DE10240343A1 - Peroxynitrite rearrangement catalysts - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung von paramagnetischen 3-, 8-substituierten Porphyrinderivaten mit verschiedenen Substituenten in den Positionen 13 und 17 des Porphyringerüstes als Peroxynitrit-Umlagerungskatalysatoren.The invention relates to the use of paramagnetic 3-, 8-substituted porphyrin derivatives with different substituents in positions 13 and 17 of the porphyrin skeleton as peroxynitrite rearrangement catalysts.
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung von metallhaltigen Komplexen, die die Umlagerung von Peroxynitrit katalysieren, zur Herstellung von Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen.The invention relates to the use of metal-containing complexes that rearrangement of peroxynitrite catalyze, for the manufacture of drugs for the treatment of Diseases.
Peroxynitrit wurde schon 1990 von Beckman et al. (Beckman et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1620–1624) als toxischer Metabolit beschrieben, der durch die diffusionskontrollierte Reaktion zwischen Stickstoffmonoxid (NO, nitric oxide) und Superoxidanion (O2) entsteht. Peroxynitrit ist an einer Reihe von inflammatorischen Prozessen beteiligt, die bei Erkrankungen wie beispielsweise der Alzheimerschen Demenz, der Multiplen Sklerose, der Amyotrophen Lateralsklerose eine wichtige Ralle spielen und für den Zelluntergang und der Induktion der Apoptose verantwortlich gemacht werden.Peroxynitrite was developed by Beckman et al. (Beckman et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1620-1624) as a toxic metabolite which arises from the diffusion-controlled reaction between nitrogen monoxide (NO, nitric oxide) and superoxide anion (O 2 ). Peroxynitrite is involved in a number of inflammatory processes that play an important role in diseases such as Alzheimer's dementia, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and are responsible for cell death and the induction of apoptosis.
Peroxynitrit reagiert mit einer Vielzahl von Proteinen, indem es Aminosäurereste oxidiert oder nitriert. In Gewebe von Patienten, die an Multipler Sklerose erkrankt sind, finden sich vermehrt Nitrotyrosinreste, da Peroxynitrit die Nitrierung der Tyrosinreste der Filamente der Motoneurone veranlasst. Durch die so gestörte Kontraktion der Filamente kommt es zu einer neuronalen Dysfunktion (Estévez et al., 1999, Science 286, 2498 – 2500). Eine Ursache für die nach einem Schlaganfall beeinträchtigte Vasokonstriktion besteht in der durch Peroxynitrit induzierten Oxydation der Lipidreste der Zellmembran, bei der es zu Verletzungen des Endotheliums und daraus resultierender Ödem – und Neutrophilbildung kommt.Peroxynitrite reacts with a variety of proteins by having amino acid residues oxidized or nitrided. In tissue from patients suffering from multiples Sclerosis, there are more nitrotyrosine residues, since peroxynitrite nitrates the tyrosine residues of the filaments of the Motor neurons induced. Because of the disturbed contraction of the filaments there is neuronal dysfunction (Estévez et al., 1999, Science 286, 2498-2500). A cause for the vasoconstriction is impaired after a stroke in the oxidation of lipid residues induced by peroxynitrite Cell membrane in which there are injuries to the endothelium and from it resulting edema and neutrophil formation comes.
Eine pharmakologische Intervention, um die von Peroxynitrit vermittelten Wirkungen zu verhindem, kann auf der Seite der Ausgangstoffe (NO, und O2) oder auf der Seite des Produktes stattfinden.Pharmacological intervention to prevent the effects mediated by peroxynitrite can take place on the side of the starting materials (NO, and O 2 ) or on the side of the product.
Ein Ansatz auf der Seite des Produktes Peroxynitrit wurde erstmals von Salvemini et al ,(Salvemini et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 2659 – 2663) beschrieben. Bei diesem Ansatz wird Peroxynitrit mittels eines Katalysators in unbedenkliche Endprodukte umgelagert. Es ist möglich, mit nur geringen Konzentrationen an Katalysator große Menge an Peroxynitrit umzuwandeln. Ein Vorteil dieses Ansatzes beruht darauf, dass es so nicht zur Bildung der nachteiligen Dekompositions-Produkte wie beispielsweise der reaktiven Sauerstoffspezies kommen kann und dass es zur Aufhebung der Inhibition der Superoxid-Dismutase (SOD) durch Peroxynitrit kommt. Demzufolge hat diese Behandlungsmethode mit neuartigen Verbindungen einen zweifachen Vorteil in der Behandlung der Erkrankungen. So wird zum einen die Rate der Umwandlung von Peroxynitrit beschleunigt und zum anderen die SOD gegenüber Inaktivierung durch Peroxynitrit geschützt.An approach on the product side Peroxynitrite was first described by Salvemini et al, (Salvemini et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 2659-2663). With this Approach peroxynitrite using a catalyst in harmless End products relocated. It is possible, with only small concentrations of catalyst large amount to convert to peroxynitrite. One advantage of this approach is based insisting that it does not lead to the formation of disadvantageous decomposition products such as the reactive oxygen species can come and that it cancels the inhibition of superoxide dismutase (SOD) comes from peroxynitrite. As a result, this method of treatment with novel compounds a double advantage in treatment of diseases. Firstly, the rate of conversion of peroxynitrite accelerates and on the other hand SOD against inactivation by peroxynitrite protected.
Als mögliche Umwandlungskatalysatoren
sind bisher metallhaltige Komplexe bekannt (WO 95/31197,
Über die Nebenwirkungen wie Toxizität und in vivo Verfügbarkeit, sowie die Blut-Hirnschrankenpermeabilität dieser bekannten Umlagerungskatalysatoren ist bisher wenig bekannt.about the side effects like toxicity and in vivo availability, as well as the blood-brain barrier permeability of these Little known rearrangement catalysts.
Für die Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, die ihre Ursache in den von Peroxynitrit vermittelten Reaktionen haben, besteht das dringende Problem gut verträgliche, chemisch stabile und in vivo verfügbare Substanzen (Katalysatoren) bereitzustellen, um so die Umlagerung von Peroxynitrit in unbedenkliche Produkte zu steigern. Diese in vivo wirksamen Substanzen können zur Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von Erkrankungen verwendet werden.For the treatment and prophylaxis of diseases that are their cause in the reactions mediated by peroxynitrite, that is urgent problem well tolerated, chemically stable and in vivo available substances (catalysts) To provide the rearrangement of peroxynitrite in harmless products to increase. These in vivo active substances can Development of drugs used to treat diseases become.
Die vorliegende Erfindung löst das Problem durch Bereitstellung von Porphyrinkomplexen, die als Peroxynitrit-Umlagerungskatalysatoren dienen. Diese Porphyrine zeichnen sich durch ihre gute in vivo Verfügbarkeit sowie durch ihre chemische Stabilität aus. Sie haben bereits als Mittel zur Diagnose von Tumoren Einsatz gefunden und ihre Verwendung für das Nekrose- und Infarkt-Imaging wurde bereits in der WO 00/05235 offenbart.The present invention solves the problem by providing porphyrin complexes that act as peroxynitrite rearrangement catalysts serve. These porphyrins are characterized by their good in vivo availability as well as their chemical stability. You already have as Means used to diagnose tumors and their use for the Necrosis and infarction imaging has already been disclosed in WO 00/05235.
In der vorliegenden Erfindung konnte mittels NMR- und UVNIS-Spektroskopie gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Porphyrine dar WO 00/05235 die Umlagerung von Peroxynitrit in unbedenklich Endprodukte, nämlich Nitrat und Nitrit katalysieren. Mittels eines Modells für Zellschädigungen konnte gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Porphyrine protektiv sind und die Zellen vor Peroxynitritschädigungen, induziert durch den Peroxynitritdonor SIN-1, schützen. Die vorliegenden Porphyrine sind bereits sehr gut charakterisiert und es ist bekannt, dass sie keine Nebenwirkungen, gute Wasserlöslichkeit und eine gute in vivo Verfügbarkeit besitzen.In the present invention NMR and UVNIS spectroscopy show that the porphyrins according to the invention dar WO 00/05235 the rearrangement of peroxynitrite in harmless End products, namely Catalyze nitrate and nitrite. Using a model for cell damage it could be shown that the porphyrins according to the invention are protective and the cells from peroxynitrite damage induced by the Protect peroxynitrite donor SIN-1. The present porphyrins are already very well characterized and it is known that they have no side effects, good water solubility and good in vivo availability have.
Der Einsatz von Porphyrinkomplexen, die zum einen Peroxynitrit-umlagernde Eigenschaften und zum anderen diagnostische Eigenschaften besitzen, ermöglicht eine gezielte Behandlung der Erkrankungen, die durch Peroxynitrit verursacht werden und deren Diagnose unter Verwendung bildgebender Verfahren, wie z. B. MRT.The use of porphyrin complexes, which on the one hand have peroxynitrite-relocating properties and on the other hand have diagnostic properties, enables targeted treatment of the diseases that caused by peroxynitrite and diagnosed using imaging techniques such as B. MRI.
Die vorliegende Erfindung stellt
pharmazeutische Mittel für
diese gezielte Behandlung bereit und betrifft einen Porphyrinkomplexes
bestehend aus einem Liganden der allgemeinen Formel I sowie mindestens einem Ion
eines Elementes der Ordnungszahl 20–32, 37–39, 42–51 oder 57–83, worin
M für ein paramagnetisches
Ion,
R1 für ein Wasserstoffatom, für einen
geradkettigen C1-C6 Alkylrest,
einen C7-C12-Aralkylrest oder
für eine
Gruppe OR' worin
R' ein Wasserstoffatom oder ein C1-C3 Alkylrest ist, steht,
R2 für R3, eine Gruppe -CO-Z oder eine Gruppe -(NH)o-(A)q-NH-D steht,
worin
Z eine Gruppe -OL ist, mit L in der Bedeutung eines anorganischen
oder organischen Kations oder eines C1-C4 Alkylrestes ist,
A eine Phenylenoxy-
oder eine durch ein oder mehrere Sauerstoffatome unterbrochene C1-C12-Alkylen- oder C7-C12 Aralkylengruppe
bedeutet,
o und q unabhängig
voneinander die Ziffern 0 oder 1 bedeuten und
D ein Wasserstoffatom
oder eine Gruppe -CO-A-(COOL)o-(H)m bedeutet, mit m gleich 0 oder 1 und unter
der Maßgabe,
dass die Summe aus m und o gleich 1 ist,
R3 für eine Gruppe
-(C=Q)(NR4)o-(A)q-(NR5)-K steht,
worin
Q für ein
Sauerstoffatom oder für
zwei Wasserstoffatome steht,
R4 eine
Gruppe -(A)q-H bedeutet und
K einen
Komplexbildner der allgemeinen Formel (IIa), (IIb), (IIc), (IId)
oder (IIe) bedeutet, wobei R für
den Fall, dass K ein Komplexbildner der Formel (IIa) ist die gleiche
Bedeutung wie R4 hat und R5 für den Fall,
dass K ein Komplexbildner der Formel (IIb), (IIc), (IId) oder (IIe)
ist, die gleiche Bedeutung wie D hat, mit der Maßgabe, dass eine direkte Sauerstoff-Stickstoff
Bindung nicht zugelassen ist,
und K für einen Komplexbildner der
allgemeinen Formel (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) oder (IIf) steht,
worin
q
die oben angegebene Bedeutung hat,
A1 die
für A angegebene
Bedeutung hat,
R6 für ein Wasserstoffatom, eine
geradkettige oder verzweigte C7-C7-Alkylgruppe, eine Phenyl- oder Benzylgruppe,
A2 für
eine Phenylen-, -CH2-NHCO-CH2-CH(CH2COOH)-C6H4-β-,
-C6H4-O-(CH2)0- 5-β, -C6H4-(OCH2CH2)0-1-N(CH2COOH)-CH2-β
oder
eine gegebenenfalls durch ein oder mehrere Sauerstoffatome, 1 bis
3-NHCO-, 1 bis 3 -CONH-gruppen unterbrochene und/oder mit 1 bis
3-(CH2)0-5COOH-Gruppen
substituierte C1-C12-Alkylen-
oder C7-C1
2-Alkylengruppe,
wobei β für die Bindungsstelle
an X steht,
X für
eine -CO- oder NHCS-gruppe und
L1,
L2, L3 und L4 unabhängig
voneinander für
ein Wasserstoffatom oder ein Metallionenäquivalent eines Elements der
oben genannten Ordnungszahl steht, unter den Maßgaben, dass mindestens zwei
dieser Substituenten für
Metallionenäquivalente stehen,
und dass zum Ausgleich gegebenenfalls vorhandener Ladungen im Metalloporphyrin
weitere Anionen vorhanden sind und worin freie, nicht zur Komplexierung
benötigte
Carbonsäuregruppen
auch als Salze mit physiologisch verträglich anorganischen und/oder
organischen Kationen oder als Ester oder als Amide vorliegen können, und
der darüberhinaus
auch noch die Umlagerungsrate von Peroxynitrit in unbedenkliche
Produkte steigern und so für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe
radikal-vermittelter Zellschädigungen
verwendet werden können.The present invention provides pharmaceutical agents for this targeted treatment and relates to a porphyrin complex consisting of a ligand of the general formula I. and at least one ion of an element of atomic number 20-32, 37-39, 42-51 or 57-83, wherein
M for a paramagnetic ion,
R 1 for a hydrogen atom, for a straight-chain C 1 -C 6 alkyl radical, a C 7 -C 12 aralkyl radical or for a group OR 'in which
R 'is a hydrogen atom or a C 1 -C 3 alkyl radical,
R 2 represents R 3 , a group -CO-Z or a group - (NH) o - (A) q -NH-D, wherein
Z is a group -OL, with L being an inorganic or organic cation or a C 1 -C 4 alkyl radical,
A represents a phenyleneoxy or a C 1 -C 12 alkylene or C 7 -C 12 aralkylene group interrupted by one or more oxygen atoms,
o and q independently of one another represent the digits 0 or 1 and
D represents a hydrogen atom or a group -CO-A- (COOL) o - (H) m , where m is 0 or 1 and provided that the sum of m and o is 1,
R 3 stands for a group - (C = Q) (NR 4 ) o - (A) q - (NR 5 ) -K,
where Q represents one oxygen atom or two hydrogen atoms,
R 4 represents a group - (A) q -H and
K denotes a complexing agent of the general formula (IIa), (IIb), (IIc), (IId) or (IIe), where R in the case that K is a complexing agent of the formula (IIa) has the same meaning as R 4 and R 5 in the case that K is a complexing agent of the formula (IIb), (IIc), (IId) or (IIe) has the same meaning as D, with the proviso that a direct oxygen-nitrogen bond is not permitted is
and K for a complexing agent of the general formula (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIe) or (IIf) stands,
wherein
q has the meaning given above,
A 1 has the meaning given for A,
R 6 represents a hydrogen atom, a straight-chain or branched C 7 -C 7 alkyl group, a phenyl or benzyl group,
A 2 for a phenylene, -CH 2 -NHCO-CH 2 -CH (CH 2 COOH) -C 6 H 4 -β-, -C 6 H 4 -O- (CH 2 ) 0- 5-β , - C 6 H 4 - (OCH 2 CH 2 ) 0-1 -N (CH 2 COOH) -CH 2 -β
or a C 1 -C 12 alkylene which is optionally interrupted by one or more oxygen atoms, 1 to 3-NHCO, 1 to 3 -CONH groups and / or is substituted by 1 to 3- (CH 2 ) 0-5 COOH groups - or C 7 -C 1 2 alkylene, wherein β represents the binding site to X,
X for a -CO or NHCS group and
L 1 , L 2 , L 3 and L 4 independently of one another represent a hydrogen atom or a metal ion equivalent of an element of the abovementioned atomic number, provided that at least two of these substituents stand for metal ion equivalents and that further ones are used to balance any charges present in the metalloporphyrin Anions are present and in which free carboxylic acid groups not required for complexation can also be present as salts with physiologically tolerable inorganic and / or organic cations or as esters or as amides, and which in addition also increase the rate of rearrangement of peroxynitrite into harmless products and thus for those Manufacture of a drug for the treatment and prophylaxis of radical-mediated cell damage can be used.
Mittels NMR- und UV/VIS-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen die Umlagerung von Peroxynitrt in unbedenklich Endprodukte, nämlich Nitrat und Nitrit katalysieren. Peroxynitrit ist ein starkes Oxidans, das durch die Reaktion von Stickoxid (NO) und Superoxid-Anion (O2) entsteht. Es konnte gezeigt werden, dass NO in vielen Zellen generiert wird wie beispielsweise in Makrophagen, in neutrophilen Zellen, Hepatocyten und Endothelzellen. Die direkte Reaktion von NO und O2 resultiert in der Bildung von Peroxynitrit-Ion, das unter physiologischen Bedingungen schnell zu oxidierenden Intermediaten zerfällt. Diese Oxidationszwischenstufen sind für die Schädigungen der biologischen Targets verantwortlich.Using NMR and UV / VIS spectroscopy, it was possible to show that the compounds according to the invention catalyze the rearrangement of peroxynitrite into harmless end products, namely nitrate and nitrite. Peroxynitrite is a powerful oxidant that is created by the reaction of nitrogen oxide (NO) and superoxide anion (O 2 ). It could be shown that NO is generated in many cells such as macrophages, neutrophils, hepatocytes and endothelial cells. The direct reaction of NO and O 2 results in the formation of peroxynitrite ion, the intermediate that can be rapidly oxidized under physiological conditions decays. These intermediate oxidation states are responsible for the damage to the biological targets.
Die Folgen dieser Schädigungen können assoziiert sein mit pathologischen Konsequenzen einschließlich der Oxidation und Nitrierung von Proteinen, Lipiden und DNA. Peroxynitrit kann mit einer deutlich höheren Geschwindigkeit als andere Oxidantien, Zellmembranen passieren, und selbst in Anwesenheit einer biologischen Membran kann Peroxynitrit schnell in das Zellinnere dringen. Peroxynitrit ist für die Nitrierung von Tyrosinresten in Proteinen bekannt, es oxidiert Sulfhydrylreste, Methianine und Makromoleküle wie beispielsweise Metallenzyme, DNA und Lipide.The consequences of this damage can associated with pathological consequences including the Oxidation and nitration of proteins, lipids and DNA. peroxynitrite can with a significantly higher Speed than other oxidants that pass through cell membranes and even in the presence of a biological membrane, peroxynitrite penetrate quickly into the cell interior. Peroxynitrite is for nitriding known from tyrosine residues in proteins, it oxidizes sulfhydryl residues, Methianine and macromolecules such as metal enzymes, DNA and lipids.
Wegen seiner hohen Reaktivität wurde Peroxynitrit mit vielen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Prophylaxe Radikal-vermittelter Zellschädigungen. Dazu zählen neurodegenerative Erkrankungen, inflammatorische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen.Because of its high reactivity Peroxynitrite has been linked to many diseases. The The invention relates to the use of the compounds according to the invention for the manufacture of a medicament for treatment and prophylaxis Radically mediated cell damage. These include neurodegenerative diseases, inflammatory diseases, autoimmune diseases, Cardiovascular disease.
Beispielsweise seien genannt:
Cerebrale
Ischaemie, ischämische
Reperfusionserkrankung, Hypoxie und andere neurodegenerative Erkrankungen,
die mit Entzündungen
in Verbindung gebracht werden wie Multiple Sklerose, ALS (Amyotrophe
Lateralsklerose) und vergleichbare sklerotische Erkrankungen, Morbus
Parkinson, Huntington's Disease, Korksakoff's Disease, Epilepsie,
Erbrechen, Schlafstörungen,
Schizophrenie, Depression, Stress, Schmerz, Migräne, Hypoglykämie, Demenz
wie z.B. Alzheimersche Krankheit, HIV-Demenz und Presenile Demenz.Examples include:
Cerebral ischemia, ischemic reperfusion disease, hypoxia and other neurodegenerative diseases that are associated with inflammation, such as multiple sclerosis, ALS (amyotrophic lateral sclerosis) and comparable sclerotic diseases, Parkinson's disease, Huntington's disease, Korksakoff's disease, epilepsy, vomiting, sleep disorders Depression, stress, pain, migraines, hypoglycemia, dementia such as Alzheimer's disease, HIV dementia and presenile dementia.
Ferner eignen sie sich zur Behandlung von Krankheiten des Nerz-Kreislauf-Systems wie Arteriosklerose und zur Behandlung autoimmuner und/oder inflammatorischer Erkrankungen wie Hypotension, ARDS (adult respiratory distress syndrome), Sepsis oder Septischer Schock, Rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, von insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM), entzündlicher Erkrankung des Beckens/Darms (bowel disease}, von Meningitis, Glomerulonephritis, akute und chronische Lebererkrankungen, Erkrankungen durch Abstoßung (beispielsweise allogene Herz-,Nieren- oder Lebertransplantationen) oder entzündlichen Hautkrankheiten wie Psoriasis und andere.They are also suitable for treatment of diseases of the mink circulatory system such as arteriosclerosis and for the treatment of autoimmune and / or inflammatory diseases such as hypotension, ARDS (adult respiratory distress syndrome), sepsis or septic shock, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, of insulin-dependent Diabetes mellitus (IDDM), inflammatory Pelvic / bowel disease, meningitis, glomerulonephritis, acute and chronic liver diseases, diseases caused by rejection (e.g. allogeneic heart, kidney or liver transplants) or inflammatory Skin diseases such as psoriasis and others.
Die erfindungsgemäßen Porphyrin-Komplexe enthalten als paramagnetisches Ion im Porphyringerüst das Eisen(III)-, Mangan(III)-, Kupfer(II)-, Cobalt(III), Chrom(III)-, Nickel(II)- oder Vanadyl(II)-Ion, wobei die drei erstgenannten bevorzugt sind.The porphyrin complexes according to the invention contain iron (III) -, manganese (III) - as paramagnetic ion in the porphyrin structure, Copper (II), cobalt (III), chromium (III), nickel (II) or vanadyl (II) ion, the first three are preferred.
Sofern eines der im Porphyrin gebundenen Ionen in einer höheren Oxidationsstufe als +2 vorliegt, wird (werden} die überschüssige(n) Ladung(en) z.B. durch Anionen von organischen oder anorganischen Säuren, bevorzugt durch Acetat-, Chlorid-, Sulfat-, Nitrat-, Tartrat-, Succinat-, und Maleat-Ionen oder durch die in R2 und/oder R3 vorhandenen negativen Ladungen ausgeglichen.If one of the ions bound in the porphyrin is in a higher oxidation state than +2, the excess charge (s) will be caused, for example, by anions of organic or inorganic acids, preferably by acetate, chloride, sulfate, nitrate -, Tartrate, succinate, and maleate ions or balanced by the negative charges present in R 2 and / or R 3 .
Gewünschtenfalls können die Carboxylgruppen, die nicht für die Komplexierung der Metallionen benötigt werden, als Ester, als Amide oder als Salze anorganischer oder organischer Basen vorliegen. Geeignete Esterreste sind solche mit 1 bis 6 C-Atomen vorzugsweise die Ethylester; geeignete anorganische Kationen sind beispielsweise das Lithium- und das Kalium-Ion und insbesondere das Natrium-Ion. Geeignete Kationen organischer Basen sind solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin, insbesondere das Meglumin.If desired, the Carboxyl groups not for the complexation of the metal ions are needed as esters, as Amides or as salts of inorganic or organic bases. Suitable ester residues are preferably those having 1 to 6 carbon atoms the ethyl esters; suitable inorganic cations are, for example the lithium and the potassium ion and especially the sodium ion. Suitable cations of organic bases are those of primary, secondary or tertiary Amines, such as ethanolamine, diethanolamine, morpholine, Glucamine, N, N-dimethylglucamine, especially the meglumine.
Als Komplexbildnerrest K seien vorzugsweise Derivate der Diethylentriaminpentaessigsäure und der 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure genannt, die über einen linker an das jeweilige Prophyrin gebunden sind.The complexing agent residue K is preferred Derivatives of diethylenetriaminepentaacetic acid and 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid, the above a left are bound to the respective prophyrin.
Die Herstellung der Komplexverbindungen
der allgemeinen Formel I erfolgt nach literaturbekannten Methoden
( s. z.B.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung ist bereits in WO 00117205 beschrieben.The preparation of the compound according to the invention is already described in WO 00117205.
Die Verbindungen worin R2 und R3 für CONHNHK-Gruppen stehen, sind bevorzugt. Die Synthese des hierfür als Edukt benötigten 3, 3'-(7, 12-Diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl)di(propanohydrazid) wird in Z. Physiol Chem. 241, 209 (1936) beschrieben.The compounds wherein R2 and R3 for CONHNHK groups are preferred. The synthesis of 3 required as an educt, 3 '- (7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl) di (propanohydrazide) is described in Z. Physiol Chem. 241, 209 (1936) described.
Die Einführung der gewünschten
Metalle (z.B. Mn) in die Porphyrine erfolgt nach literaturbekannten Methoden
(z.B. The Porphyrins, ed. D. Dolphin, Academic Press, New York 1980,
Vol. V, 459;
- a) die Substitution der pyrrolischen NHs (durch Erwärmen des metallfreien Liganden mit dem entsprechenden Metallsalz , vorzugsweise dem Acetat, gegebenenfalls unter Zusatz von säurepuffernden Mitteln, wie z.B. Natriumacetat , in einem polaren Lösungsmittel) oder
- b) die "Umkomplexierung", bei der ein bereits vom Liganden komplexiertes Metall durch das gewünschte Metall verdrängt wird.
- a) the substitution of the pyrrolic NHs (by heating the metal-free ligand with the corresponding metal salt, preferably the acetate, optionally with the addition of acid-buffering agents, such as sodium acetate, in a polar solvent) or
- b) the "re-complexing", in which a metal already complexed by the ligand is displaced by the desired metal.
Als Lösungsmittel sind vor allem polare Solventien, wie z.B. Methanol, Eisessig, Dimethylformamid, Chloroform und Wasser geeignet.Above all, as a solvent polar solvents, such as Methanol, glacial acetic acid, dimethylformamide, chloroform and water.
Die Einführung des paramagnetischen Metalls M in das Porphyrinsystem kann vor oder nach Anknüpfung des Komplexbildner-Restes K erfolgen. Dadurch wird eine besonders flexible Vorgehensweise für die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen ermöglicht.The introduction of the paramagnetic metal M into the porphyrin system can be done before or after tion of the complexing agent residue K take place. This enables a particularly flexible procedure for the synthesis of the compounds according to the invention.
Die Chelatisierung des Restes K erfolgt
in literaturbekannter Weise (siehe z.B.
Die Neutralisation erfolgt dabei mit Hilfe anorganischer Basen wie z.B. Alkali- oder Erdalkali-hydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten und/oder organischer Basen wie unter anderem primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie z.B. Ethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methyl- und N,N-Dimethylglucamin, sowie basischer Aminosäuren, wie z.B. Lysin, Arginin und Ornithin oder von Amiden ursprünglich neutraler oder saurer Aminosäuren.The neutralization takes place with the help of inorganic bases such as Alkali or alkaline earth hydroxides, carbonates or bicarbonates and / or organic bases as under other primary, secondary and tertiary Amines such as Ethanolamine, morpholine, glucamine, N-methyl and N, N-dimethylglucamine, as well as basic amino acids, e.g. Lysine, arginine and ornithine or of amides originally neutral or acidic Amino acids.
Zur Herstellung der neutralen Komplexverbindungen kann man beispielsweise den sauren Komplexsalzen in wäßriger Lösung oder Suspension soviel der gewünschten Basen zusetzen, dass der Neutralpunkt erreicht wird. Die erhaltene Lösung kann anschließend im Vakuum zur Trockne eingeengt werden. Häufig ist es von Vorteil, die gebildeten Neutralsalze durch Zugabe von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, wie zum Beispiel niederen Alkoholen (z.B. Methanol, Ethanol, Isopropanol), niederen Ketonen (z.B. Aceton), polaren Ethern (z.B. Tetrahydrofuran, Dioxan, 1,2-Dimethoxyethan) auszufällen und so leicht zu isolierende und gut zu reinigende Kristallisate zu erhalten. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die gewünschte Base bereits während der Komplexbildung der Reaktionsmischung zuzusetzen und dadurch einen Verfahrensschritt einzusparen.For the production of neutral complex compounds you can, for example, the acid complex salts in aqueous solution or Suspension as much of the desired Add bases so that the neutral point is reached. The received solution can then be evaporated to dryness in vacuo. It is often an advantage that neutral salts formed by adding water-miscible solvents, such as lower alcohols (e.g. methanol, ethanol, isopropanol), lower ketones (e.g. acetone), polar ethers (e.g. tetrahydrofuran, Dioxane, 1,2-dimethoxyethane) precipitate and so easy to isolate and easy to clean crystals to obtain. It has proven to be particularly advantageous desired Base already during add the complex formation of the reaction mixture and thereby to save one procedural step.
Enthalten die sauren Komplexverbindungen mehrere freie acide Gruppen, so ist es oft zweckmäßig, neutrale Mischsalze herzustellen, die sowohl anorganische als auch organische Kationen als Gegenionen enthalten.Contain the acidic complex compounds several free acidic groups, so it is often appropriate to neutral To produce mixed salts, both inorganic and organic Contain cations as counterions.
Dies kann beispielsweise geschehen, indem man den komplexbildenden Liganden in wäßriger Suspension oder Lösung mit dem Oxid oder Salz des das Zentralion liefernden Elements und der Hälfte des zur Neutralisation benötigten Menge einer organischen Base umsetzt, das gebildete Komplexsalz isoliert, es gewünschtenfalls reinigt und dann zur vollständigen Neutralisation mit der benötigten Menge anorganischer Base versetzt. Die Reihenfolge der Basenzugabe kann auch umgekehrt werden.This can happen, for example, by using the complex-forming ligand in aqueous suspension or solution the oxide or salt of the element providing the central ion and the half the needed for neutralization Reacts amount of an organic base, the complex salt formed isolated, if desired cleans and then to complete Neutralization with the required Amount of inorganic base added. The order of base addition can also be reversed.
Eine andere Möglichkeit, zu neutralen Komplexverbindungen zu kommen, besteht darin, die verbleibenden Säuregruppen im Komplex ganz oder teilweise in Ester zu überführen. Dies kann durch nachträgliche Reaktion am fertigen Komplex geschehen (z.B. durch erschöpfende Umsetzung der freien Carboxy-Gruppen mit Dimethylsulfat).Another way to get neutral complex compounds to come is to completely remove the remaining acid groups in the complex or to be partially converted into esters. This can by post reaction done on the finished complex (e.g. by exhaustive implementation of the free Carboxy groups with dimethyl sulfate).
Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt ebenfalls in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Komplexverbindungen – gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze – in wäßrigem Medium suspendiert oder löst und anschließend die Suspension oder Lösung gegebenenfalls sterilisiert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie z.B. Tromethamin), geringe Zusätze von Komplexbildnern (wie z. B. Diethylentriaminpentaessigsäure) oder, falls erforderlich, Elektrolyte wie z. B. Natriumchlorid oder, falls erforderlich, Antioxidantien wie z.B. Ascorbinsäure.The preparation of the pharmaceutical according to the invention Means are also carried out in a manner known per se by the complex compounds according to the invention - if appropriate with the addition of the usual in galenics Additives - in an aqueous medium suspended or dissolved and subsequently the suspension or solution sterilized if necessary. Suitable additives are, for example, physiological harmless buffers (such as tromethamine), small additions of Complexing agents (such as diethylenetriaminepentaacetic acid) or, if necessary, electrolytes such. B. sodium chloride or, if required antioxidants such as Ascorbic acid.
Prinzipiell ist es auch möglich, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel auch ohne Isolierung der Komplexsalze herzustellen. In jedem Fall muß besondere Sorgfalt darauf verwendet werden, die Chelatbildung so vorzunehmen, dass die erfindungsgemäßen Salze und Salzlösungen praktisch frei sind von nicht komplexierten toxisch wirkenden Metallionen.In principle, it is also possible to use the pharmaceutical according to the invention To produce means without isolation of the complex salts. In each Case must be special Care is taken to chelate so that the salts of the invention and salt solutions are practically free of non-complexed toxic metal ions.
Dies kann beispielsweise mit Hilfe von Farbindikatoren wie Xylenolorange durch Kontrolltitrationen während des Herstellungsprozesses gewährleistet werden. Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung der Komplexverbindungen und ihrer Salze. Als letzte Sicherheit bleibt eine Reinigung des isolierten Komplexsalzes.This can be done, for example, with the help of color indicators such as xylenol orange through control titrations during the Manufacturing process guaranteed become. The invention therefore also relates to methods of manufacture complex compounds and their salts. The last security remains a cleaning of the isolated complex salt.
Zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Arzneimittel werden diese in die Form eines pharmazeutischen Präparats gebracht, das neben dem Wirkstoff für die enterale oder parenterale Applikation geeignete pharmazeutische, organische oder anorganische inerte Trägermaterialien, wie zum Beispiel, Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Polyalkylenglykole usw. enthält. Die pharmazeutischen Präparate können in fester Form, zum Beispiel als Tabletten, Dragees, Suppositorien, Kapseln oder in flüssiger Form, zum Beispiel als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls enthalten sie darüber hinaus Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzmittel oder Emulgatoren; Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer.For the use of the compounds according to the invention as pharmaceuticals, these are in the form of a pharmaceutical preparation brought that in addition to the active ingredient for enteral or parenteral Application suitable pharmaceutical, organic or inorganic inert carrier materials, such as, water, gelatin, gum arabic, milk sugar, Strength, Magnesium stearate, talc, vegetable oils, polyalkylene glycols etc. contains. The pharmaceutical preparations can in solid form, for example as tablets, coated tablets, suppositories, Capsules or in liquid Form, for example as solutions, Suspensions or emulsions are present. If applicable included them about it In addition auxiliaries, such as preservatives, stabilizers, wetting agents or emulsifiers; Salts for change osmotic pressure or buffer.
Diese pharmazeutischen Präparate sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.These pharmaceutical preparations are also subject of the present invention.
Für die parenterale Anwendung sind insbesondere Injektionslösungen oder Suspensionen, insbesondere wäßrige Lösungen der aktiven Verbindungen in polyhydroxyethoxyliertem Rizinusöl, geeignet.For the parenteral application is in particular injection solutions or Suspensions, especially aqueous solutions of active compounds in polyhydroxyethoxylated castor oil.
Sind für die enterale Verabreichung oder andere Zwecke Suspensionen oder Lösungen der erfindungsgemäßen Mittel in Wasser oder in physiologischer Salzlösung erwünscht, werden sie mit einem oder mehreren in der Galenik üblichen Hilfsstoft(en) (z.B. Methylcellulose, Lactose, Mannit) und/oder Tensiden) (z.B. Lecithine, Tween®, Myrj®) und/oder Aromastoffen zur Geschmackskorrektur (z.B. etherischen Ölen) gemischt.If suspensions or solutions of the agents according to the invention in water or in physiological saline solution are desired for enteral administration or other purposes, they are mixed with one or more auxiliary substances (e.g. methyl cellulose, lactose, mannitol) and / or surfactants) eg lecithins, Tween ® , Myrj ® ) and / or flavoring agents for flavor correction (eg essential oils) mixed.
Als Trägersysteme können auch grenzflächenaktive Hilfsstoffe wie Salze der Gallensäuren oder tierische oder pflanzliche Phospholipide, aber auch Mischungen davon sowie Liposomen oder deren Bestandteile verwendet werden.As carrier systems can also surfactants Excipients such as bile acid salts or animal or vegetable Phospholipids, but also mixtures thereof as well as liposomes or their Components are used.
Für die orale Anwendung sind insbesondere Tabletten, Dragees oder Kapseln mit Talkum und/oder Kohlenwasserstoffträger oder -binder, wie zum Beispiel Lactose, Mais- oder Kartoffelstärke, geeignet. Die Anwendung kann auch in flüssiger Form erfolgen, wie zum Beispiel als Saft, dem gegebenenfalls ein Süßstoff beigefügt ist.For oral use is particularly tablets, coated tablets or capsules with talc and / or hydrocarbon carrier or binder, such as Lactose, corn or Potato starch, suitable. The application can also be in liquid form, such as Example as a juice, to which a sweetener may be added.
Die enteralen, parenteralen und oralen Applikationen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.The enteral, parenteral and oral Applications are also the subject of the present invention.
Die Dosierung der Wirkstoffe kann je nach Verabfolgungsweg, Alter und Gewicht des Patienten, Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung und ähnlichen Faktoren variieren. Die tägliche Dosis beträgt 0,5–1000 mg, vorzugsweise 50–200 mg, wobei die Dosis als einmal zu verabreichende Einzeldosis oder unterteilt in 2 oder mehreren Tagesdosen gegeben werden kann.The dosage of the active ingredients can depending on the route of administration, age and weight of the patient, type and The severity of the condition being treated and similar factors vary. The daily Dose is 0.5-1000 mg, preferably 50-200 mg, the dose being a single dose to be administered once or divided into 2 or more daily doses.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Porphyrinkomplexe nach Formel (1) zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen die verursacht werden durch die von Peroxynitrit-vermittelten Reaktionen und die abgeschwächt und/oder therapiert werden durch die Steigerung der Umwandlungsrate von Peroxynitrit.The present invention relates to also the use of the porphyrin complexes according to the invention Formula (1) for the treatment and prophylaxis of diseases caused are determined by the reactions mediated by peroxynitrite and the attenuated and / or be treated by increasing the conversion rate of peroxynitrite.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der erfindungsgemäßen Porphyrinkomplexe der allgemeinen Formel (1) zur Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, zu denen neurodegenerative Erkrankungen, inflammatorische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen zählen. Beispielsweise seien genannt:
- – Cerebrale Ischämie, ischämische Reperfusionserkrankung, Hypoxie und andere neurodegenerative Erkrankungen, die mit den Entzündungen in Verbindung gebracht werden wie Multiple Sklerose, Amyotrophe Lateralsklerose und vergleichbare sklerotische Erkrankungen, Morbus Parkinson, Huntington-Chorea, Korsakow Syndrom, Epilepsie, Erbrechen, Schiafsrörungen, Schizophrenie, Depression, Migräne, Hypoglykämie, Demenz wie z.B. Alzheimerscher Krankheit, HIV-Demenz und präsenile Demenz.
- – Ferner eignen sie sich zur Behandlung von Krankheiten des Herz-Kreislauf Systems und zur Behandlung autoimmuner und/oder inflammatorischer Erkrankungen wie Hypotension, ARDS (adult respiratory distress syndrome), Sepsis oder Septischer Schock, Rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis, von insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM), entzündlicher Erkrankung des Beckens/Darms (bowei disease), von Meningitis, Glomerulonephritis, akute und chronische Lebererkrankungen, Erkrankungen durch Abstossung (beispielsweise allogene Herz-, Nieren- oder Lebertransplantationen) oder entzündlichen Hautkrankheiten wie Psoriasis und anderen. Auf Grund ihres Wirkprofils eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen sehr gut zur Umlagerung von Peroxynitrit in unbedenkliche Produkte.
- - Cerebral ischemia, ischemic reperfusion disease, hypoxia and other neurodegenerative diseases which are associated with the inflammation, such as multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis and comparable sclerotic diseases, Parkinson's disease, Huntington's chorea, Korsakow syndrome, epilepsy, vomiting, schizophrenia, schizophrenia, schizophrenia Depression, migraines, hypoglycemia, dementia such as Alzheimer's disease, HIV dementia and presenile dementia.
- - They are also suitable for the treatment of diseases of the cardiovascular system and for the treatment of autoimmune and / or inflammatory diseases such as hypotension, ARDS (adult respiratory distress syndrome), sepsis or septic shock, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM ), inflammatory pelvic / bowel disease, meningitis, glomerulonephritis, acute and chronic liver diseases, rejection diseases (e.g. allogeneic heart, kidney or liver transplants) or inflammatory skin diseases such as psoriasis and others. On the basis of their activity profile, the compounds according to the invention are very suitable for the rearrangement of peroxynitrite into harmless products.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, dass M für ein Fe3+, Mn3+, Cu2+, Co3+, VO2+, Cr3+ oder Ni2+-Ion steht und die besonders wirksam sind.The present invention also relates to the use of compounds of the general formula (I), characterized in that M represents an Fe 3+ , Mn 3+ , Cu 2+ , Co 3+ , VO 2+ , Cr 3+ or Ni 2 + Ion stands and which are particularly effective.
Im weiteren ist Gegenstand der vorliegenden
Erfindung die Verwendung von Porphyrin-Komplex-Verbindungen der allgemeinen
Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass R2 und
R3 jeweils für eine -CONHNHK, -CONH(CH2)2NHK, -CONH(CH2)3NHK, -CONH(CH2)4NHK, -CONH(CH2)2
Ferner ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Porphyrin-Komplex-Verbindungen der allgemeinen Formel (1), dadurch gekennzeichnet, dass R2 und R3 jeweils für eine -CONHNHK stehen.The present invention furthermore relates to the use of porphyrin complex compounds of the general formula (1), characterized in that R 2 and R 3 each represent a -CONHNHK.
Ganz besonders wirksam sind diese Verbindungen, wenn K ein Komplexbildner der allgemeinen Formel (IIa) ist These compounds are particularly effective when K is a complexing agent of the general formula (IIa)
Weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind ins besondere Porphyrin-Komplex-Verbindungen gemäß Formel
(I), nämlich
{mu-[{16,
16'-[Chloromangan(III)-7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2,
18-diyl]-bis[3,
6, 9-tris(carboxymethyl)-11, 14-dioxo-3, 6, 9, 12, 13-pentaazahexadecanoato]}(8-)]}
digadolinato(2-),-Dinatrium,
{mu[{16, 16'-[Chloroeisen(III)-7,
12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl]-bis[3, 6, 9-tris(carboxymethyl)-11,
14-dioxo-3, 6, 9, 12, 13-pentaazahexadecanoato]}(8-]}-digadolinato(2-),-Dinatrium,
{mu[{16,
16'-[Kupfer(II)-7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2,
18-diyl]-bis[3, 6, 9-tris(carboxymethyl)-11, 14-dioxo-3, 6, 9, 12,
13-pentaazahexadecanoato]}(8-)]}-digadolinato(2-),-DinatriumThe present invention further relates in particular to porphyrin complex compounds gene according to formula (I), namely
{mu - [{16, 16 '- [Chloromangan (III) -7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl] -bis [3, 6, 9-tris (carboxymethyl ) -11, 14-dioxo-3, 6, 9, 12, 13-pentaazahexadecanoato]} (8-)]} digadolinato (2 -), - disodium,
{mu [{16, 16 '- [Chloroeisen (III) -7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl] -bis [3, 6, 9-tris (carboxymethyl) -11, 14-dioxo-3, 6, 9, 12, 13-pentaazahexadecanoato]} (8 -]} - digadolinato (2 -), - disodium,
{mu [{16, 16 '- [copper (II) -7, 12-diethyl-3, 8, 13, 17-tetramethylporphyrin-2, 18-diyl] -bis [3, 6, 9-tris (carboxymethyl) -11, 14-dioxo-3, 6, 9, 12, 13-pentaazahexadecanoato]} (8 -)]} - digadolinato (2 -), - disodium
Die gute Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen Mittel erlaubt es hochkonzentrierte Lösungen herzustellen, damit die Volumenbelastung des Kreislaufs in vertretbaren Grenzen zu haften und die Verdünnung durch Körperflüssigkeit auszugleichen. Weiterhin weisen die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur eine hohe Stabilität in vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in vivo, so dass eine Freigabe oder ein Austausch der in den Komplexen nicht konvalent gebundenen – an sich giftigen – Ionen innerhalb der Zeit, in der die Kontrastmittel vollständig wieder ausgeschieden werden, zu vernachlässigen ist.The good water solubility of the agents according to the invention it allows highly concentrated solutions produce so that the volume load of the circuit in reasonable Adhere to limits and thinning through body fluid compensate. Furthermore, the agents according to the invention not just high stability in vitro, but also a surprising one high stability in vivo, so that a release or exchange of those in the complexes not bound in a convex manner become toxic - ions within the time in which the contrast agent is fully restored are eliminated, can be neglected.
Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen Komplexe gegenüber den bislang bekannten, strukturell ähnlichen Verbindungen eine deutlich höhere Relaxivität. Da die Relaxivität als ein Maß für die Kontrastmittelwirksamkeit einer Verbindung angesehen werden kann, gelingt bei Verwendung der erfindungsgemäßen Komplexe im Bereich der NMR-Diagnostik eine vergleichbare, positive Signalbeeinflussung schon bei einer niedrigen Dosis. Dadurch vergrößert sich der Sicherheitsabstand signifikant, für den als Richtwert das Produkt aus Relaxivität und Verträglichkeit angesehen werden kann.Surprisingly show the complexes of the invention across from the previously known, structurally similar connections significantly higher Relaxivity. Because the relaxivity as a measure of contrast agent effectiveness a connection can be viewed using the complexes according to the invention a comparable, positive signal influence in the field of NMR diagnostics even at a low dose. This increases the safety distance significant, for which are regarded as a guideline, the product of relaxivity and tolerance can.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung der erfindungsgemäßen Porphyrinkomplexe der allgemeinnen Formel 1 nach Anspruch 1 zur Diagnostik von Erkrankungen, die die Gruppe folgender Erkrankungen umfassen: ischämische Reperfusionserkrankungen wie z.B. Schlaganfall, Kopftrauma und myokardiale Ischämie, Sepsis, chronische oder akute Inflammation ( wie z.B. Arthritis oder inflammatorische Darmerkrankung), adultes respiratorisches Stress-Syndrom, Krebs, Bronchio-pulmonäre Dysplasie, kardiovaskuläre Erkrankungen, Diabetes, Multiple Sklerose, Parkinsonsche Erkrankung, familiäre amyotrophe Lateraisklerose und Kollitis und spezielle neuronale Erkrankungen.The present invention relates to Moreover the use of the porphyrin complexes according to the invention of general formula 1 according to claim 1 for the diagnosis of diseases, which include the group of the following diseases: ischemic reperfusion diseases such as. Stroke, head trauma and myocardial ischemia, sepsis, chronic or acute inflammation (such as arthritis or inflammatory bowel disease), adult respiratory stress syndrome, cancer, bronchio-pulmonary dysplasia, cardiovascular Diseases, diabetes, multiple sclerosis, Parkinson's disease, family amyotrophic laterais sclerosis and collitis and special neuronal Diseases.
Beschreibung der Abbildungen:Description of the pictures:
Abb1. zeigt ein 14NMR- Spektrum Abb2. zeigt den zeitabhängigen Abbau von Peroxynitrit in An- und Abwesenheit eines Porphyrin-Katalysators, der in einem 100fachen Unterschuss appliziert wurde Abb1. shows a 14 NMR spectrum Fig2. shows the time-dependent decomposition of peroxynitrite in the presence and absence of a porphyrin catalyst, which was applied in a 100-fold deficit
BeispieleExamples
1. Untersuchung des Zerfalls von Peroxynitrit mit NMR-Spektroskopischen Methoden1. Investigation of decay of peroxynitrite using NMR spectroscopic methods
Für
die Untersuchung werden 3 Proben vorbereitet, wobei eine der Proben
die wässrige
Original Peroxynitritlösung
ohne Zusätze
enthält,
die anderen enthalten diese Lösung
in gleicher Menge aber mit definierten Zusätzen einer Referenzsubstanz
bzw. der zu untersuchenden Substanz. Von jeder Probe wird ein 14-N-Spektrum
mit den gleichen Aquisitions- und Processingparametern aufgenommen.
Die Differenzen der Integrale des Nitratsignals zwischen den behandelten
und der unbehandelten Peroxynititlösung zeigt den Anstieg des
Nitrats durch Umlagerung des Peroxynitrits an. Vergleiche der Daten
zwischen der zu untersuchenden Substanz und der Referenzverbindung
erlaubt eine Quantifizierung dieses Vorganges (
2. Messung der Kinetik der Umwandlung von Peroxynitrit zu Nitrat mittels UV-Spektrometrie2. Measurement of the kinetics of the Conversion of peroxynitrite to nitrate using UV spectrometry
Benutzt werden: ein UV-Spektrometer
eine
stopped-flow-Einrichtung mit angeflanschter Küvette
Laborgeräte für volumetrisches
Arbeiten
Reagenzien (Puffer, Peroxynitrit-Lösung, Katalysatoren) The following are used: a UV spectrometer
a stopped-flow device with flanged flask
Laboratory equipment for volumetric work
Reagents (buffer, peroxynitrite solution, catalysts)
Aus der konzentrierten Peroxynitrit – Lösung wird der Gehalt an Peroxynitrit bestimmt. Zugrunde gelegt wird ein molarer Extinktionskoeffizient von ε = 1670. Die Lösung wird mit Wasser so verdünnt, dass eine Absorption von etwa 1.6 bei der Beobachtungswellenlänge von 301 nm erreicht wird. Der pH-Wert der so erzeugten Vorratslösung soll nicht unter 11 fallen.The concentrated peroxynitrite solution becomes the content of peroxynitrite is determined. A molar is used as a basis Extinction coefficient of ε = 1670. The solution is diluted with water so that an absorption of about 1.6 at the observation wavelength of 301 nm is reached. The pH of the stock solution thus produced should do not fall under 11.
Entsprechend der eingestellten Konzentration des Peroxynitrit wird eine Lösung des zu untersuchenden Katalysators in Phosphat-Puffer hergestellt, so dass unter Berücksichtigung der gegebenen Verhältnisse der stopped-Flow-Einrichtung die gewünschten Mengen Katalysatorlösung und Peroxynitrit zur Reaktion zusammengeführt werden können. Der Puffer der Katalysatorlösung muss ausreichend Kapazität haben, um die noch stark alkalische Peroxynitrit-Lösung auf den gewünschten pH einstellen und halten zu können. Die Katalysatoren werden im 100fachen Unterschuss zugegeben.According to the set concentration Peroxynitrite becomes a solution the catalyst to be investigated is produced in phosphate buffer, so considering given conditions of stopped flow facility the desired Amounts of catalyst solution and peroxynitrite can be combined for the reaction. The Buffer of the catalyst solution must have sufficient capacity have to use the still highly alkaline peroxynitrite solution the wished adjust and maintain pH. The catalysts are added in 100-fold deficit.
Die Dosierspritzen der stopped-flow-Anlage werden mit den beiden Lösungen gefüllt und daraus die im UV-Spektrometer befindliche Küvette gefüllt. Simultan werden die Absorptionswerte bei 301 nm gemessen. Infolge Umlagerung des Peroxynitrit zu Nitrat wird die Absorption abnehmen, um nach einiger Zeit einen gleichbleibenden Wert anzunehmen. Zu diesem Zeitpunkt ist die Umlagerung abgeschlossen, und die Datenregistrierung wird abgebrochen.The dosing syringes of the stopped-flow system be with the two solutions filled and filled the cuvette in the UV spectrometer. The absorption values become simultaneous measured at 301 nm. As a result of rearrangement of the peroxynitrite to nitrate the absorption will decrease to a constant after some time Value to assume. At this point the migration is complete, and data registration is canceled.
Die Messdaten werden analysiert,
aus den sich daraus resultierenden kinetischen Kenndaten der Kurve
lässt sich
die Peroxynitrit-Konzentration errechnen. Diese Daten dienen zur
Charakterisierung des zu untersuchenden Katalysators. Um den Selbstzerfall
des Peroxynitrits zu berücksichtigen
wird zu jeder verwendeten Präparation
von Peroxynitrit zunächst
das Zersetzungsverhalten der Peroxynitrit-Lösung bei Zufügen des Puffers
ohne Katalysatorgehalt ermittelt und dessen Kenndaten werden in
Beziehung zu denen gesetzt, die aus einer Messung mit Katalysator
erhalten werden.
relative Geschwindigkeitskonstante = Eigenzerfall
des eingesetzten Peroxynitrits bei dem beschriebenen pH Wert/katalysierter
Zerfall (
relative rate constant = self-decay of the peroxynitrite used at the pH value / catalyzed decay (
3. SIN-1 Schädigungs-Assay mit neuronalen Primärkulturen aus dem Kleinhirn neonataler Ratten3. SIN-1 damage assay with neuronal primary cultures from the cerebellum of neonatal rats
Zur in vitro Testung von Substanzen auf Neuroprotektion gegenüber Schädigungen, die durch Peroxynitrit induziert sind, wird eine Primärkultur von Zellen aus dem Kleinhirn neonataler Ratten angelegt. Die Messung des Zelltods bzw. Überlebens von Neuronen in dieser Kultur erfolgt indirekt durch Messung der Umsetzung des Farbstoffs Alamar blue in seine reduzierte fluoreszierende Form. Zur Schädigung wird der Peroxinitrit-Donor SIN-1 (3-Morpholino-sydnonimin) verwendet.For in vitro testing of substances towards neuroprotection damage, which are induced by peroxynitrite becomes a primary culture created by cells from the cerebellum of neonatal rats. The measurement of cell death or survival of neurons in this culture is done indirectly by measuring the Implementation of the Alamar blue dye in its reduced fluorescent Shape. For harm becomes the peroxynitrite donor SIN-1 (3-morpholino-sydnonimin) used.
Zur Gewinnung der Zellen werden Wistar Ratten (P8) durch Dekapitation getötet, die Kleinhirne gewonnen, die Meninge vom Kleinhirn entfernt (HBSS (GIBCO, 14025-050) 4°C), zerkleinert und in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt, der Überstand wird abgesaugt und anschließend werden die Kleinhirn mittels Zugabe von 500 μl Trypsin-EDTA Lsg.( GIBCO #2530-054)/Kleinhirn trypsiniert. Nach einer Inkubation (20 min, 37°C) werden die trypsinierten Kleinhirne 3x mit 10 ml HBSS gewaschen. Es folgt eine Trituation durch Zugabe von 500 μl 0,05%ige DNAse1 (BOEHRINGER MANNHEIM, #14953000) pro Kleinhirn. Mittels einer 5 ml-Pipette, dann mit einer feuergeglätteten Pasteurpipette, und zuletzt (falls nötig) mit einer ausgezogenen, feuergeglätteten Pasteurpipette werden die Zellen vereinzelt und mit 10 ml Komplettmedium (100 ml Neurobasal (GIBCO #21103-049), 1 ml B27 Supplement (GIBCO #17504-044), 0.4 ml Pen/Strep (10000 IU/ml / 10000 UG/ml) (GIBCO #15140-106), 0.8 ml KCI-Stammlsg (MERCK, 1.04936.0500), 1ml L-Glutamin (100x – 200mM) (GIBCO #15140-106) versetzt. Die vereinzelten Zellen werden anschließend abzentrifugiert (10 min bei 600 rpm), 1x mit Komplett-Medium gewaschen und mit 20 ml Komplett-Medium resuspendiert, gezählt und auf 2×106/ml verdünnt. Pro Loch einer 96 Loch-Mikrotiterplatte werden100 μl Komplett-Medium vorgelegt und mit 100 μl Zellsuspension versetzt (=div1 = day 1 in vitro). Die Mikrotiterplatten werden vorher folgendermaßen beschichtet: pro Loch werden 5Oμl Poly-L-Lysin (MW 70-105kD) (SIGMA #P-6282) appliziert, die Platten werden dann ca. 90 min im Brutschrank inkubiert. Vor dem Ausplatten der Zellen wird die Lösung wieder abgesaugt und 2x mit HBSS bzw. mit sterilem Aqua bidest gewaschen. 24h nach Ausplattierung werden die Zellen durch Zugabe von SIN-1 geschädigt. Testsubstanzen werden 1h vor Zugabe von SIN-1 (Einzelkonzentration 10 bzw.. 30 μM, bzw als Konzentrationsreihe, CALBIOCHEM, 567028) appliziert. Die Messung der Zellfunktion erfolgt an div2 (day2 in vitro) mit Alamar blue (1Oμl/well) (BIOSOURCE INT., DAL1100). Nach einer 3 ständigen Inkubation folgt die Messung im Fluoreszenzreader (Victor, Fa. Wallac, Extinktion 544nm/Emmission 590nM). IC50-Werte werden mit dem Excel Plug-in XLfit berechnet.To obtain the cells, Wistar rats (P8) are killed by decapitation, the cerebellas are obtained, the meninges are removed from the cerebellum (HBSS (GIBCO, 14025-050) 4 ° C), crushed and transferred to a 15 ml Falcon tube, the supernatant is aspirated and then the cerebellum is trypsinized by adding 500 μl trypsin-EDTA solution (GIBCO # 2530-054) / cerebellum. After an incubation (20 min, 37 ° C) the trypsinized cerebellum is washed 3 times with 10 ml HBSS. A tr situation follows by adding 500 μl of 0.05% DNAse1 (BOEHRINGER MANNHEIM, # 14953000) per cerebellum. Using a 5 ml pipette, then with a fire-smoothed Pasteur pipette, and finally (if necessary) with an extended, fire-smoothed Pasteur pipette, the cells are separated and with 10 ml complete medium (100 ml Neurobasal (GIBCO # 21103-049), 1 ml B27 supplement (GIBCO # 17504-044), 0.4 ml pen / strep (10000 IU / ml / 10000 UG / ml) (GIBCO # 15140-106), 0.8 ml KCI stock solution (MERCK, 1.04936.0500), 1 ml L-glutamine ( 100x - 200mM) (GIBCO # 15140-106) The separated cells are then centrifuged off (10 min at 600 rpm), washed once with complete medium and resuspended with 20 ml complete medium, counted and reduced to 2 × 10 6 / 100 μl of complete medium are placed in each hole of a 96-well microtiter plate and 100 μl of cell suspension are added (= div1 = day 1 in vitro). The microtiter plates are coated beforehand as follows: 5Oμl of poly-L-lysine (MW 70-105kD) (SIGMA # P-6282) applied, the plates are then approx. 90 min in breeding incubated. Before the cells are flattened out, the solution is suctioned off again and washed twice with HBSS or with sterile Aqua bidest. 24 hours after plating, the cells are damaged by adding SIN-1. Test substances are applied 1 hour before the addition of SIN-1 (single concentration 10 or 30 μM, or as a series of concentrations, CALBIOCHEM, 567028). Cell function is measured on div2 (day2 in vitro) with Alamar blue (1Oμl / well) (BIOSOURCE INT., DAL1100). After a 3-hour incubation, the measurement is carried out in a fluorescence reader (Victor, Wallac, absorbance 544nm / emission 590nM). IC50 values are calculated with the Excel plug-in XLfit.
Die Ergebnisse aus Beispiel 2 und 3 sind in der folgenden Tabelle angegeben The results from Examples 2 and 3 are given in the following table
Claims (9)
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