
Puder, Lotionen, Salben, Cremes, Gele oder als therapeutische Systeme
vorliegen, die therapeutisch wirksame Mengen der erfindungsgemäßen Verbindungen
enthalten. Die erforderliche Dosierung ist abhängig von der Form des angewendeten
pharmazeutischen Mittels, von der Art der Anwendung, der Schwere
der Symptome und dein speziellen Subjekt (Mensch oder Tier), das
behandelt wird. Die Behandlung wird üblicherweise mit einer Dosis
begonnen, die unterhalb der optimalen Dosis liegt. Danach wird die
Dosis erhöht,
bis der für
die angegebene Bedingungen optimale Effekt erzielt wird. Im Allgemeinen
werden die erfindungsgemäßen Verbindungen
am besten in Konzentrationen verabreicht, mit welchen sich effektive
Wirkungen erzielen lassen, ohne dass schädliche oder nachteilige Wirkungen
auftreten. Sie können
in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen
lässt sich
anhand verschiedener Testsysteme bestimmen. Nähere Angaben erfolgen in den
angegebene Beispielen.
Methoden zur
Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen
kann wie untenstehend in Beispiel 1 beschrieben erfolgen.
Tabelle
1. Wachstumshemmende Aktivität
der substituierten 10-Benzyliden-1,8-dichlor-9(10H)-anthracenone gegenüber dem
Wachstum von K562 Zellen und Hemmung der Tubulinpolymerisation in
vitro
Table
4 Chemische Daten der Benzyliden-9(10H)-anthiacenone
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele dienen
der Erläuterung
der Erfindung ohne sie zu beschränken
sowie dem besseren Verständnis
der Erfindung.
Einige, vom 9(10H)Anthracenon abgeleitete
Benzylidene mit biologischer Aktivität finden sich in der Literatur.9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Für das N-[4-[(10-Oxo-9(10H)anthracenyliden)-methyl]phenyl]-acetamid
konnte kürzlich
eine Unterdrückung
der HER-2/neu-induzierten
zellulären
Transformation gezeigt werden.18 Müller et al.
beschreiben die Synthese und die biologischen Aktivitäten von
1,8-Dihydroxy-9(10H)-anthracenonen mit Acyl-, Alkyl-, oder Benzylidensubstitutionsmuster
in der 10-Position des antipsoriatrisch wirksamen Dithranols.19
Beispiel 1
Synthese der Hemmstoffe
der Tubulinpolymerisation
Chemische Methoden
Die Schmelzpunkte wurden mittels
eines Kofler Schmelzpunktbestimmungsapparates ermittelt und sind
nicht korrigiert. Spektren wurden wie folgt erhalten:
1H NMR Spektren wurden mit einem Varian Gemini
200 (50,3 MHz) Spektrometer, unter Verwendung von Tetramethylsilan
als internem Standard, aufgenommen. Fouriertransformierte IR-Spektren
wurden mit einem Bio-Rad Laboratorien Typ FTS 135 Spectrometer aufgenommen
und mittels WIN-IR Foundation Software analysiert. Verbrennungsanalysen
wurden im mikroanalytischen Labor der Universität Münster unter Verwendung eines
Heraeus CHN-O-Rapid analyser 240 durchgeführt. Alle Werte befinden sich
innerhalb ± 0.47
der berechneten Zusammensetzung. Massenspektren (EI) wurden im EI
Modus mittels eines MAT 44S Finnigan Massenspektrometers aufgenommen.
Alle organischen Lösungsmittel
wurden vor dem Gebrauch sorgfältig
getrocknet bzw. gereinigt. Aromatische Aldehyde waren überwiegend
kommerziell erhältlich.
Analytische Dünnschichtchromatographie
wurde auf mit Kieselgel bezogenen Aluminiumplattten (Merck Kieselgel
60 F254, E. Merck, Darmstadt) durchgeführt. Säulenchromatographie
mit Kieselgel wurde unter Verwendung von Kieselgel der Firma Merck
(70–230
mesh) durchgeführt.
Es ist bekannt, dass das 9(10H)-Anthracenon
(Anthron) mit Aldehyden Kondensationsreaktionen eingeht.16, 21 Die substituierten 1,8-Dichlor-benzyliden-9(10H)anthracenone
konnten durch eine aldolartige Umsetztung von 1,8-Dichlor-9(10H)-Anthracenon mit entsprechend
substituierten Benzaldehyden unter basischen Bedingungen in Gegenwart
von Pyridin/Piperidin erhalten werden (Methode A, Schema 1).16 In einer effizienteren Variante wurde
die Kondensationsreaktion unter sauren Bedingungen durch Einleiten
von Chlorwasserstoffgas durchgeführt
(Methode B).20 Im Allgemeinen liefert diese
Vorgehensweise die besseren Ausbeuten. Die hier beschriebenen strukturellen
Variationen betreffen in erster Linie den Benzylidenteil der Moleküle sowie
die Umwandlung einiger Methoxyverbindungen in die freien phenolischen
Derivate. Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Benzaldehyde
waren kommerziell erhältlich.
Zur Herstellung der Derivate 4 und 19, wurden die Ethergruppen der
Verbindungen 3 und 6 mittels Bortribromid in Dichlormethan gespalten.
Allgemeine Vorschrift zur Herstellung
der 10-Benzyliden-l,8-dichlor-9(10H)-anthracenone.
Methode A. 1,8-Dichlor-benzyliden-9(10H)-anthracenon
(2.33 g, 12 mmol) und der entsprechende Benzaldehyd (14.4 mmol)
werden in 50 ml trockenem Pyridin und unter Stickstoff suspendiert.
Man fügt
15 ml Piperidin zu und erhitzt anschließend auf dem Ölbad (130°C) bis zur
vollständigen
Umsetzung (DC-Kontrolle). Danach lässt man auf Raumtemperatur
abkühlen,
gießt
auf Wasser (700 ml) und säuert
mit 70 ml 6N HCl an. Man extrahiert gründlich mit Dichlormethan (3 × 50 ml),
trocknet die organische Phase über
Na2SO4 und engt im
Wasserstrahlvakuum ein. Der Rückstand
wird säulenchromatographisch
unter Verwendung von Kieselgel gereinigt. Beim Einengen der Reinfraktionen
kristallisiert das Produkt nach Zugabe von Hexan und Stehenlassen
im Eisbad aus.
Methode B.20 1,8-Dichlor-9(10H)-Anthracenon
(1.94 g, 10 mmol) und der entsprechend substituierte Aldehyd (10
mmol) werden in absolutem Ethanol (25 ml) bei Raumtemperatur suspendiert.
Die Suspension wird über
5 min mit gasförmigem
Chlorwasserstoff gesättigt.
Die Mischung färbt
sich dunkel und wird im Anschluss für die Dauer von 1 h unter Rückfluss
zum Sieden erhitzt (DC-Kontrolle). Man lässt auf Raumtemperatur abkühlen, gießt dann
auf 300 ml Wasser und extrahiert mit CH2Cl2 oder Ethylacetat (bei freien Phenolen). Das
Lösungsmittel
wird im Wasserstrahlvakuum entfernt, der Rückstand wird säulenchromatographisch
unter Verwendung von Kieselgel gereinigt. Beim Einengen der Reinfraktionen
kristallisiert das Produkt nach Zugabe von Hexan und Stehenlassen
im Eisbad aus.
1,8-Dichlor-10-(3,4,5-Trimethoxybenzyliden)-9(10H)-anthracenon
Smp. 234–236°C; FTIR 1683 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 7.81-7.15
(m, 9H), 6.51 (s, 2H), 5.99 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.71 (s, 6H);
MS m/z (M+); Anal. (C24H18Cl2O4)
C, H.
1,8-Dichlor-10-(3-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-9(10H)-anthracenon
mp 247–248 °C; FTIR 3425, 1676 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 7.78-6.72
(m, 10H), 5.56 (s, 1H), 3.90 (s, 3H); MS m/z = 396 (58%, M+); Anal. (C22H14Cl2O3)
C, H.
1,8-Dichlor-10-(3,5-Dimethoxy-4-hydroxybenzyliden)-9(10H)-anthracenon
mp 217–218°C; FTIR 3368, 1673 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 7.78-7.13
(in, 6H), 6.54 (s, 2H), 5.64 (s, 1H), 3.75 (s, 6H); MS m/z = 426
(100%, M+); Anal. (C23N16Cl2O4)
C, H.
1,8-Dichlor-10-(2,4-Dimethoxy-3-hydroxybenzyliden)-9(10H)-anthracenon
mp 184–185°C; F'TIR 3522, 1681 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 7.79-7.13
(m, 7H), 6.88-6.45 (AB, 2H, JAB = 8.59 Hz),
5.60 (s, 1H), 4.00 (s, 3H), 3.89 (s, 3H); MS m/z = 426 (100%, M+); Anal. (C23H18O2) C, H.
1,8-Dichlor-10-(4-Hydroxy-5-methoxybenzyliden)-4(10H)-anthracenon
mp 223–225°C; FT1R 3498, 1682 cm–1; 1H NMR (CDCl3) δ 7.79-7.13
(m, 7H), 6.88 (s, 2H), 6.76 (s, 1H), 5.73 (s, 1H), 3.68 (s, 3H);
MS m/z = 396 (100%, M+); Anal. (C22H14Cl2O3) C, H.
1,8-Dichlor-10-(2-Hydroxy-4-methoxybenzyliden)-9(10H)-anthracenon
mp 259–260°C; FTIR 3452, 1667 cm–1; 1H NMR (d6-DMSO) δ 10.10 (s, 6r, 1N), 7.99-6.90
(m, 7H), 6.44-6.25 (m, 3H), 3.69 (s, 3H); MS m/z (M+);
Anal. (C22H14Cl2O3) C, H.
Beispiel 2
Prüfung auf wachstumshemmende
Eigenschaften an K562-Zellen
Wir prüften die neu synthetisierten
Verbindungen auf wachstumshemmende Eigenschaften an der in Suspension
wachsenden K562 Leukämie
Zell-Linie.22 Der IC50-Wert
(definiert als die effektive Konzentration, die für eine 50%ige
Hemmung des Zellwachstums benötigt
wird) von Verbindung A180 beträgt
in diesem Assay 0.25 μM
(2).
Humane chronisch myelogene K562 Leukämie-Zellen
wurden von Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen bezogen und in RPMI 1640 Medium
(Zusätze:
10% Rinderserum (FBS), 10 ml PenStrep) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert.
Die K562-Zellen wurden in einer Zelldichte
von 2 × 105 Zellen/ml in Platten zu je 48 Vertiefungen (Costar,
Cambridge, MA) ausgesäät. Unbehandelte
Kontrollen wurden dabei als 100% betrachtet. Die zu prüfenden Verbindungen
wurden in DMSO/Methanol im Verhältnis
1:1 gelöst,
den Kontrollen wurde lediglich das Lösungsmittel zugesetzt. In jede
Vertiefung wurden jeweils 5 μL
der gelösten
Verbindung pipettiert, das Gesamtvolumen im Endbehältnis betrug
somit 500 μl.
Die Zellzahl wurde mittels einer Neubauerkammer nach Inkubation
mit den zu prüfenden
Verbindungen über
einen Zeitraum von 48 h ermittelt.
Eine Übersicht über die synthetisierten 1,8-Dichlorbenzylidene-9(10H)-anthracenone
sowie über
deren wachstumshemmende Eigenschaften (IC50-Werte)
gibt Tabelle 1.
Die beobachteten antiproliferativen
Effekte hängen
vom Substitutionsmuster ab.
1,8-Dichlor-10-[(3-hydroxy-4-methoxy-benzyliden)]-9(10H)-anthracenon
A173 zeigte stark wachstumshemmende Eigenschaften (IC50 (K562)
0.25 μM).
Ebenfalls im submikromolaren Bereich lagen die IC50-Werte
der Verbindungen A180 (0.15 μM)
sowie A192 (0.5 μM).
Beispiel 8
Mikrotubuliassemblierung-Turbidimetrischer
Assay
Prinzip der Methode
Bei physiologischer Temperatur und
in Gegenwart von Kofaktoren (GTP und Mg2+-Ionen)
assembliert das Mikrotubuliprotein (MTP) in vitro unter Mikrotubulibildung.
Dieser Prozess ist umkehrbar. Antagonisten der Assemblierung, wie
z.B. Ca2+-Ionen oder auch niedrige Temperaturen
(für Mikrotubuli
aus Säugerhirn
Temperaturen < 10°C) bedingen
eine Disassemblierung, Promotoren dagegen bedingen eine Stabilisierung.
Die Kinetiken und "steady
state"-Bedingungen
der MT-Bildung sowie der MT-Disintegration können durch zeit- und temperaturabhängige turbidimetrische
Messungen bei 350 nm verfolgt werden.
Isolierung von MTP und
Hemmung der MT Assemblierung
Mikrotubuliprotein wurde aus Schweinehirn
durch Zyklen temperaturabhängiger
Disassemblierung/Reassemblierung nach einer von Shelanski et al.
etablierten Methode gewonnen.27. Zur Steigerung
der Ausbeute wurden die Schritte der Reassemblierung in Gegenwart
von Glycerol durchgeführt.
Eine zufriedenstellende Reinheit des Mikrotubuliproteins war nach
zwei Zyklen von Disassemblierung/Reassemblierung gewährleistet.
Mikrotubuli zur Bestimmung antimikrotubulärer Effektoraktivitäten wurden
durch in vitro Assemblierung von Mikrotubuliprotein erhalten. Die
Mikrotubulikonzentration in den Assemblierungsstudien betrug 1 mg/ml
(bestimmt nach dem Lowry Verfahren unter Verwendung von bovinem
Serumalbumin). Die Mikrotubuli assemblierten in einem Puffer der
Zusammensetzung 20 mM PIPES (1,4-Piperazinediethansulfonsäure, pKa 6.8), 80 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2,
1 mM EGTA (Ethyleneglykol-bis-(2-aminoethylen)-tetraessigsäure) nach
Zugabe von 0.25 mM GTP (Guanosin-5'-triphosphat) und Erwärmung der
Proben auf 37°C.
Der Gleichgewichtszustand, erkennbar an der nicht weiter zunehmenden
Menge an polymerisiertem Tubulin, wurde in den Turbiditätsmessungen
nach einer Inkubationsdauer von 20 min erreicht.
Turbidimetrische Messung
Die turbidimetrischen Messungen wurden
spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 360 nm durchgeführt. Die
Temperatur in der Assemblierungs-/Disassemblierungs Küvette wurde
mittels einer Kryostat/Thermostat-Kombination reguliert. Die zu
prüfenden
Verbindungen wurden zu einer kalten MTP-Lösung (MTP Konzentration 1 mg/ml,
Temperatur 2 bis 4°C)
in PIPES Puffer (zur Zusammensetzung siehe oben) bei pH = 6.8 gegeben.
Unmittelbar mit Beginn der Messung wurde die Temperatur auf 37°C erhöht. Nach
einer kurzen "Gap-Phase" kommt es zur Assemblierung
des MTP zu MT. Die Lösung
trübt sich
und erreicht nach ca. 20 min einen Gleichgewichtszustand. Um die
Trübung
von unspezifischen Proteinpräzipitaten
zu unterscheiden, wird die Lösung
auf 2°C
gekühlt
und für
5 min bei dieser Temperatur gehalten, was eine MT Disassemblierung
bedingt. Die MTP Lösung
wird erneut transparent. Bindet oder interferiert die zu prüfende Verbindung mit
Tubulin, so nimmt der "steady
state"-Zustand für Inhibitoren
der Assemblierung ab bzw. zu für
MT stabilisierende Substanzen. Der IC50 Wert
gibt diejenige Konzentration an, die eine 50%ige Abweichung vom "steady-state" Zustand bedingt.
In der Tabelle 1 sind die IC50 Werte der Polymerisationshemmung von Schweinehirntubulin
angegeben. Als Referenzsubstanzen sind Colchicin, Nocodazol, Podophyllotoxin
und Vinblastinsulfat mit einbezogen. Als potente Inhibitoren sind
beispielsweise die Verbindungen A173 (IC50 =
1.3 μM)
und A 192 (IC50 = 1.6 μM) hervorzuheben, deren inhibitorische
Aktivität
im Bereich des Colchicins liegen.
Die gefundenen daten belegen, dass
die erfindungsgemässen
1,8-Dichlor-benzyliden-9(10H)anthracenone
potente zytotoxische Wirkstoffe darstellen, die durch Interferenz
mit dem mitotischen Spindelapparat wirken. Hervorzuheben ist außerdem die
ausgesprochen leichte Zugänglichkeit
der Verbindungen.
Literatur
- (1) Hamel, E. Natural products which interact with tubulin
in the vinca domain: maytansine, rhizoxin, phomopsin A, dolastatins
10 and 15 and halichondrin B. Pharmacol. Ther. 1992, 55, 31–5.
- (2) Pettit, G. R.; Singh, S. B.; Hamel, E.; Lin, C. M.; Alberts,
D. S.; Garcia Kendall, D. Isolation and structure of the strong
cell growth and tubulin inhibitor combretastatin A-4 [published
erratum appears in Experientia 1989 Jul 15; 45 (7): 680]. Experientia
1989, 45, 209–211.
- (3) Pettit, G. R.; Singh, S. B.; Boyd, M. R.; Hamel, E.; Pettit,
R. K.; Schmidt, J. M.; Hogan, F. Antineoplastic agents. 291. Isolation
and synthesis of combretastatins A-4, A-5, and A-6. J. Med. Chem.
1995, 38, 1666–1672.
- (4) Damayanthi, Y.; Lown, J. W. Podophyllotoxins: current status
and recent developments. Curr. Med. Chem. 1998, 5, 205–252.
- (5) Flörsheimer,
A.; Altmann, K.-H. Epothilones and their analogues – a new
class of promising microtubu e inhibitors. Expert Opin. Ther. Patents
2001,11, 951–968.
- (6) Poncet, J. The dolastatins, a family of promising antineoplastic
agents. Cecrr. Pharm. Design 1999, 5, 139–162.
- (7) Jiang, J. B.; Hesson, D. P.; Dusak, B. A.; Dexter, D. L.;
Kang, G. J.; Hamel, E. Synthesis and biological evaluation of 2-styrylquinazolin-4(3H)-ones,
a new class of antimitotic anticancer agents which inhibit tubulin
polymerization. J. Med. Chem. 1990, 33, 1721–1728.
- (8) Cushman, M.; Nagarathnam, D.; Gopal, D.; Ne, H. M.; Lin,
C. M.; Hamel, E. Synthesis and evaluation of analogues of (Z)-1-(4-methoxyphenyl)-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)ethene
as potential cytotoxic and antimitotic agents. J. Med. Chem. 1992,
35, 2293–2306.
- (9) de Barry Barnett, E.; Goodway, N. F.; Wiltshire, J. L. Beiträge zur Kenntnis
der Anthracen-Derivate (I. Mitteil.). Chem. Ber. 1930, 63, 1960–1967.
- (10) de Barry Barnett, E.; Hewett, C. L. The influenee of Bz.-substituents
upon some reactions of the anthrones. Part I. J. Chem. Soc. 1932,
1452–1458.
- (11) Ingram, V. M. The stereochemistry of 10-benzylideneanthrone
and 9-benzylideneiluorene.
J. Chem. Soc. 1950, Part III, up. 1975–2914, 2318–2323.
- (12) Bergmann, E. D.; Rabinovitz, M.; Glily, S. A ring enlargement
in the 9,10-dihydroanthracene
series. Tetrahedron Suppl. 1966, 8, 141–148.
- (13) Rabinovitz, M.; Salemnik, G. The hydroboration of 10-benzylidene-9-anthrones.
J. Org. Chem. 1968, 33, 3935–3936.
- (14) Schultz, O.-E.; Schulze, V. In meso-10-Stellung substituierte
Derivate von hydroxyanthron-9. Phurm. Acta Helv. 1969, 45, 282–285.
- (15) Rappoport, Z.; Apeloig, Y.; Greenblatt, J. Vinylic cations
from solvolysis. 29. Solvolysis of 9-(α-bromoarylidene)anthrones as
a probe to the reactivity-selectivity relationship in solvolysis
reactions. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 3837–3848.
- (16) Weitz, E. Über
einige Anthronabkömmlinge.
Liebigs Ann. Chem. 1919, 418, 29–35.
- (17) Dimmel, D. R.; Shepard, D. Regioselective alkylation of
anthrahydroquinone and anthrone in water with quinonemethides and
other alkylating agents. J. Org. Chem. 1982, 47, 22–29.
- (18) Zhang, L.; Lau, Y.-K.; Xi, L.; Hong, R.-L.; Kim, D. S.;
Chen, C.-F.; Hortobagyi, G. N.; Chang, C.; Hung, M.-C. Tyrosine
kinase inhibitors, emodin and its derivative repress HER-2/neu-induced
cellular transformation and metastasis-associated properties. Oncogene
1998, 16, 2855–2863.
- (19) Müller,
K.; Gürster,
D.; Piwek, S.; Wiegrebe, W. Antipsoriatic anthrones with modulated
redox properties. 1. Novel 10-substituted 1,8-dihydroxy-9(10H)-anthracenones
as inhibitors of 5-lipoxygenase. J. Med. Chem. 1993, 36, 4099–4107.
- (20) Bullington, J. L.; Cameron, J. C.; Davis, J. E.; Dodd,
J. H.; Harris, C. A.; Henry, J. R.; Pellegrino-Gensey, J. L.; Rupert,
K. C.; Siekierka, J. J. The development of novel and selective p56lck tyrosine kinase inhibitors. Bioorg. Med.
Chem. Lett. 1998, 8, 2489–2494.
- (21) Hünig,
S.; Schweeberg, N.; Schwarz, H. Farbe und Konstitution I. Über Farbstoffe
mit gekreuzten Absorptionssystemen. Liebigs. Ann. Chem. 1954, 587,
132–145.
- (22) Lozzio, C. B.; Lozzio, B. B. Human chronic myelogenous
leukemia cell-line with positive philadelphia chromosome. Blood
1975, 45, 321–334.
- (23) Dengler, W. A.; Schulte, J.; Berger, D. P.; Mertelsmann,
R.; Fiebig, H. H. Development of a propidium iodide fluorescence
assay for proliferation and cytotoxicity assays. Anti-Cancer Drugs
1995, 6, 522–532.
- (24) Tashiro, E.; Simizu, S.; Takada, M.; Umezawa, K.; Imoto,
M. Caspase-3 activation is not responsible for vinblastine-induced
Bcl-2 phosphorylation and G2/M arrest in human small cell lung carcinoma
Ms-1 cells. Jpn. J. Cancer Res. 1998, 89, 940–946.
- (25) Minotti, A. M.; Barlow, S. B.; Cabral, F. Resistance to
antimitotic drugs in Chinese hamster ovary cells carrelates with
changes in the level of polymerized tubilin. J. Biol. Chem. 1991,
266, 3987–3994.
- (26) Scala, S.; Wosikowski, K.; Giannakakou, P.; Valle, P.;
Biedler, J. L.; Spengler, B. A.; Lucarelli; E.; Batea, S. E.; Thiele,
C. J. Brain-derived neurotrophic factor protects neuroblastoma cells
from vinblastine toxicity. Cancer Res. 1446, 56, 3737–3742.
- (27) Shelanski, M. L.; Gaskin, F.; Cantor, C. R. Microtubule
assembly in the absence of added nucleotides. Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 1473, 70, 765–768.